Die Diskussion um BSE (bovine spongiforme Enzephalopathie) und

Ruth Baumann
12.11.2002
Referat: Prione/ BSE
BSE = bovine spongiforme Enzephalopathie
TSE = transmissible spongiform encephalopathies
BSE gehört zur Gruppe der TSE-Erkrankungen
->Überbegriff für übertragbare spongiforme Encephalopathien; transmissible
spongiform encephalopathies die verschiedene Säugerorganismen betreffen können
und deren klinische Manifestation vor allem von einen Niedergang von Neuronen im
Gehirn gekennzeichnet ist.
Es gibt bis jetzt nur relativ wenige Erkenntnisse zum Pathogenitätsmechanismus der
TSE-Erkrankungen, dennoch sind in den letzten Jahren beträchtliche Fortschritte in
der Aufklärung von Funktion und Struktur des "Erregers" gemacht worden.
Am Anfang der Erforschung der TSE-Erkrankungen stand eine sehr kontroverse
Diskussion über den Charakter des Erregers. So wurde in erster Linie der Transfer
viraler DNA als Ursache vermutet. Inzwischen ist doch allgemein akzeptiert, daß die
Grundlage der TSE-Erkankungen in der Biochemie der Faltung und Funktion der
Prionproteine liegt und hierzu sind in den letzten Jahren sehr viele neue
Erkenntnisse erhalten worden.
Prionproteine werden in allen höher entwickelten Organismen gebildet und bereits in
den einfachsten eurkaryoten Zellen wie Hefen findet sich ein dem menschlichen
Prion verwandtes Protein. Auch wenn nicht für alle speziesspezifischen Prionformen
gezeigt, so kann doch davon ausgegangen werden, daß Prionen generell in
wenigstens zwei Konformationen vorliegen können. D.h., trotz gleicher
Aminosäurensequenz nehmen sie grundsätzlich unterschiedliche dreidimensionale
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Strukturen ein. Die normalerweise in einem Organismus gebildeten, also
körpereigenen Prion-proteine werden mit dem Kürzel PrPc versehen.
Die in ihrer räumlichen Struktur veränderten pathogenen Varianten der Prionen,
werden in Anlehnung an die Erregerform bei der Scrapieerkrankung des Schafes als
PrPsc bezeichnet. Jedes Prionprotein kann also in einer normalen PrPc-Form und
einer PrPsc-Variante vorkommen. Charakteristisch für die PrPsc-Form ist die
außerordentliche Stabilität gegenüber denaturierenden Temperaturen, Chemikalien
und gegenüber enzymatischer Spaltung durch Proteasen. Letztlich liegt in dieser
"Umweltstabilität" auch die Ursache für seinen Eintrag in die Nahrungskette und
seine Persistenz. Gleichzeitig bietet die Proteasenstabilität jedoch auch die
Grundlage für den spezifischen Nachweis von PrPsc mittels Antikörper im WesternBlot oder im ELISA-Test, der in den Screeningprogrammen bei den Rindern
eingesetzt wird. Durch spezifischen Verdau der Hirnproben mit Proteinase K kann die
PrPsc -Form, da stabiler, erhalten werden und im Immunnachweis semiquantitativ
bestimmt werden.
Vorkommen und Struktur normaler Prionproteine
Prionproteine sind extrazelluläre Sialoglycoproteine, die über einen sog. GPI-Anker
(Glycosyl-Phosphatidylinositolanker) mit der Plasmamembran einer Zelle verbunden
sind. Sie zeigen eine bemerkenswerte Heterogenität der Glycosylierung wobei die
überwiegende Zahl der Proteine an zwei Asparaginresten, damit N-glycosidisch
gebunden, antennenartige Oligosaccharidstrukturen tragen. Das Gen für das
menschliche Protein ist auf Chromosom 20 lokalisiert und besteht aus zwei Exons
und einem Intron. Der offene Leserahmen kodiert für ein Protein von 253
Aminosäuren. Die 5´nicht-translatierte Region des Gens zeigt eine bemerkenswerte
Seqeunzvariabilität und auch innerhalb des kodierenden Bereichs, der in das Protein
übersetzt wird, gibt es ebenso Unterschiede in der Aminosäurensequenz zwischen
einzelnen Personen. Dies könnte für die vermutete unterschiedliche Empfänglichkeit
von Individuen gegenüber TSE-Erregern von zentraler Bedeutung sein.
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Charakteristisch für Prionproteine sind 4 aminoterminal gelegene sog.
Octapeptidrepeats, d.h., sich wiederholende Peptidsequenzen, die vorwiegend aus
Glycin-, Glutamin- und Prolinresten bestehen. Sie sind auch verantwortlich für die
Ausprägung des pathogenen Konformers mit seinem höheren Anteil an ßFaltblattstruktur während das normale Prion einen höheren Anteil a-helikaler
Strukturen aufweist. Die veränderte Proteinfaltung zu PrPsc führt auch zu den bei
Creutzfeldt-Jakob und Scrapie-Erkrankungen nachweisbaren fibrillären
Proteinstrukturen, die als Ablagerungen im neuronalen Gewebe nachweisbar sind.
Die bereits zitierte proteolytische Stabilität des PrPsc beruht ebenfalls auf dieser ßFaltblattstruktur, die gleichzeitig verhindert, das einmal im Organismus gebildetes
und falsch gefaltetes Prionprotein im Gegensatz zu allen normalen Proteinen nicht
mehr abgebaut werden kann und akkumuliert, was die das scheinbar unaufhaltsame
Fortschreiten der Erkrankung begünstigt.
Es ist bewiesen, dass die Pathogenese einer infektiösen Prionener-krankung auf der
direkten oder indirekten Wechselwirkung von PrPc mit PrPsc beruht.
Experimente an sog. knock-out-Mäusen,bei denen das Gen für deren PrPc
ausgeschaltet (PrPc-/--Tiere) worden ist (Tiere können kein köpereigenes Prion
mehr bilden), haben gezeigt,dass diese Tiere gegenüber einer Infektion mit BSEErregern absolut geschützt sind. Bemerkenswerterweise entwickeln die Tiere ohne
das PrPc keinen auffälligen Phänotyp, d.h., sie erscheinen völlig gesund.
Bringt man in die PrPc-/--Mäuse anstelle des Mäusegens das humane Gen für PrPc
ein, so können die Tiere wieder mit den Erregern vom Rind infiziert werden.
Diese genetischen Modelle mit gezielter Expression von verschiedenen Prionformen
in Mäusen waren von sehr großer Bedeutung für das Verständnis der Grundlagen
von TSE-Erkrankungen und der Speziesspezifität der Transmission.
Auf Grund dieser Experimente lässt sich also annehmen, daß das Prionprotein keine
essentielle Körperfunktion unter normalen Bedingungen hat oder sein Verlust durch
andere Proteine mit ähnlicher Funktion kompensiert wird.
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Mittlerweile sind sehr viele solcher knock-out-Mäuselinien konstruiert worden, auch
solche, die sog. negativ-dominate Formen von PrPc bilden. Diese Tiere sind gegen
jede bekannte Form des Erregers resistent.
(Dazu reichen einzelne Aminosäurenaustausche, wie sie auch als Polymorphismen des menschlichen
prpc-Gens vorgefunden werden. Auch dies läßt vermuten, daß einzelne Individuen gegenüber
pathogenen Prionen besser geschützt sein könnten)
Da die Prionenerkrankungen die Präsenz eines körpereigenen Prions erfordern, stellt
sich die Frage, wo im menschlichen oder tierischen Organismus die normalen
Prionproteine gebildet werden.
Früher ging man davon aus, dass nur neuronale Zellen dazu befähigt sind, heute
vermutet man aber, dass sehr viele andere Zelltypen und damit auch andere Organe
PrPc exprimieren. Dazu zählen u.a. Stammzellen im gastrointestinalen Epithel, die
Lunge, die Milz sowie bestimmte Zellen des Reproduktionstraktes. Auch für
Muskelzellen in Kultur ist die Expression von PrPc im Rahmen ihrer Differenzierung
gezeigt worden.
Von besonderer Relevanz ist auch die Bildung der Prionproteine in Blutzellen, da
damit gegebenenfalls auch ein Risiko für die Übertragung bei Bluttransfusion (nicht
beim Plasmatransfer) gegeben sein könnte. Es zeigt sich, daß sowohl Thrombocyten
wie Lymphocyten und Leucocyten Prionproteine in ihrer Zellmembran aufweisen.
Die Bildung in den immunkompetenten Zellen bzw. dem lymphoreticularen System
lässt befürchten, dass auch hier eine Propagation, d.h., die Replikation pathogener
PrPsc-Formen, ähnlich wie im Gehirn, stattfinden könnte.
Ein Indiz dafür ist die Tatsache, dass bei den in England gestorbenen Menschen mit
der neuen Variante der Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung die PrPsc-Immunoreaktivität
(d.h., die pathogene Proteinform) nicht nur im Gehirn sondern auch in lymphoiden
Geweben wie Tonsillen bzw. Appendix nachgewiesen worden ist.
Auf die Bedeutung der Expression von PrPc im peripheren Nerven und Immunzellen
muß auch im Zusammenhang mit der Aufnahme des Erregers in den tierischen oder
menschlichen Organismus und seines Transfers in das Gehirn hingewiesen werden.
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Sowohl im intestinalen Nervensystem wie auch den immunkompetenten Zellen des
Darmes lassen sich die Prionproteine nachweisen. Ob hier aber bereits eine starke
Vermehrung der pathogenen Formen stattfindet, ist bisher nicht eindeutig belegt.
Die Wanderung von PrPsc im Nervensystem aus dem Darm in das Gehirn ist
experimentell dagegen gezeigt. Diese Wanderung ist kein aktiver Prozess bei dem
das Protein sich selbständig bewegen würde sondern erfolgt im Rahmen normalen
Zellmigrations- und -fusionsvorgänge. Welche Rolle den Immunzellen beim Transfer
von pathogenen Prionen aus dem Darm in den Organismus zukommt, ist noch nicht
abschließend geklärt. Diese Zellen wandern nämlich ebenfalls in einem
physiologischen Prozess aus den Payerschen Platten der Darmschleimhaut in den
Organismus aus und gelangen so in diverse Gewebe.
Es steht jedoch außer Frage, daß nach der Aufnahme von erregerhaltigem Material
mit der Nahrung die chemische und enzymatische Stabilität des PrPsc es stark
begünstigt, dass das Protein in intakter Form in das Darmepithel aufgenommen wird
und von dort über das Nervengewebe und/oder die intestinalen Immunzellen in
periphere Gewebe und das Gehirn gelangen kann.
In welchem Umfang dabei bereits eine Vermehrung von PrPsc durch
Konformationsänderung des in diesen Zellen vorkommenden normalen PrPc
stattfindet, ist weitgehend unbekannt.
Proteinfaltung
Prionproteine existieren in zwei Konformationen und können sich somit trotz gleicher
Aminosäurensequenz in ihrer räumlichen Struktur und ihren physikochemischen
Eigenschaften (u.a. enzymatischer Stabilität) unterscheiden. Die Grundlage der TSEErkrankungen beruht vorallem auf der Wechselwirkung von PrPc mit PrPsc.
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Die Grundfrage aber, wie PrPsc aufgrund seiner spezifischen Form das normale
PrPc in eine neue Form zwingen kann, ist damit aber noch immer nicht erklärt.
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Jedes zelluläre Protein muss zur Wahrnehmung seiner Funktion eine bestimmte
dreidimensionale Struktur einnehmen, die jedoch von seiner Umgebung abhängig ist.
Die Herausbildung seiner räumlichen Struktur geschieht nach der Translation des
Proteins, d.h., wenn die Polypeptidkette vorliegt unter Beteiligung von speziellen
zellulären Proteinen und unter Beteiligung funktioneller Gruppen (z. Bsp.
Cysteinresten) des jeweiligen Proteins. Proteinfaltungsprozesse unterliegen einer
komplexen zellulären Kontrolle. So wird ein falsch gefaltetes Protein normalerweise
durch ein "Qualitätssicherungssystem" erkannt und sofort einer Degradierung
zugeführt. Da PrPsc aber nur geformt werden kann wenn normale PrPc-Proteine
bereits vorhanden sind, wird hier die Proteinfaltungskontrolle der Zelle unterlaufen.
Und wenn PrPsc erst einmal geformt ist, bleibt es durch seine recht hohe
Proteasenresistenz auch (zumindest in Bruckstücken) erhalten und kann normale
PrPc-Proteine durch Aufzwingen seiner Form transformieren.
FRAGE: Woher kam das erste PrPsc-Molekül???
Nun, grundsätzlich könnte der Ursprung in einer spontanen Mutation im Priongen
liegen, die für ebenso spontan auftretende Formen von Encephaolopathien bei Tier
und Mensch verantwortlich gemacht werden. Eine Infektionskette kann sich daraus
natürlich nur dann entwickeln, wenn die pathogene Form in eine Nahrungskette
gelangt und aufgrund seiner besonderen Eigenschaften dort persistiert und
propagiert werden kann.
Da man heute PrPc recht leicht gentechnisch in größeren Mengen herstellen kann,
sind Untersuchungen zur Transformation von PrPc in die PrPsc-Form auch in
zellfreien Systemen möglich.
Diese Studien belegen, daß die pathogene Form tatsächlich schon alleine durch die
Protein-Protein-Wechselwirkung entstehen kann (Proteine only Theorie).
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Auch die an der Proteinfaltung in der Zelle beteiligte Funktionsproteine der
Chaperonfamilie (Timm) könnten eine Rolle in der Genese der PrPsc-Formen
spielen. Dies lassen zumindest eine Reihe von Studien an neuronalen Zellen in
Kultur vermuten. Ob genetische Unterschiede in diesen an der Faltung beteiligten
Proteine ebenso wie unterschiedliche Glycosylierungsmuster von PrPc (aufgrund
unterschiedlicher Ausstattung mit Glycosyltransferasen) zwischen Individuen das
Erkrankungsrisiko mitbestimmen, läßt sich zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht
beantworten.
Allerdings lässt die geringe Infektionsrate bei Rindern in großen Herden bei recht
einheitlicher Ernährungsweise läßt ebenso wie die vergleichsweise geringe Zahl
bisher diagnostizierter Fälle der neuen Creutzfeldt-Jakob-Variante beim Menschen
trotz hohem Verzehr infiziertem Fleischs in England eine signifikante Beteiligung des
genetischen Hintergrundes des Empfängers vermuten.
Bindungsproteine des PrPsc
Bindungsproteine könnten große Bedeutung sowohl für die Pathogenese der TSEErkrankungen als auch die Diagnostik haben.
Bei der Suche nach einem solchen Bindungsproteinen für das PrPsc-Konformer
wurde das Blutprotein Plasminogen identifiziert.
Plasminogen ist die inaktive Vorstufe der u.a. am Gerinnungsprozess beteiligten
Serinprotease Plasmin. Plasminogen bindet spezifisch die PrPsc-Form, nicht aber
die PrPc-Variante der Prionen, wobei sich die Binding des PrPsc durch freies Lysin
blockieren läßt. So vermutet man, dass auch ein im PrPsc auf der Oberfläche des
Proteins liegender Lysinrest seine Binding an die sog. kringle-Domänen des
Plasminogens vermittelt. Es ist bisher noch nicht klar, ob Plasminogen auch in vivo
PrPsc-binden kann und damit möglicherweise seine Infektiösität beeinflusst.
Allerdings ergeben sich aus der Bindungsspezifität neue Ansätze für diagnostische
Verfahren.
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Zelluläre Funktionen von PrPc
Wenngleich die Befunde der PrPc-/--Mäuse, die kein körpereigenes Prion mehr
bilden können, vermuten lassen, dass das Protein für die normale Zellfunktionen
nicht bedeutend ist, steht außer Zweifel, dass es in der Pathophysiologie des
Nervenzelluntergangs im Gehirn eine wichtige Rolle spielt.
Der PrPsc-vermittelte Verlust von Neuronen ist offenbar die Folge einer erhöhten
Apoptoserate (programmierter Zelltod). Bringt man PrPc in neuronalen Zellen zur
verstärkten Expression, zeigen diese Zellen eine höhere Sensitivität gegenüber
oxidativem Stress, erhöhte Raten der Lipidperoxidation, Zeichen von Apoptose und
eine deutliche Reduktion der Aktivitäten glutathionabhängiger Enzyme sowie eine
verminderte Aktivität der Kupfer- und Zink-abhängigen Superoxiddismutase (SOD)
bei unverändertem Spiegel des Enzyms. Zu diesem Befund gesellt sich der
Nachweis daß PrPc ein Kupfer-Ionen bindendes Protein ist, wobei die Bindungstellen
für Kupfer in den bereits zitierten 4 Octapeptidrepeats liegen.
Nach Bindung von Kupfer gewinnt PrPc auch selbst SOD-Aktivität und die Präsenz
von PrPc in der Zellmembran beeinflußt offenbar auch den Kupfertransport in die
Zelle bzw. den zellulären Kupferspiegel. Ebenso bemerkenswert ist die Beobachtung,
dass die Kupferbindung an das membran-gebundene PrPc die Internalisierung des
Prionproteins in die Zelle begünstigt. Wie viele andere Membranproteine unterliegt
auch PrPc einer vom Clathrin abhängigen Endocytose, gelangt damit in ein frühes
Endosomenkompartiment des Zellinneren und kann von dort wieder in die
Zellmembran zurückkehren. Nach der endocytotischen Aufnahme des mit Kupfer
beladenen PrPc in das Endosomen-kompartiment, könnte Kupfer dort freigesetzt und
über Bindungsproteine in das Cytosol der Zelle entlassen werden. PrPc könnte nach
seiner Rückkehr in die Zellmembran erneut extrazelluläres Kupfer binden und würde
somit die Rolle eines Kupfertransporters wahrnehmen. Die Bindung von Kupfer oder
von Mangan, das ebenso gut gebunden wird, begünstigt aber offenbar auch das
Entstehen der PrPsc-Form und beeinflußt die Faltung des Prionproteins.
Möglicherweise ist somit auch der Spurenelementstatus eines Individuums ein
Faktor, der zur Pathogenese einer Prionenerkrankung beiträgt.
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Neben dieser Rolle im Kupferstoffwechsel der Zelle ist für die PrPsc-Form auch eine
direkte zytotoxische Funktion bekannt.
So sind bereits die Octapeptidrepeats als Fragmente des PrPsc ab bestimmten
konzentrationen toxisch für Neuronen. Auch gibt es Hinweise, daß diese
Proteindomänen sich in die Zellmembran einlagern können und hier durch
Oligomerisierung kanalähnliche Strukturen bilden, die die zelluläre Ionenhomöostase
stören.
Auch den Neuronen benachbarte Gliazellen sind offenbar am Nervenzelltod durch
pathogene Prionen beteiligt. Bei ihnen scheint PrPsc eine verstärkte
Glutamatfreisetzung zu bewirken, die, wenn sie länger anhält, toxisch auf Neuronen
wirkt.
Zusammenfassung
Die Pathogenese der Prionenerkrankungen basiert auf einem bisher nicht bekannten
biologischen Prinzip, bei dem ein Protein ein in der Primärstruktur identisches Protein
in eine neue Konformation, d.h., andere räumliche Struktur zwingt. Es erlangt
dadurch eine außerordentliche Stabilität gegenüber nahezu allen Umweltfaktoren,
die sonst Proteine zu denaturieren oder degradieren vermögen. Diese Stabilität des
Proteins ermöglicht seine Persistenz in der Nahrungskette und seine Aufnahme in
den Organismus. Seine Replikationsfähigkeit ist im Empfängerorganismus dagegen
von vielen weitgehend unbekannten Einflußgrößen abhängig. Menschliche Prionenerkrankungen sind also "Proteinfaltungskrankheiten". Sie können durch Mutationen in
den Genen sporadisch entstehen, in autosomal-dominanter Form ererbt sein oder
durch alimentäre Azfnahme der pathogenen Proteinform wie bei BSE bedingt sein.
Die Bedeutung der Theorie, daß Prionen die Ursache der TSE-Erkrankungen sind,
wurde entsprechend auch mit der Vergabe des Nobelpreises für Medizin an Stanley
Prusiner 1997 gewürdigt. Er hat den Begriff Prion eingeführt und maßgebliche
Studien zur Genese der TSE-Erkrankungen sind von seiner Arbeitgruppe vorgelegt
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