1. zweckbestimmung - IBL international
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Arbeitsanleitung TriCat ELISA Manueller und automatischer Enzymeimmunoassay für die in-vitro diagnostische quantitative Bestimmung von Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin in humanem Plasma und Urine. RE59395 3x96 2-8°C I B L I N T E R N A T I O N A L Flughafenstrasse 52a D-22335 Hamburg, Germany Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 G M B H [email protected] www.IBL-International.com TriCat ELISA (RE59395) 1. DEUTSCH ZWECKBESTIMMUNG Manueller und automatisierbarer Enzymimmunoassay für die in-vitro Diagnostik zur Bestimmung von Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin in humanem Plasma und Urin. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Die Katecholamine Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin werden als Neurotransmitter an den Synapsen freigesetzt und dienen unter anderem der Adaption des Körpers an akuten und chronischen Streß. Hierbei stehen beim Adrenalin die Wirkung auf Herzmuskulatur und Stoffwechsel, beim Noradrenalin die Wirkung auf den peripheren Kreislauf im Vordergrund. Im Zentralen Nervensystem ist Dopamin hauptsächlich in den dopaminergen Neuronen gespeichert und hat Einfluß auf motorische Funktionen und Wahrnehmung. Erhöhte oder zu niedrige Katecholaminwerte werden bei einer Reihe von Krankheiten beschrieben, wie z.B. dem Phäochromozytom (einer malignen Entartung der chromaffinen Zellen, hauptsächlich des Nebennierenmarks), bei Hypertonie, degenerativen Erkrankungen des Herzens, Schizophrenie und manischer Depression. Die Bestimmung der Katecholamine kann sowohl im Urin als auch im Plasma erfolgen. Bei der diagnostischen Beurteilung ihrer Ausscheidungsmuster und der ihrer Metabolite ist zu berücksichtigen, dass die gemessenen Konzentrationen sowohl den zentralen wie den peripheren Stoffwechsel widerspiegeln. Aufgrund des Extraktionsschrittes vor Beginn des Elisa’s kann der Assay auf verschiedene Tierarten angewendet werden, wie z.B. Ratten, Mäusen und anderen. Die chemische Struktur der Katecholamine ist in allen Tierarten identisch. 3. TESTPRINZIP Sandwich-Enzymimmunoassay (ELISA). Die Wells der Mikrotiterstreifen sind mit Ziege-anti-Kaninchen Antikörpern beschichtet. Der zugegebene flüssige Antikörper, der gegen ein Epitop des Antigenmoleküls gerichtet ist, bindet während der Inkubationszeit an die Platte. Die Proben werden in den Wells zusammen mit einem enzymmarkierten Antikörper (E-Ab) inkubiert, der gegen ein anderes Epitop des Antigens gerichtet ist. Die Intensität der gebildeten Farbe nach der Substratreaktion ist proportional zur AntigenKonzentration. Die Ergebnisse der Proben können direkt anhand der Standardkurve bestimmt werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, EinmalLatexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. 9. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf anti-HCV, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. V2009_06 1 / 14 TriCat ELISA (RE59395) 5. DEUTSCH LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8°C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 2-8°C gelagert wird. 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Die in-vivo-Freisetzung der Katecholamine wird durch verschiedene Lebensmittel und Arzneimittel beeinflusst. Der Patient sollte den Verzehr bzw. die Zufuhr von Vitamin B, Kaffee und Bananen alpha-Methyldopa, MAO- und COMT- Inhibitoren sowie Medikationen in Verbindung mit Bluthochdruck mind. 72 h vor der Probensammlung absetzen. Plasma (EDTA) Die Blutproben sollten bei 2-8°C gelagert und innerhalb von 2 h nach der Blutentnahme zentrifugiert werden, um das Plasma abzutrennen. Die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Blutabnahme sind einzuhalten. Die chemische Integrität der Blutproben muss vom Zeitpunkt der Blutabnahme bis zur Testdurchführung erhalten bleiben. Keine hämolytischen, ikterischen oder lipämischen Proben verwenden. Getrübte Proben sollten vor der Testdurchführung zentrifugiert werden, um Partikel zu entfernen. Lagerung: 2-8°C Haltbarkeit: 6h -20°C (aliquotiert) Vor Hitze und Sonneneinstrahlung schützen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Zum Versand müssen die Proben eingefroren werden. 1 mon Urin Spontanurin oder 24 h-Sammelurin können verwendet werden. Das Gesamtvolumen über 24 h sollte in einer Flasche unter Vorlage von 10 - 15 mL 6 N HCl als Konservierungsmittel gesammelt und gemischt werden. Gesamtvolumen bestimmen zur späteren Auswertung des Tests. Proben vor Gebrauch mischen und zentrifugieren. Lagerung: -20°C (aliquotiert) Haltbarkeit: 6 mon 7. Vor Hitze und Sonneneinstrahlung schützen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. KOMPONENTEN DES KITS DieReagenzien dieses Kits sind ausreichend für 96 Extraktionen in einfach Bestimmung der Proben (Extraktion): 88 Patienten Proben, 6 Standards und 2 Kontrollen. Jeder Extrakt ist ausreichend für eine einfach Bestimmung von Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin. Die Mikrotiterplatte kann benutzt werden für: Adrenalin, Noradrenalin and Dopamine. Anzahl/ Menge Symbol 3 x 12x8 MTP Komponente Mikrotiterplatte Wells einzeln abbrechbar. Beschichtet mit anti-Kaninchen IgG (Ziege, polyklonal). Standard A-F 1x 6 x 2.5 mL CAL A-F 1x 2 x 2.5 mL CONTROL 1+2 2 x 250 µL ENZCONJ CONC Adrenalin: 0; 1.5; 5.0; 15; 50; 150 ng/mL (0; 8; 27; 82; 273; 819 nmol/L) Noradrenalin: 0; 5.0; 15; 50; 150; 500 ng/mL (0; 30; 89; 296; 887; 2955 nmol/L) Dopamin: 0; 60; 180; 585; 2300; 11470 ng/mL (0; 392; 1175; 3819; 15014; 74876 nmol/L) Gebrauchsfertig. Enthält: [-] Adrenalin, [-] Noradrenalin, [-] Dopamin (biologisch aktiv), and 0.1 M HCl. Kontrolle 1+2 Gebrauchsfertig. Enthält: [-] Adrenalin, [-] Noradrenalin, [-] Dopamin (biologisch aktiv), 0.1 M HCl. Genaue Konzentrationen siehe Fläschchenetiketten oder QC Zertifikat. Enzymkonjugat Konzentrat (100x) V2009_06 Enthält: Antikörper, konjugiert mit Alkalischer Phosphatase, Trispuffer, HCl, 0.01 % NaN3. 2 / 14 TriCat ELISA (RE59395) DEUTSCH Anzahl/ Menge Symbol Komponente 4x EXTRPLATE 2 x 60 mL EXTRBUF 6 x 1.25 mL COMT LYO COMT lyophilisiert 2 x 2 mL COMT ADD COMT Additiv 1 x 7.0 mL ANTISERUM AD 1 x 7.0 mL ANTISERUM NAD 1 x 7.0 mL ANTISERUM DO 6 x 1.25 mL COENZ Coenzymlösung 3 x 3 mL ENZBUF Enzympuffer 1 x 100 mL RELEASEBUF Freisetzungspuffer 2 x 3.0 mL ACYLREAG Acylierungsreagenz Extraktionsplatte (Makrotiterplatte) Je 24 Wells. Beschichtet mit Boronat-Affinitätsgel. Extraktionspuffer Rosa gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: 0.016 % NaN3. Enthält: Catechol-o-Methyltransferase (Schweineleber), NaN3. Enthält: humanes Plasma, Stabilisatoren, 0.01 % Thimerosal. Adrenalin Antiserum Grün gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: Antikörper gegen Adrenalin (Kaninchen), Puffer, Stabilisatoren. Noradrenalin Antiserum Blau gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: Antikörper gegen Noradrenalin (Kaninchen), Puffer, Stabilisatoren. Dopamin Antiserum 3 x 50 mL Gebrauchsfertig. Enthält: S-Adenosyl-L-Methionin, Stabilisatoren. Gebrauchsfertig. Enthält: Trispuffer, HCl, Stabilisatoren. Gelb gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: 0.1 M HCl, Indikator. Gebrauchsfertig. Enthält: Dimethylformamid, Ethanol.Vorsicht! Giftig. Leichtentzündlich. WASHBUF CONC Waschpuffer Konzentrat (10x) Enthält: Trispuffer, HCl, Tween, 0.2 % NaN3. 3x9x PNPP SUBS 3 x 27 mL PNPP BUF 3 x 15 mL PNPP STOP 9x FOIL 8. Violett gefärbt Gebrauchsfertig. Enthält: Antikörper gegen Dopamin (Kaninchen), Puffer, Stabilisatoren. PNPP Substrattabletten In einer Folie verpackt. Enthält: p-Nitrophenyl-Phosphat (PNPP). PNPP Substratpuffer Gebrauchsfertig. Enthält: Diethanolamin, Wasser, 0.05 % NaN3. PNPP Stopplösung Gebrauchsfertig. Enthält: 1 M NaOH, 0.25 M EDTA. Haftklebefolie ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3% VK). Volumina: 10; 10-100; 1001000 µL 2. Orbitalschüttler (200-900 U/min) (z.B. EAS 2/4, SLT) 3. Vortex-Mischer 4. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 5. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 6. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 405 nm (Referenzwellenlänge 600650 nm) 7. Bidest. oder deionisiertes Wasser 8. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 9. Röhrchen für die Probenverdünnung 10. 0.1 M HCl, zur Probenverdünnung (Urin) V2009_06 3 / 14 TriCat ELISA (RE59395) 9. DEUTSCH HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25°C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue EinmalPipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 5. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. Ein Pipettierschema für die Probenvorbehandlung und den Assay ist auf der IBLHomepage verfügbar. 6. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-KanalMikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 7. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 8. Feuchtigkeit beeinflusst die beschichteten Wells/Röhrchen. Verpackung nicht öffnen bevor Raumtemperatur erreicht ist. Nicht benötigte Wells/Röhrchen sofort in den wiederverschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben. 10. MANUELLE DURCHFÜHRUNG 10.1. TESTVORBEREITUNGEN Der Inhalt des Kits für 288 Bestimmungen kann in 2 separaten Ansätzen durchgeführt werden. Die angegebenen Volumina sind für einen Ansatz mit 3 x 6 Streifen (144 Bestimmungen). Sichtbare Gelmengen können sich während der Extraktion ohne störenden Einfluss auf das Ergebnis von der Extraktionsplatte ablösen. Luftverunreinigungen hervorgerufen durch Peroxid-haltige Desinfektionsmittel als Puder oder Lösungen, z.B. VIRKON® müssen auf jeden Fall vermieden werden, da diese das Assay System empfindlich stören können. VIRKON® ist ein Handelsname von DuPont. 10.1.1. Probenverdünnung Proben mit einer erwarteten Konzentration über dem höchsten Standard müssen wie folgt verdünnt werden: Probe Plasma Urin V2009_06 zu verdünnen mit Bemerkungen > höchstem Standard > höchstem Standard bidest. Wasser 0.1 N HCl vor dem Extraktionsschritt vor dem Extraktionsschritt 4 / 14 TriCat ELISA (RE59395) DEUTSCH 10.1.2. Extraktion der Proben, Standards und Kontrollen (Extraktionsplatte) (manuelle Version) 1. Je 20 µL der Standards, Kontrollen und Urinproben und je 500 µL der Plasmaproben in die entsprechenden Wells der Extraktionsplatte pipettieren. 500 µL bidest. Wasser in alle Wells außer denen der Plasmaproben pipettieren, um das abweichende Volumen auszugleichen. 2. Je 1000 µL Extraktionspuffer in jedes Well pipettieren. 3. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 30 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (600–900 U/min) extrahieren. Während der Extraktion sollte die Oberfläche der Flüssigkeit die Folie benetzen, aber die Flüssigkeit sollte nicht über 2/3 des Wells hinausgehen. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 4. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. 5. Je 2 mL bidest. Wasser in jedes Well pipettieren. 6. Platte mit neuer Folie abdecken. 5 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (600–900 U/min) schütteln. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 7. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 8. Je 150 µL Extraktionspuffer in jedes Well pipettieren. Zu jedem Well 50 µL Acylierungsreagenz hinzugeben. Sofort schütteln. 9. 20 min bei RT (18-25°C) (ohne Folie) auf einem Schüttler (400–600 U/min) extrahieren. 10. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 11. Je 2 mL bidest. Wasser in jedes Well pipettieren. 12. Platte mit neuer Folie abdecken. 5 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (600–900 U/min) schütteln. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 13. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 14. Je 300 µL Freisetzungspuffer in jedes Well pipettieren. 15. 30 min bei RT (18-25°C) (ohne Folie) auf einem Schüttler (400–600 U/min) schütteln. Vorbereitete Proben sollten am gleichen Tag analysiert werden. Wenn dies nicht möglich ist, kann die Extraktionsplatte abgedeckt mit Folie bei 2-8°C über Nacht gelagert werden. WICHTIG zur Bestimmung von Dopamin Die extrahierten Standards und Kontrollen müssen vor der Zugabe in die Mikrotiterplatte in separaten Röhrchen verdünnt warden! Ebenfalls die Urinproben. Hierfür werden alle extrahierten Standards, Kontrollen und Urinproben 1:51 mit Release Puffer in separaten Röhrchen verdünnt. (i.e. 10 µL extrahierte Probe + 500 µL Release Puffer). Diese Verdünnung ist für Plasma Proben nicht erforderlich! V2009_06 5 / 14 TriCat ELISA (RE59395) DEUTSCH 10.1.3. Vorbereitung lyophilisierter oder konzentrierter Komponenten Verd./ rekonst. Komponente mit Diluent Verhältnis 75 mL Waschpuffer 675 mL bidest. Wasser 1:10 150 µL Enzymkonjugat 15 mL Waschpuffer (verdünnt) 1:101 12 PNPP Substrattabletten 32 mL PNPP Substratpuffer Bemerkungen Gründlich mischen. Frisch herstellen und nur einmal verwenden. Ohne Schaumbildung mischen. Frisch herstellen und nur einmal verwenden. Lagerung Haltbarkeit 2-8°C 4w 18-25°C 5h 18-25°C 5h 10.2. TESTDURCHFÜHRUNG (manuelle Version) 10.2.1. Herstellung der COMT Enzymlösung Die COMT Enzymlösung muss frisch vor Gebrauch hergestellt werden. Die Kitkomponente COMT in jeweils 1.25 mL bidest. Wasser lösen und gut mischen*. Anschließend 1.25 mL Coenzymlösung, dann 1.25 mL Enzympuffer und 0.40 mL COMT Additiv in jedes Fläschchen zugeben, so dass ein Endvolumen von 4.15 mL COMT Enzymlösung pro Fläschchen resultiert. Poolen Sie 3 Fläschchen für je 48 Bestimmungen Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin. Die Lösung kann trüb sein. Ohne Schaumbildung mischen. Die COMT Lösg. ist bei Raumtemperatur für 1 Std. stabil. * Wenn nur ein Teil der COMT Lösung benötigt wird, kann der Rest bei -20° C aliquotiert eingefroren werden. Die COMT Lösung ist unter diesen Bedingungen 1-2 mon. stabil. 10.2.2. Enzymatische Derivatisierung der Proben, Standards und Kontrollen (Mikrotiterplatte) Wenn mit Überhub pipettiert wird, muss die Restflüssigkeit aus der Pipettenspitze in die entsprechenden Wells der Extraktionsplatte zurückgegeben werden. Es ist außerdem hilfreich, die Extraktionsplatte schräg zu halten. Mikrotiterplatte vor gebrauch für Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin beschriften. 10.2.2.1. Zur Bestimmung von Gewebehomogenaten und Zellkulturüberständen können generell folgende Empfehlungen gegeben werden: Das Arbeiten mit Zellkulturüberständen ist abhängig von den zu erwartenden Konzentrationen und dem Medium: Wenn nach dem Urin-Protokoll (Extraktion von mindestens 20 µL Überstand) gearbeitet wird, kann eine Sensitivität für Adrenalin von 0,3 ng/mL, für Noradrenalin von 0,6 ng/mL und für Dopamin von 5 ng/mL für verdünnte Proben erwartet werden. Enthält die Matrix zusätzlich Serum (FCS), kann nach dem Plasma– Protokoll (500 µL Überstand) mit der entsprechenden Sensitivität für Plasma ( siehe 16.PERFORMANCE) gearbeitet werden. Für Gewebehomogenate sollte keine Perchlorsäure für die Homogenisierung verwendet werden. Eine detaillierte Anleitung ist bei IBL erhältlich. V2009_06 6 / 14 TriCat ELISA (RE59395) DEUTSCH 10.2.2.2. Adrenalin für Urin und Plasma Je 75 µL frisch hergestellte COMT Enzymlösung in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettieren. 1. Kurz schütteln. Je 100 µL der extrahierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Wells 2. pipettieren. Es empfiehlt sich, die Pipettenspitze dabei direkt in die COMT-Lösung zu halten. Es erfolgt ein Farbumschlag nach rosa. Kurz schütteln. Je 50 µL Adrenalin Antiserum (grün gefärbt) in jedes Well pipettieren. 3. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 120 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (400–600 U/min) 4. inkubieren. 10.2.2.3. Noradrenalin für Urin und Plasma Je 25 µL frisch hergestellte COMT Enzyme Solution in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettieren. 1. Kurz schütteln. Je 25 µL der extrahierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Wells 2. pipettieren. Es empfiehlt sich, die Pipettenspitze dabei direkt in die COMT-Lösung zu halten. Es erfolgt ein Farbumschlag nach rosa. Kurz schütteln. 50 µL Noradrenalin Antiserum (blau gefärbt) in jedes Well pipettieren. 3. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 120 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (400–600 U/min) 4. inkubieren. 10.2.2.4. Dopamin für Urin und Plasma Je 75 µL frisch hergestellte COMT Enzyme Solution in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettieren. 1. Kurz schütteln. Für Urin: 100 µL der 1:51 vorverdünnten extrahierten Standards, Kontrollen und Urin-Proben in 2. die entsprechenden Wells pipettieren. Es empfiehlt sich, die Pipettenspitze dabei direkt in die COMT-Lösung zu halten. Es erfolgt ein Farbumschlag nach rosa. Kurz schütteln. Für Plasma: 100 µL der 1:51 vorverdünnten extrahierten Standards, Kontrollen und unverdünnte extrahierte Plasma Proben in die entsprechenden Wells pipettieren. Es empfiehlt sich, die Pipettenspitze dabei direkt in die COMT-Lösung zu halten. Es erfolgt ein Farbumschlag nach rosa. Kurz schütteln. 50 µL Dopamin Antiserum (violett gefärbt) in jedes Well pipettieren. 3. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 120 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (400–600 U/min) 4. inkubieren. 10.2.3. ELISA Die folgenden Schritte müssen für Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin durchgeführt werden. 1. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 6 x mit je 250 - 300 µL verdünntem Waschpuffer waschen. 2. Je 100 µL frisch hergestelltes Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. 3. Platte abdecken. 60 min bei RT (18-25°C) auf einem Orbitalschüttler (400–600 U/min) inkubieren. 4. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 6 x mit je 250 - 300 µL verdünntem Waschpuffer waschen. 5. Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. 6. Je 200 µL Substratlösung in jedes Well pipettieren. 7. 40 min bei RT (18-25°C) auf einem Orbitalschüttler (400–600 U/min) inkubieren. 8. Die Substratreaktion durch Zugabe von 50 µL PNPP Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. 9. Die optische Dichte mit einem Photometer bei 405 nm (Referenzwellenlänge: 620-650 nm) innerhalb 60 min nach dem Pipettieren der Stopplösung messen. V2009_06 7 / 14 TriCat ELISA (RE59395) 11. DEUTSCH AUTOMATISIERTE DURCHFÜHRUNG 11.1. TESTVORBEREITUNGEN (automatisierte Version) Der Inhalt des Kits für 288 Bestimmungen kann in 2 separaten Ansätzen durchgeführt werden. Die angegebenen Volumina sind für einen Ansatz mit 3 x 6 Streifen (144 Bestimmungen). Sichtbare Gelmengen können sich während der Extraktion ohne störenden Einfluss auf das Ergebnis von der Extraktionsplatte ablösen. Luftverunreinigungen hervorgerufen durch Peroxid-haltige Desinfektionsmittel als Puder oder Lösungen, z.B. VIRKON® müssen auf jeden Fall vermieden werden, da diese das Assay System empfindlich stören können. VIRKON® ist ein Handelsname von DuPont. 11.1.1. Probenverdünnung Proben mit einer erwarteten Konzentration über dem höchsten Standard müssen wie folgt verdünnt werden: Probe Plasma Urin zu verdünnen mit Bemerkungen > höchstem Standard > höchstem Standard bidest. Wasser 0.1 N HCl vor dem Extraktionsschritt vor dem Extraktionsschritt 11.2. Extraktion der Proben, Standards und Kontrollen (Extraktionsplatte) (automatisierte Version) 1. Je 30 µL der Standards, Kontrollen und Urinproben und je 750 µL der Plasmaproben in die entsprechenden Wells der Extraktionsplatte pipettieren. 750 µL bidest. Wasser in alle Wells außer denen der Plasmaproben pipettieren, um das abweichende Volumen auszugleichen. 2. Je 1000 µL Extraktionspuffer in jedes Well pipettieren. 3. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 30 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (600–900 U/min) extrahieren. Während der Extraktion sollte die Oberfläche der Flüssigkeit die Folie benetzen, aber die Flüssigkeit sollte nicht über 2/3 des Wells hinausgehen. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 4. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. 5. Je 2 mL bidest. Wasser in jedes Well pipettieren. 6. Platte mit neuer Folie abdecken. 5 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (600–900 U/min) schütteln. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 7. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 8. Je 150 µL Extraktionspuffer in jedes Well pipettieren. Zu jedem Well 50 µL Acylierungsreagenz hinzugeben. Sofort schütteln. 9. 20 min bei RT (18-25°C) (ohne Folie) auf einem Schüttler (400–600 U/min) extrahieren. 10. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 11. Je 2 mL bidest. Wasser in jedes Well pipettieren. 12. Platte mit neuer Folie abdecken. 5 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (600–900 U/min) schütteln. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 13. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 14. Je 450 µL Freisetzungspuffer in jedes Well pipettieren. 15. 30 min bei RT (18-25°C) (ohne Folie) auf einem Schüttler (400–600 U/min) schütteln. Vorbereitete Proben sollten am gleichen Tag analysiert werden. Wenn dies nicht möglich ist, kann die Extraktionsplatte abgedeckt mit Folie bei 2-8°C über Nacht gelagert werden. V2009_06 8 / 14 TriCat ELISA (RE59395) DEUTSCH WICHTIG zur Bestimmung von Dopamin Die extrahierten Standards und Kontrollen müssen vor der Zugabe in die Mikrotiterplatte in separaten Röhrchen verdünnt warden! Ebenfalls die Urinproben. Hierfür werden alle extrahierten Standards, Kontrollen und Urinproben 1:51 mit Release Puffer in separaten Röhrchen verdünnt. (i.e. 10 µL extrahierte Probe + 500 µL Release Puffer). Diese Verdünnung ist für Plasma Proben nicht erforderlich! 11.2.1. Vorbereitung lyophilisierter oder konzentrierter Komponenten Verd./ rekonst. Komponente mit Diluent Verhältnis 75 mL Waschpuffer 675 mL bidest. Wasser 1:10 190 µL Enzymkonjugat 19 mL Waschpuffer (verdünnt) 1:101 12 PNPP Substrattabletten 32 mL PNPP Substratpuffer Bemerkungen Gründlich mischen. Frisch herstellen und nur einmal verwenden. Ohne Schaumbildung mischen. Frisch herstellen und nur einmal verwenden. Lagerung Haltbarkeit 2-8°C 4w 18-25°C 5h 18-25°C 5h 11.3. TESTDURCHFÜHRUNG (automatisierte Version) 11.3.1. Herstellung der COMT Enzymlösung Die COMT Enzymlösung muss frisch vor Gebrauch hergestellt werden. Die Kitkomponente COMT in jeweils 1.25 mL bidest. Wasser lösen und gut mischen*. Anschließend 1.25 mL Coenzymlösung, dann 1.25 mL Enzympuffer und 0.40 mL COMT Additiv in jedes Fläschchen zugeben, so dass ein Endvolumen von 4.15 mL COMT Enzymlösung pro Fläschchen resultiert. Poolen Sie 3 Fläschchen für je 48 Bestimmungen Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin. Die Lösung kann trüb sein. Ohne Schaumbildung mischen. Die COMT Lösg. ist bei Raumtemperatur für 1 Std. stabil. * Wenn nur ein Teil der COMT Lösung benötigt wird, kann der Rest bei -20° C aliquotiert eingefroren werden. Die COMT Lösung ist unter diesen Bedingungen 1-2 mon. stabil. 11.3.1.1. Zur Bestimmung von Gewebehomogenaten und Zellkulturüberständen können generell folgende Empfehlungen gegeben werden: Das Arbeiten mit Zellkulturüberständen ist abhängig von den zu erwartenden Konzentrationen und dem Medium: Wenn nach dem Urin-Protokoll (Extraktion von mindestens 20 µL Überstand) gearbeitet wird, kann eine Sensitivität für Adrenalin von 0,3 ng/mL, für Noradrenalin von 0,6 ng/mL und für Dopamin von 5 ng/mL für verdünnte Proben erwartet werden. Enthält die Matrix zusätzlich Serum (FCS), kann nach dem Plasma– Protokoll (500 µL Überstand) mit der entsprechenden Sensitivität für Plasma ( siehe 16.PERFORMANCE) gearbeitet werden. Für Gewebehomogenate sollte keine Perchlorsäure für die Homogenisierung verwendet werden. Eine detaillierte Anleitung ist bei IBL erhältlich. V2009_06 9 / 14 TriCat ELISA (RE59395) DEUTSCH 11.3.2. Enzymatische Derivatisierung der Proben, Standards und Kontrollen (Mikrotiterplatte) 11.3.2.1. Adrenalin für Urin und Plasma Je 75 µL frisch hergestellte COMT Enzymlösung in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettieren. 1. Platte 1 min. schütteln. Je 100 µL der extrahierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Wells 2. pipettieren. Platte 1 min. schütteln. Je 50 µL Adrenalin Antiserum (grün gefärbt) in jedes Well pipettieren. 3. Platte abdecken. 120 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (400–600 U/min) inkubieren. 4. 11.3.2.2. Noradrenalin für Urin und Plasma Je 25 µL frisch hergestellte COMT Enzyme Solution in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettieren. 1. Platte 1 min. schütteln. Je 25 µL der extrahierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Wells 2. pipettieren. Platte 1 min. schütteln. 50 µL Noradrenalin Antiserum (blau gefärbt) in jedes Well pipettieren. 3. Platte abdecken. 120 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (400–600 U/min) inkubieren. 4. 11.3.2.3. Dopamin für Urin und Plasma Je 75 µL frisch hergestellte COMT Enzyme Solution in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettieren. 1. Kurz schütteln. Für Urin: 100 µL der 1:51 vorverdünnten extrahierten Standards, Kontrollen und Urin-Proben in 2. die entsprechenden Wells pipettieren. Es empfiehlt sich, die Pipettenspitze dabei direkt in die COMT-Lösung zu halten. Es erfolgt ein Farbumschlag nach rosa. Kurz schütteln. Für Plasma: 100 µL der 1:51 vorverdünnten extrahierten Standards, Kontrollen und unverdünnte extrahierte Plasma Proben in die entsprechenden Wells pipettieren. Es empfiehlt sich, die Pipettenspitze dabei direkt in die COMT-Lösung zu halten. Es erfolgt ein Farbumschlag nach rosa. Kurz schütteln. 50 µL Dopamin Antiserum (violett gefärbt) in jedes Well pipettieren. 3. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 120 min bei RT (18-25°C) auf einem Schüttler (400–600 U/min) 4. inkubieren. 11.3.3. ELISA Die folgenden Schritte müssen für Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin durchgeführt werden. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Inkubationslösung verwerfen. Platte 6 x mit je 250 - 300 µL verdünntem Waschpuffer waschen. Je 100 µL Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. Platte abdecken. 60 min bei RT (18-25°C) auf einem Orbitalschüttler (400–600 U/min) inkubieren. Inkubationslösung verwerfen. Platte 6 x mit je 250 - 300 µL verdünntem Waschpuffer waschen. Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. Je 200 µL Substratlösung in jedes Well pipettieren. 40 min bei RT (18-25°C) auf einem Orbitalschüttler (400–600 U/min) inkubieren. Wenn die Temperatur im Automat 25°C überschreitet, sollte die Inkubationszeit auf 30 min verringert werden, um einen Signalüberlauf zu vermeiden. Die Substratreaktion durch Zugabe von 50 µL PNPP Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. Die optische Dichte mit einem Photometer bei 405 nm (Referenzwellenlänge: 620-650 nm) innerhalb 60 min nach dem Pipettieren der Stopplösung messen. V2009_06 10 / 14 TriCat ELISA (RE59395) 12. DEUTSCH QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP- Regeln (Good Laboratory Practice) und andere einschlägige Normen und Gesetze beachten. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Die erhaltenen OD der Standards (y-Achse, linear) gegen deren Konzentration (x-Achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (linlog) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden. Die Konzentrationen für Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin der Kit-Kontrollen und der Urinproben können direkt von der Standardkurve abgelesen werden. Adrenalin und Noradrenalin in Plasma: Wegen des höheren Pipettiervolumens von 500 µL (automatisierte Version: 750 µL) für die Plasmaproben im Vergleich zu den 20 µL (automatisierte Version: 30 µL) für die Standards müssen die erhaltenen Werte durch 25 geteilt werden. Um pg/mL zu erhalten, muss mit 1000 multipliziert werden. Die Werte von verdünnten Proben müssen mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Dopamin in Plasma: Wegen des höheren Pipettiervolumens von 500 µL (automatisierte Version: 750 µL) für die Plasmaproben im Vergleich zu den 20 µL (automatisierte Version: 30 µL) während der Extraktion, sowie der 1:51 Verdünnung der Standards, müssen die erhaltenen Werte durch 1275 geteilt werden. Um pg/mL zu erhalten, muss mit 1000 multipliziert werden. Die Werte von verdünnten Proben müssen mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, müssen wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Für jede Urinprobe die 24h-Exkretion berechnen: µg/24h = µg/L x L/24h Umrechnung: Adrenalin (µg/L) x 5.458 = nmol/L Noradrenalin (µg/L) x 5.911 = nmol/L Dopamin (µg/L) x 6.528 = nmol/L V2009_06 11 / 14 TriCat ELISA (RE59395) DEUTSCH Typische Standardkurve 2,000 (Beispiel. Nicht zur Testauswertung verwenden!) Standard Adrenalin Mittelwert OD/ODmax (ng/mL) OD (%) A 0.0 0.183 0.0 B 1.5 0.215 1.8 C 5.0 0.291 6.2 D 15 0.490 17.7 E 50 1.104 53.2 F 150 1.914 100 Standard Noradrenalin Mittelwert OD/ODmax (ng/mL) OD (%) A 0.0 0.223 0.0 B 5.0 0.322 6.7 C 15 0.539 21.3 D 50 0.984 51.2 E 150 1.438 81.8 F 500 1.708 100 Standard Dopamin Mittelwert OD/ODmax (ng/mL) OD (%) A 0 0.135 0 B 60 0.287 6.4 C 180 0.500 15.3 D 585 1.113 41.0 E 2300 2.105 82.5 F 11470 2.522 100 1,500 OD 405 nm 1,000 0,500 0,000 1 10 100 1000 Adrenalin (ng/mL) 2,000 OD 405 nm 1,500 1,000 0,500 0,000 1 10 100 1000 Noradrenalin (ng/mL) OD 405 nm 2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 10 100 1000 10000 100000 Dopamine (ng/mL) 14. NORMWERTE Therapeutische Konsequenzen sollten nicht allein aufgrund der mit diesem Test ermittelten Werte getroffen werden, sondern nur unter Berücksichtigung aller klinischen Beobachtungen und weiterer diagnostischer Mittel. Augenscheinlich gesunde Spender zeigten die folgenden Normwerte: (5 % - 95 % Perzentile) Jedes Labor sollte unter Berücksichtigung regionaler Gegebenheiten eigene Normalwertbereiche erstellen. Urin Adrenalin Noradrenalin Dopamin 15. µg/d < 20 < 90 < 600 nmol/d < 110 < 535 < 3917 pg/mL < 125 < 600 < 100 Plasma nmol/L < 0.68 < 3.55 < 0.65 GRENZEN DES VERFAHRENS Die korrekte Durchführung der Probengewinnung ist entscheidend für die Testergebnisse. Näheres siehe PROBENGEWINNUNG UND -LAGERUNG. Angaben zu Kreuzreaktivitäten sind im Kapitel TESTCHARAKTERISTIKA zu finden. Die folgenden Blutbestandteile haben bis zu der angegebenen Konzentration keinen signifikanten Einfluss auf die Testergebnisse (+/- 20 %): Hämoglobin Bilirubin Triglyceride V2009_06 2.0 mg/mL 1.0 mg/mL 91 mg/mL 12 / 14 TriCat ELISA (RE59395) 16. DEUTSCH TESTCHARAKTERISTIKA Analytische Spezifität (Kreuzreaktivität) Substanz Adrenalin Noradrenalin Dopamin Metanephrin Normetanephrin 3-MT L-DOPA Adrenalin Analytische Sensitivität Noradrenalin (Nachweisgrenze) Dopamin Adrenalin 100 0.23 < 0.007 < 0.005 < 0.001 0.011 <0.03 Urin Plasma Urin Plasma Urin Plasma Präzision Adrenalin Intra-Assay Noradrenalin Dopamin Adrenalin Inter-Assay Noradrenalin Dopamin Urin Plasma Urin Plasma Urin Plasma Urin Plasma Urin Plasma Urin Plasma Noradrenalin < 0.02 100 < 0.02 < 0.002 < 0.005 < 0.002 < 0.001 0.3 ng/mL 10 pg/mL 0.6 ng/mL 20 pg/mL 5 ng/mL 4 pg/mL Bereich (ng/mL) 5.9 - 81.2 0.057 - 0.837 16.0 - 256 0.560 - 12.38 37 - 1549 0.046 - 1.402 6.4 - 89.3 0.106 - 1.064 15.4 - 391.5 0.569 - 1.945 47 - 1026 0.213 - 1.055 Bereich (ng/mL) Urin Plasma Urin Noradrenalin Plasma Urin Dopamin Plasma No High dose hook effect detected. Adrenalin Linearität Adrenalin Wiederfindung Noradrenalin Dopamin Adrenalin Methodenvergleic Noradrenalin h versus HPLC Dopamin V2009_06 Urin Plasma Urin Plasma Urin Plasma 23.6 - 90.3 1.4 - 5.3 178 - 423 0.64 - 8.23 141 - 5732 584 - 1291 Mittelwert (%) 95.0 99.0 100.9 97.5 97.2 89 Dopamin < 0.05 < 0.05 100 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 Kreuzreaktivität aller anderen getesteten Substanzen < 0.5 % Mittleres Signal (Nullstandard) + 2SD VK (%) 5.4 7.1 7.3 7.4 7.0 10.9 10.1 13.5 12.1 12.5 10.2 16 Höchste Verdünnungsstufe 1:32 1:32 1:32 1:32 1:32 1:16 Bereich (%) 86 - 108 75 - 109 81 - 116 83 - 111 79 - 110 70 - 113 Bereich (%) 86 - 125 79 - 126 85 - 115 89 - 111 88 - 115 100 - 135 % Wiederfindung nach Spiken IBL= 0.906 x HPLC + 13.9; r = 0.969; n = 120 IBL = 0.75 x HPLC + 4.8; r = 0.945; n = 134 IBL = 1.06 x HPLC - 21.8; r = 0.985; n = 90 13 / 14 TriCat ELISA (RE59395) 17. DEUTSCH LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT 1. Rust MB, Faulhaber J et. al. Neurogenic Mechanisms Contribute to Hypertension in Mice with Disruption of the K-CL Cotransporter KCC3. Circulation Research, January (2006) 2. Creces J., Appleton Ch.: Catecholamines and their Metabolites: Evaluation of a commercial ELISA. Clin. Biochem., QML Pathology, Brisbane QLD (2004) 3. Adams, J. M. et al. Effects of 17-Estradiol on hypoglycemia-induced increases in plasma catecholamines in the rat. Poster Society for Neuroscience, Annual Meeting, New Orleans (2003) 4. Westermann J, Hubl W, Kaiser N, Salewski L, Simple, rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by non-competitive enzyme immunoassay, compared with HPLC method. Clin. Lab., 48: 61-71 (2002) V2009_06 14 / 14
