Möglichkeiten zur Diagnose der progressiven Rhinitis Atrophicans
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Literaturrecherche Möglichkeiten zur Diagnose der progressiven Rhinitis Atrophicans im Zeitraum von 1996-2004 Pasteurella multocida gehören zur kommensalen Flora des oberen Respirationstraktes des Schweins. Als Sekundärerreger können die Bakterien an pneumonischen Erkrankungen bei Mastschweinen mit beteiligt sein. Die progressive Rhinitis Atrophicans (pRA) ist eine respiratorische Erkrankung, die zu grossen finanziellen Verlusten führen kann. Zum ersten Mal wurde das Krankheitsbild in Deutschland vor 165 Jahren beschrieben. Typisch für die Erkrankung sind Niesen, Nasenbluten, Atrophie der Nasenmuscheln und Verformung der angrenzenden Knochen, sowie Deviation des Nasenseptums, was zu verkürzten und/oder verformten Rüsseln führt. Beteiligt sind die beiden Erreger Bordetella bronchiseptica und Pasteurella multocida. Für die progressive Form der Erkrankung sind P. multocida Stämme nötig, die ein dermatonekrotisches Toxin (DNT) bilden. Die Übertragung der Erkrankung erfolgt vor allem über Nasen-zu-Nasen-Kontakt, und auch die Übertragungen via Luft wurden schon beschrieben. Nicht alle infizierten Tiere bzw. Herden zeigen typische klinische Symptome. Um eine Einschleppung in Betriebe über Tierverkehr zu vermeiden, ist es wichtig, die Herden entsprechend zu überwachen. Da der Antikörper-Titer nach erfolgter Infektion meist sehr niedrig bleibt, sind nur sehr sensitive Methoden geeignet, eine Infektion mittels Serologie nachzuweisen. Dies ist wohl der Grund, weshalb hauptsächlich direkt toxinbildende P. multocida Stämmen mittels Tonsillen- oder Nasentupferproben nachgewiesen werden. Dazu müssen die Kolonien auf selektiven Nährböden angezüchtet werden. Die Isolate werden anschliessend auf DNT getestet, wozu mehrere verschiedene Tests möglich sind. Weil P. multocida Keime häufig leicht durch andere Kolonien überwuchert werden können, wurde nach alternativen, sensitiveren Methoden gesucht. Das toxA-Gen, welches für das DNT kodiert wurde, isoliert und sequenziert. Es wurde festgestellt, dass toxA in allen toxischen P. multocida Strängen gefunden werden kann, nicht aber in den P. multocida Isolaten, die kein DNT bilden. Nur in wenigen nicht-toxischen Kolonien konnten nicht komplette oder mutierte toxA-Gensequenzen nachgewiesen werden. Für exaktere epidemiologische Abklärungen wurden in den letzten Jahren weitere Tests entwickelt, um die genetische Verwandtschaft der jeweils gefundenen P. multocida Keime zu bestimmen. Am Institut für Veterinärbakteriologie in Zürich werden die Nasentupferproben auf einem spezifischen Nährboden für P. multocida während einem Tag angezüchtet und anschliessend einen weiteren Tag inkubiert. In den gewachsenen Kolonien wird mittels ELISA das dermatonekrotische Toxin nachgewiesen. Detection of toxigenic Pasteurella multocida infections in swine herds by assaying antibodies in sow colostrum K. Levonen et al. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 8, 455-459 (1996) In Finnland werden die Herden des Schweinegesundheitsdienstes seit 1963 klinisch und mittels Rüsselquerschnitten bezüglich pRA überwacht. Für diese Studie wurden 5650 Kolostrumproben von 188 Herden mit einem neuen ELISA untersucht. Mittels diesem ELISA wurden Antikörper gegen das dermatonekrotische Toxin nachgewiesen. Gemäss Autor ist es einfacher, Antikörper im Kolostrum als im Serum nachzuweisen, da sie im Kolostrum in grösseren Mengen erscheinen. Zusätzlich wurden die Herden alle drei Monate klinisch beurteilt. Obwohl die Herden über eine lange Zeitspanne hinweg bezüglich pRA überwacht wurden, konnte bei dieser Untersuchung ein Bestand positiv getestet werden. Dieses Resultat wurde anhand eines Nachweises von toxinbildenden P. multocida in Nasentupferproben bestätigt. Es handeltete sich dabei um einen Betrieb, der Tiere aus einem pRAinfizierten Bestand zugekauft hatte. Im Moment des Zukaufs war der Betrieb jedoch schon längere Zeit frei von klinischen Anzeichen. Zusätzlich kam es zu schwach positiven Resultaten bei verschmutzten Kolostrum-Proben. Bei diesen konnten jedoch mittels Nasentupferproben keine toxinbildenden P. multocida gefunden werden. Ersteller : Riccarda Ursprung Datum : 22.09.04 Seite 1 von 6 Der Autor bewertet den ELISA für Kolostrum als gute Screening-Methode zur Herdenüberwachung bezüglich pRA. Anwendbarkeit eines ELISA-Testes für die Überwachung von Schweinebeständen auf Freiheit von progressiver Rhinitis atrophicans E. Bürgi et al. Gefunden auf aramis-research.ch (wurde nie als Paper veröffentlicht) Im Rahmen dieses Projektes sollte abgeklärt werden, ob sich der Nachweis von DNTAntikörper aus Kolostrumproben von Sauen mittels ELISA als Screeningtest zur SGDBestandesüberwachung eignen würde, und wie diese Methode im Vergleich zum Nachweis von toxinogenen Pasteurellen aus Nasentupfern von Absetzferkeln und Mastschweinen zu bewerten ist. In 20 ausgewählten Beständen wurden Kolostrumproben von Sauen gesammelt und Nasentupferproben von Absetzferkeln und/oder Mastschweinen entnommen. Total wurden 161 Nasentupferproben aus sechs pRA-verseuchten, 150 Proben aus fünf pRA-freien, und 162 Proben aus neun pRA-fraglichen (Folgebetriebe eines pRA verseuchten Remontierungsbetriebes, mit leicht- bis mittelgradigen Konchenatrophien bei Schlachtschweinen) Beständen genommen. In den pRA-verseuchten Beständen konnten in 44.1% der Proben toxinogene P. multocida festgestellt werden; 2.5% der Proben waren fraglich positiv. Keine toxinogenen Pasteurellen liessen sich in den Proben aus den pRAfreien und pRA-fraglichen Betrieben nachweisen. Von den 163 Kolostrumproben aus den pRA-Beständen reagierten 26.4% mit dem ELISA positiv und 2.4% fraglich. Von 292 Kolostrumproben aus pRA-freien oder –fraglichen Beständen reagierten 99.7% mit dem ELISA negativ und 0.3% positiv. Diese Untersuchung zeigt, dass sich eine pRA-Bestandesdiagnose am zuverlässigsten mit dem Nachweis von DNT aus Nasentupfern durchführen lässt. Im Sauenkolostrum lassen sich Antikörper gegen DNT nachweisen, jedoch sind die Titer meist tief und oft sind nur wenige Sauen pro Betrieb positiv. Würde die Überwachungsmethode mittels Kolostrum durchgeführt werden, müsste der Probenumfang wesentlich grösser sein als bei den Nasentupfern und es ist mit falsch positiven Ergebnissen, wenn auch in geringem Umfang (0.3%) zu rechnen. A specific and sensitive PCR assay suitable for large-scale detection of toxigenic Pasteurella multocida in nasal and tonsillar swabs specimens of pigs E. A. Kamp et al. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 8, 304-309 (1996) In Holland wird ein Zertifizierungsprogramm durchgeführt, bei welchem die Schweinherden drei Mal pro Jahr auf toxinbildende P. multocida untersucht werden. Wenn in zwei aufeinander folgenden Jahren keine entsprechenden Bakterien nachgewiesen werden und weitere Voraussetzungen erfüllt sind, erhält der Betrieb das Zertifikat –frei von toxinbildenden P. multocida-. Auf diese Weise fallen sehr viele Proben an, die jedes Jahr untersucht werden müssen. Deshalb wurde in dieser Studie eine PCR validiert, die viele Proben in kurzer Zeit bewältigen kann. Verglichen wurden der PCR-Test mit den beiden häufigsten Nachweismethoden, der Isolation auf selektivem Agar und der direkte Nachweis des Toxins mittels ELISA aus Primärkulturen. Als Primer für den PCR-Test wurden DNA-Sequenzen, die für das DNT kodieren, gewählt. Die Sensitivität des Tests wurde anhand von 346 Nasen- oder Tonsillentupferproben von neun Herden mit bekannten P. multocida Infektionen getestet. Die meisten Proben wurden mit allen drei Nachweismethoden negativ getestet. Aus 22 Proben konnte P. multocida bakteriologisch kultiviert werden. Mittels ELISA wurden 28 Proben positiv getestet und mittels PCR wurde bei 40 Tieren eine Infektion mit toxinbildenden P. multocida nachgewiesen. Zusätzlich wurden die 22 Proben, von denen P. Ersteller : Riccarda Ursprung Datum : 22.09.04 Seite 2 von 6 multocida kultiviert werden konnten, mittels ELISA und PCR getestet. Dabei waren alle Proben in der PCR positiv, mit dem ELISA aber nur 19. Daraus lässt sich schliessen, dass die PCR die sensitivste Methode dieser drei Tests ist. Die Spezifität wurde anhand von 372 Nasen- und Tonsillentupferproben aus Betrieben, die als frei von pRA galten, untersucht. Es wurden dabei weder P. multocida Stämme aus den Proben isoliert noch mittels ELISA nachgewiesen. Mit dem PCR-Test waren zwei Proben positiv. Diese zwei Proben stammen von zwei Tieren aus demselben Wurf und waren nur leichtgradig positiv. Aus diesen Resultaten wurde gefolgert, dass der PCR-Test sowohl hoch sensitiv als auch hoch spezifisch ist. Um falsch-negative Resultate wegen fehlerhafter DNA-Amplifikation zu vermeiden, wurde jeweils pro Testplatte eine positive Kontrolle mitgeführt. Es kann aber auch zu falsch-negativen Resultaten kommen, wenn die erforderliche DNA-Sequenz durch Nukleasen zerstört wurde oder bei der Probenreinigung verloren ging. Da die positive Kontrolle erst nach der Isolation der DNA von den Tupfern auf die Platte aufgetragen wurde, sind diese falsch-negativen Resultate nicht kontrolliert worden. Direct PCR analysis for toxigenic Pasteurella multocida C. A. Lichtensteiger et al. Journal of Clinical Microbiology 3035-3039, December 1996 Auch in diesem Versuch wurde ein direkter PCR-Test (ohne vorgängige Anzüchtung der Kolonien auf spezifischem Agar) für den Nachweis des toxA-Gens, welches für das dermatonekrotische Toxin codiert, erprobt. Damit der PCR-Test zugelassen werden konnte, musste nachgewiesen werden, dass er für das toxAGen spezifisch ist, für alle toxigenen P. multocida anwendbar und ausserdem sensitiv genug ist, um auch mit einer geringen Erregerzahl zu reagieren. Die toxA-Primer wurden in der PCR mit P. multocida M33 (toxinbildend) und P. multocida M29 (nichttoxinbildend) sowie mit mehreren Keimen, die im oberen Respirationstrakt vorkommen getestet. Dabei konnten nur DNA-Amplifikationen der M33 Proben festgestellt werden. Es kam zu keiner Reaktion mit M29, Bordetella bronchiseptica, A. pleuropneumoniae u. a.. Um die Genauigkeit des Tests zu bestimmen, wurden im Feld 40 Tupferproben gewonnen und zuerst vier anderen Untersuchungsmethoden unterzogen, um den Status der Toxinbildung zu ermitteln. Die Resultate der PCR-Analyse stimmten vollkommen mit den Resultaten aus den vorgängigen Tests überein, was für die Spezifität des PCR-Tests spricht. Mittels PCR-Test konnten P. multocida in Proben mit weniger als 100 Bakterien nachgewiesen werden. Diskutiert wurden falsch positive Resultate, die entstehen können, wenn mutierte nichtfunktionale toxA-Gene im PCR amplifiziert werden, die jedoch kein Toxin mehr bilden. In diese Untersuchung konnten jedoch keine PCR positiven Proben festgestellt werden, deren Bakterien nicht auch das dermatonekrotische Toxin bildeten. Enhanced detection of toxigenic Pasteurella multocida directly from nasal swabs using a nested Polymerase Chain Reaction C. Choi und C. Chae The Veterinary Journal 162, 255-258 (2001) Diese Studie wurde durchgeführt, da mittels der üblichen PCR-Methoden immer wieder Trägertiere unentdeckt blieben, weil in den gewonnenen Proben zu wenige Keime für den Nachweis vorhanden waren. Das heisst, dass die angewendete Nachweismethode zu wenig sensitiv war. Um dieses Problem zu lösen wurde eine verschachtelte PCR entwickelt, die es ermöglicht, kleinere Mengen an DNA-Fragmenten nachzuweisen. Bei der verschachtelten PCR werden die Produkte einer ersten PCR in eine zweite eingesetzt. Das Primerpaar der zweiten PCR liegt zwischen den Primern der ersten Reaktion. Dadurch werden falsche Amplifikationen der ersten PCR ausgesondert. Es wurden 23 Nasentupferproben von Schweinen gewonnen, die aus Herden stammen, von denen man weiss, dass sie mit toxinbildenden P. multocida infiziert sind. Die Kolonien wurden angezüchtet Ersteller : Riccarda Ursprung Datum : 22.09.04 Seite 3 von 6 und zur Identifizierung verschiedenen biochemischen Tests unterzogen. Zusätzlich wurden 70 Nasentupferproben mittels herkömlicher und verschachtelter PCR untersucht, ohne dass zuerst Kulturen angesetzt wurden. Um die Spezifität der PCR zu testen, wurden die Primer für verschiedene Keime eingesetzt (A. pleuropneumoniae, E. coli, Bordetella bronchiseptica, M. hyopneumoniae, PRRS Virus, PCV2 Virus). Um die Sensibilität der beiden PCR zu vergleichen, wurde die Konzentration der DNA-Fragmente der toxinbildenden P. multocida spektro-photometrisch bestimmt. Anschliessend wurde anhand der DNAMenge, die im Zellkern eines P. multocida Bakteriums vorhanden ist, die Anzahl Keime berechnet, die vorhanden sein muss, damit die PCR funktioniert. Bei der herkömlichen PCR ergab dies eine Mindestkeimzahl von 2.1 x 104 Organismen, während bei der verschachtelten PCR bereits 20 Keime nachgewiesen werden konnten (die genannte Mindestkeimzahl stimmt nicht überein mit dem Paper von C. A. Lichtensteiger et al., 1996, obwohl darauf Bezug genommen wird). Die Primer reagierten mit keinen anderen getesteten Bakterien oder Viren. Von den 70 Nasentupfern, welche nicht kultiviert wurden, waren 16 Proben in beiden PCR-Tests positiv und sechs Proben waren nur in der verschachtelten PCR positiv. Die 22 Produkte der positiven PCR wurden sequenziert und als toxA-Gene idenzifiziert. Die Resultate zeigten, dass die verschachtelte PCR gut geeignet ist, um toxinbildende P. multocida direkt von Nasentupfern nachzuweisen, ohne dass die Proben zuerst kultiviert werden müssen. Durch den Einsatz der verschachtelten PCR konnte die Sensitivität von 22.8% (16/70) auf 31.4% (22/70) gesteigert werden. Development of a typing system for epidemiological studies of porcine toxin-producing Pasteurella multocida ssp. multocida in Denmark V. Fussing et al. Veterinary Microbiology 65, 61-74 (1999) 1996 wurden in Dänemark von 179 Schweineherden Nasentupferproben zur bakteriologischen Untersuchung eingeschickt, wobei 32% der Herden positiv für toxinproduzierende P. multocida waren. Dies führte dazu, dass in dieser Studie für epidemiologische Untersuchungen verschiedenen Methoden wie Ribotypisierung, Kapseltypisierung, Phagentypisierung und Plasmidprofilierung zur Spezifizierung von P. multocida Stämmen getestet wurden. Die Kapseltypisierung ergab, dass die meisten toxinbildenden P. multocida vom Typ A waren. Dies entspricht nicht den Resultaten, wie sie in anderen Ländern gefunden wurden. Mittels Plasmidprofilierung und Ribotypisierung konnten 90% der Stämme nicht unterschieden werden. Bei der Phagentypisierung waren 39% der Stämme nicht typisierbar, die restlichen Stämme konnten in verschiedene Typen unterteilt werden. Aus anderen Untersuchungen ist bekannt, dass PhagenTypen sich in vivo innerhalb von 4-6 Monaten verändern können. Aus diesem Grund sollte diese Methode nur für epidemiologische Abklärungen angewendet werden, die innerhalb eines kurzen Zeitraumes durchgeführt werden. Die HindIII-Ribotypisierung stellt eine gut durchführbare Methode dar, obwohl die Ribotyp 2 Gruppe, welche 44% der Stämme umfasst, nicht weiter mit dieser Methode unterschieden werden kann. Keine der durchgeführten Untersuchungsmethoden konnte zwischen Isolaten aus Lungen- oder Nasentupferproben unterscheiden. Dieses Resultat zeigt, dass toxinbildende Stämme aus Lungenläsionen ebefalls die Nasenhöhlen befallen können und umgekehrt. Identische HindIIIRibotypen konnten ebenfalls in Holland, England und Amerika nachgewiesen werden. Dies wird einerseits mit dem Handel von Tieren aber auch mit der Erregerübertragung durch Vögel begründet. Characterization and comparison of Pasteurella multocida strains associated with porcine pneumonia and atrophic rhinitis R. L. Davies et al. Journal of Medical Microbiology 52 (1), 59-67 (2003) In dieser Studie wurden 158 Proben von Schweinen entnommen, die entweder an Pneumonien oder pRA erkrankt waren. Die Bakterien wurden anhand der Kapseltypen, Fehlen oder Vorhandensein des Ersteller : Riccarda Ursprung Datum : 22.09.04 Seite 4 von 6 toxA-Gens und anhand der Proteine der äusseren Membran (outer membran protein Omp) untersucht. Die Untersuchung zeigte, dass verschiedene Subpopulationen von P. multocida für die pneumonischen Erkrankungen und pRA verantwortlich sind (widerspricht der Aussage von V. Fussing et al., 1999). Bei Tieren, die an pRA erkrankt waren, fand man toxinbildende P. multocida vom Typ D mit Omp Typ 4.1 und Typ A und D mit dem Omp Typ 6.1. Bei Tieren, die an einer Lungenentzündung erkrankten, konnten keine toxinbildenden P. multocida nachgewiesen werden. Involviert waren P. multocida vom Typ A und D mit unterschiedlichen Omp Typen. Toxinbildende und nicht-toxinbildende P. multocida können anhand ihrer verschiedenen Omp Typen unterschieden werden. Aufgrund der Verbindung von P. multocida vom Typ A und D mit den selben Omp Typen, und dem Vorhandensein oder Fehlen von toxA-Genen in Keimen des selben Omp Typs wird angenommen, dass ein horizontaler Transfer von Genen, die für die Kapselsynthese codieren, und von toxA-Genen zwischen verschiedenen P. multocida Subpopulationen stattfindet. Die beiden folgenden Arbeiten beschäftigen sich ebenfalls mit der genotypischen Charakterisierung von P. multocida Stämmen. Beide Methoden basieren auf PCR-Techniken. Relatedness of Pasteurella multocida isolates evaluated by RAPD W. V. Giumaraes et al. Proceedings of the 18th IPVS Congress, Hamburg, 2004, Volume 1, 198 Die getesteten P. multocida Stämme wurden in verschiedenen Regionen Brasiliens bei klinisch erkrankten Schweinen gewonnen. Anhand der RAPD-Technik (random amplification of polymorphic DNA) wurden die Stämme genetisch analysiert. Dazu wurde die DNA in Fragmente aufgeteilt, diese amplifiziert und anschliessend mittels Gelelektrophorese dargestellt. Die Präsenz von einem oder mehreren gleichen Fragmenten bedeutet Ähnlichkeit zwischen den Stämmen. Im Durchschnitt unterschieden sich die Stämme in 52% des genetischen Materials. Die niedrigste Übereinstimmung lag bei 11%, die höchste bei 92%. Genotipic characterization of Pasteurella multocida strains using RAPD and AFLP R. Paixao et al. Proceedings of the 18th IPVS Congress, Hamburg, 2004, Volume 1, 204 Auch in dieser Studie wurden 97 Proben in verschiedenen Regionen Brasiliens gewonnen. Die Tiere zeigten Pneumonien, atrophische Rhinitis und Septikämie. Der Kapsel-Typ wurde bestimmt und das toxA-Gen wurde mittels PCR nachgewiesen. Zusätzlich wurden zwei weitere PCR-Techniken angewendet. Zum einen die bereits vorher erwähnte RAPD und zum anderen die AFLP (single enzyme amplified fragment length polymorphism), um die Isolate zu typisieren. Dabei zeigten die Typ A Stämme sehr hohe genetische Heterogenität. Es konnten aber trotzdem grosse genetische Ähnlichkeiten in Stämmen aus verschiedenen Regionen gefunden werden. Dies wird auf den Tierverkehr zurückgeführt. Zum Abschluss noch etwas exotisches. Computed Tomography - A powerful tool to track turbinate atrophy in pigs T. Magyar et al. Proceedings of the 18th IPVS Congress, Hamburg, 2004, 198 Ersteller : Riccarda Ursprung Datum : 22.09.04 Seite 5 von 6 Diese Arbeit wurde durchgeführt, um eine Alternative für das Rüsselsägen zu finden. Dazu wurden Ferkel im Alter von 4 und 8 Tagen künstlich mit toxinbildenden P. multocida Stämmen infiziert. Anschliessend wurden im Alter von 6, 10, 18, 23 und 27 Wochen CT-Bilder angefertigt. Die ersten Scans wurden 10 mm cranial des ersten Prämolaren und anschliessend alle 2 mm wiederholt. Diese Werte wurden im Laufe der Zeit an die Grösse der Versuchstiere angepasst. Die Veränderungen der Nasenmuscheln wurden in Scores von 0-4 eingeteilt und die Veränderungen des Nasenseptums in Scores von 0-2. Zum Schluss wurden die Werte addiert. Bereits im Alter von 6 Wochen konnten deutliche Veränderungen der Nasenmuscheln und des Septums nachgewiesen werden. Die errechneten Score-Werte nahmen jedoch bis ins Alter von 27 Wochen nicht mehr zu. Nach der Meinung des Autors eignet sich die Computertomographie gut, um bei pRA auftretende Rüsselveränderungen nachzuweisen, ohne dass dazu Tiere geschlachtet werden müssen. Ersteller : Riccarda Ursprung Datum : 22.09.04 Seite 6 von 6
