Molekularbiologische Methoden des genetischen Fingerabdrucks

Molekularbiologische Methoden des genetischen Fingerabdrucks
Das Southern Blotting
Die Methode des Southern Blotting wurde nach dem Entdecker E.M. SOUTHERN benannt, der das
Verfahren 1975 publizierte (engl. blotting paper = Löschpapier).
Das Southern Blotting dient dem Isolieren von DNA-Fragmenten (z.B. aus einem Gel) und dem Transfer
der DNA auf ein festes Trägermaterial.
Das Ausgangs-Material des Southern Blotting ist ein Gel aus Agarose, auf dem sich doppelsträngige
DNA-Abschnitte, der Größe nach geordnet, befinden (Gruppe A).
Auf das Gel wird ein Blatt Nitrocellulose gelegt. Man hat durch Experimente die Erfahrung gemacht,
dass DNA-Stränge an dieser Substanz besonders gut haften. Die DNA-Fragmente werden durch Blotten
auf das Papier bzw. die Membran übertragen (ähnlich wie beim Ablöschen mit Löschpapier).
Das Agarose-Gel liegt dabei auf einem Schwamm in einer Alkalilösung (sehr hoher pH-Wert). Die
alkalische Lösung wird von einem Stapel Papiertücher, die sich oben auf der Nitrocellulose befinden und
auf die ein Gewicht gelegt wird, durch das Gel und durch die Nitrocellulose gesogen. Dabei reißt die
alkalische Lösung die DNA-Abschnitte mit.
Außerdem wird bei diesem Vorgang die doppelsträngige DNA durch die alkalische Lösung in
Einzelstränge getrennt (= Denaturierung). Die einzelsträngigen DNA-Fragmente werden vom Gel auf die
Nitrocellulose übertragen, wo sie fest anhaften.
Die Nitrocellulose mit den ihr anhaftenden,
einzelsträngigen DNA-Fragmenten wird vorsichtig
vom Gel abgezogen.
Nach dem Southern Blotting ist die DNA
a) einzelsträngig und
b) für weitere Analysen (z.B. mit Gensonden) besser
zu handhaben, als wenn sie sich in einem Gel
befindet.
Einsatz genetischer Sonden (Hybridisierung)
[Hybridisierung = Eingehen von Basenpaarungen zwischen zwei komplementären DNA-Abschnitten
(z.B. zwischen einer Gen-Sonde und einem komplementären DNA-Abschnitt).]
Durch das Southern Blotting hat man die DNA-Fragmente des kompletten Genoms eines Individuums auf
die Nitrocellulose übertragen. Oft liegen dabei so viele Fragmente vor, dass man nur ein Geschmier, aber
keine sauberen Banden erhält. Die entscheidenden Abschnitte lassen sich jedoch selektiv sichtbar
machen, indem man eine markierte Gen-Sonde benutzt.
Genetische Sonden sind künstlich hergestellte, kurze einzelsträngige DNA-Moleküle, die zu Abschnitten
der Basensequenz eines bestimmten DNA-Fragments (z.B. eines gesuchten Gens) komplementär sind.
Achtung: Prinzipiell können Gensonden für jede beliebige Art von DNA-Abschnitt hergestellt werden
(codierender DNA-Abschnitt = Gen ; nicht-codierender DNA-Abschnitt). Damit eine genetische Sonde
gezielt eingesetzt werden kann, muss zumindest ein Teil der Basensequenz des DNA-Fragments bekannt
sein, an dass sie binden soll.
Werden die genetischen Sonden zu zahlreichen, einzelsträngigen DNA-Fragmenten gegeben (z.B. zur
Nitrocellulose aus dem Southern Blotting), gehen sie mit ihrem komplementären DNA-Abschnitt
Basenpaarungen ein (in der Abbildung mit einem * markiert). Diesen Vorgang nennt man die
Hybridisierung der Gensonden an bestimmte DNA-Fragmente.
Ausgehend vom Southern Blotting gibt man zunächst die Nitrocellulose gemeinsam mit den radioaktiv
markierten Gensonden in eine Plastiktasche. Es findet die Hybridisierung der Gensonden statt (*).
Schwarze Banden
zeigen die Lage der
DNA-Fragmente, an
die eine Gensonde
gebunden hat
(Banden sind der
Länge nach geordnet)
Um festzustellen, an welche DNA-Fragmente die genetischen Sonden gebunden haben, werden sie zuvor
markiert, entweder radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Wenn radioaktiv markierte Sonden
eingesetzt werden, wird die Nitrocellulose anschließend auf einen radioaktiv empfindlichen Film gelegt.
Die radioaktiv markierten DNA-Abschnitte erzeugen eine Schwärzung auf dem Film.
Kurz gesagt: Gensonden binden an komplementäre DNA-Abschnitte (z.B. aus einem Agarose-Gel) und
die DNA-Abschnitte, an die eine Sonde gebunden hat, können sichtbar gemacht werden, wenn die Sonde
zuvor radioaktiv markiert wurde. So können aus einer riesigen Anzahl von DNA-Fragmenten einzelne
(bekannte) ausgewählt und separat sichtbar gemacht werden (Konzentration auf einen DNA-Bereich).
Wichtig:
Basensequenz muss bekannt sein !
Prinzipiell können die Gensonden für jeden beliebigen DNA-Abschnitt hergestellt werden, dessen
Sequenz (zum Teil) bekannt ist. Die Voraussetzung für die Hybridisierung ist, dass ein Teil des DNAAbschnitts komplementär zur Gensonde ist:
Hybridisierung mit Gensonden
Hybridisierung = Eingehen von Basenpaarungen zwischen zwei komplementären DNA-Abschnitten (z.B.
zwischen einer Gen-Sonde und einem komplementären DNA-Abschnitt).
Allgemeine Methode zum Nachweis und zur Analyse homologer DNA-Sequenzen.
Man kann damit nachweisen, ob in unterschiedlichen DNA-Proben homologe Sequenzen vorkommen.
Auch lässt sich die Zahl der homologen Abschnitte in einem Genom ermitteln und die Größe der
Restriktionsfragmente bestimmen, auf denen diese Abschnitte lokalisiert sind.
Dadurch kann man genetische Unterschiede zwischen Organismen feststellen.
Zur Hybridisierung verwendet man eine markierte Sonde.
Falls eine Hybridisierung erfolgt, ist dies über die Markierung der Sonde zu erkennen.
Einsatz genetischer Sonden
Das Ausgangsmaterial für die Hybridisierung bildet oft das vollständige Genom eines Organismus.
Aus diesen großen DNA-Molekülen entstehen so viele Restriktionsfragmente, dass man nach Anfärbung
eines Elektrophorese-Gels oft nur ein Geschmier, aber keine diskreten Banden erhält.
Die entscheidenden Banden lassen sich jedoch selektiv sichtbar machen, indem man eine markierte
Sonde benutzt.
Die Sonde besteht aus vielen Kopien eines radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten
DNA-Stücks (einzelsträngig !), das mit dem nachzuweisenden DNA-Abschnitt Basenpaarungen eingeht.
Damit diese Hybridisierung stattfinden kann, muss man die zu überprüfende DNA auf einen festen Träger
transferieren. → Southern Blotting
Sonde
Kurze, einzelsträngige DNA-Moleküle, die zu Abschnitten der Basensequenz des gesuchten Gens
komplementär sind und mit diesem hybridisieren, also Basenpaarungen eingehen.
Zum Nachweis einer Hybridisierung wird die Sonde markiert, entweder radioaktiv oder mit einem
Fluoreszenzfarbstoff.