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Antikörper
Antikörper sind Glykoproteine ( bestehend aus Protein- und Kohlenhydratteil ), die sich in
der γ-Globulinfraktion der Bluteiweiße und gehören zur Klasse der Globuline ( Globuläre
Proteine - Proteine mit kugelförmiger Tertiär- oder Quatärstruktur ).
Sie werden im Organismus als Reaktion auf bestimmte Stoffe, die sogenannten Antigene (
antibody generating )gebildet. Antigene sind meistens Proteine, können aber auch
Kohlenhydrate, Lipide oder gänzlich andere Stoffe sein. Diese Stoffe können entweder frei
vorliegen oder an der Oberfläche von eingedrungenen Fremdkörpers anhaften ( zB. Auf
Pollenkörnen, an Bakterien oder im Kot von Hausstaubmilben ). Unter gewissen Umständen
können auch körpereigene Stoffe als fremd erkannt werden, dieser Fehler führt zu
Autoimmunerkrankungen. Normalerweise ruft ein Antigen nur die Bildung von Antikörper
hervor, die gegen es selbst gerichtet sind, es gibt aber auch Fälle in denen Antikörper gegen
eine Gruppe von ähnlichen Antigenen gebildet werden ( zB. Impfungen, Kuhpocken sind für
den Menschen harmlos, die gegen sie gebildeten Antikörper reagieren aber auch bei einer
normalen Pockenerkrankung ). Antikörper erkennen nicht das gesamte Antigen sondern nur
die sogenannte antigene Determinante ( Epitop ). Dabei wird unterschieden ob das Epitop
durch die räumliche Anordnung des AS-Reste gebildet wird, also nur im nativen Zustand
vorliegt, oder von der Sequenz abhängig ist. Ist es sequenzabhängig spricht man von einem
koninuierliche Epitop, geht es bei Denaturierung verloren sprich man von diskontinuierlichen
Epitopen. Die entsprechende Antigenbindungstelle am Antikörper heißt Paratop.
Struktur von Antikörpern
Jeder Antikörper besteht aus zwei identischen schweren
Ketten (heavy chains, H) und zwei identischen leichten
Ketten (light chains, L), die durch kovalente
Disulfidbrücken zu einer Ypsilon-förmigen Struktur
miteinander verknüpft sind. Die leichten Ketten bestehen
aus jeweils einer variablen und einer konstanten Domäne.
Bezeichnet werden diese als VL und CL. Die schweren
Ketten hingegen haben jeweils eine variable und 3 (IgG,
IgA) bzw. 4 (IgM, IgE) konstante Domänen. Bezeichnet werden diese analog als VH und CH 1,
CH2
und
CH3.aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
Die variablen Domänen einer leichten und einer schweren Kette bilden die
Antigenbindungsstelle. Die Domäne CH2 besteht u. a. auch aus einer Kohlenhydratkette, die
eine Bindungsstelle für das Komplementsystem ( neben der Bildung von Antikörpern ist
dieses System ein zweiter Weg Fremdkörper zu beseitigen )bildet.
Wirkungsweisen
von sezernierten
( abgesonderten )
Antikörpern
Antikörper haben verschiedene Wirkmechanismen:
 Neutralisation der Antigene
Durch die Bindung des Antigens an den Antikörper
wird dieses blockiert und kann seine Wirkung nicht
mehr entfalten oder wird durch den angelagerten
Antikörper räumlich am Eindringen in Zellen oder
Gewebe gehindert.
 Opsonierung ( ``Lecker machen ´´ )
Durch Einhüllen mit dem Antikörper wird das
Antigen markiert. Die konstante Region des Antikörpers wird von Phagozyten
( Fresszellen )erkannt und diese können das Bakterium aufnehmen und verdauen.
 Aktivierung des Kompletsystems
 Aktivierung von NK-Zellen ( natürliche Killerzellen, Teil des angeborenen
Immunsystems ) die fremde Bestandteile abtöten. Dieser Prozess wird auch als
„Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity“ (ADCC) bezeichnet.
 Agglutination ( Komplexbildung )
Weist ein Antikörper zwei Antigenbildungsstellen auf, kann es zu der Ausbildung
einen Komplexes kommen.
Antikörperklassen
Es gibt derzeit fünf im menschlichen Serum
nachgewiesene Antikörperklassen und 2 weiter, die in
tierischem Serum gefunden wurden. Die einzelnen
Antikörper werden mit IgX bezeichnet , wobei Ig für
Immunoglobin/globolin steht und X für G,M,A,D,E sowie
Y oder W stehen kann.
Jede Klasse hat andere Eigenschaften und Vorkommen
im Organismus.
Sie können Monomere, Dimere oder Pentamere sein.
 Immunglobin A
Macht etwa 15% der Ig im Serum aus und findet sich vor allem in externen
Körperflüssigkeiten ( Eingeweideflüssigkeiten oder Milch ). Es dient zur Abwehr von
Krankheitserregern, vor allem an den Schleimhäuten wie Augen, Nase, Darm oder
Rachen.
Es kommt in zwei Varianten vor, als IgA1 und als IgA2. Die Varianten unterschieden
sich in der Molmasse der schweren Kette.
IgA kann als Monomer oder als Dimer vorliegen. Das
Dimer entsteht durch Verknüpfung zweier Monomere
mit einer J-Kette ( joining ).
Zum Schutz vor Verdauungsenzymen ist der Antikörper
mit einer Sekretionskette ( Polypeptid ) umhüllt.
Schematische Darstellung des Immunglobulin A als Dimer: HKette (1), L-Kette (2), J-Kette (3) und Sekretionskette (4).
 Immunglobin D
IgD macht unter 1% der Igs im menschlichen Serum aus. Seine Funktion ist bis heute nicht
geklärt. Es liegt als Monomer vor und wird sehr rasch abgebaut.
 Immunglobin E
IgE macht unter 1% der Igs im Menschlichen Serum aus. Es wurde als letztes der fünf im
menschlichen Serum vorhandenen Igs entdeckt, da seine Konzentration nur ein Hundertstel
der des IgD ausmacht. Es dient zur Abwehr von Parasiten und spielt eine wichtige Rolle bei
Allergien. Es kann sich an sogenannte Mastzellen binden und veranlasst diese Histamin
auszuschütten wenn es ein Allergen bindet. Es hat verglichen mit anderen Igs einen etwas
längeren Stamm ( langes Ende des Y ).
 Immunglobin M
IgM liegt als Pentamer vor, fünf Monomere sind durch die J-Kette und intermolekülare
Disulfidbrücken miteinander verbunden. IgM wird vom Körper in der ersten Phase einer
Infektion produziert und dient zur Aktivierung des Komplementsystems. Im Serum zeigt sein
Vorkommen eine momentane Infektion an. Die Konzentration an IgA sinkt nach der akuten
Phase der Infektion rasch wieder ab.
Immunglobulin M, bestehend aus 5 Grundeinheiten
1 Grundeinheit
2 H-Kette
3 L-Kette
4 J-Kette
5 Intermolekulare Disulfidbrücken
 Immunglobin G
IgG macht mit etwa 11-18% des gesamten Bluteiweißes den größten Teil der Igs im Serum
aus. Es dient zur Produktion von Antikörpern, die vor allem gegen Bakterien wirken.
Neugeborene müssen diese Antikörper erst entwickeln und sind daher auf die Antikörper
der Mutter angewiesen. Vor der Geburt erfolgt die Versorgung über die Plazenta.
Bei einer Impfung kommt der Organismus mit einem Antigen in Berührung und entwickelt
Antikörper. Bestimmte Plasmazellen Merken sich die Antigene und die Produktion des
Antikörpers. Kommt es zu einer Infektion so beginnt die rasche Produktion des
entsprechenden Antikörpers. IgG bildet sich erst bis zu 3 Wochen nach der Infektion.
ELISA
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
ELISA ist ein immunologisches Testverfahren, das sowohl qualitativ als auch quantitativ
angewendet werden kann. Seine Anwendungsgebiete reichen von medizinischen
Untersuchungen ( zB. HIV-Test ) bis hin zur Lebensmittelanalytik ( Bestimmung von
unerlaubten Antibiotika/Masthilfsmittel ).
Er beruht auf der Bildung des Immunkomplexes aus Antikörper und Antigen.
Der ELISA kann indirekt, als Sandwich-ELISA oder auch kompetitiv/konkurrierend durchgeführt werden.
 Indirekter ELISA
Schematische Durchführung eines indirekten ELISA
1. In einem ersten Schritt wird ein Trägermaterial mit Antigen beschichtet, dies kann
eine Membran oder eine Kaverne in einer Mikrotiterplatte sein. Bei standardisierten
Untersuchungen sind die Titerplatten in einem Testkit bereits beschichtet und
können direkt verwendet werden.
2. In einem Zweiten Schritt wird der Erstantikörper zugegeben. Dieser Erstantikörper ist
der Antikörper der im Organismus bei Vorhandensein des entsprechenden Antigens
gebildet wird. Es wird daher nicht direkt das Antigen untersucht, sondern der als
Immunantwort gebildete Antikörper. Die Lösung wird durch Ausklopfen entfernt. Die
freien Bindungsmöglichkeiten am Antigen werden mit Proteinen wie BSA ( Bovine
Serum Albumin ) oder Casein vollständig besetzt. Dieser Schritt wird als Blocking
bezeichnet.
3. Waschen
4. In einem dritten Schritt wird ein mit einem Enzym markierter Antikörper, der Zweitoder Sekundärantikörper zugesetzt. Er ist meistens ein tierischer Antikörper, für den
der an das Antigen gebundene Antikörper selbst ein Antigen darstellt.
5. Der überschüssige nicht gebundene markierte Antikörper wird durch Waschen
entfernt.
6. In einem vierten Schritt wird ein Substrat zugegeben. Das Enzym setzt das Substrat
um. Das erhaltene Produkt muss entweder zu einer Färbung führen oder ein
lumineszierendes oder fluoreszierendes Produkt bilden. Am einfachsten ist die
Verwendung eines farbbildenen Reagens, einem Chromogen, und einer
anschließenden Auswertung mit einem Spektrometer, wobei die Extinktion der
Antikörperkonzentration im Analyten direkt proportional ist.
Nachteil dieser Methode ist die mangelnde Selektivität, da verschiedene Bestandteile des
Analyten am Antigen gebunden werden können.
 Sandwich - ELISA
Der Unterschied zum indirekten ELISA besteht darin, dass hier zuerst ein Antikörper an der
Wand der Kavernen vorliegt, der verschiedene Antigene aus dem Analyten bindet. Dann
wird ein auf das gesuchte Antigen spezifischer Antikörper zugesetzt. An diesen lagert sich
dann der markierte Sekundärantikörper an. Waschschritte und Blocking sind gleich wie beim
indirekten ELISA.
Schema eines Sandwich-ELISA
 Kompetitiver ELISA
Hier wird eine bestimmte Menge eines Antikörpers mit einer bestimmten Menge eines
markierten Antigens und einer unbekannten Menge eines nicht markierten Antigens
versetzt. Je mehr nicht markiertes Antigen vorhanden ist desto mehr des markierten
Antigens wird verdrängt und desto geringer ist das Signal. Die Antigenkonzentration ist also
indirekt proportional zum Messsignal.
Weitere Assay-Methoden:
 RIA ( Radioimmuno-Assay )
Hier wird statt eines Enzyms ein radioaktiv markierter Antikörper verwendet und die
Strahlung als Signal ausgewertet. Er wird vor allem zur Bestimmung kleinerer Analyten
angewandt ( wie zB. Testosteron ).
Western-Blot
Immun-Blot
Der Western-Blot dient zur Übertragung der aufgetrennten Proteine auf eine
Trägermembran. Eine Durchführung könnte folgendermaßen aussehen:
1. Durchführung einer SDS, einer IEF oder einer anderen geeigneten elektrophoretischen Trennung des Proteingemisches
2. Blotting:
 Diffusionsplotting
 Kapilarblotting
 Anlegen eines senkrecht zum Gel stehenden Stromes und Übertragung der
Banden auf eine Trägermembran wie zB. Nitrocellusose, Nylon oder
Polyvinyldifluorid.
3. Wenn eine SDS durchgeführt wurde wird das SDS ausgewaschen und die Proteine
renaturieren und erhalten ihre Sekundär bzw. Tertiärstruktur teilweise wieder
zurück.
4. Freie Bindungsstellen auf der Membran werden entweder durch chemische Polymere
oder durch Proteine abgesättigt ( zB. BSA, fettarmes Milchpulver oder Gelatine ).
5. Die Membran wird mit einer verdünnten Antikörperlösung behandelt, der Antikörper
muss selektiv auf den Analyten sein, sonst reagiert er mit weiteren Proteinen, die
nicht dem Analyten entsprechen.
6. Durch Waschen werden nur schwachgebundene unspezifisch gebundene Antikörper
ausgewaschen.
7. Ein markierter Sekundärantikörper wird zugegeben, er muss selektiv gegen den
Primärantikörper sein.
8. Durch Waschen wird überschüssiger Sekundärantikörper entfernt.
9. Die Detektion erfolgt bei Enzym-markierten Sekundärantikörpern durch Umsetzen
eines Substrates. Häufig wird dafür Peroxidase aus Meerrettich ( hourseradish
peroxidase, HRP ) verwendet, die Luminol/-derivate oxidiert und dadurch Lumineszenz hervorruft. Werden Radioaktiv-markierte Sekundärantikörper verwendet
werden die die entsprechenden Banden durch Autoradiographie von Röntgenplatten
sichtbar gemacht ( Autoradiographie mit Röntgenplatten – Schwarzfärbung der Platte
bei radioaktiver Strahlung ).
10. Möchte man keine speziellen Banden sichtbar machen, sondern die gesamten
Proteine, so kann man mit Tusche, Coomassie, Poncreu S oder kolloidalem Gold die
Gesamtheit der Proteine sichtbar machen.
Skizze eines Antigens, das mit einem mit HPR markierten Sekundärantikörpers detektiert wurde