J. Riegler, T. Nann, Adv. Mater. Submitted.
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Thema: Systembiologie der Signaltransduktion Der mit diesem Antrag geplante Forschungsschwerpunkt konzentriert sich auf eine zentralen Herausforderungen der postgenomischen Ära: Das quantitative Verständnis der dynamischen und regulatorischen Systemeigenschaften der Signaltransduktion. Für dieses Ziel wollen sich 7 Arbeitsgruppen zusammenschließen, die am Zentrum für Biosystemanalyse, am Zentrum für Biochemie und Molekulare Zellforschung und am Zentrum für Datenanalyse und Modellbildung, respektive den Fakultäten für Biologie, Medizin, Physik und Mathematik, und Angewandte Wissenschaften und dem Max-Planck-Institut für Immunbiologie beheimatet sind. Für ein quantitatives Verständnis der systemischen Eigenschaften der Signaltransduktion ist eine mathematische Modellierung der Prozesse notwendig. Dieser unter dem Namen Systembiologie zur Zeit international stark wachsende Forschungsbereich stützt sich bisher hauptsächlich auf Simulationen. Hierzu werden basierend auf dem qualitativen biochemischen Wissen dynamische Modelle in Form von nichtlinearen Differentialgleichungen aufgestellt. Die Parameter in diesen Gleichungen sind in der Regel nicht bekannt und werden ad hoc ohne Bezug auf experimentelle Daten festgesetzt. Dadurch ist es schwer, aus den Ergebnissen der Simualtionen Schlüsse über die zu Grunde liegende Biologie zu ziehen, da nicht entschieden werden kann, ob die Struktur der Gleichungen oder die Wahl der Parameter das Ergebnis bestimmt. Das zentrale Anliegen dieses Antrags ist es, eine quantitative mathematische Modellierung basierend auf experimentellen Daten zu erreichen und dadurch theoretische Modelle mit experimentellen Daten in Bezug zu setzen. Dieses erfordert die Entwicklung von neuen Methoden im experimentellen wie im theoretischen Bereich. Im experimentellen Bereich müssen Methoden der Mirkosystemtechnik, Molekularbiologie, Biochemie und Zellbiologie weiterentwickelt werden, um quantitativ zeitaufgelöste Daten dynamischer, biologischer Prozesse im Hochdurchsatz zu erheben. Hierzu sind am Zentrum für Biosystemanalyse, am Zentrum für Biochemie und Molekulare Zellforschung und am Institut für Mirkosystemtechnik in Bezug auf Genexpressionsanalyse, Proteinanalyse und Imaging bereits umfangreiche Vorarbeiten geleistet worden. Im theoretischen Bereich müssen physikalisch/mathematische Methoden entwickelt werden, um basierend auf experimentellen Daten, mathematische Modelle zu spezifizieren, zu testen und zu erweitern. Hierzu sind am Zentrum für Datenanalyse und Modellbildung (Sprecher: Prof. Honerkamp, Fakultät für Mathematk und Physik) umfangreiche Vorarbeiten geleistet worden. Ferner wird dieser Themenbereich im Graduiertenkolleg "Nichtlineare Differentialgleichungen" (Sprecher Prof. Kröner, Fakultät für Mathematk und Physik), bearbeitet. Daher bietet der Antrag die Chance, der Anregung der Arbeitsgruppe Lebenswissenschaften des Landesforschungsbeirats in Bezug auf ein verstärktes Engagements der Fakultät für Mathematik und Physik der Universtät Freiburg in den Lebenswissenschaften konsequent Rechnung zu tragen. Durch die Etablierung des hier beantragten Schwerpunktes soll die Grundlage für einen fakultätenübergreifenden systembiologisch orientierten Sonderforschungsbereich gelegt werden. Der Zeitplan sieht vor, daß die Voranträge Anfang des WS 03/04 zur Begutachtung vorgelegt werden, der Hauptantrag zur Begutachtung zu Beginn des SS 04 vorliegt, damit die Etablierung des SFB zum 1.1.2005, zeitgleich mit dem Bezug des Gebäudes des Zentrums für Biosystemanalyse (ZBSA), möglich ist. Die Projekte, für die hier eine Anschubfinanzierung beantragt wird, sollen im Anschluß in den SFB aufgenommen werden. Der SFB soll darüberhinaus auf der theoretischen Seite von der am Institut für Mirkosystemtechnik der Fakultät für Angewandte Wissenschaften im Berufungsverfahren befindlichen Professur für Systemtheorie und den an der Fakultät für Biologie und am Institut für Informatik im Berufungsverfahren befindlichen Professuren für Bioinformatik sowie dem Institut für Angewandte Mathematik verstärkt werden. Auf der biologisch/klinischen Seite sollen weitere Arbeitsgruppen des Max-Planck-Instituts für Immunbiologie und der Fakultäten für Biologie und Medizin aufgenommen werden. Somit stellt der beabsichtigte SFB einen fakultätenübergreifenden Ansatz dar, der von biologisch/klinischen Fragestellungen über mikrosystemtechinsche Messtechniken bis hin zur Bioinformatik und der mathematischen Modellierung die Möglichkeiten der Freiburger Universität im Bereich der Lebenswissenschaften bündelt und die Systembiologie zu einem Schwerpunkt der Forschung an der Universität Freiburg werden läßt. Die Teilprojekte dieses Antrags reflektieren intensive Vorarbeiten unseres interdisziplinären Ansatzes. Der apoptotische Fas/CD95 Signalübertragungsweg von T- und B-Zellen (Borner) und die JAK-STAT Signalkaskade in erythroiden Vorläuferzellen (Klingmüller) sind qualitativ gut bekannt. Basierend auf quantitativen zeitaufgelösten Messungen der beteiligten Proteine (Nann, Urban) soll an diesen Systemen durch mathematische Modellierung (Timmer) ein quantitatives Verständnis der Systemeigenschaften erzielt werden. Für T- und B-Zellen soll die Reaktion unter verschiedenen physiologischen Bedingungen vorausgesagt werden. Für das hämatopoetischen System sollen negative Rückkopplungsmechanismen modelliert und die daraus resultierende Robustheit des Systems quantitativ erklärt und Modellvorhersagen an knock-out Modellen getestet werden. Die Untersuchung von Transportmechanismen durch die Kernmembran erweitert die Analyse um den räumlichen Aspekt (Nitschke). Durch moderne Imaging-Methoden wird die raumzeitliche Dynamik der Translokation von Markomolekülen erfasst und so durch mathematischen Modellierung (Timmer) ermöglicht, zwischen passiver Diffusion und aktiven Transport der Moleküle in Abhängigkeit relevanter physiologischer Parameter zu unterscheiden. Speziell soll eine Hypothese über den Kerntransport im JAK-STAT Signalweg untersucht werden, die aus einer ersten Modellierung dieses Systems (Klingmüller, Timmer) resultierte. Weitaus komplexer stellt sich die Situation für die Modulation der EGFund Wnt-vermittelten Signalübertragung in Protease-defizienten Keratinozyten dar (Reinheckel, Hecht, Peters). Daher sind hier zuerst durch Hochdurchsatzmessmethoden der Proteomanalyse (Reinheckel) und der Genomanalyse (Walz, Sparna, Donauer) notwendig, um die relevanten Komponenten zu identifizieren und diese einer mathematischen Modellbildung (Timmer) zuzuführen. Auf der theoretischen Seite werden die konkreten Anforderungen der biologischen Fragestellungen neue Methoden der Modellierung und Systemanalyse hervorbringen. Auf biologischer Seite ist einerseits ein systembiologisches Verständnis allgemeiner Prinzipien der Informationsverarbeitung von Signalnetzwerken Ziel des beantragten Projektes, andererseits ermöglicht dieses Verständnis aber auch Anwendungen wie das Identifizieren von drug targets und neuer Therapieansätze. Dieser Landesschwerpunkt ist Teil eines integrierten Konzeptes zur Stärkung der Systembiologie und der Bioinformatik im Rahmen der Freiburger Zentren für Biosystemanalyse (ZBSA), für Bioinformatik (ZfBI) und für Datenanalyse und Modellbildung (FDM). Mit diesen Zentren hat die Universität Freiburg einen prominenten Schwerpunkt innerhalb der Life Sciences etabliert. Im Rahmen dieses integrierten Konzeptes werden in dieser Antragsphase zwei koordinierte Forschungsschwerpunktprogramme dem Lande Baden-Württemberg vorgelegt. Der parallel eingereichten Antrag " Effiziente Suche und Wissensextraktion in komplexen biologischen Datenbanken" hat seinen Schwerpunkt im Bereich der Bioinformatik und zielt auf die Entwicklung neuer Konzepte und Algorithmen für Suchstrategien in Datenbanken unterschiedlichster multidimensionaler Datentypen - damit bewegt er sich aus der "Eindimensionalität" der Sequenzanalyse der "klassischen" Bioinformatik heraus in Neuland hinein. Der hier vorliegende komplementäre Antrag wird dagegen Grundstein eines neuen Sonderforschungsbereiches sein, der das Herz der Systembiologie in Freiburg bilden soll, und durch neue Datenerhebungsparadigmen zur zeitlich und räumlich hochauflösenden in vivo Untersuchung von Signalwegskomponenten neue realitätsnahe Modellbildungskonzepte in der Freiburger Systembiologie etabliert. Die koordinierte Förderung beider Forschungsschwerpunkte wird bewirken, dass im Jahre 2005 die Forschung im neuen Freiburger Forschungszentrum ZBSA auf höchstem internationalem Niveau beginnen kann. Beantragte Mittel: Die Teilprojekte sollen durch den Einsatz je eines Doktoranden durchgeführt werden. Dafür werden 7 BATIIa/2 Stellen beantragt. An Sachmitteln wird für die 6 experimentell arbeitenden Teilprojekte 15.000 Euro pro Jahr beantragt. Teilprojekt 1 Thema: Mathematische Modelierung der Fas/CD95 Signalübertragungswege Antragsteller: Prof. Dr. Christoph Borner, Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Universität Freiburg Stand der Forschung: Das Tumor Nekrose Faktor (TNF)-ähnliche Zytokin FasL/CD95L wird von zytotoxischen TZellen verwendet, um viral infizierte Zielzellen durch Apoptose zu eliminieren. Zudem dient dieser Faktor dazu, T- und B-Zellen und andere Blutzellen nach ihrer Aktivierung bzw. Funktionsausübung abzutöten. Dadurch wird die Ausbildung von Leukemien und Autoimmunkrankheiten verhindert. Der intrazelluläre Signalübertragungsweg dieser Apoptose ist relativ gut bekannt. Er beginnt mit der Bindung des FasL/CD95L an seinen Rezeptor Fas/CD95. Dies führt zu einem "Clustering" des Fas/CD95, gefolgt von der intrazellulären Bindung von Adaptermoleküülen (z.B. FADD), welche dann eine Kaskade von Todesproteasen (Caspasen) aktivieren. Einige dieser Caspasen (die Effektor Caspasen-3 und -7) schneiden zelluläre Substrate, welche für die Zerteilung der Zelle in apoptotische Fragmente und deren Aufnahme und Abbau durch Phagozyten verantwortlich sind. In gewissen Zellen wird dieser apoptotische Signalübertragungsweg durch mitochondriale Proteine (z.B. Cytochrome c) verstärkt, welche ins Zytoplasma ausgeschüttet werden und dort die Caspasen Aktivierung beschleunigen. Diese Ausschüttung wird hervorgerufen durch eine Schädigung der äusseren, mitochondrialen Membran, welche unter anderem durch eine Caspase-8-induzierte Spaltung des Bcl-2 Proteins BID induziert wird. Nebst Apoptose kann Fas/CD95L auch über FADD und der Proteinkinase RIP einen nekrotischen Zelltod bewirken. Noch erstaunlicher ist, dass Komponenten des Fas Signalweges, so z.B. FADD und Caspase-8 auch eine Rolle bei der TZell-Proliferation und dem Erhalt von B-Zellen spielen. Die mitogene Wirkung des FasL/CD95L ist vermutlich daher möglich, weil in gewissen T- oder B-Zellstadien der apoptotische Signalweg durch andere Zytokine wie Interleukine und Inteferone, als auch durch Ko-stimulation von Nachbarzellen über Oberflächenadhesionsmoleküle we CD28, blockiert wird. Dies erklärt, warum aktivierte T Zellen trotz der Ko-Präsenz von FasL und Fas Rezeptor in einer Anfangsphase nicht sterben und ihre Effektorfunktionen ausführen können. Der mitogene Signalübertragungsweg von FasL/Fas läuft vermutlich über c-FLIP, den Ras/Raf/MAPK Signalweg also auch über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB. Um die komplexen molekularen Veränderungen einer Fas-stimulierten T- oder B-Zelle in einem bestimmten Stadium funktionell richtig zu interpretieren oder gar voraussagen zu können, ist eine mathematische Modellierung der einzelnen Signalwege (apoptotisch, nekrotisch, mitogen), basierend auf quantitativ messbaren Grössen der Signalkomponenten, erforderlich. Beteiligte Wissenschaftler: Prof. Dr. Ch. Borner, Dipl. Biol. L. Egger, K. Neubert, TA, Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Universität Freiburg Eigene Vorarbeiten: Am Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung sind umfangreiche Erfahrungen im Messen von Komponenten der apoptotischen und nekrotischen (C. Borner) als auch der mitogenen (C. Borner, A. Hecht) Signalwege vorhanden. Weiter haben wir mit Prof. Dr. Heike Pahl (hier am ZKF) bereits 'Gel-shift' Assays für den Aktivierungsstatus von NFkB ausgeführt und werden von ihr weitere Reagenzien zum Studium des NFkB Weges verwenden können (z. B. Dominant-negatives IB). Zudem verfügen wir über wichtige Reagenzien zur Analyse der Fas-Signalwege. Unsere Gruppe hat in Vorarbeiten ein effizientes Ko-Kultursystem entwickelt, das erlaubt Fas-exprimierende Suspensionszielzellen (Jurkat T oder JILY B) durch adherente, FasL exprimierende CHO Zellen effizient in die Apoptose oder Nekrose zu führen. Ziele und Arbeitsprogramm: Erstes Ziel dieses Antrages ist den Fas-induzierten apoptotischen Signalübertragungsweg mathematisch zu modellieren. Zu diesem Zweck werden wir Fas/CD95-exprimierende JILY Bund Jurkat T-Suspensionszellen einer adherenten, FasL/CD95L-exprimierenden CHO Zelle aussetzen und damit eine physiologisch relevante Apoptose in den B-und T-Zellen auslösen. Zu verschiedenen Zeiten werden Daten über die Proteinmenge, Proteinkomplexbildung und Aktivität der einzelnen Signalübertragungskomponenten (Fas/CD95, FADD, caspase-8, -3, etc) erhoben. Diese werden über ELISA, Ko-ImmunoprŠzipitation, Caspase Assays und Western blots, Immunofluoreszenz und FACS Analyse (Annexin-V-Positivität, PropidiumiodidNegativität, ein Mass für Apoptose) quantitativ ermittelt. Die Daten werden dann in Differenzialgleichungen eingespiesen, um ein mathematisches Apoptose Modell zu entwickeln. In einer zweiten Phase möchten wir den apoptotischen Fas Signalweg mit Caspase Hemmern (Z-VAD.fmk) blockieren, um Nekrose auszulösen, und mit Zytokinen oder anderen Hemmstoffen behandeln, um mitogenes Signaling anzuschalten. Wiederum werden die Komponenten der entsprechenden Signalwege quantitativ gemessen, wofür noch zusätzlich Protein Kinase Assays, NFB gel-shifts und [3H]Thymidin-Einbau Messungen notwendig sind. Diese Daten werden auch mathematisch modelliert und die Modelle mit dem des apoptotischen Signalweges verknüpft. Dies soll voraussagen können, wie eine T- oder B-Zelle unter bestimmten physiologischen Bedingungen (Ko-stimulation, Zytokine-Exposition, Hemmung durch Decoy-Rezeptoren) auf ein FasL Signal reagiert. Publikationen: Borner, C., Filipuzzi, I., Weinstein, I. B. & Imber, R. (1991) Nature 353, 78-80. Borner, C., Ueffing, M., Jaken, S., Parker, P. J. & Weinstein, I. B. (1995) J. Biol. Chem. 270, 78-86 Borner, C. (1996) J. Biol. Chem. 271, 12695-12698. Olivier, R., Otter, I., Monney, L., Wartmann, M. & Borner, C. (1997) Biochem J. 324, 75-83. Ross, T., Olivier, R., Monney, L., Rager, M., Conus, S., Fellay, I., Jansen, B.& Borner, C. (1998) Nature , 391, 496-499. Monney, L., Otter, I., Olivier, R., Ozer, H. L., Haas, A. L., Omura, S. & Borner, C. (1998) J. Biol. Chem., 273, 6121-6131. Conus, S., Kaufmann, T., Fellay, I., Otter, I., Ross, T., & Borner, C. (2000a) EMBO J. 19, 15341544. Conus, S., Ross, T. & Borner, C. (2000b) Cell Death Differ 7, 947-954. Egger, L., Schneider J., Rhime, C., Tapernoux, M., Hocki, J. & Borner, C. (2002) submitted. Teilprojekt 2 Thema: Dynamische Modellierung von Signalübertragungskaskaden im Hämatopoetischen System Antragsteller: PD Dr. Ursula Klingmüller, Max-Planck-Institut für Immunbiologie Freiburg Stand der Forschung: In einem kontrollierten Wachstums- und Differenzierungsprozess entstehen im hämatopoetischen System kontinuierlich aus pluripotenten hämatopoetsiche Stammzellen hochspezialisierte reife Zellen. Dieser Prozess wird durch eine Vielzahl von Zytokinen koordiniert, die durch Bindung an Rezeptoren ein komplexes intrazelluläres Signaltransduktionsnetzwerk aktivieren. Obwohl die molekulare Zusammensetzung multipler Signlatransduktionswege detailliert entschlüsselt wurde, ist noch vollständig unbekannt auf welche Weise Information prozessiert wird und biologische Entscheidungen getroffen werden. Für die Untersuchung des dynamische Verhaltens komplexer Systeme und zur Identifikation von systembiologischen Eigenschaften, bieten mathematische Modelle geeignete Werkzeuge. Bisher wurden die Parameter der mathematischen Modelle ad hoc festgesetzt oder aus der Literatur übernommen. Da die zu Grunde liegenden Experimente unter unterschiedlichen Bedingungen und zum Teil auch in verschiedenen Organismen durchgeführt wurden, kann bei einer Diskrepanz von Simulation und experimentellen Daten nicht entschieden werden, ob das Model prinzipiell falsch ist oder ob die Parameter nicht richtig bestimmt wurden. Eine eindeutiges Testen von Hypothesen ist daher nicht möglich. Wir haben ein auf experimentellen Daten basierendes mathematisches Model des Kernmoduls des JAK-STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)5 Signaltransduktionswegs etabliert. Dieser Signaltransduktionsweg ist biochemisch sehr gut charakterisiert und spielt eine wesentliche Rolle bei der Signaltransduktion durch eine Vielzahl von Rezeptoren, einschließlich des Erythropoietin Rezeptors (EpoR). Ein Fehlen von STAT5 resultiert in einer verringerten Produktion reifer Eryrthrozyten (Socolovsky et al., 2001, Blood) und einer Einschränkung der Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen (S. Zhao et al., 2002, EMBO J.). Desweiteren wurde beobachtet, daß STAT5 in einer Vielzahl von Leukemien konstitutiv aktiviert ist. Negativ reguliert wird der JAK-STAT Signaltransduktionsweg z. B. durch die Induktion der Suppressor of Cytokine Signalling (SOCS) Protein. Eine genauere Kenntnisse der Kontrollmechanismen und Vorhersage von effizienten Eingriffsmöglichkeiten im JAK-STAT5 Signaltransduktionsweg mittels dynamischer Modellierung sind daher von großer medizinischer Bedeutung . Beteiligte Wissenschaftler: PD Dr. Ursula Klingmüller, Max-Planck-Institut für Immunbiologie Freiburg Prof. Dr. Gerd Walz, Medizin IV, Schwerpunkt Nephrologie HD Dr. Jens Timmer, Zentrum für Datenanalyse und Modellbildung, Universität Freiburg Dipl. Biol. Marcel Schilling, Max-Planck-Institut für Immunbiologie Freiburg, Eigene Vorarbeiten: Schwerpunkt unserer Forschung ist die systembiologische Untersuchung der Signaltransduktion durch den EpoR. Um zu testen, ob dynamische Modellierung dazubeitragen kann Funktionsprinzipien zu entschlüsseln, haben wir ein auf experimentellen Daten basierendes mathematisches Model des Kernmoduls des JAK-STAT5 Signaltransduktionswegs erstellt. Die dynamische Parameter des gekoppelten Gleichungssystems haben wir basierend auf simultan durchgeführten zeitaufgelösten Quantifizierungen der Phosphorylierung des Rezeptors als Input-Funktion und von STAT5 geschätzt. Mittels dieses Models konnten wir zeigen, daß im Gegensatz zu einer weitverbreiteten Annahme der JAK-STAT5 Signaltransduktionsweg keine lineare Kaskade darstellt, sondern durch repetitive Aktivierungzyklen kontinuierlich Rezeptoraktivierung mit der Induktion von Zielgenen koppelt (Swameye et al., 2002, under review). Ein Zielgen des JAK-STAT5 Signaltransduktionswegs ist das CIS (Cytokine inducible SH2 Domain containing) Protein, das zur Familie der SOCS Proteine gehört. Wir konnten zeigen, daß CIS mit STAT5 um die Bindung an den EpoR kompetiert und auf diese Weise die Signaltransduktion durch STAT5 reprimiert (Ketteler et al., under review at J. Biol. Chem.). Desweitern konnten wir zeigen, daß die Tyrosinphosphatase SHP1 durch Rekrutierung an den aktivierten EpoR durch Dephosphorylierung der Janus kinase JAK2 terminiert (Klingmüller et al., 1995, Cell). Ziele und Arbeitsprogramm: Unser auf experimentellen Daten basierendes mathematisches Model des JAK-STAT5 Kernmoduls soll erweitert werden, um negative Rückkopplungsmechansimen zu erfassen und deren Einfluß auf das dynamische Verhalten des System zu entschlüsseln. 1. Quantitative Analyse der Epo-induzierten CIS Expression und mathematische Modellierung. 2. Analyse des gestörten Systems durch Entfernung von CIS mittels RNAi Technik 3. Quantitative Analyse der Epo-induzierten Aktivierung der Tyrosinphosphatase SHP1 und mathematische Modellierung. 4.Analyse des gestörten Systems in primären erythroiden Vorläuferzellen aus SHP1 konditionellen knock-out Mäusen. In Zusammenarbeit mit dem Teilprojekt 4 (Walz) wollen wir jeweils DNA Arrays einsetzen, um global den Effekt der Aktivierung des JAK-STAT5 Signaltransduktionswegs auf die Induktion von Zielgenen zeitaufgelöst und quantitativ analysieren. Dies sollte es ermöglichen in silico Vorhersagen bezüglich des Ertrags der JAK-STAT5 Signaltransduktionskaskade experimentell zu überprüfen. Negative Rückkopplungsmechanismen wie z. B. Aktivierung einer Phosphatase oder Induktion eines negativ regulatorischen Proteins fördern die Anpassung eines Systems an extrazelluläre Veränderungen. Ein genaueres Verständnis der Funktionsprinzipien und quantitative Vorhersage des dynamischen Verhaltens sollte es ermöglichen effiziente Eingriffspunkte in das System zu identifizieren und für die Entwicklung von neuen therapeutischen Strategien zu nutzen. Publikationen: Ursula Klingmüller, Ulrike Lorenz, Lewis C. Cantley, Benjamin G. Neel, and Harvey F. Lodish. (1995) Cell 80. 729-738. J. Timmer, T. G. Müller, I. Swameye, O. Sandra, and U. Klingmüller (2002). in press: International Journal of Bifurcation and Chaos. Swameye, T. G. Müller, J. Timmer, O. Sandra, and U. Klingmüller. (2002) positively reviewed at PNAS. R. Ketteler, C. S. Moghraby, J. G. Hsiao, O. Sandra, H. F. Lodish, and U. Klingmüller. (2002) under review at J. Biol. Chem. Teilprojekt 3 Thema: Modulation der EGF- und Wnt-vermittelten Signaltransduktion in Protease- defizienten Keratinozyten Antragsteller: Dr. T. Reinheckel, PD Dr. A. Hecht, Prof. Dr. C. Peters Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Universität Freiburg Stand der Forschung: Die physiologische Struktur und Funktion der Epidermis wird durch exakt regulierte Proliferations- und Differenzierungsprozesse epidermaler Keratinozyten sichergestellt. Die Steuerung dieser Prozesse erfolgt wesentlich durch die Bindung extrazellulärer Liganden an spezifische Rezeptoren, die eine Signaltransduktion ins Zellinnere vermitteln, welche in einer spezifischen Signalantwort auf der Ebene der Gen- und Proteinexpression resultiert. Typische Liganden für Rezeptoren auf Keratinozyten sind der Epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und mehrere Wnt-Familienmitglieder (Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5 u. a.). Für einen geregelten Ablauf von Signaltransduktionsprozessen ist nicht nur die Initiation (durch Bindung des Liganden), sondern auch die effiziente Terminierung des Signals von entscheidender Bedeutung. Ein wesentlicher Mechanismus für die Signalabschaltung ist die Internalisierung von Rezeptor/Ligand Komplexen und die Degradation von Liganden und Rezeptoren durch Peptidasen des endosomal/lysosomalen Kompartiments der Zelle. Die Verfügbarkeit von Mausmodellen mit einer Defizienz für einzelne endosomal/lysosmale Peptidasen (Cathepsine) ermöglicht es, die Rolle dieser Enzyme für die Terminierung rezeptorvermittelter Signaltransduktion zu untersuchen. Dabei ermöglicht der Einsatz moderner Methoden zur parallelen und quantitativen Erfassung tausender Protein- und mRNA-Spezies die molekularen Konsequenzen der modulierten Signalübertragung zu erfassen. Die funktionelle Interpretation der zu erwartenden komplexen molekularen Veränderungen erfordert den gezielten Einsatz von Methoden der Bioinformatik und Systembiologie (Virtuelle Zelle). Beteiligte Wissenschaftler: Dr. T. Reinheckel, PD Dr. A. Hecht, Prof. Dr. C. Peters, Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung, Universität Freiburg Dr. J. Donauer, Prof. G. Walz, Nephrologische Klinik HD Dr. J. Timmer, Zentrum für Datenanalyse und Modellbildung L.M. Campano, AG Hecht, Abtlg. Peters Dipl. Ing. T. Lohmüller M.Sc., AG Reinheckel, Abtlg. Peters Eigene Vorarbeiten: Am Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung sind umfangreiche Erfahrungen in der Generierung Peptidase-defizienter Mauslinien (C. Peters), Zellbiologie von Keratinozyten (T. Reinheckel) und intrazellulärer Signaltransduktion (A. Hecht) vorhanden. In der Arbeitsgruppe wurden knock-out Mauslinien mit Defizienzen für die lysosomalen Cathepsine B, D, H und L generiert und analysiert. Dabei weisen Cathepsin L-defiziente Mäuse eine erhöhte Proliferation und gestörte Differenzierung von Keratinozyten der Epidermis und Haarfollikel auf (Roth 2000, Reinheckel 2001, Tobin 2002). Vorläufige Ergebnisse lassen eine Störung der durch den EGF-Rezeptor vermittelten Signaltransduktion vermuten. Für die Untersuchung von Wnt-Signalprozessen und ihre Auswirkung auf transkriptionelle Aktivität von Genen wurden Expressionssysteme für verschiedene Komponenten des WntSignalwegs etabliert, die es erlauben auf mehreren Stufen in Wnt-Signaltransduktion einzugreifen. Hierzu zählen Wnt1, die löslichen Wnt-Antagonisten Dickkopf1 bzw. sFRP2 sowie dominant-negative und konstitutiv-aktive Formen der nukleären Wnt-Effektoren aus der TCF-Familie von DNA-bindenden Proteinen (Aoki 1999, Vleminckx, 1999, Hecht, 2000). Die biologische Wirksamkeit dieser Faktoren wurde in verschiedenen Vertebraten-Zelllinien und Embryonen des Krallenfrosches X. laevis nachgewiesen. Die Gewinnung primärer Keratinozyten aus der Epidermis neonataler Mäuse, sowie Proliferationsmessungen und Induktion einer Keratinozyten-Differenzierung wurden im Rahmen eines DFG-Projekts (RE 1584/1-2, Laufzeit bis 07/03) etabliert. Die Methoden der Proteomanalyse (hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese und Proteinidentifizierung durch Massenspektrometrie) sind etabliert. Mikroarrays mit 15.000 gespotteten Maus-cDNAs (NIA 15K Mouse cDNA Clone Set) sind in der Freiburger “Core Facility Genomics” (Teilprojekt 4, Prof. Walz, Dr. Donauer) seit Sommer 2002 verfügbar. Ziele und Arbeitsprogramm: Grundlegendes Ziel ist die quantitative Erfassung der EGF- und Wnt- vermittelten Signaltransduktion auf molekularer (Transkriptom- und Proteomanalyse) und zellbiologischfunktioneller Ebene (Proliferation und Differenzierung). Durch den Einsatz Peptidasedefizienter Keratinozyten kann eine weitere Modulation der Signaltransduktion erzielt werden. Die quantitativen Daten, die in diesem Netz definierter zellulärer Zustände gewonnen werden, sollten das geeignete Rohmaterial ür die Modellierung von Systemeigenschaften darstellen. Teilziele: 1. Untersuchung der differentiellen Signaltransduktion durch EGF bzw. Wnt in proliferierenden Keratinozyten. Subkonfluente Maus-Keratinozyten werden mit kommerziell erhältlichem Maus-EGF bzw. Wnt-konditionierten Medien inkubiert. Die Zellproliferation wird mittels 3H-Thymidineinbau bestimmt. Transkriptom- und Proteomanalysen werden 3h, 8h und 24h nach Zugabe der Liganden durchgeführt. Zur Erhöhung der Sensitivität der zweidimensionalen Elektrophoresen zur Proteomanalyse sowie zur Erfassung der durch die Wachstumsfaktoren induzierten Proteinsynthese werden metabolische Proteinmarkierungen mittels 35S-Met/Cys durchgeführt. 2. Untersuchung der differentiellen Signaltransduktion durch EGF bzw. Wnt in differenzierenden Keratinozyten. Terminale Differenzierung von Keratinozyten in vitro wird durch Zugabe von 1mM Kalzium induziert. Der Differenzierungsprozess kann anhand der Zellform und spezifischer Differenzierungsmarker verfolgt werden. Die Analysen werden 6h, 24h und 48h nach Induktion der Differenzierung in Analogie zu 1 durchgeführt. 3. Untersuchung der differentiellen Signaltransduktion durch EGF bzw. Wnt in proliferierenden / bzw. differenzierenden Keratinozyten mit einer Defizienz für Cathepsin L. Die Untersuchungen werden parallel und in Analogie zu 1 und 2 durchgeführt. Diese Experimente sind hinsichtlich des Haut- und Haarphänotyps Cathepsin L defizienter Mäuse sehr interessant. 4. Untersuchung der differentiellen Signaltransduktion durch EGF bzw. Wnt in proliferierenden / bzw. differenzierenden Keratinozyten mit Defizienzen für die Cathepsine B, D und H. Anhand der in 1.-3. erhaltenen Ergebnisse sollen die Untersuchungen dieser Cathepsindefizienten Keratinozyten zunächst nur an ausgewählten, interessanten Zeitpunkten durchgeführt werden. Perspektive: Störungen epidermaler Proliferations- und Differenzierungsprozesse sind aufgrund einer Vielzahl von Erkrankungen (epidermale Neoplasien, Psoriasis) medizinisch hochrelevant. Für viele dieser Erkrankungen sind adäquate Mausmodelle verfügbar. Die in diesem Projekt eingesetzten Methoden sowie die gewonnenen Erkenntnisse zur Systembiologie der Signaltransduktion können somit in Zukunft in Bezug auf eine Vielzahl relevanter physiologischer und pathologischer Prozesse interpretiert sowie experimentell überprüft und ausgebaut werden. Publikationen: Aoki, M., Hecht, A., Kruse, U., Kemler, R., Vogt, P. K. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 139-144. Hecht, A., Vleminckx, K., Stemmler, M. P., van Roy, F., Kemler, R. (2000).EMBO J. 19, 18391850. Reinheckel, T., Deussing, J., Roth, W., Peters, C. (2001). Biol Chem 382, 735-741 Roth, W., Deussing, J., Botchkarev, V.A., Pauly-Evers, M., Saftig, P., Hafner, A., Schmidt, P., Schmahl, W., Scherer, J., Anton-Lamprecht, I., von Figura, K., Paus, R., and Peters, C. (2000). FASEB J., 14, 2075-86. Tobin, D.J., Foitzik, K., Reinheckel, T., Mecklenburg, L., Botchkarev, V.A., Peters, C., and Paus, R. (2002) American Journal of Pathology 160 ,1807-21. Vleminckx, K., Kemler, R., und Hecht, A. (1999). Mech. Dev. 81, 65-74. Teilprojekt 4 Thema: Microarray-basierte Charakterisierung von Signaling- Pathways in transfizierten MausZellinien Antragsteller: Prof. Dr. Gerd Walz, Medizin IV, Schwerpunkt Nephrologie Stand der Forschung: Die Analyse der zellulären Genexpression mit Hilfe von DNA- Microarrays hat offenbart, wie komplex die biologische Antwort auf eine externe Stimulation - beispielsweise die Bindung eines Liganden an den zugehörigen Rezeptor - sein kann. Viele der nach RezeptorDimerisierung auftretenden Signalleitungs- Vorgänge laufen dabei über die Änderung enzymatischer Aktivitäten oder posttranslationalen Modifikationen und lassen sich daher nicht direkt mit Hilfe der Genexpressions Kartierung nachweisen. Erst die mittelbaren Auswirkungen, die beispielsweise über Transkriptionsfaktor- vermittelte Neusynthese von Zielgenen verläuft, kann dann wieder als Änderung in der Genexpression beobachtet werden. Erschwerend kommt hinzu, dass die Signaltransduktion unterschiedlichen Zeitverläufen folgt und ein vielfach rückgekoppeltes System bildet, das zudem vom untersuchten Zelltyp abhängt. Bisherige Untersuchungen der zentralen Signalleitungskaskaden - beispielsweise nach Aktivierung von TNF oder Fas/CD95 - mit Hilfe von DNA- Microarrays haben zeigen können, dass die Rezeptoren über gemeinsame Signalkaskaden kommunizieren, jedoch auch spezifische Gene aktivieren, die eine Unterscheidung des Aktivators erlauben (Manos & Jones, Can. Res. 61, 433-8 (2001)). Eine umfassende Charakterisierung der induzierten Genexpression nach gezielten Manipulationen definierter Signalkaskaden und in zeitlicher Auflösung wurde bislang jedoch nicht veröffentlicht. Beteiligte Wissenschaftler: Prof. Dr. Gerd Walz, Medizin IV, Schwerpunkt Nephrologie Dr. Donauer, Titus Sparna, Core Facility Genomics, Universitätsklinikum Freiburg HD Dr. J. Timmer, Mathematische Modellierung Prof. Dr. Irmgard Merfort, Institut für Pharmazeutische Biologie Eigene Vorarbeiten: Die Charakterisierung von Signaltransduktionswegen sowie cDNA Microarray basierte Genexpressionsanalysen sind Forschungsschwerpunkte der AG Walz. Basis der geplanten Experimente ist der NIA 15k cDNA Maus-Array, der unserem Labor zur Verfügung steht. Ziele und Arbeitsprogramm: Mit Hilfe unseres 15 k Maus Microarrays soll kartiert werden, welche Änderungen des GenExpressions- Profils auftreten, nachdem spezifische Signaling Pathways aktiviert wurden. Die statistische Analyse der erhaltenen Gen- Profile soll ferner Marker- Gene oder Gen- Gruppen identifizieren helfen, die geeignet sind, um Signalleitungswege zu differenzieren, die teilweise überschneidende genetische Antworten bedingen. In einem ersten Schritt wollen wir hierfür dominant aktivierende Formen von OberflächenRezeptoren und anderen Schlüsselmoleküle aus Signalleitungs- Kaskaden wie TNF, TGF, EGFR, Fas, p38, NF-?B, JNK1, etc. herstellen und in gut transfizierbaren Maus- Zellinien zur Expression bringen. Als Qualitätskontrolle soll parallel das Genexpressions- Profil nach Stimmulation durch entsprechende Cytokine und aktivierende Antikörper aufgezeichnet werden, um transfektionsbedingte Änderungen gezielt unterscheiden zu können. Der Auswahl einer geeigneten Zellinie (Verfügbarkeit der Pathways) sowie der verwendeten Transfektionsmethoden (Lipofektion, virale Methoden, etc.) kommt eine hohe Bedeutung zu, so dass diese Fragen erst nach Auswertung von Vorversuchen getroffen werden kann. Neben einer hohen Transfektionseffizienz soll eine Standardisierung des gesamten experimentellen Ablaufs unter Einsatz des vorhandenen Pipettierroboters und die Hybridisierung gegen eine einheitliche Referenz für eine Vergleichbarkeit der Expressionsdaten über den gesamten Projektverlauf sorgen. Die folgende Microarray- Analyse der so gewonnen RNA bildet die Grundlage um Gene oder Gengruppen zu identifizieren, die von einem bestimmten Enzym oder Pathway reguliert werden. Dazu sollen alle erhaltenen Microarrays in Bezug zu einer Referenz-RNA gemessen und so vergleichbar gemacht werden. Die folgende statistische Auswertung erlaubt dann Gene oder Cluster von Genen zu identifizieren, die im Rahmen des Versuchs eine eindeutige Identifizierung des aktivierten Pathways ermöglicht. Die so gewonnenen Informationen können dann genutzt werden, um - in der Umkehrung des Vorgangs - bei experimentellen oder pharmakologischen Untersuchungen direkt die involvierten Signaling- Pathways zu identifizieren. Publikationen: Benzing T, Kottgen M, Johnson M, Schermer B, Zentgraf H, Walz G, Kim E.J Biol Chem. (2002) 277:32954-62. Nickel C, Benzing T, Sellin L, Gerke P, Karihaloo A, Liu ZX, Cantley LG, Walz G. J Clin Invest. (2002) 109:481-9 Huber TB, Kottgen M, Schilling B, Walz G, Benzing T. J Biol Chem. (2001)276:41543-6 Benzing T, Gerke P, Hopker K, Hildebrandt F, Kim E, Walz G. Proc Natl Acad Sci U S A (2001)98:9784-9. Arnould T, Kim E, Tsiokas L, Jochimsen F, Gruning W, Chang JD, Walz G. J Biol. Chem.(1998) 273:6013-8. Kim E, Arnould T, Sellin LK, Benzing T, Fan MJ, Gruning W, Sokol SY, Drummond I, Walz G. J Biol Chem. (1999) 274:4947-53. Donauer J., Rumberger B., Klein M., Faller D., Timmer J., Schieren G., Walz G. J Am Soc Nephrol (2002) 13: 119A Teilprojekt 5: Thema: Passive Diffusion und aktiver Transport durch den Kernporenkomplex als Modell für ein integrales Schaltsystem der Zelle Antragsteller: Dr. phil. nat. Roland Nitschke, Institut für Biologie I, Entwicklungsbiologie, Life Imaging Center Stand der Forschung: Die Übertragung von extrazellulären oder zytosolischen Signalen in den Zellkern bzw. von nukleären Signalen aus dem Zellkern ist in jeder Zelle ein essentieller integraler Bestandteil vieler Schaltsysteme. Die Kommunikation zwischen Zellkern und Zytosol erfolgt durch den Kernporen-Komplex (KPK). Wohl der Hauptgrund für viele widersprüchliche Ergebnisse in der Literatur über den KPK Transport ist die Schwierigkeit bei hohem Datendurchsatz solche Untersuchung standardisiert und an intakten lebenden Zellen durchzuführen. Auf Grund struktureller Untersuchungen und um temporär auftretende Ionengradienten zwischen Zytosol und Kern erklären zu können, wurde angenommen dass innerhalb eines KPK mindestens zwei unterschiedliche räumliche Wege für Ionen bzw. Makromoleküle bestehen müssen. Neueste Erkenntnisse stellen nun die passive Diffusion von Ionen durch den KPK in Frage. Der gerichtete Transport von Makromolekülen über die KM erfolgt mit Hilfe spezifischer an das zu transportierende Molekül gekoppelter Signalsequenzen, die wiederum von Rezeptoren am KPK erkannt werden. Die, auch gegen einen Konzentrationsgradienten mögliche, Translokation von Molekülen durch den KPK wurde lange als ein aktiver GTP-abhängiger Prozess angesehen; neue Untersuchungen zeigen nun dass der einzelne Transportvorgang ohne direkten Energiebedarf erfolgt. Ein andauernder Transport durch den KPK bedarf jedoch eines Gradienten der kleinen RanGTPase über die KM. Der nukleo-zytoplasmatische Transport benutzt in einem noch nicht abschließend verstandenem Prozessablauf den RanGTP Gradienten für den gerichteten Transport, entweder im Anti- oder Symport-Modus. Beim Weg der Signale in den Zellkern sind zelluläre Strukturen wie z.B. Mikrotubuli ebenfalls von großer Bedeutung. Beteiligte Wissenschaftler: Dr. phil. nat. Roland Nitschke, Institut für Biologie I, Entwicklungsbiologie, Life Imaging Center PD Dr. Ursula Klingmüller, Max-Planck-Institut für Immunbiologie Freiburg HD Dr. Jens Timmer, Zentrum für Datenanalyse und Modellbildung, Universität Freiburg Eigene Vorarbeiten: Meine Arbeitsgruppe untersucht seit einigen Jahren lokale Veränderungen des intrazellulären Ca2+ und pHs in epithelialen Zellen mittels hoch auflösender mikroskopischer Fluoreszenzverfahren (1,2). Häufig tauchte dabei die Frage auf inwieweit und unter welchen Bedingungen Kern und/oder Zytosol in die Regulation dieser Parameter eingreifen. Die passive Diffusion von Makromolekülen wurde in Epithelzellen mittels Mikroinjektion und Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) untersucht (3). Die Induktion von Ca2+-Transienten durch Freisetzung von InsP3 mittels Uncaging im Kern und deren Ausbreitung ins Cytosol wurde gezeigt (3). Durch die Entwicklung einer Methode (4) der schnellen Messung des Zellvolumens wurde der Einfluss des intrazellulären pH auf das Zellkernvolumen untersucht (5). In einer Arbeit wurde mittels fluoreszierender GFP-Konstrukte das zytosolische Processing eines intrazellulären Proteins untersucht (6). Die Kombination der experimentellen Ansätze zur Untersuchung der Regulation des KPK als einem ubiquitären Vorgang in der Zelle ist derzeit in Arbeit. Ziele und Arbeitsprogramm: Exemplarisch für ein komplexes, intrazelluläres, biologisches System von zeitlich und räumlich in einer Sequenz ablaufenden Transportvorgängen soll der grundlegende Prozess der Weiterleitung von Signalen innerhalb der Zelle durch Makromoleküle untersucht werden. Die Daten werden durch Kombination hoch auflösender 2D- und 3D-Timelapse Mikroskopie (Weitfeld- oder konfokale 1- und 2-Photonen Mikroskopie) mit Photobleaching (FRAP oder FLIP), Uncaging (caged Ca2+ oder H+), Licht-induzierter Aktivierung von GFP und Live-Mikroinjektion zuerst generell an einem epithelialen Zell-Modellsystem (HeLa-Zellen) erfasst und dann mit einem speziellen System dem JAK-STAT5 Signalweg verglichen. 1.) Messung der passiven Diffusion von Makromolekülen unterschiedlicher Größe durch die KM bei Beeinflussung zellphysiologisch relevanter Parameter wie Ca2+, pH, InsP3, ATP,GTP und Zellvolumen, sowie unter Beeinflussung von Zytoskelett oder Zellorganellen durch Toxine oder andere Wirkstoffe. 2.) Messung der erleichterten Diffusion von transient transfizierten RanGTP abhängigen, fluoreszierenden Makromolekülen (GFP-gekoppelte Proteine mit NLS-Sequenz) durch die KM bei Beeinflussung zellphysiologischer relevanter Parameter. Die unter 2.) an HeLa-Zellen gewonnenen Daten über die erleichterte Diffusion werden mit Daten verglichen, die unter soweit wie möglich gleichen Bedingungen érhalten werden, aber in den vom Ursprung her völlig verschiedenen hämatopoetischen Zellsystem von Frau Dr. Klingmüller (MPI Freiburg). Des Weiteren soll dann mit den gleichen methodischen Ansätzen das JAK-STAT5 System (siehe Teilprojekt XX) in diesem System untersucht werden. Hierzu sind durch Frau Dr. Klingmüller bereits entsprechende GFP-Konstrukte vorhanden bzw. in Arbeit. Die mathematische Modellierung der untersuchten Transportabläufe und ihre Regulation ist das abschließende Ziel dieses Projekts. Publikationen: 1. Nitschke R, Henger A, Ricken C, Müller V, Köttgen M, Bek M, Pavenstädt H. J Am Soc Nephrol (12): 678-687 (2001) 2. Ricken S, Leipziger J, Greger R, Nitschke R. J Biol Chem (273(52)): 34961-34969 (1998) 3. Ricken S, Santella L, Greger R, Nitschke R. Pflugers Arch 435 Suppl.: R63 (1998) 4. Schreiber R, Nitschke R, Greger R, Kunzelmann K. J Biol Chem (274): 11811-11816 (1999) 5. Nitschke R, Haxelmans S,.Henger A. Pflugers Arch 439 (6): R417 (2000) 6. Kramer-Zucker A, Sellin L, Irmgrund M, Nickel Ch, Nitschke R, Walz G. Am J Physiol (submitted) (2002) Teilprojekt 6 Thema: Entwicklung einer neuartigen Methode zur parallelen Multiplex-Proteinanalytik Antragsteller: Dr. T. Nann , Prof. G.Urban Stand der Forschung: Entwicklung von Proteinarrays zur Multiplex-Proteinanalytik sind augenblicklich einer der Hauptschwerpunkte in der Proteomikforschung. Allerdings weisen bisherige Assayverfahren einige gravierende Mängel auf: -Proteinen zeigen einen unspezifischen Response. -Das Signal-Rauschverhältnis bisheriger Assays ist nicht zufriedenstellend (geringer StokesShift organischer Fluorophore). -Durch Photobleaching der Fluorophore ist die Sensitivität begrenzt. -Signale werden durch Überlappung verschiedener Emissionsspektren unspezifisch. -Eine quasikontinuierliche Erfassung von Proteinen ist nicht möglich. Ein Weg diese Problematik zu umgehen ist die Verwendung spezieller lumineszierender Nanopartikel zur Proteinmarkierung auf einem Array und die Implementierung solcher ProteinArrays in eine Mikrofluidik. Beteiligte Wissenschaftler: T. Nann, J. Riegler, N. N. / Freiburger Materialforschungszentrum (FMF), Institut für Mikrosystemtechnik (IMTEK). Eigene Vorarbeiten: Die am Freiburger Materialforschungszentrum (FMF) angesiedelte Arbeitsgruppe hat weitreichende Erfahrung in der Synthese und Derivatisierung von Halbleiter Nanopartikeln mit besonderem Augenmerk auf biologischen Anwendungen. Die bisher dargestellten Partikel weisen Emissionsbanden mit Halbhöhenbreiten bis zu 25 nm auf, die im gesamten sichtbaren Bereich beliebig eingestellt werden können. Diese Partikel zeigen kaum Photobleaching, einen großen Stokes-Shift (Anregungsmaxima im UV) und können quasi beliebig chemisch derivatisiert werden (z. B. mit spezifischen Antikörpern). Damit eignen sich diese Fluorophore optimal zur parallelen multiplexen Proteinanalytik. Erste Erfolge bei der unspezifischen Markierung von Protein-Arrays wurden bereits erzielt. Ziele und Arbeitsprogramm: Wie oben gezeigt, eigenen sich die optischen Eigenschaften lumineszierender Nanopartikel optimal zur parallelen Multiplexanalyse von Proteinen. Dazu müssen die Nanopartikel jedoch derart derivatisiert werden, dass sie spezifisch an Proteine binden. Dies kann z. B. durch Konjugation mit den entsprechenden Antikörpern erreicht werden. Die primäre wiss. Fragestellung besteht also einerseits in der Kopplung von lumineszierenden Nanopartikeln an Antikörper und andererseits an der funktionellen Analyse dieser Biokonjugate. Der dritte Schritt besteht dann in der Entwicklung eines Protokolls zur quasikontinuierlichen, parallelen Detektion verschiedener Proteine auf einem Array bzw. in einem mikrofluidischen System. Publikationen: J. Riegler, T. Nann, R. Kiefer, G. A. Urban, Chem. Bio. Chem. Submitted. J. Riegler, T. Nann, Adv. Mater. Submitted. T. Nann, J. Riegler, Chem. Eur. J. 2002, 20, in press. T. Nann, U. Kielmann, C. Dietrich, Anal. Bioanal. Chem. 2002, 373, 749-753. T. Nann, G. Urban, J. Electroanal. Chem. 2001, 505, 125-132. T. Nann, G. Urban, Sens. Actuators B 2000, 70(1-3), 188-195. Teilprojekt 7 Thema: Mathematische Methoden zur datenbasierten Modellierung der Signaltransduktion Antragsteller: HD Dr. Jens Timmer, Freiburger Zentrum für Datenanalyse und Modellbildung und Fakultät für Mathematik und Physik, Universität Freiburg Stand der Forschung: Die biochemischen Komponenten von zahlreichen Signaltransduktionskaskaden sind qualitativ gut bekannt. Ein quantitatives Verständnis systemischer Eigenschaften der Informationsübertragung und der Regulationsmechanismen der Signaltransduktion erfordert eine mathematische Modellierung. Bisher geschieht dieses biher meistens im Rahmen von Simulationen. Hierzu wird die Struktur der Differentialgleichungen aus dem qualitativen Wissen über die Signaltransduktionskasden abgeleitet. Die Parameter der Gleichungen sind weitgehend unbekannt und werden in der Regel ad hoc festgelegt. Dadurch ist es schwierig zu entscheiden, ob die Resultate durch die Modellannahmen oder die gewählten Parameter bestimmt werden. Beteiligte Wissenschaftler: HD Dr. Jens Timmer, Dr. H.U. Voss, Dipl. Phys. D. Faller, Datenanalyse und Modellbildung Freiburger Zentrum für Eigene Vorarbeiten : In der Arbeitsgruppe des Antragstellers verfügt über langjähriger Erfahrung in der interdisziplinären Analyse und Modellierung biologischer Systeme. In den vergangenen Jahren Methoden zur Parameterschätzung in Differentialgleichungen entwickelt und auf technische und biologische Systeme angewandt worden. In einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Frau PD Dr. U. Klingmüller vom Max-Planck-Institut für Immunbiologie konnten wir durch eine mathematische Modellierung zeigen, daß, entgegen der bisherigen Annahme, der JAKSTAT Signalweg des Epo-Rezeptors nicht in einer reinen feed-forward Kaskade besteht, sondern aus einem auf kurzen Zeitskalen rückgekoppelten System. Auf systemischem Niveau bedeutet dies, das Gentranskription sensibler an Rezeptoraktivierung gekoppelt werden kann als dies bei einem reiner feed-forward Kaskade der Fall wäre. Ziele und Arbeitsprogramm: Ziel des Projektes ist es, mathematische Methoden zu entwickeln, um durch eine Modellierung der Dynamk von Signaltransduktionswegen basierend auf experimentellen Zeitreihen ein quantitatives Verständnis der Systemeigenschaften zu ermöglichen, Dazu sollen Methoden zu Parameterschätzung in dynamischen Systemen weiterentwickelt werden. Speziell sind Methoden zu entwickeln, um die strukurelle Identifizierbarkeit von Parametern zu untersuchen. Biologische System zeichnen sich in der Regel durch Robustheit aus. Dieses bedeutet, dass sich ihr systemisches Verhalten nicht wesentlich ändert, wenn sich die Parameter im System ändern. Dieser Umstand schränkt die Identifizierbarkeit der Modellparameter ein. Es sind mathematische Methoden zu entwickeln, um die eventuelle Nicht-Identifizierbarkeit der Modelle auf Grund ihrer mathematischen Struktur von der Nicht-Identifizierbarkeit auf Grund der biologischen Robustheit zu unterscheiden. Hierzu werden statistische Methoden aus dem Bereich des Bootstrap verwendet werden. Ferner sind Methoden der Modellselektion und der Modellvalidierung für misspezifizierte Modelle bei finiten Stichprobenumfängen zu entwickeln. Im ersten Jahr liegt der Schwerpunkt der Arbeit auf der Entwicklung der mathematischen Methoden. Im zweiten Jahr werden die entwickelten Methoden in enger Kooperation mit den experimentellen Arbeitsgruppen auf die erhobenen Daten angewendet. Publikationen: Müller T., Noykova N., Gyllenberg M., Timmer J.: Math. Biosciences 177-178, 2002, 147-160 Noykova N., Müller T., Gyllenberg M., Timmer J.: Biotech. & Bioeng. 78, 2002, 89-103 Timmer J., Rust H., Horbelt W., Voss H.U.: Phys. Lett. A 274, 2000, 123-134 Horbelt W., Timmer J., Bünner M.J., Meucci R., Ciofini M.: Phys.Rev. E 64, 2001, 016222 J. Timmer, T. G. Müller, I. Swameye, O. Sandra, and U. Klingmüller (2002). International Journal of Bifurcation and Chaos, in press Swameye, T. G. Müller, J. Timmer, O. Sandra, and U. Klingmüller. (2002), PNAS, submitted.
