Dissertation_N.Rückert
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Aus dem Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Charakterisierung von caninen und felinen Parvoviren in archiviertem Organmaterial aus den Jahren 1970 bis 1978 Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Nicola Rückert aus Bochum Leipzig, 2007 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. Karsten Fehlhaber Betreuer: Prof. Dr. Uwe Truyen Gutachter: 1.Gutachter: Prof. Dr. Uwe Truyen Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig 2.Gutachter: Prof. Dr. Volker Moennig Institut für Virologie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 3.Gutachter: Prof. Dr. Heinz-Adolf Schoon Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Tag der Verteidigung: 16.01.2007 Für meine Eltern In Liebe und Dankbarkeit Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung............................................................................................................ 1 2 Literaturübersicht .............................................................................................. 2 2.1 Entdeckung des CPV-2 als Pathogen ........................................................... 2 2.2 Pathogenese, Klinik und Pathologie einer Infektion mit CPV/ FPV ............... 3 2.3 Taxonomie der Parvoviren ............................................................................ 5 2.4 Das Genus Parvovirus .................................................................................. 6 2.5 Morphologie .................................................................................................. 7 2.6 Genomorganisation....................................................................................... 9 2.7 Replikation .................................................................................................. 11 2.8 Wirtsspektren von CPV und FPV ................................................................ 13 2.9 Transferrinrezeptor ..................................................................................... 14 2.10 Evolutionäre Mechanismen des Caninen Parvovirus .................................. 15 2.11 Theorien zur Entstehung des CPV ............................................................. 19 3 Material und Methoden .................................................................................... 21 3.1 Material ....................................................................................................... 21 3.1.1 Probenauswahl .................................................................................... 21 3.2 Methoden .................................................................................................... 22 3.2.1 Probennahme ...................................................................................... 22 3.2.2 Aufreinigung der Proben ...................................................................... 22 3.2.3 Auswahl der Oligonukleotide ............................................................... 22 3.2.4 Polymerase-Kettenreaktion ................................................................. 25 3.2.5 Agarose-Gel-Elektrophorese ............................................................... 28 3.2.6 Klonieren der PCR-Amplifikate in Escherichia coli............................... 29 3.2.7 Aufreinigung der PCR-Produkte .......................................................... 30 3.2.8 Sequenzierung der PCR-Amplifikate ................................................... 30 3.2.9 Bearbeitung und Analyse der Sequenzen ........................................... 31 3.2.10 Tierartspezifische PCR ........................................................................ 33 3.2.11 Immunhistochemie............................................................................... 33 4 Ergebnisse........................................................................................................ 34 4.1 Probenauswahl ........................................................................................... 34 4.2 Sensitivität der PCR .................................................................................... 34 4.3 Nachweis der parvoviralen DNA ................................................................. 35 4.4 Ergebnisse der PCR zur vollständigen Sequenzierung des VP2-Gens ...... 36 4.5 Ergebnisse der Immunhistochemie und der tierartspezifischen PCR ......... 39 4.6 Sequenzanalyse ......................................................................................... 40 4.6.1 Sequenzierung..................................................................................... 40 4.6.2 Sequenzanalyse der Hunde- und Katzenproben ................................. 40 5 Diskussion ........................................................................................................ 46 5.1 Nachweismethoden .................................................................................... 46 Inhaltsverzeichnis 5.2 5.3 Sequenzanalyse ......................................................................................... 47 Abschließende Betrachtung ........................................................................ 49 6 Zusammenfassung .......................................................................................... 50 7 Summary........................................................................................................... 52 8 Literaturverzeichnis ......................................................................................... 54 9 Anhang.............................................................................................................. 62 9.1 Chemikalien und Reagenzien ..................................................................... 62 9.2 Tabellen ...................................................................................................... 63 9.3 Verwendete Codes ..................................................................................... 73 9.4 Vergleich der Parvovirussequenzen aus den Katzengeweben mit der Referenzsequenz FPV-b ....................................................................................... 75 10 Danksagung ..................................................................................................... 88 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis A Adenin Ala Alanin Arg Arginin AS Aminosäure Asn Asparagin Asp Aspartat bp Basenpaare BFPV Polarfuchs-Parvovirus (blue fox parvovirus) C Cytosin CPV canines Parvovirus DNA Desoxyribonukleinsäure (Desoxyribo-nucleid-acid) dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat ds doppelsträngig (double-stranded) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FPV felines Panleukopenie-Virus G Guanin g Gramm Gly Glycin Ile Isoleucin ITR inverted terminal repeats IZKF Interdisziplinäres Zentrum für klinische Universität Leipzig kD Kilo-Dalton Leu Leucin Lys Lysin M Molar Met Methionin MEV Nerz-Enteritis-Virus (mink enteritis virus) min Minuten ml Milliliter mM Millimol Forschung der Abkürzungsverzeichnis mRNA messengerRNA (Boten-RNA) g Mikrogramm l Mikroliter nm Nanomol NS1 Nichtstrukturprotein1 NS2 Nichtstukturprotein2 NS3 Nichtstrukturprotein3 Nt Nukleotid OD Optische Dichte ORF Leserahmen (open reading frame) PCR Polymerase Kettenreaktion pg Pikogramm pmol Pikomol RDPV Marderhund-Parvovirus (raccoon dog parvovirus) RNA Ribonukleinsäure (Ribo-nucleid-acid) RPV Waschbär-Parvovirus (raccoon parvovirus) Ser Serin ss einzelsträngig (single-stranded) Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan Tyr Tyrosin UV ultraviolettes Licht V Volt Val Valin VP1 Virusstrukturprotein1 VP2 Virusstrukturprotein2 VP3 Virusstrukturprotein3 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1:Die Familie der Parvoviridae* ......................................................... 6 Tabelle 2: Oligonukleotide ............................................................................ 24 Tabelle 3: Zyklusbedingungen für die Oligonukleotide M1RE+M2RE .......... 26 Tabelle 4: Reaktionskomponenten des PCR Master Mix mit Volumen und Konzentrationsangaben ........................................................................ 26 Tabelle 5: Reaktionskomponenten des Taq PCR Core Kit mit Volumen und Konzentrationsangaben ........................................................................ 27 Tabelle 6: Viursisolate mit Angabe der Genbank-Nummern, Referenz, Herkunft und Jahr der Isolierung ........................................................... 32 Tabelle 7: Parvovirus-positive Hundeproben (1970-1978) ........................... 37 Tabelle 8: ausgewählte Parvovirus-positive Katzenproben (1970-1978) ..... 38 Tabelle 9: Nukleotid- und Aminosäurenunterschiede im VP2-Gen aller Katzenproben im Vergleich mit FPV-b .................................................. 42 Tabelle 10: Sequenzübereinstimmungen der Parvovirussequenzen der Katzenproben untereinander sowie mit FPV-b und CPV-d in Prozent .. 44 Tabelle 11: Ausgewählte Proben (Hunde und Katzen) von 1980 –1970 ...... 63 Tabelle 12: Ausgewählte Proben anderer Tierarten ..................................... 66 Tabelle 13: Parvovirus-positive Proben bei Hunden (1970-1980) ................ 67 Tabelle 14: Parvovirus-positive Proben bei Katzen (1970-1980) ................. 69 Tabelle 15: Parvovirus-positive Proben anderer Tierarten: Waschbär ......... 72 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: elektronenmikroskopische Aufnahme des caninen Parvovirus . 7 Abbildung 2: Schematische Darstellung des strukturellen Aufbaus des Viruskapsids autonomer Parvoviren ....................................................... 8 Abbildung 3: Kapsidstruktur (CPV/FPV) mit eingezeichneter Dreiecksuntereinheit (PARRISH u. HUEFFER 2006) ............................. 9 Abbildung 4: Replikation autonomer Parvoviren. Modifiziert nach COTMORE und TATTERSALL (1987) ..................................................................... 12 Abbildung 5: Schema der Entstehung des caninen Parvovirus. Modifiziert nach HUEFFER et al. (2004) ................................................................ 16 Abbildung 6: Asymmetrische Untereinheit des CPV Kapsid mit Darstellung der Lokalisation substituierter Aminosäuren auf der Kapsidoberfläche (SHACKELTON et al. 2005a)................................................................ 17 Abbildung 7: Verdünnungsreihe der Plasmid-DNA (von 10-4 bis10-13) ......... 35 Abbildung 8: PCR-Amplifikate der Oligonukleotide M1RE+M2RE ................. 36 Abbildung 9: PCR-Amplifikate der Oligonukleotidpaare A(f/r), A0(f/r),A1(f/r), A2(f/r), A3(f/r), A4(f/r), B(f/r), B1(f/r) (Hundeprobe 464 aus dem Jahr 1978) ..................................................................................................... 38 Abbildung 10: Fortsetzung Abbildung 9; PCR-Amplifikate der Oligonukleotidpaare B1(f/r), B2(f/r), B3(f/r), B4(f/r), B5 (f/r), C(f/r), C1(f/r), M(f/r) (Hundeprobe 464 aus dem Jahr 1978) ........................................ 39 Einleitung 1 Einleitung Das canine Parvovirus (CPV-2) trat erstmals 1978 in den Hundepopulationen auf und verbreitete sich weltweit in einer schweren Pandemie. Die Infektion mit CPV-2 führte zu einer akuten Gastroenteritis und wies eine hohe Mortalität bei Hundewelpen auf. Die pathologischen Befunde und die klinischen Erscheinungen der Erkrankung waren dem Erkrankungsbild einer Infektion mit dem Felinen Panleukopenie-Virus (FPV) sehr ähnlich. Die vermutete nahe Verwandtschaft des neu aufgetretenen CPV-2 mit FPV wurde aufgrund genetischer und antigener Untersuchungen schnell nachgewiesen. Ein bis zwei Jahre nach dem ersten Auftreten des caninen Parvovirus verdrängte eine neue antigene Variante (CPV-2a) das CPV-2 vollständig aus den Hundepopulationen. Im Gegensatz zu CPV-2 ist diese Variante in der Lage neben Hunden, auch Katzen zu infizieren. Ab 1984 trat eine weitere antigene Variante (CPV-2b) auf, die zusammen mit CPV-2a in den Hundepopulationen bis heute koexistiert. Die Unterschiede im Wirtsspektrum von FPV und CPV-2 basieren auf nur wenigen kodierenden Nukleotidaustauschen im VP2-Gen. Aufgrund der Aminosäureveränderungen im Kapsidprotein (VP2) kommt es zu einer strukturellen Veränderung des Viruskapsids und zu einer Änderung wesentlicher biologischer Eigenschaften des Virus. Die Entstehung des CPV-2 konnte bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Retrospektiv wird angenommen, dass sich das canine Parvovirus aus dem Felinen Panleukopenie-Virus oder einem nahe verwandten Virus entwickelt hat. Neuere Studien, welche die Substitutionsraten von CPV-Sequenzen untersuchten, berechneten, dass CPV-2 bereits 10 Jahre vor 1978 in den Hundepopulationen vorgekommen sein musste. Basierend auf dieser Vermutung war es das Ziel dieser Arbeit CPV-2 aus archivierten Gewebeproben von Hunden und Katzen aus den Jahren 1970 bis 1978 zu isolieren, um einen möglichen Anzestor des caninen Parvovirus unter den frühen Isolaten des Virus zu identifizieren. 1 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2 Literaturübersicht 2.1 Entdeckung des CPV-2 als Pathogen In den späten 1970er Jahren wurde eine zum ersten Mal aufgetretene Infektionserkrankung bei Hundewelpen beschrieben, die eine akute infektiöse Gastroenteritis verursachte und eine hohe Mortalität aufwies. Diese Erkrankung breitete sie sich weltweit in einer schweren Pandemie bei Hunden aus (PARRISH 1990b). Die Darmerkrankung war nach histopathologischen Untersuchungen und den klinischen Erscheinungen dem Erkrankungsbild des felinen PanleukopenieVirus bei Katzen sehr ähnlich. Eine Verwandtschaft zum FPV wurde durch genetische (PARRISH et al. 1988a; TRUYEN et al. 1995b) und antigene Untersuchungen (PARRISH et al. 1982a; PARRISH u. CARMICHAEL 1983) in den folgenden Jahren nachgewiesen. In den ersten Jahren der Ausbreitung des caninen Parvovirus wurde auch eine bei Hundewelpen auftretende Myokarditis mit dieser Infektion in Zusammenhang gebracht (LENGHAUS u. STUDDERT 1980). Die erste publizierte Isolierung des caninen Parvovirus erfolgte 1978 in den USA (APPEL et al. 1979). Auch in Europa (BURTONBOY et al. 1979; OSTERHAUS et al. 1980), Australien (KELLY 1978), Canada (GAGNON u. POVEY 1979), Japan (AZETAKA et al. 1981) und Neuseeland (HORNER et al. 1979) erfolgten Nachweise. Innerhalb kürzester Zeit infizierte CPV weltweit sowohl wilde, als auch domestizierte Caniden. Um das Virus von dem früher beschriebenen caninen Parvovirus, dem canine minute virus (CnMV/CPV-1), unterscheiden zu können, wurde es als CPV-2 bezeichnet. Der erste Nachweis von caninen Parvoviren erfolgte retrospektiv in Griechenland durch den Nachweis von CPV-Antikörpern in einer Hundeprobe aus dem Jahr 1974 (KOPTOPOULOS et al. 1986c). Auch Untersuchungen von Hundeproben aus Belgien und den Niederlanden aus dem Jahr 1976/77 wiesen Antikörper gegen das CPV nach (OSTERHAUS et al. 1980). Neuere Studien, welche die Substitutionsraten von CPV-Isolaten untersuchten, vermuten, dass CPV2 bereits 10 Jahre vor 1978 in den Hundepopulationen vorgekommen sein musste (SHACKELTON et al. 2005e). Ein bis zwei Jahre nach dem ersten Auftreten des CPV-2 wurde eine neue antigene Variante (CPV-2a) beschrieben, die das CPV-2 in den folgenden Jahren vollständig verdrängte (PARRISH et al. 1985c; PARRISH et al. 1988c; PARRISH 1991b). Ab 1984 verbreitete sich in den Populationen eine 2 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. weitere Variante (CPV-2b). In den USA ersetzte CPV-2b den vorherigen Typ CPV2a fast vollständig (PARRISH et al. 1991c). Das Wirtsspektrum des CPV-2, das sich auf Hunde beschränkte, wurde durch die neuen anitgenen Varianten erweitert. So besitzen diese die Fähigkeit sowohl Hunde als auch Katzen zu infizieren. Neuere Studien berichten von weiteren antigenen Varianten. Eine dieser Varianten scheint sich in Vietnam und Taiwan bei Leopardenkatzen (IKEDA et al. 1999; MIYAZAWA et al. 1999; IKEDA et al. 2000a; NAKAMURA et al. 2004a), eine andere in Italien in den Hundepopulationen auszubreiten (BUONAVOGLIA et al. 2001a; MARTELLA et al. 2004). Grundlage für die Unterschiede zwischen FPV und CPV sowie seinen antigenen Varianten bilden wenige Aminosäurenaustausche im Viruskapsid (vgl. Punkt 2.10). 2.2 Pathogenese, Klinik und Pathologie einer Infektion mit CPV/ FPV Die Infektion mit dem caninen Parvovirus führt zu einer schweren Allgemeinerkrankung, die eine hohe Mortalität aufweist. Sie stellt eine zyklisch verlaufende Allgemeininfektion dar. Das Virus wird oral aufgenommen und vermehrt sich in den ersten 1-3 Tagen zunächst in dem lymphatischen Gewebe des Nasopharynx, insbesondere den Tonsillen (CSIZA et al. 1971c; CARMAN u. POVEY 1982; POLLOCK 1982; MACARTNEY et al. 1984c). In der nachfolgenden virämischen Phase gelangt das Virus zu den Zielorganen: Thymus, Knochenmark, Mesenteriallymphknoten, Milz, Peyer’sche Platten und Darmepithel (CSIZA et al. 1971b; CARLSON et al. 1977; MACARTNEY et al. 1984b; MEUNIER et al. 1985b). Die Annahme, dass eine Infektion der Lymphozyten der Peyer’schen Platten auch direkt via M-Zellen erfolgen könnte (CARMAN u. POVEY 1985), wurde durch Studien widerlegt, die den Beginn der Infektion primär in den pharyngealen Lymphozyten nachwiesen (PETERS 1996). 3-5 Tage post infectionem infiziert das Virus die Epithelvorläuferzellen in den Lieberkühnschen Krypten und es kommt zu einer massiven Zerstörung der Darmepithelzellen. Histopathologisch zeigt sich das typische Bild einer Zottenatrophie vor allem im Ileum und im Jejunum (COOPER et al. 1979; MACARTNEY et al. 1984a). Histologisch lassen sich intranukleäre 3 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Einschlusskörperchen nachweisen. Der Grad und die Schwere der Infektion sind zum Teil durch die Erneuerungsrate der intestinalen Epithelzellen bestimmt (CARLSON u. SCOTT 1977). Koinfektionen mit Darmparasiten oder Bakterien wie Rota- und Coronaviren sind möglich und verschlimmern den Krankheitsverlauf. Pathologisch-anatomisch ist eine akute katarrhalische bis fibrinös-hämorrhagische Gastroenteritis nachweisbar. Klinisch zeigen die Tiere vor allem starken, wässrig-blutigen Durchfall, häufiges Erbrechen sowie Anorexie, Fieber und Depression. Eine Infektion mit CPV und FPV kann jedoch auch mild oder subklinisch verlaufen (PARRISH et al. 1982b). Obwohl CPV Zellen des Knochenmarks infiziert (MACARTNEY et al. 1984d; MEUNIER et al. 1985a; TRUYEN u. PARRISH 1992a), kommt es bei Hunden im Vergleich mit einer FPV-Infektion bei Katzen eher zu einer relativen Lymphopenie. Ursächlich dafür könnte sein, dass CPV und FPV unterschiedliche Zielzellen im Kochenmark infizieren (PARRISH 2006). 4-6 Tage post infectionem beginnt die Ausscheidung des Virus über den Kot. Die Pathogenese sowie das klinische Erscheinungsbild stimmten weitgehend mit der Infektion von Katzen mit FPV überein. Pathologisch-anatomisch kommt es hier zu einer akuten katarrhalischen bis fibrinösen Enteritis. Der starke Befall der Stammzellen im Knochenmark führt zu einer Panleukopenie. Bei einer diaplazentaren Infektion der Katzenwelpen mit dem Virus kommt es zum klinischen Erscheinungsbild der felinen Ataxie (KILHAM et al. 1971; CSIZA et al. 1971a). Klinisch zeigen die Katzen neben der Ataxie auch Hypermetrie und Koordinationsstörungen. Ursache ist eine durch das Virus hervorgerufene Kleinhirnhypoplasie. Eine Infektion neugeborener Hundewelpen mit CPV kann eine cerebelläre Erkrankung verursachen (SCHATZBERG et al. 2003). Charakteristisches Anzeichen einer frühen Infektion mit CPV bei Hundewelpen ist eine Myokarditis. Diese besondere Verlaufsform der caninen Parvovirose kann bei Infektion innerhalb der ersten Lebenstage bei immunologisch naiven Welpen auftreten. Es kommt zu kardialen Arrythmien, Dyspnoe und zum plötzlichen Tod der zwei bis acht Wochen alten Welpen (HAYES et al. 1979). Da die Myokardzellen zum Zeitpunkt der Infektion noch mitotisch aktiv sind, stellen sie aufgrund des Tropismus des Virus zu teilungaktiven Zellen ein Zielorgan dar. Es kommt zu multifokalen Nekrosen der Myokardzellen. Oft können histologisch intranukleäre 4 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Einschlusskörperchen nachgewiesen werden. Die Lungen sind sekundär infolge der Herzschäden ödematös verändert. Diese Verlaufsform kommt allerdings aufgrund der Durchseuchung der Populationen bzw. Impfungen und den damit vorhandenen maternalen Antikörpern nur noch selten vor. Lebendimpfstoffe gegen das CPV wurden frühzeitig entwickelt. Aufgrund der engen Verwandtschaft zwischen FPV und CPV wurde anfangs ein attenuiertes FPV in hohen Dosen eingesetzt, das beim Hund eine Wirksamkeit zeigte. Später erfolgte der Einsatz eines CPV-spezifischen Lebendimpfstoffes. Erkrankungen durch Infektion mit CPV kommen meistens nur noch als Einzelerkrankungen vor. Insbesondere die Welpen erkranken, welche zum Zeitpunkt der Impfung hohe maternale Antikörpertiter aufweisen. Die noch vorhandenen Antikörper neutralisieren das Impfvirus, so dass es nicht zu einer durch das Impfvirus induzierten Immunität kommen kann. Durch die Entwicklung wirksamer Lebendimpfstoffe konnte der seuchenhafte Charakter der Erkrankung wirksam bekämpft werden. 2.3 Taxonomie der Parvoviren Die Familie der Parvoviridae (parvus (lat.) = klein) wird in zwei Subfamilien unterteilt. Die in der Subfamilie Densovirinae zusammengefassten Viren infizieren ausschließlich Arthropoden und sind veterinärmedizinisch ohne Bedeutung. Die Subfamilie der Parvovirinae repräsentiert alle Parvoviren, die bei Vertebraten vorkommen. Die Klassifizierung erfolgt in drei Genera: Dependovirus, Erythrovirus und Parvovirus. Viren des Genus Dependovirus benötigen für ihrer Replikation sogenannte Helferviren wie z.B. Adeno- oder Herpesviren (MCPHERSON et al. 1982). Die Genera Erythrovirus und Parvovirus dagegen repräsentieren Viren, die keine Helferviren benötigen und daher auch als autonome Parvoviren bezeichnet werden. Im Genus Erythrovirus ist das für den Menschen pathogene Parvovirus B19 klassifiziert. Dieses Virus zeichnet sich durch einen hohen Tropismus zu erythroiden Vorläuferzellen aus. Das Genus Parvovirus repräsentiert alle tierpathogenen Parvoviren. Einen Überblick der taxonomischen Einteilung gibt Tabelle 1. 5 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 1: Die Familie der Parvoviridae* Subfamilie Genus Spezies Wirt Parvovirinae Parvovirus Minute virus of mice (MVM) Maus Feline panleukopenia virus Stämme: Feline panleukopenia virus Katze - Canine parvovirus Hund - Raccoon parvovirus Waschbär - Mink enteritis virus (MEV) Nerz H-1 parvovirus Nager Kilham rat virus (KVR) Ratte LuIII virus Maus Mouse parvovirus 1 (MPV-1) Maus Porcine parvovirus Schwein Adeno-associated virus (AAV1-5) Mensch Avian adeno-associated virus (AAAV) Huhn Bovine adeno-associated virus (BAAV) Rind Duck parvovirus (DPV) Ente Goose parvovirus Gans Canine adeno-associated virus (CAAV) Hund Equine adeno-associated virus (EAAV) Pferd Ovine adeno-associated virus (OAAV) Schaf Erythrovirus Human parvovirus B19 Mensch Amdovirus Aleutian mink disease virus (AMDV) Nerz Bocavirus Bovine parvovirus type 1 (BPV-1) Rind Dependovirus Densovirinae - Canine minute virus (CnMV) Hund Densovirus1 Junonia coenia densovirus Schmetterling Iteravirus1 Bombyx mori Densovirus Seidenspringer Brevidensovirus Aedes aegypti Densovirus Stechfliege Pefudensovirus Periplaneta fuliginosa Densovirus Schabe * Modifiziert nach (TATTERSALL 2006) 1 exemplarisch jeweils nur ein Vertreter aufgeführt 2.4 Das Genus Parvovirus Das canine Parvovirus (CPV-2), feline Panleukopenie-Virus (FPV) und eine weitere Anzahl FPV-ähnlicher Viren wie das Nerz-Enteritis-Virus (MEV, mink enteritis virus), 6 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Marderhund-Parvovirus (RDPV, raccoon dog parvovirus), Waschbär-Parvovirus (RPV, raccoon parvovirus) und das Polarfuchs-Parvovirus (BFPV, blue fox parvovirus) führen alle zu einem ähnlichen Krankheitsbild bei der jeweiligen Spezies und weisen auf DNA-Ebene eine Homologie von über 98% auf (REED et al. 1988; MARTYN et al. 1990; PARRISH 1991c). Das canine minute virus (CnMV bzw. CPV-1; (BINN et al. 1970)) wurde 1967 aus einem Hund isoliert und in die Subfamilie der Parvovirinae eingeordnet. Das als CPV-1 bezeichnete Virus weist zu dem später entdeckten CPV-2 keine genetische Ähnlichkeit auf (MACARTNEY et al. 1988; MOCHIZUKI et al. 2002) und ist eher verwandt mit dem bovinen Parvovirus Typ-1 (SCHWARTZ et al. 2002). Das Virus wird mit Fruchtbarkeitsstörungen und Welpenerkrankungen in Zusammenhang gebracht (CARMICHAEL et al. 1991; CARMICHAEL et al. 1994). 2.5 Morphologie Parvoviren sind kleine unbehüllte Viren, die im Durchschnitt 18-26nm groß sind. Aufgrund der fehlenden Hülle besitzen sie eine hohe Tenazität in der Außenwelt. Das Virus ist bei pH-Werten zwischen pH 3 bis pH 9 und Temperaturen bis 56°C stabil (SIEGL et al. 1985). Abbildung 1: elektronenmikroskopische Aufnahme des caninen Parvovirus Das Genom ist von einem Kapsid umgeben, das sich aus 60 Kopien der Strukturproteine VP1 und VP2 zusammensetzt (TSAO et al. 1991a). Diese liegen im Kapsid in einem Verhältnis von 1:10 vor. Aufgeklärt wurde die Kapsidstruktur von CPV-2 und FPV mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse (TSAO et al. 1991b; 7 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. AGBANDJE et al. 1993b; LLAMAS-SAIZ et al. 1996a; SIMPSON et al. 2000; GOVINDASAMY et al. 2003). Die oberflächliche Struktur des Viruskapsids bildet einen Ikosaeder, der 20 Flächen und 12 Ecken besitzt. Auf die Flächen lassen sich 60 identische gleichseitige Dreiecke projizieren. Jede Dreiecksuntereinheit ist aus Teilen der Proteinkette des VP2 zusammengesetzt. Es wird ein fassförmiges Faltungsmuster gebildet, das aus acht anitparallelen ß-Faltblattsträngen besteht. Die Verbindung dieser Stränge erfolgt durch große ineinandergreifende Schleifen. Diese als „loops“ bezeichneten Schleifen befinden sich auf der Kapsidoberfläche und werden durch zahlreiche nichtkovalente Bindungen stabilisiert. Dadurch erklärt sich die hohe Stabilität des Kapsids. Durch die Anordnung der Dreiecke kommt es zur Ausbildung verschiedener Symmetrieachsen. Es werden 2x-Achsen, 3x-Achsen und 5x-Achsen unterschieden (Abb. 2). 5x-Achse Canyon Three-fold-spike 3x-Achse Dimple Three-fold-spike 2x-Achse 3x-Achse Abbildung 2: Schematische Darstellung des strukturellen Aufbaus des Viruskapsids autonomer Parvoviren Die 5x-Achse besitzt eine zylinderartige Form, ist hervorgehoben und von einer kreisförmigen Vertiefung, dem sogenannten „canyon“, umgeben. Die 2x-Achse wird von einer Einkerbung durchzogen, die als „dimple“ bezeichnet wird und die 3xAchse bildet eine Erhebung den „Three-fold-spike“(AGBANDJE et al. 1993a). 8 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Eine weitere Struktur zwischen „Canyon“ und „Dimple“ am Rande des „Three-foldspike“ wird als Schulter des „Dimple“ bezeichnet (STRASSHEIM et al. 1994d). 5x-Achse 3x-Achse Abbildung 3: Kapsidstruktur (CPV/FPV) mit eingezeichneter Dreiecksuntereinheit (PARRISH u. HUEFFER 2006) Die Strukturen um den „Three-fold-spike“ sind von besonderem Interesse. Studien ergaben, dass diese an den zellulären Transferrinrezeptor binden und für die Kontrolle des Wirtsspektrums ausschlaggebend sind (PALERMO et al. 2003b; HUEFFER u. PARRISH 2003b). Auf die Lage wichtiger Aminosäuren bzw. Veränderungen von Aminosäuren an den oben genannten Regionen bei FPV, CPV-2 und den neuen antigenen Varianten CPV-2a und 2b wird im Rahmen der Evolution des caninen Parvovirus ausführlich in Punkt 2.10 eingegangen. 2.6 Genomorganisation Parvoviren besitzen ein einzelsträngiges lineares DNA-Genom von ungefähr 5000 Basen Länge (COTMORE u. TATTERSALL 1987). Das Genom codiert für die Strukturproteine VP1 und VP2 sowie für drei Nichtstrukturproteine (NS1, NS2 und NS3). Es sind zwei große offene Leserahmen („open reading frame“, ORF) vorhanden. Am 3’-Ende des Genoms befindet sich der rechte ORF, der für die 9 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Strukturproteine codiert. Die Informationen für die Nichtstrukturproteine sind im linken ORF enthalten, der sich am 5’-Ende befindet. Innerhalb des linken ORF ist ein weiterer kleinerer Leserahmen verankert. Die Nichtstrukturproteine werden durch alternatives Spleißen prozessiert, bei dem der gleiche Genomabschnitt in verschiedenen Leserastern abgelesen wird. Die gespleißten und ungespleißten Transkripte dienen als mRNA für die anschließende Translation. Die genetischen Informationen des VP2 sind vollständig im VP1 enthalten. Damit eine mRNA für das VP2 transkribiert wird, ist ein „Splice“-Schnitt erforderlich. Durch diesen erfolgt die Translation nicht vom ersten Startcodon sondern vom zweiten Startcodon aus (COTMORE u. TATTERSALL 1987). Findet die Translation vom ersten Startcodon aus statt, entsteht das am aminoterminalen Ende um 143 Aminosäuren längere VP1. Ein drittes als VP3 bezeichnetes Protein entsteht durch proteolytische Spaltung des VP2 am aminoterminalen Ende (TULLIS et al. 1992). Die Funktion ist nicht genau geklärt. Das Spleißen und das Ablesen des Genoms in verschiedenen Leserastern ermöglichen den Parvoviren ihre gesamte Erbinformation auf dem sehr kleinen Genom unterzubringen. (PARRISH 1990a). Die Funktion der Nichtstrukturproteine ist noch nicht eindeutig geklärt. Am meisten ist über das NS1 bekannt, das eine Nickase-, Helikase- und ATPase Aktivität besitzt und bei der Replikation wichtig für die Auflösung der sogenannten „hairpin“Strukturen ist (WILSON et al. 1991). Das NS2 ist am Besten bei dem Minute Virus of Mice untersucht worden, bei dem es eine entscheidende Rolle für eine effiziente Translation spielt (NAEGER et al. 1993). Ebenso wird es bei der Kapsidbildung benötigt (COTMORE et al. 1997a; COTMORE et al. 1997b). Die Strukturproteine VP1 und VP2 bilden die Oberfläche des Kapsids und besitzen eine besondere Bedeutung im Hinblick auf das Wirtszellspektrum (vgl. Punkt 2.9). Insbesondere das VP2 bestimmt neben der Wirtsspezifität auch andere biologische Unterschiede bei verschiedenen Parvoviren. Ein Austausch weniger Aminosäuren in diesem Strukturprotein ist dafür verantwortlich, dass sich genetische und antigene Eigenschaften verändern (PARRISH et al. 1991b; TRUYEN et al. 1995c). 10 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.7 Replikation Die Replikation der Parvoviren ist abhängig von der S-Phase der Wirtszelle, da die Viren auf zelluläre Replikationskationsmechanismen angewiesen sind. Während der S-Phase in der Mitose werden DNA-Polymerasen exprimiert, welche für die Synthese des komplementären Stranges zur Doppelstrang-DNA des Virus benötigt werden. Parvoviren besitzen deshalb einen ausgeprägten Tropismus zu mitotisch aktiven Zellen. Die Viruskapside binden an den Transferrinrezeptor und gelangen relativ schnell in die Zelle mit einem anschließenden langsameren Transport innerhalb des endosomalen Systems (VIHINEN-RANTA et al. 2000; PARKER u. PARRISH 2000; VIHINEN-RANTA et al. 2002). Die im Zellkern stattfindende DNA-Replikation wird mit einem „rolling-hairpin“-Modell erklärt (COTMORE u. TATTERSALL 1987; COTMORE et al. 1995). Besondere Bedeutung besitzen die palindromischen Sequenzen, die sich am 3’- und 5’-Ende des Genoms befinden. Diese auch als ITR-Regionen (inverted terminal repeats) bezeichneten Strukturen (ASTELL et al. 1985) bilden Y- (3’-Ende) bzw. T-förmige (5’-Ende) doppelsträngige Sekundärstrukturen aus. Der „hairpin“ am 3’-Ende dient der DNA-Polymerase als Primer. Die Synthese erfolgt in Richtung 5’-Ende mit anschließender Ligation zum geschlossenen Genom. Durch die Nickase-Aktivität des NS1-Proteins wird das Genom an einer sequenzspezifischen Stelle wieder aufgespalten und die DNA-Synthese wird entlang der Matrize fortgesetzt. Auf diese Weise entsteht ein doppelsträngiges DNA-Molekül doppelter Genomlänge. Dieses wird in zwei intermediäre Formen getrennt, die am 5’-Ende verlängert werden. Eines dieser beiden Intermediate kann für einen weiteren Replikationszyklus eingesetzt werden. Das andere liefert den Minus-Strang, der in das Viruskapsid verpackt wird (s.Abb.4). 11 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 4: Replikation autonomer Parvoviren. Modifiziert nach (COTMORE u. TATTERSALL 1987) ABa, EFf : palindromische Sequenzen 1)“hairpin”-Struktur am 3’-Ende dient als Primer 2)Amplifikation mittels zellulärer Polymerase 3)Ligation 4)Auftrennen der zirkulären DNA durch Nickase-Aktivität des NS1 5) bis 7)Bildung eines doppelsträngiges DNA- Molekül 8)Spaltung, Ligation und Verlängerung des DNA-Moleküls 9)Bildung von zwei Intermediärprodukten 10)Verpackung des Minus-Strangs in das Kapsid 11)Virion mit noch angehefteten NS1 12 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.8 Wirtsspektren von CPV und FPV Das Wirtsspektrum von CPV und FPV in vivo und in vitro ist sehr unterschiedlich. In felinen Zelllinien repliziert FPV in vitro und infiziert Katzen in vivo. In caninen Zelllinien erfolgt keine Replikation. Bei Hunden, die mit FPV experimentell infiziert wurden, erfolgt eine Replikation im Thymus und im Knochenmark ohne Krankheitsanzeichen (TRUYEN u. PARRISH 1992b). Im Gegensatz dazu erfolgt bei CPV-2 in vivo eine Replikation nur im Hund (PARRISH 1990b; TRUYEN u. PARRISH 1992c). In vitro allerdings repliziert CPV-2 sowohl in felinen als auch in caninen Zelllinien. Mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern wurden die neuen antigenen Varianten CPV-2a und 2b bestimmt (PARRISH et al. 1985b; PARRISH et al. 1991a). CPV-2a weist zwei von CPV-2 abweichende Epitope auf. (STRASSHEIM et al. 1994c). Diese befinden sich in drei separaten Regionen auf oder um den „Three-fold-spike“. Wie unter Punkt 2.10 beschrieben wird, resultieren die Unterschiede zwischen den Varianten aus nur wenigen Aminosäurenunterschieden im Kapsidprotein. Durch diese Veränderungen gewannen die neuen antigenen Varianten die Fähigkeit, in Katzen zu replizieren (TRUYEN et al. 1996a). Dass Katzen nicht nur nach experimenteller Infektion mit CPV-2a erkranken, sondern dass diese Variante in verschiedenen Katzenpopulationen vorkommt, zeigen Untersuchungen von erkrankten Katzen in Asien, Deutschland und USA. Bei ca. 5% der untersuchten Katzen wurde CPV-2a nachgewiesen (MOCHIZUKI et al. 1993; TRUYEN et al. 1996b; IKEDA et al. 2000b; IKEDA et al. 2002). Ebenso sind auch Wildtiere für die neuen anitgenen Varianten CPV-2a und 2b empfänglich. Vor allem Großkatzen, bei denen klinische Symptome einer Parvovirusinfektion festgestellt wurden, waren mit CPV-2a oder 2b infiziert (STEINEL et al. 2001). In den Hundepopulationen wurde der ursprüngliche Typ CPV-2 durch die neuen antigenen Varianten CPV-2a und 2b vollständig verdrängt (PARRISH et al. 1985a; PARRISH et al. 1988d; PARRISH 1991a), wohingegen die neuen Varianten, die sich nur in einer Katzepopulationen Aminosäureposition koexistieren. Diese unterscheiden, Varianten sind in in Hunde- und unterschiedlich ausgeprägter Verteilung weltweit vertreten. In den USA scheint das CPV-2b mit 80% dominant zu sein, während in Deutschland eine Verteilung von 60% CPV-2a zu 40% CPV-2b vorliegt (TRUYEN et al. 1996c). 13 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.9 Transferrinrezeptor Der Transferrinrezeptor ist physiologisch für die Aufrechterhaltung der EisenHomöostase der Zelle verantwortlich (PONKA u. LOK 1999). Er wird auf vielen Zellen, aber vor allem auf mitotisch aktiven Zellen (Darmgewebe, lymphatisches System), exprimiert, welche das Hauptziel bei einer CPV- oder FPV-Infektion darstellen (PARRISH 1995). Der Transferrinrezeptor ist ein Transmembran-Protein (90 kD) mit einem Amino- und einem Carboxyterminus. Der Aminoterminus befindet sich im Zytoplasma, der Carboxyterminus extrazellulär. Die extrazelluläre Domäne des humanen Transferrinrezeptors besitzt eine große Sequenzhomologie zum felinen und caninen Rezeptor (HUEFFER et al. 2003c). An der extrazellulären Domäne kann eine helikale und eine apikale Domäne, strukturell ähnlich zu einer Protease, unterschieden werden. Die apikale Domäne wurde als der Teil des Rezeptors identifiziert, der mit dem Kapsid von CPV und FPV interagiert (PALERMO et al. 2003a). Von besonderer Bedeutung für die Kontrolle des Wirtsspektrums von CPV und FPV scheinen eine Insertion einer AsparaginAminosäure in die apikale Domäne des caninen Transferrinrezeptors und eine zusätzliche Glykolisierungsstelle in dieser Domäne zu sein (PALERMO et al. 2003c). Als funktionaler Rezeptor für CPV und FPV wurde zunächst der feline Transferrinrezeptor identifiziert (PARKER et al. 2001). In Versuchen mit Zellkulturen wurden canine Zellen, die nicht für FPV empfänglich sind, mit dem Gen des felinen Transferrinrezeptors transfiziert. Es zeigte sich, dass diese Zellen für FPV empfänglich waren (HUEFFER et al. 2003d) und eine Infektion caniner Zellen durch FPV unter normalen Bedingungen nicht möglich ist, weil ein funktionaler Rezeptor auf diesen Zellen fehlt. Das canine Wirtsspektrum wird diesen Untersuchungen zu Folge durch die Unterschiede in der Bindung von CPV und FPV an den caninen Transferrinrezeptor kontrolliert. Die Bindung an den Rezeptor wird durch die Regionen auf der Erhebung der 3x-Achse bestimmt (HUEFFER et al. 2003e). Welche Aminosäurepositionen und Aminosäuren in dieser Region entscheidend für eine strukturelle Veränderung des Kapsids und damit dem Wirtsspektrum sind, wird ausführlich in Punkt 2.10 beschrieben. Bestimmte strukturelle Veränderungen in dieser Region führen bei den antigenen Varianten CPV-2a/2b zu einer effektiveren 14 Bindung an den caninen Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Transferrinrezeptor als bei CPV-2 und legen den Schluss nahe, dass die Bindung und die effektivere Nutzung des caninen Transferrinrezeptors wichtige Ereignisse in der Evolution und der Pathogenese des caninen Parvovirus darstellen (HUEFFER et al. 2003f). Es ist anzunehmen, dass das ursprüngliche CPV-2 den caninen Transferrinrezeptor nur ineffizient nutzen konnte und sich im weiteren Verlauf seiner Evolution die Bindungs- und damit die Infektionseffizienz verbesserte (HUEFFER u. PARRISH 2003a). 2.10 Evolutionäre Mechanismen des Caninen Parvovirus Die Anpassung des caninen Parvovirus an den Hund war ein komplexer Vorgang. Die Fähigkeit des Anzestors von CPV in den frühen 1970er Jahren Hunde zu infizieren, führte 1978 zu einer weltweiten Verbreitung des CPV-2 in einer schweren Pandemie. Die Veränderungen im Genom von CPV im Vergleich zu FPV basieren auf wenigen Nukleotidunterschieden. Die kodierenden Nukleotidaustausche und die sich daraus ergebende Aminosäureunterschiede im Kapsidprotein führen zu einer Veränderung des Wirtsspektrums. Kontrolliert werden die Wirtsspektren von CPV und FPV durch 3 Regionen, die sich auf und um den sogenannten „Three-fold-spike“ befinden. Insbesondere die zwei Aminosäuren an den Positionen 93 und 323 im VP2 bestimmen zusammen das canine Wirtsspektrum. Versuche zeigten, dass Veränderungen dieser Aminosäuren in FPV, vergleichend zu denen in CPV, dazu führten, dass diese so veränderten Viren nun in der Lage waren, auch canine Zellen zu infizieren. (CHANG et al. 1992b; HORIUCHI et al. 1994; STRASSHEIM et al. 1994b; LLAMAS-SAIZ et al. 1996b; PARKER u. PARRISH 1997; HUEFFER et al. 2003a). Allerdings führte ein Austausch von nur einer dieser Aminosäuren zu keiner Veränderung des Wirtsspektrums. Dies deutet darauf hin, dass erst eine bestimme Kombination von Veränderungen in FPV dazu führte, dass dieses Virus canine Zellen infizieren konnte. Bestimmte Aminosäureaustausche in Regionen nahe den Aminosäurepositionen 299 und 300 auf dem „Three-fold-spike“ verhindern eine Infektion caniner Zellen. Diese Regionen scheinen das feline Wirtsspektrum in vivo zu kontrollieren (TRUYEN et al. 1994a). Die Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 80, 564 15 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. und 568 scheinen für eine effiziente Vermehrung des Virus in der Katze verantwortlich zu sein (TRUYEN et al. 1996d). Die antigene Variante CPV-2a weist im Vergleich zu CPV-2 Aminosäureaustausche an den Positionen 87, 300 und 305 auf. Diese befinden sich an der Schulterregion des „Three-fold-spike“ (TRUYEN et al. 1995d; TRUYEN et al. 1996e). Bei dem ab 1984 nachgewiesenen anitgenen Typ CPV-2b sind im Vergleich zu CPV-2a Substitutionen an den Aminosäurepositionen 426 und 555 vorhanden. In Abbildung 5 ist die Entstehung des CPV mit seinen neuen Varianten und den entsprechenden Aminosäuresubstitutionen schematisch dargestellt. CPV-2 (1978-1981) heute ausgestorben (Fuchs,Nerz)? Val103Ile Hund Lys80Arg Lys93Asn Leu87Met Asp323Asn Anpassung an caninen TfR Ala300Gly Ser564Asn Asp305Tyr Hund und Katze Gly568Ala CPV-2a (1978 bis heute) Katze FPV (< 1900 bis heute) Asp426Asn MEV (1940 bis heute) Ile555Val Bindung an felinen TfR CPV-2b (1984-heute) Abbildung 5: Schema der Entstehung des caninen Parvovirus. Modifiziert nach (HUEFFER et al. 2004) 16 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Blau/Türkis: Unterschiede zwischen FPV CPV Grün: Unterschiede zwischen CPV-2 CPV-2a/b Gelb: Varianten innerhalb von CPV2a/b Abbildung 6: Asymmetrische Untereinheit des CPV Kapsid mit Darstellung der Lokalisation substituierter Aminosäuren auf der Kapsidoberfläche (SHACKELTON et al. 2005d) Die Funktion einiger Mutationen wurde in verschiedenen Studien bestimmt. Die Aminosäureaustausche an den Positionen 93 und 323 kontrollieren zusammen die Bindung an den caninen Transferrinrezeptor (HUEFFER et al. 2003b). Die Veränderungen der Aminosäuren an den Positionen 87, 300 und 305, die bei CPV2a vorliegen, führen zu einer verbesserten bzw. effektiveren Bindung an den caninen Transferrinrezeptor (HUEFFER et al. 2003g). Dies legt den Schluss nahe, dass CPV-2a durch diese Fähigkeiten in der Lage war, die frühere antigene Variante CPV-2 vollständig zu verdrängen und dass diese Aminosäureaustausche von zentraler Bedeutung in der Evolution und Pathogenese des caninen Parvovirus sind (HUEFFER et al. 2003h). Die Unterschiede in diesen Aminosäurepositionen haben neben der Veränderung des Wirtsspektrum und der Bindung an den Transferrinrezeptor auch zu Veränderungen der Epitope des Kapsidproteins geführt. Der Unterschied zwischen FPV und CPV an dem CPV-spezifischen Epitop um Aminosäure 93 (CHANG et al. 1992a) zeigte sich in einer Substitution von Lys zu Asn. Zwischen CPV-2 und CPV2a waren mehrere Aminosäureaustausche im Kapsidprotein (AS 87, 300, 305) an dem Verlust eines CPV-2 spezifischen Epitops und dem Gewinn eines für CPV-2a spezifischen Epitops beteiligt (STRASSHEIM et al. 1994a). Das CPV-2b spezifische 17 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Epitop um Aminosäure 426 (PARRISH et al. 1991d) veränderte im Vergleich zu CPV-2a ebenfalls ein Epitop des Virus. Veränderungen weiterer Aminosäuren in CPV-2a/2b finden sich an zwei Regionen des VP2 nahe den Positionen 93 und 300 auf dem „Three-fold-spike“, zum einen an der Aminosäureposition 426, zum anderen an der Position 297. Diese Aminosäureveränderungen wurden bei zwei CPV-Isolaten von Hunden aus Italien beschrieben (BUONAVOGLIA et al. 2001b). Die Aminosäuren Asn bei CPV-2a und Asp bei CPV-2b die an der Position 426 vorliegen, wurden durch Glu ersetzt. Möglicherweise handelt es sich um eine neue Variante des caninen Parvovirus, die in der Hundepopulation in Italien neben CPV-2a und 2b koexistiert (BUONAVOGLIA et al. 2001c). Die Aminosäuresubstitution an Position 297 (AlaSer) wurde bei verschiedenen CPV-Isolaten in Deutschland nachgewiesen (TRUYEN 1999a). Diese Mutation kommt sowohl bei CPV-2a als auch CPV-2b vor und scheint in Deutschland sehr verbreitet zu sein. Ebenso wurde diese Veränderung bei Isolaten in Asien (IKEDA et al. 2000c) und Italien (BATTILANI et al. 2001; BUONAVOGLIA et al. 2001d) nachgewiesen. In den USA scheint diese Mutation bis wenigstens 1999 in CPV2a/2b nicht vorherrschend zu sein (TRUYEN 1999b). Weitere Aminosäureaustausche wurden bei Leopardenkatzen aus Vietnam und Taiwan beschrieben (NAKAMURA et al. 2004b). Diese neue Variante (CPV-2c) weist an der Aminosäureposition 300 einen Austausch von Gly durch Asp auf. Weitere Nukleotidaustausche, die vereinzelt weltweit vorkommen, wurden bei verschiedenen CPV-Isolaten beschrieben. Es wird vermutet, dass diese zusammen mit anderen im Genom vorkommenden Austauschen korrelieren (PARRISH u. HUEFFER 2006). Die immer wieder neu auftauchenden Nukleotidaustausche weisen darauf hin, dass die Anpassung des caninen Parvovirus an den Wirt Hund noch nicht abgeschlossen ist und in den folgenden Jahren mit einer Weiterentwicklung des Virus gerechnet werden kann. 18 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.11 Theorien zur Entstehung des CPV Zum Entstehungsmechanismus des caninen Parvovirus gibt es verschiedene Theorien. Eine Theorie basiert auf der Annahme, dass sich CPV durch eine zufällige Mutation der Nukleotide in FPV entwickelt hat. Phylogenetische Sequenzvergleiche der beiden Viren aus den 1970er Jahren zeigten allerdings, dass sich Isolate von CPV und FPV immer deutlich unterschieden. Es wurde bis heute keine Zwischenform in FPV- und CPV-Sequenzen aus dieser Zeit gefunden, die eine zufällige Entstehung von CPV aus FPV erklären könnte. Der Einsatz von FPV-Lebendvakzinen führte früh zu einer weiteren Theorie, welche eine mögliche Entstehung von CPV aus einer veränderten FPV-Vakzine vermutete. In Untersuchungen mit polyklonalen Seren und Restriktionsenzymen früher CPVIsolate sowie FPV-Vakzine-Stämme aus den 1970er Jahren wurde eine enge Verwandschaft von CPV und FPV nachgewiesen (TRATSCHIN et al. 1982). Die Vermehrungsfähigkeit von CPV in felinen Zellkulturen stützt diese Theorie. Es konnte jedoch kein Nachweis einer direkten Abstammung aus den FPVImpfstämmen erbracht werden. Eingehende Sequenzanalysen der viralen DNA früher CPV-Isolate aus 1978/79, der FPV-Impfstämme sowie FPV-Isolate aus dieser Zeit widerlegten diese Theorie (TRUYEN et al. 1998a). Eine Sequenz eines Parvovirus-Isolats bei einem europäischen Rotfuchs (Vulpes vulpes) stützt eine dritte Theorie, die eine Entwicklung des CPV über FPV-ähnliche Viren bei Wildtieren für möglich hält (TRUYEN et al. 1998d). Diese DNA-Sequenz weist einen kodierenden Nukleotidunterschied an Position 3094 auf, der zu einer Aminosäuresubstitution an Position 103 (ValIle) im VP2 führt. Das plötzliche Auftreten von CPV in domestizierten Hundepopulationen könnte durch eine Übertragung dieses Virus von wilden auf domestizierte Carnivoren erklärt werden (TRUYEN et al. 1998c). Untersuchungen zu phylogenetischen Verwandtschaftsverhältissen der Familien Canidae und Felidae der Ordnung Carnivora ergaben, dass es unter den Caniden Spezies gibt, die verwandtschaftlich gesehen den Feliden näher stehen als dem Hund. Diese Spezies (z.B. Füchse, Nerze, Waschbären) könnten als potentielle Wirte für eine intermediäre Form des CPV gedient und diese auf den Hund übertragen haben. Im Anschluss könnte eine Anpassung an den neuen Wirt Hund erfolgt sein. 19 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Neuere Studien, welche die Substitutionsraten von verschiedenen Parvovirussequenzen aus der Genbank untersuchten, ergaben, dass CPV bereits 10 Jahre vor der weltweiten Ausbreitung im Jahr 1978 in den caninen Populationen hat zirkulieren müssen (SHACKELTON et al. 2005c). CPV-2 mit einem ermittelten mittleren Alter von 36 Jahren zirkulierte demnach zwischen 1968 und 1978 in den caninen Populationen. Ein Bericht aus Griechenland, in dem rückwirkend 1974 CPV-Antikörper in einem Hundeserum nachgewiesen wurde, stützt diese Annahme (KOPTOPOULOS et al. 1986b). Für CPV-2a wurde im Mittel ein Alter von 28 Jahren bestimmt. Diese Variante des caninen Parvovirus existierte nach diesen Untersuchungen bereits seit 1976. Es wird angenommen, dass diese beiden Varianten des caninen Parvovirus in den 1970er Jahren in den caninen Populationen kozirkulierten und nützliche Mutationen unter strenger positiver Selektion anhäuften, bis es schließlich zum Ausbruch einer Epidemie kam (SHACKELTON et al. 2005b). 20 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Probenauswahl Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit ausgewählten und untersuchten Proben wurden freundlicherweise vom Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. Es wurde ein Zeitraum von 1970 bis 1980 festgelegt. In diesem Zeitraum erfolgte eine Auswahl der in Befundordnern dokumentierten Fälle. Dabei handelte es sich um Hunde- und Katzenproben sowie eventuell vorhandene Proben anderer Karnivoren. Die Proben wurden nach folgenden Kriterien in Vorberichten und Befunden ausgewählt. Vorberichtliche Erwähnungen wie Erbrechen, Durchfall, katarrhalische oder hämorrhagische Enteritis, Welpensterben als Bestandproblem, plötzlicher Tod sowie Ataxie und Verdacht auf Panleukopenie bei Katzen wurden als Hinweise für eine Infektion mit Parvoviren gewertet. Bei den pathologisch-anatomischen Befunden, den pathologischen Diagnosen und den histopathologischen Befunden wurde auf Kriterien wie katarrhalische bis fibrinöse Enteritis, andere pathologische Veränderungen des Darmepithels (z.B. Zottenatrophie, Abschilferung des Darmepithels) und Lymphopenie geachtet. Weitere Auswahlkriterien bei Katzen waren Hinweise auf Panleukopenie oder auch „Katzenseuche“ sowie Myokarditis und Parvovirose bei Hunden. Die Auswahl erfolgte, wenn mindestens eines der aufgeführten Kriterien erfüllt wurde. Die Paraffinblöcke mit Darm- und/ oder Herzgewebe wurden aussortiert und gekennzeichnet. 21 von ausgewählten Fällen Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 3.2 Methoden 3.2.1 Probennahme Von jedem Paraffinblock wurden jeweils drei Schnitte mit einer Dicke von 10m mit Hilfe eines Schlittenmicrotoms (Firma Jung) entnommen und anschließend in 1,5 ml Eppendorfgefäße verbracht. Nach jeder Probe wurden zwei Schnitte von einem paraffineingebetteten Gehirngewebe eines Hirsches zur Kontaminationskontrolle entnommen. Die Desinfektion des Arbeitsplatzes erfolgte jahrgangsweise nach den Katzen- bzw. Hundeproben mit 70%igem Ethanol und 10%igem Natriumhypochlorit. Die Klingen des Schlittenmicrotoms wurden gewechselt. 3.2.2 Aufreinigung der Proben Um die DNA isolieren zu können, wurden die Gewebeproben mit 1200l Xylol deparaffinisiert und anschließend zweimal mit jeweils 1200l 100%igem Ethanol gewaschen (TRUYEN et al. 1994b). Bis zur vollständigen Verdunstung des Ethanols wurden die Proben in den geöffneten Eppendorfgefäßen unter dem Abzug getrocknet. Die weitere DNA-Aufreinigung wurde mit Hilfe des DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Das Gewebe wird bei der Aufreinigung zunächst lysiert und anschließend auf eine Silikagel-Membran aufgetragen. Die DNA wird durch Zentrifugieren an der Membran adsorbiert. Nach zweimaligem Waschen mit Pufferlösungen wird die DNA mit Hilfe eines weiteren Puffers eluiert. Das Eluat diente dem anschließenden Nachweis der parvoviralen DNA. 3.2.3 Auswahl der Oligonukleotide Zum Nachweis der parvoviralen DNA wurde das von Steinel et al. (2000) veröffentliche Oligonukleotidpaar M1RE+M2RE verwendet. Weitere angegebene Oligonukleotidpaare (M10+M11, M13+M44, M1+M41) konnten nicht verwendet werden, da mit diesen keine Ergebnisse bei den Proben erzielt werden konnten. 22 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Daher wurden zur vollständigen Sequenzierung des VP2-Gens weitere Oligonukleotide anhand einer FPV-Nukleotidsequenz (Genbank-Nr. M24004, FPV-b Isolat CU4) entweder mit dem Programm Primer 3 (ROZEN u. SKALETSKI 2000) oder manuell erstellt. Die Überprüfung der Oligonukleotide hinsichtlich ihrer Spezifität wurde mit der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) und dem Programm BLAST (ALTSCHUL et al. 1997) durchgeführt. Die Überprüfung erfolgte, um eine fehlerhafte Anlagerung (sog. mismatching) der Oligonukleotide an ähnliche, nicht FPV- bzw. CPV- spezifische Gensequenzen zu verhindern. Die Bezeichnung der Oligonukleotide, die Sequenz und die Nukleotid-Position bezogen auf die Nukleotidsequenz des FPV-b Isolates CU4 sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Synthese der Oligonukleotide erfolgte durch die Firma Biomers, Ulm. 23 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 2: Oligonukleotide Primer Nukleotidsequenz nt-Position Fragmentlänge A0f 5’-cca tca aca tca aga cca aca-3’ 379-399 A0r 5’-gac cac cgt ctg gtt gaa ct-3’ 535-516 Af 5’-ccg gtg cag gac aag taa aa-3’ 464-483 Ar 5’-tac ccg tag aaa tcc cca ca-3’ 631-612 A1f 5’-ggt gca gga caa gta aaa ag-3’ 466-485 A1r 5’-agt ctg ctt gag ttt gct gt-3’ 704-685 M1RE 5’-agc tgt cga cga aaa cgg atg ggt gga aat-3’ 656-683 M2RE 5’-gct cga gaa ttc agt tgc caa tct cct gga tt-3’ 896-865 A2f 5’-cat tgg ttg atg caa atg ct-3’ 830-849 A2r 5’-gct gct gga gta aat ggc ata-3’ 1067-1047 A3f 5’-cat tga tgg ttg cat tag at-3' 1016-1035 A3r 5’-tgg cac aga att ttc aat ag-3’ 1254-1235 A4f 5’-cca tgg aaa cca acc ata cc-3’ 1096-1115 A4r 5’-tct aca tgg ttt Rca atc aaa aa-3’ 1323-1301 Bf 5’-taa gaa cag gtg atg aat tt-3’ 1265-1284 Br 5’-ctc agc tgg tct cat aat ag-3’ 1506-1487 B1f 5’-tgc ctc aat ctg aag gag cta-3’ 1382-1402 B1r 5’-tca cca tct gct gct tga tt-3’ 1625-1606 B2f 5’-cgt cta cac aag ggc cat tta-3’ 1541-1561 B2r 5’-tga atc caa tct cct tct gga-3’ 1748-1728 B3f 5’-caa cag gag aaa cac ctg aga g-3’ 1670-1691 B3r 5’-ccc aaa ttt gac cat ttg gat-3’ 1912-1892 B4f 5’-cca att gga ggt aaa aca gga-3’ 1804-1824 B4r 5’-ttc gtt aaa tta ggc gca ac-3’ 2024-2005 B5f 5’-cac cag ttt atc caa atg gtc a-3’ 1883-1904 B5r 5’-cct ttc cac caa aaa tct gaa-3’ 2093-2073 Cf 5’-atc ctg atg cat ctg cta at-3’ 2033-2052 Cr 5’-ggt gct agt tga gat ttt tca t-3’ 2240-2219 C1f 5’-ttc aga ttt ttg gtg gaa agg-3’ 2073-2093 C1r 5’-tgt tct agg tgc tag ttg ata tg-3’ 2307-2285 f: r: : R: 156 bp 167 bp 238 bp 240 bp 237 bp 238 bp 227 bp 241 bp 243 bp 207 bp 242 bp 220 bp 210 bp 207 bp 234 bp vorwärts gerichtete Amplifikationsrichtung (forward) rückwärts gerichtete Amplifikationsrichtung (reverse) nicht zu FPV-b komplementär __: Restriktionsenzymschnittstelle Nukleotid A oder G bp: Basenpaare 24 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 3.2.4 Polymerase-Kettenreaktion 3.2.4.1 Durchführung der PCR Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine in-vitro-Methode, um DNA spezifisch zu amplifizieren. Es werden zwei Primer benötigt, wobei einer am 3’-Ende des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes, der andere am 5’-Ende bindet. Dadurch sind zwei Startpunkte für die DNA-Polymerasereaktion definiert. Die Vervielfältigung der DNA erfolgt durch eine thermostabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) in sich wiederholenden Zyklen. Zunächst wird die DNA bei 94°C denaturiert. Anschließend erfolgt die Anlagerung (Annealing) der Oligonukleotide an die einzelsträngige DNA bei den für die Oligonukleotide jeweils spezifischen Annealing-Temperaturen. Danach wird durch die DNA-Polymerase mit Hilfe der Desoxynukleotidtriphosphate ein komplementärer DNA-Strang bei 72°C synthetisiert (Elongation). Anschließend erfolgt wieder eine Denaturierung bei 94°C und der Zyklus wiederholt sich. Bei jedem dieser Zyklen kann somit die Anzahl der Amplifikate verdoppelt werden. Nach Ablauf des letzten Zyklus erfolgt eine finale Elongation bei 72°C und anschließend das Abkühlen auf 4°C. Die PCR diente zum einen dem Nachweis der parvoviralen DNA, zum anderen der Herstellung von PCR-Amplifikaten, die zur vollständigen Sequenzierung des VP2Gens erforderlich waren. Die optimalen Zyklusbedingungen für die Oligonukleotide M1RE+M2RE sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die optimale Annealing-Temperatur bei den übrigen Oligonukleotiden betrug 54°C. Die weiteren Parameter des Zyklus wurden übernommen. 25 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 3: Zyklusbedingungen für die Oligonukleotide M1RE+M2RE Phase Temperatur Zeit 1.Denaturierung 94°C 5min 2.Denaturierung 94°C 30s 3.Annealing 59°C 30s 4.Elongation 72°C 1min 5.finale Elongation 72°C 10min 6.kühlen 4°C Zyklenzahl 35 x Die Menge je Reaktionsansatz betrug 25l. Je Reaktion wurde 1,5l Template und jeweils ein Oligonukleotidpaar in einer Konzentration von 200nM eingesetzt. Es wurde entweder der PCR Master Mix (1.1x ReddyMix ABgene House, Surrey, UK) oder der Taq PCR Core Kit (Qiagen, Hilden) für die PCR Reaktion verwendet. Die genauen Mengen- und Konzentrationsangaben sind in Tabelle 4 und 5 wiedergegeben. Tabelle 4: Reaktionskomponenten des PCR Master Mix mit Volumen und Konzentrationsangaben Reagenzien Bestandteile Volumen Konzentrationen in 25l PCR Master Mix (in l) Reaktionsansatz PCR MasterMix* 22,5 DNA Polymerase 0,625 units Tris-HCL 75mM (NH4)2SO4 20mM MgCl2 2,5mM Tween 20 0,01% dNTP 0,2mM 1) Primer f 0,5 200nM Primer r 0,5 200nM * enthält 2,5mM MgCl2, Laufpuffer 1) für jedes dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 26 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 5: Reaktionskomponenten des Taq PCR Core Kit mit Volumen und Konzentrationsangaben Qiagen PCR Konzentration in 25l Volumen (in l) Reagenzien Puffer* Reaktionsansatz 2,5 (Tris Cl, KCL, (NH4)2SO4,) Q-Solution 2,5 MgCl2 1) 3 2,25mM 2) dNTP (1:3 verdünnt) 2 200M 3) Destilliertes Wasser 11,4 - Primer f 1 400nM Primer r 1 400nM 0,1 0,5 units Taq DNA Polymerase *enthält 15 mM MgCl2, pH 8,7 1) 25 mM MgCl2 2) zusammen mit MgCl2 im PCR Puffer: 3,75mM 3) für jedes dNTP Für jedes Oligonukleotidpaar wurde ein Versuchsansatz in einem Reaktionsgefäß hergestellt und das Oligonukleotidpaar hinzugefügt. Anschließend wurden räumlich getrennt dazu die Gefäße für die PCR-Reaktion mit 23,5l pro Gefäß befüllt und die Proben hinzupipettiert. Die einzelnen Reagenzien sowie die Reaktionsansätze wurden dabei immer auf Eis gehalten. Bei jeder PCR-Reaktion wurde eine Positivund eine Negativkontrolle mitgeführt. Als Positivkontrolle diente der aufgereinigte Zellkulturüberstand des Isolats CPV-d. Die PCR-Reaktionen fanden im Eppendorf Mastercyclergradient (Firma Eppendorf, Hamburg) statt. 3.2.4.2 Optimierung der PCR Die optimalen Zyklusbedingungen sowie die Sensitivität der PCR für die Oligonukleotide M1RE+M2RE und die weiteren in Tabelle 2 aufgeführten Oligonukleotide wurden experimentell ermittelt. Dazu wurde eine Verdünnungreihe von 10-4 bis 10-12 für die Oligonukleotide M1RE+M2RE mit einem Plasmid, das ein 27 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. partielles VP2-Gen (891bp) von einem CPV-Isolat enthält, angefertigt. Für die weiteren Oligonukleotide wurde eine 10-3 bis 10-6 Verdünnung des aufgereinigten Zellkulturüberstandes des Isolats CPV-d benutzt. Mit Hilfe eines Gradientencyclers (Eppendorf Mastercyclergradient, Firma Eppendorf, Hamburg) wurden die optimalen Annealing-Temperaturen für die Oligonukleotide ermittelt. Die PCRProdukte wurden dazu auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen und nach Färbung im Ethidiumbromidbad visuell ausgewertet. 3.2.5 Agarose-Gel-Elektrophorese Die Gelelektrophorese wurde eingesetzt, um die PCR-Produkte nachzuweisen. Sie basiert darauf, dass Nukleinsäuren bei einem neutralen pH aufgrund ihrer Phosphatgruppen polyanionisch sind und bei angelegter Spannung in der Gelelektrophoreseapparatur in Richtung Anode wandern. Die Nukleinsäuremoleküle werden durch eine Gelmatrix, die aus einem Agarosegel besteht, entsprechend ihrer Größe aufgetrennt. Mit steigender Konzentration des Gels können immer kleinere DNA-Fragmente auch mit nur wenigen hundert Basenpaaren aufgetrennt und nachgewiesen werden. Der Nachweis der PCR-Produkte erfolgte mit 2%igen Agarosegelen. Zur Herstellung des Agarosegels wurden 2g Agarosepulver in 100 ml TBE Laufpuffer gelöst, in der Mikrowelle erhitzt und anschließend in einen Gelträger gegossen. Nach Erstarren der Agarose wurde das Gel in die mit TBE gefüllte Elektrophoresekammer (Firma Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) gelegt. Die Zusammensetzung des Laufpuffers und die des Agarosegels sind detailliert im Anhang aufgeführt. Es wurden jeweils 8l der PCR-Produkte, sowie der Positiv- und Negativkontrollen in die Kavitäten des Agarosegels pipettiert. Zur Größenbestimmung der Amplifikate wurde 4l des Molekulargewichtsmarkers (PeqGold 50 bp DNA-Leiter, Firma Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) aufgetragen. Da der Taq PCR Core Kit (Qiagen, Hilden) keinen Laufpuffer enthält, wurde zu 8l der PCR-Amplifikate je 1,5l Ladepuffer (Firma Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) zugesetzt und die gesamte Menge in die Kavitäten des Gels pipettiert. An der Elektrophoresekammer wurde mit einem Netzgerät (Powerpack 200, BioRad Laboratories, Hercules, USA) eine Spannung von 140 V für 60 min angelegt. Anschließend wurde das Gel mit dem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff 28 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Ethidiumbromid (Ethidiumbromid-Lösung 1%, Firma AppliChem GmbH, Darmstadt) für ca. 10 bis 15 Minuten angefärbt. Die Konzentration des Ethidiumbromidbades betrug 0,5g/ ml. Durch Einlagerung des Ethidiumbromids in die DNA kann diese unter UV-Licht (Wellenlänge 460nm) als Banden sichtbar gemacht werden. Zur Visualisierung und zum Fotografieren wurde das Geldokumentationssystem Gel Doc 2000 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) und die Software Bio Rad Quantity One- 4.0.3. (Bio Rad Laboratories, Herkules, USA) benutzt. 3.2.6 Klonieren der PCR-Amplifikate in Escherichia coli In Einzelfällen wurden die amplifizierten PCR-Produkte mit Hilfe des TOPO TA Cloning-Kits (Firma Invitrogen, Karlsruhe) kloniert. Es wurden PCR-Produkte entweder direkt aus dem Reaktionsansatz oder ausgeschnitten aus einem 2%igen TAE-Gel verwendet. Die Aufreinigung im letzteren Fall erfolgte mittels QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden). Die Insertion der DNA-Fragmente in den pCR 2.1Vektor erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers. Anschließend wurden die Plasmide in TOP10F’ (E.coli)-Bakterien transformiert. Gemäß Herstellerangaben erfolgte die Blau-Weiß-Selektion der Klone mit inseriertem PCR-Produkt auf LB-ZNährböden mit Ampicillin. Die genaue Zusammensetzung ist im Anhang aufgeführt. Nach Aufschütteln der Klone in LB-Bouillon (Sigm, LB Broth, Miller, Luria Bertani) für 6-8 Stunden erfolgte die Aufreinigung der Plasmid-DNA mit Hilfe des QIAprep Miniprep Kit (Qiagen, Hilden). Zur Kontrolle, ob das gewünschte PCR-Produkt tatsächlich in dem Plasmidvektor enthalten ist, wurde vor der Sequenzierung ein Restriktionsverdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI (New England BioLabs GmbH, Frankfurt a.M.) in einer Konzentration von 100000 U/ml durchgeführt. Das „insert“, das bei dem verwendeten Vektor von EcoRI-Schnittstellen flankiert ist, kann somit aus dem Plasmid geschnitten werden. Verdau: Plasmid 4l EcoRI 2l EcoRI Puffer 4l Destilliertes Wasser 30l 29 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C erfolgte der Nachweis der erwarteten Größe des „inserts“ mit Hilfe der Gelelektrophorese (2%iges Agarosegel, 140 V, 60 min.). 3.2.7 Aufreinigung der PCR-Produkte Die in der PCR amplifizierten DNA-Fragmente wurden für die folgende Sequenzierung mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers. Die DNA-Fragmente werden dabei an eine Silicagel-Membran gebunden. Die restlichen noch enthaltenen Bestandteile der PCR wie Oligonukleotide, dNTP, Pufferionen und DNA-Polymerase wurden mit Hilfe eines Waschschrittes entfernt. Die Elution erfolgte mit einem Elutionspuffer. Anschließend wurden die Proben an das IZKFLeipzig (IZKF- Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung der Universität Leipzig) weitergeleitet. 3.2.8 Sequenzierung der PCR-Amplifikate Die Nukleotidsequenzen wurden durch das IZKF Leipzig (IZKF- Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung der Universität Leipzig) ermittelt. Die Bestimmung erfolgte nach der Kettenabbruchmethode nach Sanger (SANGER et al. 1977). Prinzip dieser Methode ist es, dass es durch Einbau von Didesoxy-Nukleotiden zum Abbruch der Polymerisationsreaktion kommt. Dabei verläuft die Polymerisationsreaktion in vier getrennten Ansätzen mit jeweils den vier NukleotidMonomeren und der Didesoxy-Variante einer Nukleotidsorte. Der Start der Polymerisationsreaktionen ist bei allen Strängen gleich und wird durch ein Oligonukleotid, das als Primer dient, vorgegeben. Die Kettenverlängerung läuft solange ab, bis schließlich ein Didesoxy-Nukleotid eingebaut wird und damit die 3’OH-Gruppe zur Ausbildung der Phosphodiesterbindung zum nächsten Kettenglied fehlt. Da der Anfangspunkt festgelegt ist, spiegelt die Länge der Synthesefragmente in einem Reaktionsansatz die relative Position der jeweiligen Nukleobasenorte im Molekül wider. Die Auftrennung der vier Ansätze nebeneinander entsprechend ihrer Größe in einem Acrylamidgel ermöglicht das Ablesen der Basensequenz direkt vom Gel. 30 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Die Nukleotide wurden vom IZKF mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Die Probenvorbereitung erfolgte mit dem Big Dye Terminator v. 3.1. Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Für die PCR-Reaktion wurde das 16 Kapillargerät ABI Prism 3100 Genetic Analyzer C (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) eingesetzt. Die Auswertung der Daten erfolge mit Hilfe der dazugehörigen Software DNA Sequencing analysis 5.1. (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 3.2.9 Bearbeitung und Analyse der Sequenzen Die vom IZKF ermittelten Sequenzen wurden zunächst mit dem Programm BLAST (ALTSCHUL et al. 1997) hinsichtlich ihrer Spezifität überprüft. Die Analyse und Bearbeitung erfolgte im Anschluss mit den Programmen Chromas (Technelysium Ltd, Tewantin Qld) und der Sofware LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin). Phylogenetische Untersuchungen wurden in einem Alignment der ermittelten Sequenzen mit verschiedenen in der Genbank veröffentlichten Sequenzen (Tab.6) von FPV-, CPV-, MEV-, RPV-, RDPV- und BFPV- Isolaten nach der clustal WMethode (THOMPSON et al. 1994) und mit Hilfe von Stammbäumen, die mit dem Programm PAUP (Swofford, D.L. 1998, PAUP, Phylogenetic Analysis Using Parsimony, Version 4.0b, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts) erstellt wurden, durchgeführt. 31 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 6: Viursisolate mit Angabe der Genbank-Nummern, Referenz, Herkunft und Jahr der Isolierung Genbank-Nr. Virusisolat Referenz Isolierung Herkunft (Jahr) AB000056 FPlV-Obihiro Horiuchi,M.; direct submission 1996 1974 JAPAN AB000068 FPLV-tu4 Horiuchi,M.; direct submission 1996 1975 JAPAN AB000066 FPLV-tu2 Horiuchi,M.; direct submission 1996 1975 JAPAN AB000064 FPLV-tu12 Horiuchi,M.; direct submission 1996 1979 JAPAN AB000061 FPLV-Som4 Horiuchi,M.; direct submission 1996 1995 JAPAN AB000059 FPLV-Som1 Horiuchi,M.; direct submission 1996 1994 JAPAN AB000052 FPLV-A04 Horiuchi,M.; direct submission 1996 1994 JAPAN M24002 FPV-a (Philips Roxane) (PARRISH et al. 1988b) 1962 U.K.a M24004 FPV-b CU4 (PARRISH et al. 1988b) 1967 U.S.b U22187 FPV-23 (TRUYEN et al. 1995a) 1990 U.S. U22189 FPV-d (TRUYEN et al. 1995e) 1964 U.S. X55115 FPV-193 (MARTYN et al. 1990) 1970 AUSTRALIEN M10824 FPV-Carlson (CARLSON et al. 1985) 1966 U.S. U22188 FPV-377 (TRUYEN et al. 1995a) 1993 DEUTSCHLAND AY742934 CPV-447 (SHACKELTON et al. 2005e) 1995 DEUTSCHLAND AY742935 CPV-U6 (SHACKELTON et al. 2005e) 1995 DEUTSCHLAND AY869724 CPV-Taichung (WANG et al. 2005) 2003/04 TAIWAN M74849 CPV-39 Parrish,C.R. direct submission 1991 1984 U.S. M24003 CPV-15 (PARRISH et al. 1988b) 1984 U.S. M38245 CPV-d (PARRISH 1991c) 1978 U.S. NC_001539 CPV-Norden (REED et al. 1988) 1978 U.S. M24000 CPV-31 (PARRISH et al. 1988b) 1983 U.S. M74852 CPV-133 Parrish, C.R.; direct submission 1991 1990 U.S. AJ002928 CPV-Pudel (TRUYEN et al. 1998b) 1979 DEUTSCHLAND AJ002927 CPV-ChowChow (TRUYEN et al. 1998b) 1979 DEUTSCHLAND U22186 CPV-128 (TRUYEN et al. 1995a) 1979 U.S. D26079 CPV-Y1 (HORIUCHI et al. 1994) 1982 JAPAN U22193 RD-87 (TRUYEN et al. 1995a) 1987 FINNLAND D00765 MEV-Abashiri (KARIATSUMARI et al. 1991) 1978 JAPAN U22191 MEV-e (TRUYEN et al. 1995a) 1965 U.S. M23999 MEV-a (PARRISH et al. 1988b) 1973 U.S. M24001 MEV-b (PARRISH et al. 1988b) 1975 U.S. U22190 MEV-d (TRUYEN et al. 1995a) 1965 U.K. U22185 BFPV-1 (TRUYEN et al. 1995a) 1983 FINNLAND M24005 Raccoon (PARRISH et al. 1988b) 1979 U.S. a: United Kingdom b: United States 32 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 3.2.10 Tierartspezifische PCR Die tierartspezifische PCR wurde vom Tierärztlichen Institut der Georg-AugustUniversität in Göttingen durchgeführt. Eine Probe wurde mit 7 katzenspezifischen Mikrosatelliten als Marker (FCA26, FCA43, FCA58, FCA88, FCA90, FCA 126, FCA132) und 11 hundespezifischen Markern (PEZ1;FHC5054; FHC2010; PEZ5; PEZ12; PEZ6; PEZ8; FHC2079; FH2247; FH2164; FH2001) untersucht. 3.2.11 Immunhistochemie Der immunhistochemische Nachweis von felinen / caninen Parvoviren einer Probe wurde am Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Dabei wurden folgende Antikörper benutzt: - Maus-anti-Parvovirus: CPV1-2A1 (von Chris Grant, Ph.D., D.Sc., 813 Harbor BLV #284), Balb/C Mäuseascites (BioLogo, Kronshagen) - Biotinyliertes Ziege-anti-Maus-Serum: Laboratories, Petersborough, U.K.). 33 GAM-b IgG (H+L) (Vector Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 4 Ergebnisse 4.1 Probenauswahl Im Rahmen dieser Arbeit wurden in Befundordern des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in den Jahren von 1970 bis 1980 nach den in Punkt 3.1.1 genannten Auswahlkriterien 493 Fälle ermittelt. Dabei handelte es sich um 208 Katzen und 250 Hunde sowie 35 Fälle anderer Karnivoren, die für eine Untersuchung in Frage kamen. Jahrgangsweise wurden maximal jeweils 10 Hunde- und 10 Katzenproben ausgewählt. 1973 wurden alle Hundeproben untersucht, da eine als Hundeprobe gekennzeichnete Probe positiv war. Die Paraffinblöcke der Proben wurden im Archiv herausgesucht und gekennzeichnet. Zusätzlich wurden aus dem Jahr 1967 zwei Nerzproben, dem Jahr 1972 eine Wolfprobe, dem Jahr 1973 eine Nerz- und aus dem Jahr 1974 zwei Waschbärproben untersucht. Eine detaillierte Aufführung der ausgewählten Proben findet sich in Tabelle 11 und 12 im Anhang. Insgesamt wurden 204 Proben untersucht. 4.2 Sensitivität der PCR Zur Bestimmung der Sensitivität der PCR mit den Oligonukleotiden M1RE+M2RE wurde ein in TE-Puffer gelöstes Plasmid, welches das partielle VP2-Gen (891 bp) eines CPV-Isolates enthielt, verwendet. Die Verdünnung erfolgte mit destilliertem Wasser in Verdünnungsstufen von 10-4 bis 10-12. Nach Messung der optischen Dichte bei 260nm wurde die Kopienzahl als Genomäquivalente nach folgender Formel bestimmt: Eine Einheit OD260 entspricht einer Konzentration von 50g/ml. Ein Nukleotidbasenpaar weist ein Molekulargewicht von 660pg/pmol auf. Daraus resultierte für das verwendete Plasmid (4822 bp) ein Molekulargewicht von 3,2 x 10 6 g/mol. Für die PCR ergab sich demnach eine Nachweisgrenze von 10 bis 100 Kopien pro Reaktionsansatz. Die Bestimmung der optimalen Annealing-Temperatur erfolgte mit Hilfe eines Gradientencyclers (Eppendorf Mastercyclergradient, Firma Eppendorf, Hamburg) und wurde bei 59°C festgelegt. Die Annealing-Temperatur wurde so gewählt, dass der Nachweis einer spezifischen Bande möglich war. Zur 34 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Bestimmung der Sensitivität der Polymerase-Kettenreaktionen der weiteren in Tabelle 2 genannten Oligonukleotide wurde der mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigte Zellkulturüberstand des Isolats CPV-d eingesetzt. Im Vergleich mit der Sensitivität der PCR mit den Oligonukleotiden M1RE+M2RE war der Unterschied in der Sensitivität nicht mehr als um den Faktor 100 geringer. Die optimale Annealing-Temperatur betrug 54°C. MG: Molekulargewichtsstandard 10-4 10-8 10-12 250 bp MG (50bp) - : Negativkontrolle - Abbildung 7: Verdünnungsreihe der Plasmid-DNA (von 10-4 bis10-13) 4.3 Nachweis der parvoviralen DNA Zum Nachweis der parvoviralen DNA wurde als spezifische und sensitive Nachweismethode die PCR mit den Oligonukleotiden M1RE+M2RE eingesetzt. Diese Oligonukleotide amplifizieren ein Sequenzstück von 240 bp Länge, das sich in dem Genomabschnitt befindet, der für das VP2-Strukturprotein kodiert. Von den insgesamt 198 untersuchten Hunde- und Katzenproben aus den Jahren 1970 bis 1980 konnten 17 positive Hunde- und 64 positive Katzenproben ermittelt werden. Bei den ausgewählten Proben anderer Karnivoren war als einzige Probe eine Waschbärprobe als positiv zu beurteilen. Die genaue Angabe des Jahres, der Diagnose bzw. des Befundes, des Alters des Tieres, Vorberichts und untersuchten Gewebes der positiven Proben sind in den Tabellen 13, 14 und 15 im Anhang zusammengefasst. Zur Kontaminationskontrolle wurde bei allen positiven Hundeproben und stichprobenweise bei den Katzenproben Gewebe einer anderen Spezies (Hirsch) 35 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. untersucht. Die Hirschproben, welche jeweils zwischen den einzelnen Hunde- bzw. Katzenproben entnommen wurden, waren in der PCR mit den Oligonukleotiden M1RE+M2RE negativ. In Abbildung 8 sind exemplarisch die PCR-Amplifikate der Oligonukleotide M1RE+M2RE von drei Proben dargestellt. MG: Molekulargewichtsstandard (50 bp) 1 2 3 250 bp 1,2,3 : Proben (Doppelansatz) + : Positivkontrolle (10-9) - : Negativkontrolle + MG Abbildung 8: PCR-Amplifikate der Oligonukleotide M1RE+M2RE 4.4 Ergebnisse der PCR zur vollständigen Sequenzierung des VP2-Gens Im Rahmen dieser Arbeit stand die Sequenzierung des VP2-Gens im Vordergrund. Es war vor allem von Interesse in diesem Bereich nach Veränderungen im Genom zu suchen, da sich hier die Nukleotidpositionen befinden, die für die phylogenetisch wichtigen Aminosäuren kodieren und von besonderem Interesse bei der Untersuchung der Evolution dieser Parvoviren sind. Mit den von Steinel et al. (2002) veröffentlichen Oligonukleotid-Kombinationen M1+M41, M10+M11 und M13+M14 konnten bei den Proben keine Ergebnisse erzielt werden. Diese Oligonukleotidpaare amplifizieren DNA-Fragmente in der Größenordnung von 538bp (M10+M11), 482bp (M13+M44) und 891bp (M1+M41). Möglicherweise kam es aufgrund der Formalin- und Paraffinbehandlung zu einem erhöhten Auftreten von Einzelstrangbrüchen, die zur Fragmentierung der DNA führten und somit einen Nachweis der DNA-Fragmente in dieser Größenordnung nicht erlaubten (DUBEAU et al. 1986). Aufgrund dessen wurden die in Tabelle 2 36 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. aufgeführten Oligonukleotide ausgewählt, die kleinere Fragmente von 150bp bis 250bp amplifizieren. Für die vollständige Sequenzierung des VP2-Gens wurden im Zeitraum von 1970 bis 1978 Polymerase-Kettenreaktionen mit diesen Oligonukleotidpaaren bei allen positiven Hundeproben, 10 Katzenproben und einer Waschbärprobe durchgeführt. Die vollständige Sequenzierung der Waschbärprobe war mit diesen OligonukleotidKombinationen nicht möglich. Bei dem untersuchten Gewebe handelte es sich bei allen Proben um Darmgewebe. Die in jeder PCR mitgeführte Positivkontrolle (aufgereinigter Zellkulturüberstand des Isolats CPV-d) wurde ebenfalls vollständig sequenziert, um eine mögliche Kontamination mit dieser überprüfen zu können. In Tabelle 7 und 8 sind die untersuchten Proben mit Fall- und Sektionsnummer zusammengefasst. Die Abbildungen 9 und 10 zeigen exemplarisch das Ergebnis einer PCR mit allen Oligonukleotid-Kombinationen einer Hundeprobe. Tabelle 7: Parvovirus-positive Hundeproben (1970-1978) Jahr* Fall Sektions-Nr1). 1978 464 S 1111/78 455 S 772/78 1977 420 S 6357/77 1973 281 S 5102/73 1) Sektionsnummern des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 37 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 8: ausgewählte Parvovirus-positive Katzenproben (1970-1978) Jahr Fall Sektions-Nr. 1978 425 S 6599/78 430 S 6757/78 1977 386 S 4699/77 1976 363 S 2588/76 1975 361 S 2503/75 1974 308 S 5830/74 1973 277 S 4735/73 1972 232 S 2664/72 1971 195 S 571/71 1970 174 S 469/70 Die Waschbärprobe aus dem Jahr 1974 hat die Fallnummer 321 und die Sektionsnummer S43/74. A A0 A1 A2 MG: Molekulargewichtsstandard (50bp) + - + - + - +: Positivkontrolle + - (Zellkulturüberstand CPV 265 10-3) MG - : Negativkontrolle MG Oligonukleotidpaare (jeweils f u. r): A2 A3 + - A4 + - B + - B1 A, A0, A1, A2, A3, A4, B, B1 + - Abbildung 9: PCR-Amplifikate der Oligonukleotidpaare A(f/r), A0(f/r),A1(f/r), A2(f/r), A3(f/r), A4(f/r), B(f/r), B1(f/r) (Hundeprobe 464 aus dem Jahr 1978) 38 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. MG: Molekulargewichtsstandard B1 B2 B3 + - + - B4 (50bp) + - + - MG +: Positivkontrolle (Zellkulturüberstand CPV 265 10-3) - : Negativkontrolle Oligonukleotidpaare (jeweils f und r): MG B5 C C1 M B1, B2, B3, B4, B5,C,C1 M: M1RE+M2RE + - + - + - Abbildung 10: Fortsetzung Abbildung 9; PCR-Amplifikate der Oligonukleotidpaare B1(f/r), B2(f/r), B3(f/r), B4(f/r), B5 (f/r), C(f/r), C1(f/r), M(f/r) (Hundeprobe 464 aus dem Jahr 1978) 4.5 Ergebnisse der Immunhistochemie und der tierartspezifischen PCR Mit dem Antikörper CPV1-2A1 konnte bei der immunhistochemischen Untersuchung der Hundeprobe 281/73 FPV / CPV nachgewiesen werden. Durchgeführt wurde diese Untersuchung durch das Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Die Sequenz dieser Probe stellte sich als typische FPV-Sequenz dar. Am Tierärztlichen Institut der Georg-August-Universität Göttingen wurde eine Tierartbestimmung dieser Probe durchgeführt. In allen Systemen konnten die Allelgrößen bestimmt werden. Es wurde eindeutig festgestellt, dass es sich um Gewebe einer Katze handelt. Die Untersuchung mit 11 hundespezifischen Markern verlief negativ. Aufgrund dieser Ergebnisse wird die Probe 281 aus dem Jahr 1973 in folgenden Analysen bei den Katzenproben mit aufgeführt. 39 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 4.6 Sequenzanalyse 4.6.1 Sequenzierung Nach Aufreinigung der in Tabelle 7 und 8 aufgeführten Proben, wurden die Nukleotidsequenzen vom IZKF-Leipzig (IZKF- Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung der Universität Leipzig) ermittelt. Die Sequenzen wurden zunächst mit dem Programm BLAST (ALTSCHUL et al. 1997) überprüft. Die anschließende Bearbeitung wurde mit der Software LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin) und dem Programm Chromas (Technelysium Ltd, Tewantin Qld) durchgeführt. Die Sequenzen der komplementären DNA-Stränge wurden mit dem Programm Chromas (Technelysium Ltd, Tewantin Qld) miteinander verglichen, wobei eine Bestätigung bei zweifelhaften Sequenzergebnissen einzelner Nukleotide jeweils durch den komplementären DNA-Strang erfolgten. Anschließend wurden die Sequenzen editiert und in einem Alignment überprüft. Die Sequenzen der überlappenden Amplifikate aller Oligonukleotidpaare aus Tabelle 2 wurden zur vollständigen Sequenz mit einer Länge von 1755bp zusammengefügt. Diese deckt das VP2-Strukturproteingenom komplett ab. 4.6.2 Sequenzanalyse der Hunde- und Katzenproben Die ermittelten Sequenzen der positiven Hunde- und Katzenproben wurden mit je einer Bezugssequenz in einem Alignment nach der clustal-W Methode verglichen. Für die Hundeproben wurde das Alignment mit dem Isolat CPV-d aus dem Jahr 1978, für die Katzenproben mit dem Isolat FPV-b aus dem Jahr 1967 durchgeführt. Die Sequenzen der Isolate wurden aus der Genbank übernommen. Die genauen Angaben sind in Tabelle 6 aufgeführt. Da sich der Vergleich ausschließlich auf das VP2-Strukturprotein bezog, wurde auch bei den beiden Isolaten jeweils nur die VP2-Sequenz verwendet. Die Gesamtlänge der untersuchten Sequenzen betrug 1755bp. Der Vergleich der positiven Hundeproben ergab eine 100%ige Übereinstimmung mit dem Isolat CPV-d. Der Vergleich der Katzenproben mit dem Isolat FPV-b ergab dagegen mehrere Nukleotidaustausche bei einzelnen oder auch mehreren Proben. Genaue Angaben 40 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. dazu sind in Tabelle 9 aufgeführt. Es sind sowohl kodierende als auch nicht kodierende Nukleotidaustausche in dieser Tabelle erfasst. Die kodierenden Nukleotidaustausche sind im Folgenden kurz aufgeführt. Im Vergleich zur Bezugssequenz ist an der NT-Position 694 bei allen Katzenproben statt einem A ein G vorhanden. Daraus ergibt sich an der Aminosäurenposition 232 eine Änderung von Isoleucin zu Valin. Mit Ausnahme dieser Mutation sind die weiteren kodierenden Nukleotidaustausche nur bei einzelnen Proben vorhanden. Diese finden sich an den NT-Postionen 271 (K361/75 GT und K363/76 GA), 274 (K430/78 GA), 415 (K386/77 GA) und 1232 (K361/75 AC). Diese Nukleotidaustausche führen auf den entsprechenden Aminosäurepositionen zu folgenden Veränderungen: 91 AS (K361/75), 91 AT (K363/76), 92 VI (K430/78), 139 VI (K386/77) und 411 EA (K361/75). 41 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 9: Nukleotid- und Aminosäurenunterschiede im VP2-Gen aller Katzenproben im Vergleich mit FPV-b NukleotidPosition 99 FPV-b K174 K195 K232 K277 K281 K308 K361 K363 K386 K425 K430 Amino70 71 72 73 73 74 75 76 77 78 78 säurenPosition GGT ------------------C ----33 FPV-b K174 K195 K232 K277 K281 K308 K361 K363 K386 K425 K430 70 71 72 73 73 74 75 76 77 78 78 G - - - - - - - - G - - 135 TTC --- --- --- --- --- --T --- --- --- --- --- 45 F - - - - - F - - - - - 171 GGG --A --A --A --A --A --A --A --A --A --A --A 57 G G G G G G G G G G G G 183 ATC --T --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 61 I I - - - - - - - - - - 246 GTA --- --G --- --- --- --- --- --- --- --- --- 82 V - V - - - - - - - - - 271 GCA --- --- --- --- -- --- T-- A-- --- --- --- 91 A - - - - - - S T - - - 274 GTT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- A-- 92 V - - - - - - - - - - I 415 GTT --- --- --- --- --- --- --- --- A-- --- --- 139 V - - - - - - - - I - - 448 TTA --- --- --- --- --- C-- --- --- --- --- --- 150 L - - - - - L - - - - - 501 AAT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --C 167 N - - - - - - - - - - N 585 TTG --- --- --A --- --- --- --A --- --- --- --- 195 L - - L - - - L - - - - 648 AGA --- --- --- --- --- --G --- --- --- --- --- 216 R - - - - - R - - - - - 694 ATA G-- G-- G-- G-- G-- G-- G-- G-- G-- G-- G-- 232 I V V V V V V V V V V V 699 TAT --- --C --- --- --- --- --- --- --- --- --- 233 Y - Y - - - - - - - - - 738 ATT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- 246 I - - - - - - - - - I - 801 TTT --- --- --- --C --- --- --- --- --- --- --- 267 F - - - F - - - - - - - 804 TTT --- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- 268 F - - - - - F - - - - - 810 TGC --T --T --T --T --T --T --T --T --T --T --T 270 C C C C C C C C C C C C 855 TTG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- 285 L - - - - - - - - - L - 871 TTA C-- C-- C-- C-- --- C-- C-- C-- C-- C-- C-- 291 L L L L L - L L L L L L 1041 GCG --- --- --- --- --- --- --- --A --- --- --A 347 A - - - - - - - A - - A 1092 GCG --- --- --- --A --- --- --- --- --- --- --- 364 A - - - A - - - - - - - 1232 GAA --- --- --- --- --- --- -C- --- --- --- --- 411 E - - - - - - A - - - - 1290 TTG --- --- --- --- --- --- --- --- --A --- --- 430 L - - - - - - - - L - - 1470 TGT --- --- --- --- --- --C --- --- --- --- --- 490 C - - - - - C - - - - - 1521 ACG --A --- --- --- --A --A --A --A --A --- --A 507 T T - - - T T T T T - T 1572 TAT --C --C --- --- --C --C --C --C --C --- --C 524 Y Y Y - - Y Y Y Y Y - Y 1710 AAA --- --- --- --- --- --- --G --- --- --- --- 570 K - - - - - - K - - - - 42 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Auf der Grundlage eines Alignments nach clustalW wurde Tabelle 10 erstellt, die die Übereinstimmung der Katzenproben untereinander und zu den Isolaten CPV-d und FPV-b zeigen. In der oberen Hälfte der durch eine Diagonale geteilten Tabelle sind die Übereinstimmungen auf Nukleotidebene, in der unteren Hälfte auf Aminosäureebene in Prozent dargestellt. Im Vergleich der Katzenproben mit dem FPV-b Isolat liegt ein Schwankungsbereich der Übereinstimmungen auf Nukleotidebene von 99,4 bis 99,7% vor. Abweichungen der Katzenproben untereinander sind von 0,5 bis 0,1% zu verzeichnen, die einer Homologie von > 99,5% entsprechen. Im Vergleich mit dem CPV-d Isolat sind größere Unterschiede vorhanden. Diese liegen zwischen 1,1 und 0,7%. Der Unterschied zwischen den beiden Isolaten beläuft sich auf 1%. Auf Aminosäureebene liegt der Schwankungsbereich der Übereinstimmungen der Proben zu dem Isolat FPV-b zwischen 99,3% als niedrigsten und 99,7% als höchsten Wert. Die Katzenproben untereinander zeigen Unterschiede zwischen 0,7 und 0,2%. Vergleich der Proben mit dem Isolat CPV-d ergab entsprechend der Unterschiede auf Nukleotidebene größere Unterschiede im Bereich von 2,1 bis 1,7%. Die Isolate untereinander unterscheiden sich auf Aminosäureebene um 1,5%. Auf eine Darstellung der Hundeproben wurde Übereinstimmung mit dem Isolat CPV-d verzichtet. 43 aufgrund der 100%igen Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 10: Sequenzübereinstimmungen der Parvovirussequenzen der Katzenproben untereinander sowie mit FPV-b und CPV-d in Prozent ----- FPVb CPV- K174/ K195/ K232/ K277/ K281/ K308/ K361/ K363/ K386/ K425/ K430/ d 70 71 72 73 73 74 75 76 77 78 78 FPV-b ----- CPV-d 98.5 ----- K174/70 99.7 98.3 ----- K195/71 99.7 98.3 99.8 ----- K232/72 99.7 98.3 99.8 99.8 ----- K277/73 99.7 98.3 99.8 99.8 99.8 ----- K281/73 99.7 98.3 99.8 99.8 99.8 99.8 ----- K308/74 99.7 98.3 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 ----- K361/75 99.3 97.9 99.5 99.5 99.5 99.5 99.5 99.5 ----- K363/76 99.5 98.1 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.5 ----- K386/77 99.5 98.1 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.3 99.5 ----- K425/78 99.7 98.3 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.5 99.7 99.7 ----- K430/78 99.5 98.1 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.3 99.5 99.5 99.7 ----- 99.0 99.6 99.6 99.7 99.7 99.7 99.4 99.4 99.5 99.5 99.7 99.5 99.1 99.3 99.0 99.0 99.1 98.9 99.0 99.1 99.0 99.0 99.0 99.8 99.8 99.7 99.9 99.7 99.7 99.8 99.8 99.7 99.8 99.8 99.7 99.8 99.5 99.6 99.7 99.7 99.7 99.7 99.8 99.8 99.5 99.7 99.7 99.7 99.8 99.7 99.7 99.5 99.5 99.7 99.6 99.8 99.6 99.7 99.7 99.8 99.8 99.7 99.8 99.5 99.6 99.5 99.5 99.5 99.7 99.6 99.5 99.6 99.7 99.7 99.8 99.6 99.7 99.6 Aminosäure Die phylogenetischen Untersuchungen wurden mit den in Tabelle 6 aufgeführten Isolaten durchgeführt. Da sich die Untersuchungen auf das VP2-Strukturprotein beschränkten, wurde dementsprechend von den einzelnen Isolaten ausschließlich die Sequenz des VP-2 Gens für das Alignment verwendet. Die Gesamtlänge betrug 1755bp. Ausnahmen bildeten die Isolate CPV-Pudel und CPV-ChowChow, die das VP2-Gen mit einer Länge von 1593bp nur partiell abdecken. Das Alignment wurde mit der clustal-W Methode durchgeführt und diente als Grundlage für die Erstellung phylogenetischer Stammbäume auf Nukleotid- und Aminosäureebene. Die phylogenetische Verwandtschaft der einzelnen Insolate und der Proben wurde anhand dieser Stammbäume untersucht. Es lassen sich zwei Cluster unterscheiden. Zum einen ein Cluster mit CPV-ähnlichen Parvoviren mit Viren von Hund und Marderhund und zum anderen ein Cluster mit FPV-ähnlichen Viren von Katze, Nerz und Waschbär. In dem Cluster mit CPV-ähnlichen Viren lassen sich zwei Unterkomplexe unterscheiden. Einer beinhaltet den Typ CPV-2, der andere die 44 DNA Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. neueren Typen CPV-2a und 2b. Die untersuchten Sequenzen der positiven Hundeproben ordnen sich in den Unterkomplex des CPV-2 Typs ein. Bei dem Cluster, der durch die FPV-ähnlichen Viren gebildet wird, lässt sich keine eindeutige Bildung von Unterkomplexen erkennen. Die Proben ordnen sich zwischen die einzelnen Sequenzen der FPV-, MEV- und RPV-Isolate ein. Eine zeitliche Einordnung der Proben zu älteren FPV-Isolaten ist nicht zu erkennen. 45 Diskussion 5 Diskussion Der Zeitpunkt der weltweiten Ausbreitung des CPV-2 in den Hundepopulationen in einer Pandemie wird auf das Jahr 1978 datiert. Neuere Studien, die eine große Zahl von CPV-Sequenzen aus den 1970er Jahren untersuchten, kamen zu den Schluss, dass sich dieses Virus bereits 10 Jahre früher in den caninen Populationen befunden haben musste (SHACKELTON et al. 2005a). Ebenso wird angenommen, dass CPV-2a schon einige Jahre früher (ab 1976) zusammen mit CPV-2 in den Populationen existierte. Gestützt wird diese Annahme unter anderem durch eine Untersuchung aus Griechenland, die retrospektiv in einer Hundeprobe aus dem Jahr 1974 CPV-Antikörper nachwies (KOPTOPOULOS et al. 1986a). Alle Untersuchungen im Hinblick auf einen möglichen Anzestor des caninen Parvovirus haben bis heute noch zu keinem eindeutigen Ergebnis geführt. Gestützt auf die Annahme, dass CPV vor 1978 in den caninen Populationen vorgekommen sein müsste, wurden in dieser Arbeit Gewebeproben aus den Jahren 1970 bis 1978 von Katzen, Hunden und Wildtieren (Waschbär) aus dem pathologischen Archiv des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover untersucht. Ziel war es, eine mögliche intermediäre Form zwischen FPV und CPV in den Proben zu finden und damit einen Anzestor des caninen Parvovirus zu identifizieren. 5.1 Nachweismethoden Die Aufreinigung der paraffineingebetteten Gewebeproben von Hunden und Katzen aus diesem Zeitraum erfolgte mit Xylol und 100%igem Ethanol nach der von Truyen et al. (1994) beschriebenen Methode. Für eine vollständige Lyse des Gewebes war es notwendig, die Proben über Nacht zu inkubieren. Hunde- und Katzenproben wurden jahrgangsweise Aufreinigung wurde und eine getrennt voneinander Negativkontrolle aufgereinigt. mitgeführt, um eine Bei jeder mögliche Kontamination ausschließen zu können. Der Nachweis von CPV / FPV in diesen Proben wurde mit Hilfe der PCR durchgeführt. Die verwendeten Oligonukleotide M1RE und M2RE wurden aus der Studie von STEINEL et al. (2000) übernommen. Nach Etablierung der PCR mit einer ausreichenden Sensitivität von 10 bis 100 Kopien pro Reaktionsansatz wurden 46 Diskussion diese für den Nachweis der parvoviralen DNA in den Proben benutzt. Dieses Oligonukleotidpaar ergibt Amplifikate, die sich innerhalb des VP2-Gens befinden und eine Länge von 240bp aufweisen. Im Hinblick auf die vollständige Sequenzierung des VP2-Gens ergaben sich Probleme bei der Übernahme weiterer von STEINEL et al. (2000) verwendeten Oligonukleotidpaare, die DNA-Fragmente in der Größenordnung von ca. 500 bis 900bp amplifizieren. Mit diesen waren bei den Proben keine Ergebnisse zu erzielen. Grund dafür kann die Behandlung der Proben mit Formalin und Paraffin bei der Fixierung des Gewebes gewesen sein, die zu einem erhöhten Auftreten von Einzelstrangbrüchen der parvoviralen DNA geführt hat. Zur vollständigen Sequenzierung des VP2-Gens wurden aus diesem Grund Oligonukleotidpaare erstellt, die kleinere DNA-Fragmente amplifizieren (150bp bis 250bp). Bei allen positiven Hundeproben und einigen ausgewählten positiven Katzenproben konnte mit diesen 15 Oligonukleotidpaaren das vollständige VP2-Gen amplifiziert und sequenziert werden. Bei einer positiven Waschbärprobe war es allerdings mit diesen Oligonukleotiden nicht möglich, die vollständige Sequenz zu ermitteln. Bei allen Polymerase-Kettenreaktionen wurden sowohl Positiv- (aufgereinigter Zellkulturüberstand des Isolats CPV-d) als auch Negativkontrollen mitgeführt. Die Negativkontrollen, die bei der Aufreinigung der Proben und bei der Herstellung der Versuchsansätze für die PCR mitgeführt wurden, waren bei allen Durchläufen negativ, so dass eine Kontamination während dieser Arbeitsschritte ausgeschlossen werden konnte. Als Kontrolle einer möglichen Kontamination während der Probennahme mit Hilfe des Schlittenmicrotoms wurden zwischen den einzelnen Proben Paraffinschnitte eines Gewebes einer anderen Spezies (Hirsch) entnommen. Diese Proben wurden bei allen positiven Hundeproben und stichprobenweise bei den positiven Katzenproben im Hinblick auf eine mögliche Kontamination überprüft. Alle untersuchten Hirschproben waren negativ, so dass auch hier eine Kontamination ausgeschlossen werden konnte. 5.2 Sequenzanalyse In einer als Hundeprobe gekennzeichneten Probe aus dem Jahr 1973 wurden FPVtypische Sequenzen nachgewiesen. Die ermittelte Sequenz ordnete sich in einem Stammbaum mit FPV- und CPV-Sequenzen eindeutig in den FPV-Cluster ein. 47 Diskussion Aufgrund der eindeutigen Zuordnung zu den FPV-Isolaten wurde eine Überprüfung der Spezies des Gewebes vorgenommen. Diese ergab, dass es sich um Gewebe einer Katze und nicht um das eines Hundes handelt. Das feline PanleukopenieVirus wurde demnach bei einer Katze nachgewiesen. Somit konnte diese Probe nicht, wie zunächst angenommen, zur Aufklärung der Herkunft des CPV beitragen. Im untersuchten Zeitraum von 1970-1978 wurde in drei Hundeproben das CPV-2 nachgewiesen. Zwei Proben stammen aus dem Jahr 1978 und eine Probe aus dem Jahr 1977. Der Nachweis des caninen Parvovirus in einer Hundeprobe aus 1977 stützt die Annahme, dass CPV-2 schon vor 1978 in den Hundepopulationen existierte. Durch Sequenzvergleiche auf Nukleotid- und Aminosäureebene und anhand der daraus abgeleiteten Stammbäume konnten die Sequenzen der drei positiven Hundeproben eindeutig den CPV-2-Isolaten zugeordnet werden. Im Vergleich mit der Referenzsequenz CPV-d war eine 100%ige Übereinstimmung vorhanden. Eine mögliche Kontamination der Proben mit der Positivkontrolle (Zellkulturüberstand des Isolats CPV-d) konnte ausgeschlossen werden, da sich in einem Sequenzvergleich auf Nukleotidebene ein Unterschied zwischen den Hundeproben und der Positivkontrolle an der Position 1123 (AG) zeigte. Auf Aminosäureebene führt dies an Position 375 zu einer Substitution von Asparagin zu Aspartat bei der Positivkontrolle. Damit unterscheidet sich die Sequenz des Zellkulturüberstandes des Isolats CPV-d von den Sequenzen der Hundeproben aber auch von der CPV-d-Sequenz , die in der Genbank-Datenbank hinterlegt ist. Die Ursache für den Unterschied zwischen der hinterlegten CPV-d-Sequenz und der CPV-d-Sequenz aus der Zellkultur kann in der wiederholten Passagierung des Virus in Zellkultur liegen. Eine Kontamination der Hundeproben untereinander kann aufgrund der negativen Ergebnisse der Hirschproben sowie der Negativkontrollen ausgeschlossen werden. Die Stammbaumanalyse ergab, dass sich die Sequenzen der Hundeproben eindeutig in die Gruppe der CPV-2 –Viren einordnen und bestätigen das Bild, dass 1978 beziehungsweise wie in dieser Arbeit gezeigt, bereits 1977 Hunde in Deutschland mit CPV-2 infiziert waren. Bei den untersuchten Sequenzen der Katzenproben ergaben sich im Vergleich zur Referenzsequenz FPV-b einige kodierende und nicht-kodierende Nukleotidunterschiede. Diese vereinzelt bei den 48 Diskussion Proben vorkommenden Mutationen scheinen zufällige nicht gerichtete oder selektierte Veränderungen im Genom darzustellen. Bei der Analyse der Stammbäume auf Nukleotid- und Aminosäureebene ließ sich für die FPV-Sequenzen keine Gruppierung der Proben entsprechend des Zeitpunkts der Isolierung erkennen. Die Distanztabelle mit den Sequenzen des VP2-Gens der Parvovirus-positiven Katzenproben und den Isolaten CPV-d und FPV-b bestätigt die in verschiedenen Studien dargestellte hohe Homologie > 98% zwischen CPV und FPV. Die Abweichungen auf Nukleotidebene lagen zwischen 0,1 und 1,1%, auf Aminosäureebene zwischen 0,2 und 2,1%. 5.3 Abschließende Betrachtung Die hier beschriebenen Untersuchungen zeigen, dass sich sowohl die ermittelte Sequenz einer positiven Hundeprobe aus dem Jahr 1977 als auch die Sequenzen der beiden anderen positiven Hundeproben aus 1978 typische CPV-2-Sequenzen darstellen. Es konnte somit eine Probe vor der Erstbeschreibung 1978 identifiziert werden, die die Theorie stützt, dass CPV bereits vor 1978 in den Hundepopulationen existierte. Aufgrund der 100%igen Übereinstimmung der Sequenzen untereinander und mit CPV-2 Sequenzen aus der Genbank wird die Vermutung untermauert, dass alle CPV-Isolate auf einen einzigen Anzestor zurückgeführt werden können. Im Hinblick auf die Anzestorfrage erscheint es sinnvoll, weitere Proben aus den frühen 1970er Jahren zu untersuchen. Durch die Möglichkeit, Virus-DNA aus paraffineingebetteten Geweben amplifizieren und sequenzieren zu können, ist die Untersuchung dieser Fragestellung leicht möglich. Der Nachweis des caninen Parvovirus in Hundeproben oder in Proben von Wildtieren aus dieser Zeit könnte dazu beitragen, den Entstehungsmechanismus weiter aufzuklären. 49 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 6 Zusammenfassung Charakterisierung von caninen und felinen Parvoviren in archiviertem Organmaterial aus den Jahren 1970 bis 1978 Nicola Rückert Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im August 2006 89 Seiten, 10 Abbildungen, 15 Tabellen, 100 Literaturstellen Schlüsselworte: canines Parvovirus, CPV-2, VP2, Evolution, paraffineingebettetes Gewebe, PCR, Phylogenie Das canine Parvovirus (CPV-2) wurde erstmals bei Hunden im Jahr 1978 beschrieben. Dieses Virus verbreitete sich innerhalb weniger Monate weltweit in einer schweren Pandemie. Retrospektiv wird angenommen, dass es sich aus dem Felinen Panleukopenie-Virus (FPV) oder einem nah verwandten Virus entwickelt hat. CPV-2 und FPV sind genetisch sehr ähnlich und zeigen eine Identität auf DNAEbene von >98%. Zur Entstehung des CPV-2 gibt es verschiedene Theorien. Neueste Studien, welche die Substitutionsraten von Parvovirusisolaten untersuchten, kamen zu dem Ergebnis, dass CPV-2 bereits 10 Jahre vor der Erstbeschreibung in 1978 in den Hundepopulationen hat zirkulieren müssen. Ziel dieser Arbeit war es, durch Untersuchung von archivierten paraffineingebetteten Gewebeproben von Hunden und Katzen aus den frühen 1970iger Jahren einen möglichen Anzestor des caninen Parvovirus zu identifizieren und die Hypothese zu überprüfen, dass CPV-2 schon vor 1978 in den Hundepopulationen zirkulierte. Auswahlkriterien für die Entnahme von Gewebeproben waren pathologische (v.a. akute Gastroenteritis, Myokarditis (Hd.) ) sowie histopathologische Befunde (z.B. Zottenatrophie). Vorberichtliche Erwähnungen wie z.B. Erbrechen und Durchfall, hämorrhagische Enteritis, Lymphopenie, Welpensterben als Bestandsproblem wurden ebenfalls als Hinweise für eine Infektion mit Parvoviren gewertet. Auf der Grundlage dieser Auswahlkriterien wurden aus den Jahren 1970 bis 1980 aus dem 50 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Archiv des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 204 Proben ausgewählt und mit Hilfe der PCR untersucht. Nachdem mit einem Oligonukleotidpaar (M1RE /M2RE) das Vorkommen von FPV oder CPV in den Proben nachgewiesen wurde, erfolgte eine Auswahl Parvoviruspositiver Proben aus den Jahren 1970 bis 1978 für die vollständige Sequenzierung des VP2-Gens. Es wurden alle Parvovirus-positiven Hundeproben (zwei Proben aus 1978 und eine Probe aus 1977) und 11 Parvovirus-positive Katzenproben untersucht. Um das 1755bp große VP2-Gen sequenzieren zu können, wurden 15 Oligonukleotidpaare erstellt, die überlappende Amplifikate in einer Größenordnung von ca. 150 bis 250bp amplifizieren. Die ermittelten Sequenzen der Hunde- und Katzenproben wurden jeweils mit einer Referenzsequenz untereinander verglichen. und zu der Die Sequenzen Referenzsequenz der Hundeproben (CPV-d) eine wiesen 100%ige Übereinstimmung auf. Dagegen waren bei den Sequenzen der Katzenproben einige kodierende und nicht kodierende Nukleotidaustausche im Vergleich mit der Referenzsequenz (FPV-b) vorhanden. Unter den untersuchten Sequenzen konnte ein Anzestor des caninen Parvovirus nicht identifiziert werden. Es konnte aber 1977 in einer Hundeprobe CPV-2 nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis stützt die Theorie, dass CPV-2 bereits vor der Erstbeschreibung 1978 in den Hundepopulationen existiert haben muss. 51 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 7 Summary Characterization of canine and feline parvoviruses in archived tissue samples from 1970 to 1978 Nicola Rückert Institute of Animal Hygiene and Veterinary Public Health Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in August 2006 89 pages, 10 figures, 15 tables, 100 references Keywords: canine parvovirus, CPV-2, VP2, evolution, paraffin-embedded tissues, PCR, phylogeny Canine parvovirus (CPV-2) was first isolated as the cause of disease in dogs in 1978. Within a few months CPV-2 spread epidemically worldwide. In retrospective it is clear that CPV-2 emerged from feline panleukopenia virus (FPV) or a closley related virus. CPV-2 and FPV are >98% identical in their DNA sequences and very similar antigenically. There are many theories about the evolution of CPV-2 and recent studies determined substitution rates of several parvoviruses. The results indicate, that CPV-2 circulated in the canine population up to 10 years before it was first recognized. The goal of the study was to identify a possible ancestor of the canine parvovirus and to determine if CPV-2 was prevalent in dog population prior to 1978. Proofing this hypothesis archived paraffin-embedded tissue samples from dogs and cats from 1970 to 1978 were investigated. Tissue samples had been selected on the basis of pathological (especially gastroenteritis, myocarditis (puppies)) and histopathological (e.g. necrosis of the crypt cells of the intestinal epithelium) results. Reports of vomiting, diarrhoea, haemorrhagic enteritis, lymphopenia, death of puppies were also regarded as possible symptoms of an infection with parvoviruses. On the basis of these conditions 204 samples from 1970-1980 were selected from the Institute of Pathology of the University of Veterinary Medicine, Hannover and investigated by polymerase chain reaction. In a first assay, samples were tested for 52 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. the presence of CPV-2 or FPV with primer pair M1RE and M2RE. Then the VP2gene with a total length of 1755 bp of all positive samples from 1970-1978 from dogs (two from 1978, one from 1977) and 11 samples from cats were amplified and sequenced. Fifteen Primer pairs were designed to amplify overlapping fragments of 150 to 250 nucleotides in length. The sequences were compared with reference sequences retrieved from the Genbank. The dog samples were 100% identical to the reference sequence CPV-d. The cat samples showed several coding and non-coding single nucleotide substitutions in comparison with reference sequence FPV-b. In conclusion of this study we were able to identify a CPV-2 sequence in one dog sample from 1977, supporting the hypothesis that CPV-2 was already present prior 1978 in the German dog population. 53 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis Agbandje M, McKenna R, Rossmann MG, Strassheim ML, Parrish CR. Structure determination of feline panleukopenia virus empty particles. Proteins. 1993a;16(2):155-71. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997;25(17):3389-402. Appel MJ, Scott FW, Carmichael LE. Isolation and immunisation studies of a canine parco-like virus from dogs with haemorrhagic enteritis. Vet Rec. 1979;105(8):156-9. Astell CR, Chow MB, Ward DC. Sequence analysis of the termini of virion and replicative forms of minute virus of mice DNA suggests a modified rolling hairpin model for autonomous parvovirus DNA replication. 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Gewebe 1980 552 S 4209/80 Darm 549 S 4159/80 Darm 556 S 4290/80 Darm 574 S 4531/80 Darm 576 S 4801/80 Herz 583 S 5378/80 Darm 580 S 4952/80 Darm 593 S 5608/80 Darm 584 S 5470/80 Darm 604 S 5981/80 Darm 585 S 5514/80 Herz 605 S 6039/80 Darm 600 S 5791/80 Darm 615 S 6221/80 Darm 610 S 6161/80 Darm 616 S 6227/80 Darm 621 S 6312/80 Darm 624 S 6339/80 Darm 656 S 6538/80 Darm 631 S 6362/80 Darm 488 S 2060/79 Darm 497 S 2442/79 Darm 490 S 2110/79 Darm 503 S 3056/79 Darm 491 S 2126/79 Darm 505 S 3112/79 Darm 494 S 2335/79 Darm 507 S 3207/79 Darm 498 S 2520/79 Darm 510 S 3414/79 Darm 513 S 3530/79 Darm 515 S 3544/79 Darm 518 S 3580/79 Darm 516 S 3553/79 Darm 531 S 3726/79 Darm 519 S 3591/79 Darm 533 S 3769/79 Darm 528 S 3700/79 Darm 541 S 4063/79 Darm 535 S 3795/79 Darm 431 S 6772/78 Darm 425 S 6599/78 Darm 437 S 6931/78 Darm 428 S 6718/78 Darm 443 S 195/78 Darm 429 S 6728/78 Darm 445 S 300/78 Darm 430 S 6757/78 Darm 447 S 326/78 Darm 436 S 6918/78 Darm 455 S 772/78 Darm 444 S 259/78 Darm 458 S 880/78 Darm 452 S 663/78 Darm 1979 1978 63 Anhang 1977 1976 1975 Hund Sektions-Nr. Gewebe Katze Sektions-Nr. Gewebe 472 S 1401/78 Darm 453 S 708/78 Darm 478 S 1638/78 Herz 462 S 1098/78 Darm 464 S 1111/78 Darm 476 S 1527/78 Darm 389 S 5034/77 Darm 386 S 4699/77 Darm 398 S 5533/77 Darm 390 S 5043/77 Darm 403 S 5731/77 Darm 391 S 5134/77 Darm 404 S 5732/77 Darm 394 S 5342/77 Darm 417 S 6222/77 Darm 399 S 5534/77 Darm 420 S 6357/77 Darm 400 S 5616/77 Darm 421 S 6361/77 Darm 408 S 5898/77 Darm 422 S 6415/77 Darm 410 S 5969/77 Darm 412 S 5984/77 Darm 416 S 6171/77 Darm 366 S 2771/76 Darm 363 S 2588/76 Darm 367 S 2775/76 Darm 365 S 2744/76 Darm 369 S 2833/76 Darm 371 S 3397/76 Darm 372 S 3631/76 Herz 374 S 3771/76 Darm 379 S 4113/76 Darm 375 S 3934/76 Darm 381 S 4295/76 Darm 376 S 3967/76 Darm 378 S 3985/76 Darm 383 S 4443/76 Darm 384 S 4458/76 Darm 385 S 4487/76 Darm 345 S 1191/75 Herz 337 S 674/75 Darm 348 S 1617/75 Herz/Darm 338 S 704/75 Darm 354 S 2152/75 Herz 340 S 859/75 Darm 362 S 2547/75 Herz 341 S 924/75 Darm 342 S 974/75 Darm 347 S 1450/75 Darm 351 S 2115/75 Darm 352 S 2135/75 Darm 359 S 2467/75 Darm 361 S 2503/75 Darm 64 Anhang Jahr Hund Sektions-Nr. Gewebe Katze Sektions-Nr. Gewebe 1974 305 S 5706/74 Darm/Herz 307 S 5823/74 Darm 316 S 6457/74 Darm 308 S 5830/74 Darm 322 S 93/74 Darm 309 S 5945/74 Darm 323 S 105/74 Herz 313 S 6296/74 Darm 331 S 538/74 Darm 318 S 6472/74 Darm 332 S 539/74 Darm 324 S 234/74 Darm 335 S 650/74 Darm 326 S 408/74 Darm 328 S 459/74 Darm 329 S 460/74 Darm 334 S 587/74 Darm 1973 1972 256 S 3883/73 Darm 258 S 4005/73 Darm 257 S 3888/73 Darm 259 S 4013/73 Darm 264 S 4165/73 Darm 260 S 4025/73 Darm 265 S 4265/73 Darm 267 S 4362/73 Darm 268 S 4428/73 Herz 273 S 4607/73 Darm 269 S 4562/73 Herz 277 S 4735/73 Darm 272 S 4587/73 Darm 278 S 4887/73 Darm 275 S 4630/73 Darm 279 S 4888/73 Darm 276 S 4634/73 Darm 281 S 5102/73 Darm 271 S 4585/73 Darm 274 S 4614/73 Herz 286 S 5313/73 Darm 287 S 5318/73 Darm 290 S 5359/73 Darm 292 S 5373/73 Darm 293 S 5374/73 Darm 301 S 5523/73 Darm 222 S 2052/72 Darm 221 S 2049 Darm 224 S 2070/72 Darm 227 S 2187 Darm 229 S 2336/72 Darm 232 S 2664 Darm 238 S 3001/72 Herz 240 S 3152 Darm 241 S 3178/72 Darm 243 S 3528 Darm 65 Anhang 1971 1970 Hund Sektions-Nr. Gewebe Katze Sektions-Nr. Gewebe 242 S 3187/72 Darm 244 S 3524 Darm 245 S 3529/72 Darm 246 S 3538 Darm 252 S 3749/72 Herz 249 S 3669 Darm 250 S 3679 Darm 251 S 3747 Darm 191 S 220/71 Herz 193 S 569/71 Darm 192 S 444/71 Darm 194 S 570/71 Darm 198 S 614/71 Herz 195 S 571/71 Darm 207 S 899/71 Darm 196 S 588/71 Darm 208 S 986/71 Darm 210 S 1099/71 Darm 213 S 1825/71 Darm 214 S 1841/71 Darm 217 S 1936/71 Darm 215 S 1853/71 Darm 173 S 419/70 Herz 171 S 246 Darm 176 S 661/70 Darm 172 S 297 Darm 177 S 723/70 Darm 174 S 469 Darm 180 S 1295/70 Herz 179 S 881 Darm 181 S 1339/70 Herz 183 S 1384 Darm 182 S 1367/70 Darm/Herz 184 S 1521 Darm 186 S 1849/70 Herz 187 S 1850/70 Herz 188 S 1851/70 Herz Tabelle 12: Ausgewählte Proben anderer Tierarten Jahr Tierart Fall Sektions-Nr. Gewebe 1967 Nerz 108 S 1014/67 Herz/Darm Nerz 109 S1015/67 Herz/Darm 1972 Wolf 225 S 2098/72 Darm 1973 Nerz 294 S 5384/73 Darm 1974 Waschbär 320 S 42/74 Darm Waschbär 321 S 43/74 Darm 66 Anhang Tabelle 13: Parvovirus-positive Proben bei Hunden (1970-1980) Fall SektionsNr. Diagnose/ Befund Alter Gewebe Vorbericht S 5102/73 Hämorrhagisch-katarrhalische Enteritis 8 Wo. Darm Schreien, blutiger Durchfall, Erbrechen S 6357/77 Enteritis cat., hgr. Schwellung der Mesenterial Lnn. 10 Wo. Darm ? 455 S 772/78 Hgr. fibrinöse Enteritis 7 Wo. Darm Durchfall, mehrere Tiere tot 464 S 1111/78 Gastroenteritis cat. acuta 11 Wo. Darm Erbrechen, Durchfall, gestorben 490 S 2110/79 hgr. ulzerierende Enteritis 10 Wo. Darm verendet 498 S 2520/79 Enteritis cat. akuta juvenil Darm Erbrechen, blutiger Durchfall, Bestand krank 513 S 3530/79 Enteritis, Verlust der Darmschleimhaut 16 Mon Darm Erbrechen, Durchfall 518 S 3580/79 Virusinfektion unbekannter Genese ? Darm Erbrechen, blutiger Durchfall 513 S 3726/79 Gastroenteritis, ulzerierte Darmschleimhaut 8 Wo. Darm gestorben 552 S 4209/80 Enteritis (Parvoviren) 13 Wo. Darm Hämorrhagische Enteritis 556 S 4290/80 Virale hämorrhagische Enteritis 3 Mon. Darm Erbrechen, blutiger Durchfall 580 S 4952/80 Parvo-Virus-Enteritis 4 Mon. Darm Erbrechen, Durchfall, Panleukopenie 585 S 5514/80 Parvovirusenteritis 10 Wo. Herz Erbrechen, Durchfall 600 S 5791/80 Parvovirusinfektion 9 Wo. Darm Erbrechen, Druchfall 610 S 6161/80 Parvovirusinfektion 12 Wo. Darm Erbrechen, Durchfall 1973 281 1977 420 1978 1979 1980 67 Anhang 621 S 6312/80 fibrinöse Auflagerung Darm, wässrig-blutiger Inhalt 8 Mon. Darm Erbrechen, blutiger Druchfall, Parvovirose 656 S 6538/80 Parvovirusinfektion 3 Mon. 68 Darm Erbrechen, Durchfall, aus Tierheim Verdacht Anhang Tabelle 14: Parvovirus-positive Proben bei Katzen (1970-1980) Fall SektionsNr.. Diagnose/ Befund Alter Gewebe Vorbericht 172 S 297/70 Enteritis, Lymphadenitis 8 Mon. Darm gestorben 174 S 469/70 Panleukopenie 9 Mon. Darm ganze Würfe gestorben oder tot geboren 183 S 1384/70 Verdacht Laryngoenteritis, Enteritis cat., Tonsillitis ? Darm häufig Todesfälle im Katzenbestand 184 S 1521/70 hgr. cat. Enteritis 4 Mon. Darm Verdacht Panleukopenie 194 S 570/71 Verdacht Katzenseuche, chronische Enteritis ? Darm plötzlich gestorben 195 S 571/71 Verdacht Laryngoenteritis, Enteritis ? Darm plötzlich gestorben 196 S 588/71 Verdacht Panleukopenie ? Darm Transport von 15 Katzen, davon 4 tot 214 S 1841/71 blutige Enteritis ? Darm Niesen 215 S 1853/71 Panleukopenie Welpe Darm ? 221 S 2049/72 Panleukopenie ? Darm ? 227 S 2187/72 Panleukopenie ? Darm 1 Wurf davon 3 tot 232 S 2664/72 fibrinöse Enteritis 4 Mon. Darm Verdacht Katzenseuche 240 S 3152/72 Panleukopenie, diphteroide Enteritis 5 Mon. Darm Erbrechen, Durchfall, Fieber 243 S 3528/72 hgr. akute kat. Gastroenteritis ? Darm Fieber, Durchfall, gestorben 244 S 3524/72 hgr. akute kat. Gastroenteritis ? Darm Fieber, Durchfall, gestorben 246 S 3538/72 Katzenseuche ? Darm Verdacht Vergiftung 249 S 3669/72 hgr. akute kat. Gastroenteritis ? Darm Verdacht Panleukopenie 1970 1971 1972 69 Anhang Fall Sektions-Nr. Diagnose/ Befund Alter Gewebe Vorbericht 250 S 3679/72 Katzenseuche 5 Mon. Darm ? 259 S 4013/73 Verdacht Panleukopenie 9 Mon. Darm Erbrechen, gestorben 260 S 4025/73 Panleukopenie ? Darm Erbrechen, Durchfall, Fieber 267 S 4362/73 Panleukopenie ? Darm Apathie, Anorexie 273 S 4607/73 Infektiöse Laryngoenteritis 2 Jahre Darm Apathie, Inappetenz 277 S 4735/73 Infektiöse Laryngoenteritis 8 Wo. Darm Stammt aus Tierheim, Inappetenz 279 S 4888/73 Panleukopenie 10 Wo. Darm gestorben 307 S 5823/74 Panleukopenie ? Darm ? 308 S 5830/74 Panleukopenie 1 Jahr Darm 3 Katzen tot, Erbrechen, Durchfall 318 S 647/274 Panleukopenie 17 Mon. Darm Erbrechen, Untertemperatur 324 S 234/74 Panleukopenie adult Darm ? 328 S 459/74 Gastroenteritis 9 Mon. Darm Erbrechen, Durchfall 337 S 674/75 Panleukopenie ? Darm ? 341 S 924/75 Panleukopenie 6 Mon. Darm Erbrechen, Durchfall 342 S 974/75 Panleukopenie jung Darm ? 347 S 1450/75 Panleukopenie 2 Jahre Darm ? 359 S 2467/75 Panleukopenie 4 Mon. Darm Gastroenteritis, Stomatitis 361 S 2503/75 Panleukopenie ? Darm 3 von 7 Katzen tot, Erbrechen, Durchfall 1973 1974 1975 70 Anhang Fall Sektions-Nr. Diagnose/ Befund Alter Gewebe Vorbericht 363 S 2588/76 Panleukopenie 3 Mon. Darm Brechdruchfall 375 S 3934/76 Panleukopenie, Enteritis cat. fibrinosa 2 Mon. Darm Rhinotracheitis 383 S 4443/76 Panleukopenie 1 Jahr Darm Erbrechen 386 S 4699/77 Laryngoenteritis 6 Mon. Darm Ohne Symptome gestorben 390 S 5043/77 / 5 Jahre Darm Verdacht Panleukopenie 391 S 5134/77 Verdacht Panleukopenie 1 Jahr Darm Erbrechen, Durchfall 408 S 5898/77 Gastoenteritis 5 Wo. Darm Brechdurchfall, Bestandserkrankung 410 S 5969/77 hgr. Zottenatrophie 1 Jahr Darm plötzlich tot 412 S 5984/77 Enteritis 1 Jahr Darm ? 416 S 6171/77 Panleukopenie 1 Jahr Darm Inappentenz, gestorben 425 S 6599/78 Panleukopenie 10 Mon. Darm 4 Katzen tot in einer Woche, Apathie 428 S 6718/78 Verdacht Panleukopenie 3 Mon. Darm Erbrechen, Durchfall 430 S 6757/78 Panleukopenie 8 Mon. Darm Verdacht Panleukopenie 436 S 6918/78 Panleukopenie Adult Darm mehrere Katzen nach Erbrechen tot 452 S 663/78 Verdacht Panleukopenie 8 Mon. Darm Erbrechen, Durchfall 462 S 1098/78 Panleukopenie 14 Wo. Darm Erbrechen, Wurfgeschwister tot 476 S 1527/78 Verdacht Panleukopenie 3,5 Mon. Darm aus Tierheim, Erbrechen, Durchfall 1976 1977 1978 71 Anhang Fall Sektions-Nr. Diagnose/ Befund Alter Gewebe Vorbericht 497 S 2442/79 cat. häm. Enteritis 10 Mon. Darm Erbrechen, Durchfall 503 S 3056/79 Enteritis cat. akuta, Verdacht Vergiftung 8 Wo. Darm 3 Katzen plötzlich tot 507 S 3207/79 Enteritis, Verdacht Panleukopenie jung Darm ? 510 S 3414/79 Panleukopenie 11 Wo. Darm Erbrechen, Inappetenz 515 S 3544/79 häm. Enteritis 2 Mon. Darm Erbrechen, Fieber, Apathie 516 S 3553/79 Panleukopenie jung Darm Erbrechen, Durchfall, plötzlich tot 519 S 3591/79 Panleukopenie 2 Mon. Darm plötzlich tot 583 S 5378/80 Verdacht Panleukopenie 10 Wo. Darm Ataxie 593 S 5608/80 Verdacht Panleukopenie 3 Mon. Darm Erbrechen, Inappetenz 605 S 6039/80 Panleukopenie 5 Mon. Darm Erbrechen 615 S 6221/80 Panleukopenie 7 Mon. Darm ? 616 S 6227/80 Panleukopenie 2 Mon. Darm gestorben 1979 1980 Tabelle 15: Parvovirus-positive Proben anderer Tierarten: Waschbär Fall Sektions-Nr. Diagnose/ Befund Alter Gewebe Vorbericht S 42/74 fibrinöse Enteritis ? Darm Wildfang; 1974 321 seit plötzlicher Tod 72 6 Wochen im Gehege; Anhang 9.3 Verwendete Codes genetischer Code 1. Position (5’ Ende) T C A G 2. Position 3. Position T C A G (3’ Ende) Phe Ser Tyr Cys T Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser STOP STOP A Leu Ser STOP Trp G Leu Pro His Arg T Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ile Thr Asn Ser T Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly T Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G universeller genetischer Code A Adenin C Cytosin G Guanin T Thymin 73 Anhang Aminosäuren und ihre Symbole Codons A Ala Alanin GCA GCC C Cys Cystein TGC TGT D Asp Aspartat GAC GAT E Glu Glutamat GAA GAG F Phe Phenylalanin TTC TTT G Gly Glycin GGA GGC H His Histidin CAC CAT I Ile Isoleucin ATA ATC K Lys Lysin AAA AAG L Leu Leucin TTA TTG M Met Methionin ATG N Asn Asparagin AAC AAT P Pro Prolin CCA CCC Q Gln Glutamin CAA CAG R Arg Arginin AGA S Ser Serin T Thr V GCG GCT GGG GGT ATT CTA CTC CCG CCT AGG CGA AGC AGT Threonin ACA Val Valin GTA W Trp Tryptophan TGG Y Tyr Tyrosin TAC 74 CTG CTT CGC CGG CGT TCA TCC TCG TCT ACC ACG ACT GTC GTG GTT TAT Anhang 9.4 Vergleich der Parvovirussequenzen aus den Katzengeweben mit der Referenzsequenz FPV-b Nukleotidsequenz des VP2-Gens 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 A T G A G T G A T G G A G C A G T T C A FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 A C C A G A C G G T G G T C A A C C T G FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 CTGTCAGAAATGAAAGAGCT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 A C A G G A T C T G G G A A C G G G T C FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 81 81 81 81 81 81 81 81 81 81 81 81 TGGAGGCGGGGGTGGTGGTG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 101 101 101 101 101 101 101 101 101 101 101 101 G T T C T G G G G G T G T G G G G A T T FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 TCTACGGGTACTTTCAATA A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 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- - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 ACTTGTACATTTAAATATGC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 181 181 181 181 181 181 181 181 181 181 181 181 A T C A C A G C A A A C T C A A G C A G FPV-b CU4 - - T - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 221 221 221 221 221 221 221 221 221 221 221 CAGAAAGTGAAAATTATAAA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 241 241 241 241 241 241 241 241 241 241 241 241 A G A G T A G T T G T A A A T A A T A T FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - G - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 261 261 261 261 261 261 261 261 261 261 261 261 G G A T A A A A C T G C A G T T A A A G FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - 430 Ktz. 78 281 281 281 281 281 281 281 281 281 281 281 281 GAAACATGGCTTTAGATGAT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 32 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 301 301 301 301 301 301 301 301 301 301 301 301 ACTCATGTACAAATTGTAAC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 321 321 321 321 321 321 321 321 321 321 321 321 ACCTTGGTCATTGGTTGATG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 341 341 341 341 341 341 341 341 341 341 341 341 C A A A T G C T T G G G G A G T T T G G FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 76 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 Anhang 361 361 361 361 361 361 361 361 361 361 361 361 TTTAATCCAGGAGATTGGCA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 381 381 381 381 381 381 381 381 381 381 381 381 ACTAATTGTTAATACTATGA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 401 401 401 401 401 401 401 401 401 401 401 401 GTGAGTTGCATTTAGTTAGT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 421 421 421 421 421 421 421 421 421 421 421 421 TTTGAACAAGAAATTTTTAA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 441 T G T T G T T T T A A A G A C T G T T T 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - C - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 461 461 461 461 461 461 461 461 461 461 461 461 C A G A A T C T G C T A C T C A G C C A FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 481 481 481 481 481 481 481 481 481 481 481 481 CCAACTAAAGTTTATAATAA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 501 501 501 501 501 501 501 501 501 501 501 501 TGATTTAACTGCATCATTGA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 521 521 521 521 521 521 521 521 521 521 521 521 TGGTTGCATTAGATAGTAAT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 541 541 541 541 541 541 541 541 541 541 541 541 AATACTATGCCATTTACTCC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 77 Anhang 561 561 561 561 561 561 561 561 561 561 561 561 AGCAGCTATGAGATCTGAGA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 581 581 581 581 581 581 581 581 581 581 581 581 CATTGGGTTTTTATCCATGG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 601 601 601 601 601 601 601 601 601 601 601 601 AAACCAACCATACCAACTCC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 621 621 621 621 621 621 621 621 621 621 621 621 ATGGAGATATTATTTTCAAT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 641 641 641 641 641 641 641 641 641 641 641 641 GGGATAGAACATTAATACCA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 661 661 661 661 661 661 661 661 661 661 661 661 T C T C A T A C T G G A A C T A G T G G FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 681 681 681 681 681 681 681 681 681 681 681 681 CACACCAACAAATATATATC - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - C- - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 701 701 701 701 701 701 701 701 701 701 701 701 A T G G T A C A G A T C C A G A T G A T FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 721 721 721 721 721 721 721 721 721 721 721 721 GTTCAATTTTATACTATTGA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 741 741 741 741 741 741 741 741 741 741 741 741 AAATTCTGTGCCAGTACACT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 78 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 Anhang 761 761 761 761 761 761 761 761 761 761 761 761 TACTAAGAACAGGTGATGAA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 781 781 781 781 781 781 781 781 781 781 781 781 TTTGCTACAGGAACATTTTT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 801 T T T T G A T T G C A A A C C A T G T A 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 C - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - C - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 801 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 821 821 821 821 821 821 821 821 821 821 821 821 G A C T A A C A C A T A C A T G G C A A FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 841 841 841 841 841 841 841 841 841 841 841 841 ACAAATAGAGCATTGGGCTT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ACAAATAGAGCATTAGGCTT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 861 861 861 861 861 861 861 861 861 861 861 861 ACCACCATTTTTAAATTCTT - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - - - - - - - - - - C- - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 881 881 881 881 881 881 881 881 881 881 881 881 T G C C T C A A T C T G A A G G A G C T FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 901 901 901 901 901 901 901 901 901 901 901 901 ACTAACTTTGGTGATATAGG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 921 921 921 921 921 921 921 921 921 921 921 921 AGTTCAACAAGATAAAAGAC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 941 941 941 941 941 941 941 941 941 941 941 941 G T G G T G T A A C T C A A A T G G G A FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 79 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 Anhang 961 961 961 961 961 961 961 961 961 961 961 961 AATACAGACTATATTACTGA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 981 981 981 981 981 981 981 981 981 981 981 981 AGCTACTATTATGAGACCAG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1001 1001 1001 1001 1001 1001 1001 1001 1001 1001 1001 1001 CTGAGGTTGGTTATAGTGCA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1021 1021 1021 1021 1021 1021 1021 1021 1021 1021 1021 1021 CCATATTATTCTTTTGAAGC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1041 1041 1041 1041 1041 1041 1041 1041 1041 1041 1041 1041 GTCTACACAAGGGCCATTTA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1061 1061 1061 1061 1061 1061 1061 1061 1061 1061 1061 1061 AAACACCTATTGCAGCAGGA - 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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 1181 CACCTGAGAGATTTACATAT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1201 1201 1201 1201 1201 1201 1201 1201 1201 1201 1201 1201 ATAGCACATCAAGATACAGG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1221 1221 1221 1221 1221 1221 1221 1221 1221 1221 1221 1221 AAGATATCCAGAAGGAGATT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1241 1241 1241 1241 1241 1241 1241 1241 1241 1241 1241 1241 GGATTCAAAATATTAACTTT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1261 1261 1261 1261 1261 1261 1261 1261 1261 1261 1261 1261 AACCTTCCTGTAACAAATGA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1281 1281 1281 1281 1281 1281 1281 1281 1281 1281 1281 1281 T A A T G T A T T G C T A C C A A C A G FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - 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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 1341 ATTTAATACTTATGGTCCTT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 81 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 Anhang 1361 1361 1361 1361 1361 1361 1361 1361 1361 1361 1361 1361 TAACTGCATTAAATAATGTA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1381 1381 1381 1381 1381 1381 1381 1381 1381 1381 1381 1381 CCACCAGTTTATCCAAATGG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1401 1401 1401 1401 1401 1401 1401 1401 1401 1401 1401 1401 TCAAATTTGGGATAAAGAAT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1421 1421 1421 1421 1421 1421 1421 1421 1421 1421 1421 1421 TTGATACTGACTTAAAACCA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1441 1441 1441 1441 1441 1441 1441 1441 1441 1441 1441 1441 A G A C T T C A T G T A A A T G C A C C FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 1461 1461 1461 1461 1461 1461 1461 1461 1461 1461 1461 1461 ATTTGTTTGTCAAAATAATT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1481 1481 1481 1481 1481 1481 1481 1481 1481 1481 1481 1481 GTCCTGGTCAATTATTTGTA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1501 1501 1501 1501 1501 1501 1501 1501 1501 1501 1501 1501 A A A G T T G C G C C T A A T T T A A C FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 1521 G A A T G A A T A T G A T C C T G A T G FPV-b CU4 1521 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 1521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 1521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 1521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 1521 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 1521 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 1521 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 1521 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 1521 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 1521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 1521 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 1541 1541 1541 1541 1541 1541 1541 1541 1541 1541 1541 1541 C A T C T G C T A A T A T G T C A A G A FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 82 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 Anhang 1561 1561 1561 1561 1561 1561 1561 1561 1561 1561 1561 1561 A T T G T A A C T T A T T C A G A T T T FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - 430 Ktz. 78 1581 1581 1581 1581 1581 1581 1581 1581 1581 1581 1581 1581 TTGGTGGAAAGGTAAATTAG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1601 1601 1601 1601 1601 1601 1601 1601 1601 1601 1601 1601 TATTTAAAGCTAAACTAAGA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1621 1621 1621 1621 1621 1621 1621 1621 1621 1621 1621 1621 GCATCTCATACTTGGAATCC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1641 1641 1641 1641 1641 1641 1641 1641 1641 1641 1641 1641 AATTCAACAAATGAGTATTA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1661 1661 1661 1661 1661 1661 1661 1661 1661 1661 1661 1661 ATGTAGATAACCAATTTAAC - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1681 1681 1681 1681 1681 1681 1681 1681 1681 1681 1681 1681 TATGTACCAAATAATATTGG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1701 1701 1701 1701 1701 1701 1701 1701 1701 1701 1701 1701 AGCTATGAAAATTGTATATG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -G- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1721 1721 1721 1721 1721 1721 1721 1721 1721 1721 1721 1721 AAAAATCTCAACTAGCACCT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 1741 1741 1741 1741 1741 1741 1741 1741 1741 1741 1741 1741 AGAAAATTATATTAA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 83 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 Anhang Aminosäuresequenz des VP2-Gens 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MSDGAVQPDGGQPAVRNERA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 TGSGNGSGGGGGGGSGGVGI - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-bCU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 STGTFNNQTEFKFLENGWVE - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 61 ITANSSRLVHLNMPESENYK - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 81 81 81 81 81 81 81 81 81 81 81 81 R V V V N N M D K T A V K G N M A L D D FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - S - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - T - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - I - - - - - - - - 430 Ktz. 78 101 101 101 101 101 101 101 101 101 101 101 101 THVQIVTPWSLVDANAWGVW - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 F N P G D W Q L I V N T M S E L H L V S FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - I - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 141 F E Q E I F N V V L K T V S E S A T Q P 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 141 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 84 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 Anhang 161 161 161 161 161 161 161 161 161 161 161 161 P T K V Y N N D L T A S L M V A L D S N FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 181 181 181 181 181 181 181 181 181 181 181 181 NTMPFTPAAMRSETLGFYPW - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 201 KPTIPTPWRYYFQWDRTLIP - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 221 221 221 221 221 221 221 221 221 221 221 221 SHTGTSGTPTNIYHGTDPDD - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 241 241 241 241 241 241 241 241 241 241 241 241 VQFYTIENSVPVHLLRTGDE - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 261 261 261 261 261 261 261 261 261 261 261 261 FATGTFFFDCKPCRLTHTW - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 281 281 281 281 281 281 281 281 281 281 281 281 TNRALGLPPFLNSLPQSEGA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 301 301 301 301 301 301 301 301 301 301 301 301 TNFGDIGVQQDKRRGVTQMG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 321 321 321 321 321 321 321 321 321 321 321 321 NTDYITEATIMRPAEVGYSA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 341 341 341 341 341 341 341 341 341 341 341 341 PYYSFEASTQGPFKTPIAAG - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 441 441 441 441 441 441 441 441 441 441 441 441 GINYTNIFNTYGPLTALNNV - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 481 481 481 481 481 481 481 481 481 481 481 481 R L H V N A P F V C Q N N C P G Q L F V FPV-b CU4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 521 I V T Y S D F W W K G K L V F K A K L R FPV-b CU4 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 174 Ktz. 70 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 195 Ktz. 71 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 232 Ktz. 72 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 277 Ktz. 73 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 281 Ktz. 73 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 308 Ktz. 74 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 361 Ktz. 75 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 363 Ktz. 76 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 386 Ktz. 77 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 425 Ktz. 78 521 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 430 Ktz. 78 86 381 381 381 381 381 381 381 381 381 381 381 381 GRQHGQKTTTTGETPERFTY - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 421 421 421 421 421 421 421 421 421 421 421 421 NLPVTNDNVLLPTDPIGGKT - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 461 461 461 461 461 461 461 461 461 461 461 461 PPVYPNGQIWDKEFDTDLKP - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 581 581 581 581 581 581 581 581 581 581 581 581 87 RKLY. - - - -. - - - -. - - - -. - - - -. - - - -. - - - -. - - - -. - - - -. - - - -. - - - -. - - - -. FPV-b CU4 174 Ktz. 70 195 Ktz. 71 232 Ktz. 72 277 Ktz. 73 281 Ktz. 73 308 Ktz. 74 361 Ktz. 75 363 Ktz. 76 386 Ktz. 77 425 Ktz. 78 430 Ktz. 78 Danksagung 10 Danksagung Herrn Prof. Dr. Uwe Truyen danke ich für die Bereitstellung des Themas, die wissenschaftliche Betreuung und die stets gewährte Hilfe und Unterstützung. Herrn Dr. Peter Wohlsein danke ich für die Bereitstellung der Gewebeproben aus dem umfassenden Archiv des Institus für Pathologie in Hannover sowie für seine Hilfe und Beratung bei der Probennahme. Frau Dr. Sonja Wilhelm danke ich besonders für ihre stets gewährte freundliche Hilfe. Beim praktischen Arbeiten im Labor sowie bei allen anfallenden Fragen im Bereich der Molekularbiologie war sie mir eine sehr große Hilfe. Ich danke ihr sehr für ihre Unterstützung in allen Bereichen während meiner Zeit am Institut und ihre konstruktive Kritik bei der Anfertigung der Dissertationsmanuskriptes. Herrn Dr. Uwe Rösler danke ich für seine freundliche Hilfe bei Computerproblemen und anderen diversen Problemen, die im Rahmen meiner Doktorarbeit aufgetreten sind. Frau Nadja Leinecker und Frau Evelin Brumme danke ich herzlich für ihre Hilfsbereitschaft im Labor. Bedanken möchte ich mich auch bei den Doktoranden des Insituts für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen, insbesondere meiner besten Freundin Vivian Hennig für ihre Unterstützung. Gemeinsam haben wir alle Höhen und Tiefen im Studium und im Institut gemeistert. Besonders möchte ich mich bei meinem Freund Lars Schneider für seine Geduld, seine Hilfe und seine aufmunternden Worte bedanken, die mich immer wieder motiviert und mir viel bedeutet haben. Meinen Eltern gilt mein ganz besonderer Dank. Ich danke ihnen für ihre Unterstützung sowohl während meiner Studienzeit als auch während meiner Zeit als Doktorandin. Ihre konstruktive Kritik bei allen Fragen rund um die Doktorarbeit waren mir eine große Hilfe. 88
