Stoffwechseluntersuchungen bei Mikroorganismen mit Hilfe

Stoffwechseluntersuchungen bei Mikroorganismen
mit Hilfe radioaktiver Isotope 11
Kompetitive und nicht-kompetitive Enthemmung von 5-82Br-Uracil *
V o n F R I E D R I C H W E Y G A N D , A D O L F W A C K E R u n d HANSWERNER D E L L WEG
Aus dem Chemischen Institut der Universität Heidelberg
(Z. Naturforschg. 7 b, 19—25 [1952]; eingegangen am 30. Oktober 1951)
Wächst Streptococcus faecalis R mit Thymin und 5-82Br-Uracil, so besteht eine Gesetzmäßigkeit zwischen der aufgenommenen Hemmstoffmenge und der Wachstumsstärke der
Bakterienkultur derart, daß die Kultur mit dem kleineren Trübungswert die größere Hemmstoffmenge pro mg Bakterien enthält.
Bei der nichtkompetitiven Enthemmung von 5-82Br-Uracil mit Folsäure wurde in den Zellen
mehr 5-82Br-Uracil gefunden, als unter den gleichen Bedingungen bei der kompetitiven Enthemmung mit Thymin.
Wie papierchromatographische Untersuchungen ergaben, wird das von der Zelle gebundene
5-82Br-Uracil in die „Nucleinsäure" eingebaut.
Durch die Verwendung von 5-82Br-Uracil wurden die Kenntnisse über Zellteilung und
Gültigkeit des Massenwirkungsgesetzes in der Bakterienzelle vertieft.
K
ürzlich konnten wir mit Hilfe von radioaktivem
Brom zeigen, daß bei der kompetitiven Enthemmung von 5- 82 Br-Uracil mit Thymin bei Streptococcus faecalis R sich in den Bakterien weniger
Hemmstoff befindet als bei der nichtkompetitiven
Enthemmung mit Folsäure 1 . Zur Klärung des Mechanismus der kompetitiven und nichtkompetitiven Enthemmung von 5-Brom-uracil werden in der vorliegenden Arbeit weitere Versuche mitgeteilt.
Methodik
Synthese
von
5-82Br-Uracil**
5-82Br-Uracil
Die Synthese von
ist bereits in der I. Mitt.
beschrieben worden1. In 160 mg Bromuracil waren bei
verschiedenen Versuchen zwischen 2 und 5 mC 82 Br enthalten.
Z ü c h t u n g und A u f a r b e i t u n g
der B a k t e r i e n
Sc. faecalis R wurde in Oberflächenkultur auf Schrägagar (synthetisches Medium + 2% Agar) gehalten und
monatlich überimpft. Zwecks Beimpfung eines Versuches wurden 2 Vorpassagen in synthetischem Medium
+ 3,3 my/cm3 Folsäure durchgeführt. Zusammensetzung
des Nährmediums (Konz./cm3): KH,P0 4 2,5 mg; NaCitrat 25 mg; Casein (mit Pancreatin verdaut) 5 mg;
Glucose 20 mg; Cystein-hydrochlorid 0,2 mg; Adenin 10 y;
Guanin 10 y; Uracil 10 y; Xanthin 10 y; Asparagin 0,1 mg;
* Vorgetragen von F. W e y g a n d auf der I s o t o p e
T e c h n i q u e s C o n f e r e n c e , Oxford/England, Juli
1951.
** Die Synthese von 5-82Br-Uracil wurde von Dipl.Chem. H. G r i s e b a c h durchgeführt.
d,Z-Alanin 0,2 mg; Aneurin 0,2 y; Lactoflavin 0,2 y; Nicotinsäure 0,6 y; Adermin 1,2 y; Calciumpantothenat 0,4 v;
Biotin 0,4 my; M g S 0 4 - 7 H 0 0 200 y; NaCl 10 y
FeS0 4 • 7 H 2 0 10 y; M n S 0 4 - 2 H 2 0 6,7 y. Alle Verbindungen wurden zusammen sterilisiert. Die Züchtung erfolgte
in 100 cm3 Erlenmeyer-Kolben (60 cm3 Medium) mit
Kapsenberg-Kappen. Sterilisation: 20 Min. bei 100°.
Impfmenge: 2 Ösen 0 2 mm. Bebrütung bei 37°. Die
Stärke des Wachstums wurde durch Trübungsmessung mit
dem lichtelektrischen Kolorimeter nach Dr. B. L a n g e bestimmt. Ablesung an der Extinktionsskala, Skalenteile
mal 1000.
Nachdem die Bakterien gewachsen waren, wurden sie in
V 2 A - Stahlbechern abzentrifugiert (15000 Umdr./min),
5-mal mit je 10 ccm dest. Wasser gewaschen und anschließend in den Bechern bei 80°/12 Torr getrocknet.'Dann
wurde die Bakterienmasse in den Bechern zerkleinert und
auf M essin gschälchen (innerer 0 1,4 cm) gebracht. Es
wurde darauf geachtet, daß die getrockneten Bakterien
möglichst gleichmäßig auf den Schälchen verteilt waren.
Mit dem Strahlungsmeßgerät FH 41 mit eingebautem
^-Zählrohr ( F r i e s e k e & H o e p f n e r , Erlangen-Bruck)
wurde die Aktivität der Präparate gemessen.
Da 82 Br eine harte Strahlung aussendet, spielt die Korngröße der Bakterien keine so große Rolle wie beim Arbeiten mit einem weichen Strahler, z. B. 14C oder 35S -. Nachdem wir mit sorgfältig pulverisierten Bakterien und beim
Arbeiten mit kleiner Schichtdicke ( ^ 1 mg/cm2) ungefähr
die gleichen Ergebnisse erhielten wie beim Arbeiten mit
weniger sorgfältig zerkleinerten Bakterien und etwas
größerer Schichtdicke, führten wir die weiteren Versuche
ohne spezielle Behandlung der Bakterien aus.
1 F. W e y g a n d , A. W a c k e r u. H. G r i s e b a c h ,
Z. Naturforschg. 6b, 177 [1951].
2 H. N o l l , J. B a n g , E. S o r k i n u. H. E r l e n m e y e r , Helv. chim. Acta 34, 340 [1951].
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung
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Als Standardpräparat verwendeten wir reines 5- 82 BrUracil, vcn dem wir verschiedene Einwaagen machten.
Im allgemeinen zählten wir bis 10000 Impulse, um den
Fehler unter ± 5 % zu halten. Die Korrektur für den
radioaktiven Abfall ermittelten wir derart, daß wir zu
Beginn und am Ende einer Meßreihe von dem gleichen
Präparat die Aktivität bestimmten.
Die Bakterien wurden durch die verwendete Strahlungsintensität nicht in ihrem Wachstum gehemmt. Zur Kontrolle nahmen wir bei jedem Versuch eine Hemmkurve
mit aktivem und inaktivem Brom-uracil auf.
Um die Frage zu entscheiden, ob durch das Waschen
mit dest. Wasser 5- 8: Br-Uracil aus den Bakterien entfernt
wird, haben wir die Aktivität der Waschwässer bestimmt.
Das Waschwasser wurde in kleinen Petrischalen [0 3,5 cm)
abgedampft und anschließend die Aktivität des Rückstandes mit dem /^-Zählrohr gemessen. Es zeigte sich, daß
das erste Waschwasser entsprechend der Konzentration
Papierchromatographie
Papier: W h a t m a n Nr. 1; Lösungsmittel: n-Butanol
mit Wasser gesättigt. Es wurde absteigend bei 20°
chromatographiert. Die Stellen auf dem Papier, auf denen
sich die Nucleinsäure, die Purine und Pyrimidine befanden,
wurden mit UV-Licht der Wellenlänge ~ 260 m u ermittelt 4 . Danach wurde das Chromatogramm in Streifen
geschnitten und deren Aktivität mit dem /^-Zählrohr gemessen.
Die aus den Bakterien mit 10-proz. NaCl-Lösung bei
95° isolierte Nucleinsäure wurde nach der Methode von
M a r s h a k und V o g e l 5 gespalten.
Ergebnisse
Versuche
mit wachsenden
Bakterien
In Abb. 2 sind Wachstumskurven von Sc. faecalis R
mit Thymin und verschiedenen Konzentrationen 5-
I
1
b=—;
7.
2.
3.
f.
5,:
Abb. 1. Aktivität der Waschwasser in Teilchen/min ohne
Berücksichtigung des Nulleffektes. Im Kulturmedium befanden sich H
1-4, O—O 33, • — • 133 und A—A
266 y/ccm 5- 8: Br-Uracil. Die Bakterien hatten eine Aktivität von 4
f- 1750, O —O 1280, • — • 2500 und A—A
2400 Teilchen / min. O r d i n a t e : Teilchen / min, A b s z i s s e : Waschwasser Nr.
Abb. 2. Wachstum von Sc. faecalis R nach 18 Stdn. in Anwesenheit von A — A 4 y/ccm, X — X 16 y/ccm, O — O
66 y/ccm und • — • 266 y/ccm 5- 8: Br-Uracil und steigenden Mengen Thymin. O r d i n a t e : Trübungswert;
Ablesung an der Extinktionsskala des lichtelektrischen
Kolorimeters nach Dr. B. L a n g e (Skalenteile X 1000).
A b s z i s s e : y/ccm Thymin.
des 5-82Br-Uracils im Nährmedium die größte Aktivität
besaß, die von der restierenden Flüssigkeitsmenge beim
Zentrifugieren herrührte. Mit dem zweiten und dritten
Waschwasser sank aber die Aktivität schnell und erreichte
schließlich einen Endwert, der auch durch weiteres
Waschen nicht mehr unterschritten wurde (Abb. 1). Offenbar wird also durch mehrmaliges Waschen keine ins Gewicht fallende Menge 5-8-Br-Uracil aus den Bakterien
entfernt 3 .
Zu den Versuchen mit ruhenden Bakterien ist folgendes
zu bemerken. Die von dem Nährmedium abzentrifugierten
Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung 3-mal
gewaschen. Darauf wurden sie in einer Menge physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, die dem Volumen der
ursprünglichen Kulturlösung entsprach und 14 Stdn. bei
37° gehalten. Je nach den Versuchsbedingungen enthielt
die NaCl-Lösung 5-82Br-Uracil, Thymin oder beides zusammen. Die weitere Aufarbeitung der Bakterien erfolgte
wie oben beschrieben.
82 Br-Uracil aufgezeichnet. Dividiert man die zur Erreichung eines gleichhohen Trübungswertes erforderliche Menge Thymin durch die entsprechende Menge
5- 82 Br-Uracil, so sieht man, daß der Quotient Thymin/5- 82 Br-Uracil (y/cm3) ungefähr gleich bleibt; d. h.
nicht die absolute Konzentration der Wirkstoffe im
Nährmedium bestimmt die Größe des Wachstums,
sondern ihr Verhältnis 6 . Der Grund hierfür ist folgender: Wuchs- und Hemmstoff haben ähnliche Struktur und reagieren mit dem gleichen Rezeptor in der
Zelle; diese Reaktion verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz.
Vgl. hierzu die Untersuchungen von H. N o 11 et al.2.
R . M a r k h a m u. J. D. S m i t h , Biochem. J. 45,
294 [1949].
5 A. M a r s h a k u. H. J. V o g e 1, J. biol. Chemistrv
189, 597 [1951],
3
4
Durch die Verwendung von radioaktivem
5-Bromuracil war es nun möglich, die Verhältnisse in der
Zelle in bezug auf Brom-uracil zu studieren. — In
Abb. 3 ist auf der Abszisse aufgetragen, wieviel
5- 82 Br-Uracil sich in den Bakterien befindet, auf der
Ordinate der Quotient der im Medium befindlichen
Konzentrationen Thymin/5- 82 Br-Uracil. Man sieht,
e D. D. W o o d s ,
Brit. J. exp. Pathol. 21, 74 [1940].
daß die Menge 5-Brom-uracil, die sich in den Bakterien befindet, von dem Verhältnis Thymin/5-Bromuracil abhängt.
8
v
2
1
kultur auf, so erhält man eine Gerade, wie Abb. 5
zeigt.
Verlängern wir in Abb. 5 die Gerade bis zur
Ordinate, so zeigt der Schnittpunkt mit ihr den
Trübungswert, den die Bakterienkultur ohne 5-Bromuracil erreichen sollte, was auch zutrifft. Der Schnittpunkt mit der Abszisse gibt den Wert an Brom-uracil
an, bei dem keinerlei Wachstum mehr erfolgt und der
wo
US
+
>
300 -
0ß5
ZOO
0,12
100
0,06
0,03
20
'
0.5
1
1.5
WO
300
J
10
60
80
Abb. 4. Zusammenhang zwischen Trübungswert der Bakterienkultur und Gewicht der getrockneten Bakterien.
O r d i n a t e : siehe Abb. 2. A b s z i s s e : mg; Trockengewicht der in 120 ccm Kulturmedium enthaltenen Bakterien.
too
200
300
100
200
0,5
1
1,5
100
Abb. 3 und 5. Von den Bakterien nach 18 Stdn. aufgenommene Menge 5- 8 Br-Uracil in Abhängigkeit von dem
Verhältnis Thymin/5-Brom-uracil. Konzentration des 5^Br-Uracil: A —A 4 yl ccm, X — X 16 y /ccm, O—O
66 yl ccm und • — • .266 yl ccm. O r d i n a t e der Abb. 3:
Quotient aus yl ccm Thymin / yl ccm 5-82Br-Uracil. O r d i n a t e d e r A b b . 5: Trübungswert. A b s z i s s e :
y 5-82Br-Uracil pro mg getrockneter Bakterien.
Abb. 6 (vgl. Tab. 1). Aufnahme von 5-8'-Br-Uracil durch
Sc. faecalis R nach 16 Stdn. in Anwesenheit von Thymin
(T) oder Folsäure (F). O r d i n a t e : Trübungswert. A b s z i s s e : y 5-8-Br-Uracil pro mg getrockneter Bakterien.
Bestimmt man die Stärke des Wachstums durch
Trübungsmessungen mit dem lichtelektrischen Kolorimeter nach Dr. B. L a n g e unter Verwendung der
Extinktionsskala des Gerätes, so besteht ein linearer
Zusammenhang zwischen dem Trübungswert einer
Bakterienkultur und dem Gewicht der getrockneten
Bakterien, oder, gleiche Größe aller Zellen vorausgesetzt, ihrer Zahl (s. Abb. 4). — Trägt man in Abb. 3
auf der Ordinate an Stelle des Quotienten Thymin/5- 82 Br-Uracil den Trübungswert der Bakterien-
ungefähr der maximal aufnehmbaren Menge 5-Bromuracil entspricht, was auch aus den nachfolgend beschriebenen Versuchen mit Folsäure als Wuchsstoff
hervorgeht.
Wieviel Brom-uracil befindet sich nun in den Bakterien, wenn diese mit Folsäure gewachsen sind?
Bevor wir diese Frage beantworten, müssen wir eine
gewisse Einschränkung machen. Das gewählte Beispiel Sc. faecalis R, Folsäure, Thymin und 5-Bromuracil ist nicht ideal, weil nämlich auch in Gegenwart
Folsäure
(my/ccm)
3,3
3,3
3,3
3,3
3,3
Thymin
(y/ccm)
3,3
3,3
3,3
2
2
2
2
2
2
2
2
33
16
8
4
5-82Br-Uracil
(y/ccm)
33
16
8
4
33
16
8
4
33
16
8
4
133
133
133
133
Trübungswert
der Bakt.kultur
nach 16 Stdn.
155
160
190
210
225
275
330
365
190
250
330
370
375
320
220
112
y
mg getrockneter
Bakterien
2,16
1,98
1,65
1,44
1,37
1,04
0,59
0,33
1,39
1,28
0,71
0,45
0,41
0,69
1,26
1,63
5-8äBr-Uracil/
Tab. 1. Graphische Darstellung der Werte siehe Abb. 6 und 7.
von Folsäure 5-Brom-uracil das Wachstum hemmt 7 .
Diese Hemmung ist nicht stark und kann auch durch
Verwendung größter Mengen 5-Brom-uracil nicht
vermehrt werden. Trotzdem ist es erforderlich, die
von den Bakterien in Anwesenheit von Folsäure und
in Anwesenheit von Thymin aufgenommene Hemmstoffmenge bei dem gleichen Trübungswert der Bak-
Ordinate und Abszisse siehe Abb. 6.
terienkulturen zu vergleichen. Der Stamm muß sich
also in Gegenwart von Folsäure und 5-Brom-uracil
wie auch in Gegenwart von Thymin und 5-Bromuracil gleichschnell vermehren. Darauf achteten wir
in der I. Mitt. 1 noch nicht.
In Abb. 6 sind 2 Kurven einer anderen Versuchsreihe zu sehen; F zeigt die pro mg Bakterien aufgenommene Hemmstoffmenge, wenn sie mit Folsäure
gewachsen sind, T, wenn sich die Bakterien in Gegenwart von Thymin vermehrt haben. Die Kurve T zeigt
den vorhin besprochenen Verlauf. Wächst das Bakterium mit Folsäure und wird dabei die Menge
5- 8 -Br-Uracil von 33 auf 4 y/'cm3 verringert, so wird
auch von den Zellen entsprechend weniger Hemm7 Vgl. Abb. 4 a. F. W e y g a n d , E. F. M ö l l e r u.
A. W a c k e r , Z. Naturforschg. 4b, 269 [1949],
stoff aufgenommen. Sind gleichzeitig Folsäure, Thymin und 5- 82 Br-Uracil vorhanden, so zeigt sich
ebenfalls eine Gesetzmäßigkeit zwischen der aufgenommenen Hemmstoffmenge und dem Trübungswert der Bakterienkultur. Verbindet man in Abb. 7
die entsprechenden Punkte miteinander, so ergibt sich
eine Gerade, die weitgehend der Thymin-Geraden
Folsäure (my/ccm)
3,3
3,3
3,3
3,3
5-82Br-Uracil (y/ccm)
33
66
133
266
Trübungswert der Bakterienkultur nach 16 Stdn.
152
140
117
116
y 5-82Br-Uracil/mg
getrockneter Bakterien
2,5
2,2
2,0
2,5
Tab. 2. 5-82Br-Uracil-Aufnahme durch Sc. faecalis
Anwesenheit großer Mengen Hemmstoff.
R in
der Abb. 6 gleicht. Wie weitere Versuche zeigten,
scheinen bei einer Konzentration von 33 y/cm3 5- 82 BrUracil in Gegenwart von Folsäure, in den Bakterien
alle Rezeptoren besetzt zu sein, denn bei einer weiteren Steigerung der Hemmstoffmenge auf 266 y/cm3
wird von den Bakterien nicht mehr Hemmstoff aufgenommen (Tab. 2). Auffällig ist, daß die von den
Zellen maximal aufgenommene Hemmstoffmenge ungefähr mit dem Wert übereinstimmt, der sich ergibt,
wenn die Thymin-Gerade die Abszisse schneidet
(vgl. Abb. 5 und 6). Von diesem Schnittpunkt sagten
wir oben, daß er die Menge 5- 82 Br-Uracil anzeigt, bei
der praktisch alle Rezeptoren besetzt sein müssen. —
Das wichtigste Ergebnis aber, das wir Abb. 6 entnehmen können ist folgendes: Wächst Sc. faecalis R
mit Folsäure und 5- 82 Br-Uracil, so enthält das Bäk-
terium mehr Hemmstoff, als wenn es unter den gleichen Bedingungen
mit Thymin und 5- 82 Br-Uracil
wächst.
Um nun die Frage zu entscheiden, warum sich das
Bakterium in Anwesenheit von Folsäure und einer
Menge 5-Brom-uracil, die bei Verwendung einer
physiologischen Konzentration Thymin an Stelle von
Folsäure total hemmen würde, trotzdem vermehrt,
war es erforderlich, festzustellen, was mit dem Hemmstoff innerhalb der Zelle geschieht. Da 5-Brom-uracil
ein kompetitiver Antagonist des Thymins ist 8 , konnte
man annehmen, daß das 5-Brom-uraeil irgendwie in
den Stoffwechsel der Desoxy-ribonucleinsäure eingreift.
säure 10 y 5- 82 Br-Uracil zu. Durch mehrfaches Waschen
mit 95-proz. Alkohol konnten wir die zugesetzte Aktivität wieder entfernen, während dagegen die aus den
Bakterien extrahierte in der Nucleinsäure verblieb. —
zoom
woM
L J
L
zoo-m
Papierchromatographische Untersuchung der B a k t e r i e n n u c l e i n s ä u r e
Um zu sehen, ob 5- 82 Br-Uracil in die Nucleinsäure
eingebaut wird, haben wir aus 370 mg Bakterien, die
mit Folsäure (3,3 my/cm3) und 5- 82 Br-Uracil (66y/cm 3 )
gewachsen waren, die Ribo- und gleichzeitig damit
die Desoxy-ribonucleinsäure mit 10-proz. NaCl-Lösung extrahiert. Zuvor wurden die Bakterien mit
Wasser, Alkohol, Trichloressigsäure-Lösung und Äther
gewaschen; dabei wurden keine nennenswerten Mengen 5- 8 -Br-Uracil aus den Bakterien entfernt. Die umgefällte und von NaCl weitgehend befreite Nucleinsäure wurde
a) als solche chromatographiert,
b) unter Zusatz von 5- 82 Br-Uracil und
c) nach Hydrolyse mit 12-n. Perchlorsäure, außerdem
d) 5- 82 Br-Uracil allein.
Dabei ergab sich (Abb. 8): In dem verwendeten
Lösungsmittelsystem n - B u t a n o l - H 2 0 wandert die
Ribo- und Desoxy-ribonucleinsäure nicht von der
Startlinie des Chromatogramms ab. Die gesamte aus
den Bakterien extrahierte Aktivität blieb ebenfalls
auf der Startlinie sitzen. Wurde dagegen 5- 82 Br-Uracil
der Nucleinsäure zugesetzt, so wanderte das zugesetzte 5- 82 Br-Uracil mit einem RF-Wert von 0,52.
Erst nachdem wir die Nucleinsäure mit Perchlorsäure
gespalten hatten, wanderte die aus den Bakterien
extrahierte Aktivität mit dem RF-Wert von 5-Bromuracil. Gleichzeitig fanden wir auf dem Chromatogramm Adenin, Uracil, Cytosin und Guanin. In einem
weiteren Versuch setzten wir der extrahierten Nuclein8 G. H. H i t c h i n g s , E.A. F a l c o u. M. B. S h e r w o o d , Science [New York] 102, 251 [1945],
a)
1
1
41
«
200-
1
700-
GC
200-
700-
0
U A B
l
0,1 0,2 0,3 O/f 0,5 0,6 0,7 0,8 03 1
Abb. 8. Skizze der Papierchromatogramme mit zugehöriger
Aktivität, a) Nucleinsäure, b) Nucleinsäure + 2 y 5- 82 BrUracil, c) Nucleinsäure nach der Hydrolyse mit Perchlorsäure, d) 1,5 y 5-8-'Br-Uracil. O r d i n a t e : Aktivität in
Teilchen/Minute. A b s z i s s e : Rp -Wert. Z e i c h e n e r k l ä r u n g : N = Nucleinsäure, G = Guanin, C = Cytosin, U = Uracil, A = Adenin, B = 5-82Br-Uracil.
Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, daß
5- 82 Br-Uracil in der Bakterienzelle nicht umgewandelt,
sondern vermutlich in die Desoxy-ribonucleinsäure
eingebaut wird. Wachsen die Bakterien mit Thymin
und 5-Brom-uracil und wird dabei 5-Brom-uracil von
den Zellen aufgenommen, so dürfte es auch in diesem Falle in die Thymonucleinsäure eingebaut werden.
Versuche
mit
ruhenden
Bakterien
In einem Versuch waren die Bakterien (Abb. 9) mit
Folsäure gewachsen. Danach wurden sie von dem
Nährmedium zentrifugiert, gewaschen und in physiologischer Kochsalzlösung, die steigende Mengen 582 Br-Uracil enthielt, suspendiert. Wie aus der Abb.
hervorgeht, nehmen die Bakterien auch in ruhendem
y 5-82Br-Uracil/mg getrockneter Bakterien nach
Bebrütung in:
a) 0 , 9 % NaCl-Lösung
b) 0 , 9 % NaCl-Lösung + 2 y/ccm Thymin
c) 0,9 % NaCl-Lösung + 66 y/ccm Thymin
14 Stdn.
2,26
1,86
1,57
Tab. 3. Verdrängung von 5-82Br-Uracil aus ruhenden Zellen von Sc. faecalis R durch Thymin. Die Bakterien waren
mit 3,3 my/ccm Folsäure und 66 y/ccm 5-82Br-Uracil gewadisen.
In einem weiteren Versuch ließen wir Sc. faecalis R
mit Folsäure und 5- 82 Br-Uracil wachsen. Trotz 14-stdg.
Bebrütung der in physiologischer Kochsalzlösung suspendierten Zellen war es nicht möglich, 5- 82 Br-Uracil
aus den Bakterien zu „eluieren". Erst nachdem wir
der NaCl-Lösung Thymin zufügten, wurde entsprechend der Konzentration des Thymins 5- 82 Br-Uracil
aus den Zellen in Freiheit gesetzt (s. Tab. 3).
Diskussion
Abb. 9. Aufnahme von 5-82Br-Uracil durch ruhende Zellen von Sc. faecalis R in Anwesenheit von A — AO y/ccm,
A 2 y/ccm und A 66 y/ccm Thymin und steigenden
Mengen 5-82Br-Uracil. O r d i n a t e : y 5-82Br-Uracil pro mg
getrockneter Bakterien. A b s z i s s e : y/ccm 5-82Br-Uracil.
16
33
66
133
Abb. 10. Hemmstoffaufnahme durch ruhende Zellen von
Sc. faecalis R in Anwesenheit von X — X 0 y/ccm und O
2 bzw. 66 y/ccm Thymin und steigenden Mengen 5- 82 BrUracil. Ordinate und Abszisse siehe Abb. 9.
Zustand radioaktives Bromuracil auf. Ist gleichzeitig
noch Thymin vorhanden, so wird weniger Hemmstoff
von den Zellen gebunden.
Wächst Sc. faecalis R mit Thymin und werden die
zentrifugierten und gewaschenen Zellen mit den
gleichen Konzentrationen 5- 82 Br-Uracil wie in dem
vorhergehenden Versuch zusammengebracht, so ist
auch hier die aufgenommene Hemmstoffmenge von
der Konzentration des Hemmstoffes in der Lösung
abhängig (Abb. 10). Im Vergleich zu den mit Folsäure gewachsenen Bakterien wird jedoch weniger
5- 82 Br-Uracil aufgenommen. Ist neben Brom-uracil
noch Thymin in der Lösung, so wird dadurch die aufgenommene Hemmstoffmenge noch weiter reduziert.
9
Eigene Zählungen; siehe auch Fußnote 2.
Durch Verwendung von radioaktivem 5-Bromuracil war es möglich, den Mechanismus der kompetitiven und nichtkompetitiven Enthemmung genauer zu studieren. Im Falle der kompetitiven Enthemmung von Sc. faecalis R durch Thymin zeigte
sich, daß die aufgenommene Hemmstoffmenge von
dem Verhältnis der Konzentration Thymin/5-Bromuracil abhängt und nicht von der absoluten Menge
des Hemmstoffes im Nährmedium. — Die aufgenommene Menge 5-Brom-uracil bestimmt die Stärke des
Wachstums derart, daß die weniger gut gewachsene
Kultur mehr Hemmstoff enthält. Wir müssen jedoch
beachten, daß wir mit unserer Methodik nicht den
Zustand eines einzelnen Bakteriums erfassen, sondern
statistisch den der gesamten Bakterienkultur.
Unter der Annahme, daß ungefähr 2 y 5 82 Br-Uracil
maximal in 1 mg getrockneter Bakterien enthalten
sind und 1 mg Bakterien aus 10 9 Zellen besteht 9 , errechnen sich daraus 10 6 Moleküle 5-Brom-uracil pro
Bakterium. Zu der gleichen Zahl kommt man auch,
wenn man die Anzahl der Moleküle Thymin in der
Thymonucleinsäure eines Bakteriums bestimmt 10 und
schließlich fanden wir bei der Extraktion der Nucleinsäure aus Sc. faecalis R Werte für Adenin und 5 82 BrUracil, die dem oben angegebenen Wert entsprechen.
Wir können annehmen, daß die Verbindung Rezeptor—Substrat reversibel ist. Dadurch ist es mögK. D i m r o t h u. L. J a e n i c k e , Z. Naturforschg.
5 b, 185 [1950]; F. J . D i C a r l o et al., J. biol. Chemistry
180, 329 [1949]; E. C h a r g a f f , S. Z a m e n h o f , J.
biol. Chemistry 173, 327 [1948],
lieh, daß der Rezeptor eine gewisse Zeit von dem
Wuchsstoff wie auch von dem Hemmstoff besetzt
werden kann. Die Verweilzeit an dem Rezeptor wird
durch die Affinität des Substrats zum Rezeptor bestimmt und findet ihren Ausdrude in dem molaren
Verhältnis der Konzentrationen Wuchsstoff/Hemmstoff, die zur Erreichung eines bestimmten Wachstums
erforderlich sind.
nucleinsäure ist. Da bei der nichtkompetitiven Enthemmung von 5-Brom-uracil mit Folsäure der Hemmstoff in der Zelle verbleibt, muß er also an Stelle des
Thymins in die Desoxyribonucleinsäure eingebaut
werden 1 1 . Die Versuchsergebnisse bestätigen dies
auch, denn ohne die Spaltung der Nucleinsäure mit
Perchlorsäure wird daraus 5- 92 Br-Uracil nicht in Freiheit gesetzt.
Eine Zelle kann sich erst dann teilen, wenn entweder alle oder ein bestimmter Teil der Rezeptoren
frei von Hemmstoff sind. Dieser Zustand wird aber
um so häufiger eintreten, je größer das Verhältnis
Wuchsstoff/Hemmstoff ist, mit anderen Worten, in
der Zeiteinheit werden die Zellen, die im Durchschnitt weniger Hemmstoff enthalten, sich schneller
teilen als die, die mehr Hemmstoff enthalten. Infolgedessen enthält die Bakterienkultur
mit dem
größeren
Trübungswert
im Durchschnitt
pro Zelle
iveniger
Hemmstoff.
Die Ergebnisse mit ruhenden Bakterien können als
ein weiterer Beweis für den festen Einbau von 5Brom-uracil in die Nucleinsäure aufgefaßt werden.
Bislang haben wir den in der Zelle in ungebundener Form vorliegenden Anteil 5-Brom-uracil nicht
berücksichtigt. Aus den Versuchsergebnissen kann
man nicht entnehmen, wie groß er ist; seine Größe
hängt aber in irgendeiner Weise mit der Konzentration des Hemmstoffes im Nährmedium zusammen ;
Dies gilt jedoch nicht für den gesamten Konzentrationsbereich (bis 266 yl cm 3 ), denn nach Absättigung
der Rezeptoren wird die Aufnahmefähigkeit der Zelle
beschränkt sein. Auch wird bei einer Lokalisierung an
der Oberfläche der Zelle der in ungebundener Form
vorliegende Anteil eines Stoffes ein anderer sein, als
wenn sich die Rezeptoren im Zellinnern befinden.
Dies muß man im Falle des Thymins bzw. 5-Bromuracils beachten, da sich die Ribonucleinsäure vermutlich nahe der Zelloberfläche befindet 12 und die
Desoxyribonucleinsäure genetisch eng mit der Ribonucleinsäure zusammenhängt. Wohl der Hauptgrund, warum wir über den in freier Form vorhandenen Anteil nichts aussagen können, liegt in der
Aufarbeitung der Bakterien. Beim Waschen mit dest.
Wasser wie mit physiologischer Kochsalzlösung wird
der sich im Gleichgewicht mit der Konzentration im
Medium befindliche Anteil in der Zelle mit verdünnt
und entzieht sich so der Beobachtung.
Im Falle der nichtkompetitiven Enthemmung von
5- 82 Br-Uracil durch Folsäure fanden wir in den Bakterien mehr Hemmstoff als unter den gleichen Bedingungen (Trübungswert) bei der kompetitiven Enthemmung mit Thymin. Daraus kann man schließen,
daß in Anwesenheit von Folsäure kein Thymin zur
Enthemmung
von 5-Brom-uracil gebildet wird und
der Stoffwechsel in einer anderen Weise verläuft.
Durch die papierchromatographische Untersuchung
der Nucleinsäure konnten wir auch etwas über den
Verbleib des 5- 82 Br-Uracils in der Zelle aussagen. —
Der Mechanismus der kompetitiven und nichtkompetitiven Enthemmung ist durch die Spezifität des Substrates gekennzeichnet. Wenn man mit Thymin in
kompetitiver Weise die Hemmung von 5-Brom-uracil
aufheben kann, so folgt daraus, daß 5-Brom-uracil
den Platz in der Zelle besetzt, der sonst von Thymin
eingenommen wird, das ein Baustein der DesoxyriboVgl. hierzu die Untersuchungen von G. W. K i d d e r
et al., J. biol. Chemistry 179, 181 [1949]; L. L. B e n n e 11
et al., Cancer Res. 10, 644 [1950]; J. H. M i t c h e 11 et al.,
Cancer Res. 10, 647 [1950]; G. W. K i d d e r et al., Cancer
Res. 11, 204 [1951].
« A. P. N y g a a r d u. V. H. C h e 1 d e 1 i n , J. Bacteriology 61, 497 [1951].
11
Wir danken Hrn. K. W a c k e r für unermüdliche Hilfe
bei den Versuchen, der Fa. F r i e s e k e & H o e p f n e r ,
Erlangen-Bruck, für Überlassung eines Strahlungsmeßgerätes FH 41. Der N o t g e m e i n s c h a f t d e r D e u t s c h e n W i s s e n s c h a f t danken wir für Unterstützung
dieser Arbeit,• ebenso dem F o n d s f ü r C h e m i e für
die Gewährung eines Stipendiums (A. W.).