3. Separation der Blutzellen

Lymphozytenisolation
I. PRAKTISCHER TEIL
Die morphologischen und histologischen Eigenschaften von Blutzellen können mit
Blutausstrichen und so genannten Cytopreps untersucht werden.
Blutausstrich: Ein Tropfen heparinisiertes Blut wird auf einem Objektträger plaziert und mit
der Kante eines zweiten Objektträgers „verschmiert”. Die Zähflüssigkeit des Plasmas sorgt
dafür, dass die Zellen durch dieses Verstreichen nicht zerstört werden. Auch von
Gewebeproben können solche Ausstriche bereitet werden, wenn die Zellen ordentlich gelöst
sind. Die Ausstriche werden mit Mathanol oder Formalin fixiert und mit verschiedenen
Farbstoffen eingefärbt (Giemsa, May-Grünwald-Giemsa).
Cytoprep: Fünf Tropfen lymphozytenreiche Zellsuspension werden in den Trichter des
Cytopreperators gegeben und in der Cytozentrifuge bei 1000 Upm fünf Minuten lang
zentrifugiert. Die Qualität des Cytopreps hängt stark von dem Anteil an Zellmaterial in der
Suspension und von der Zelldichte (100-120 Zellen/Objektträger ist optimal) ab. Die
Cytopreps werden herausgenommen und für einige Minuten zum Trocknen an der Luft
gelassen.
Beide Anwendungen (Blutausstrich und Cytopreps) werden mit May-Grünwald-GiemsaFarbstoff gefärbt und anschließend unter dem Lichtmikroskop analysiert.
II. HINTERGRUND
Separation der Zellen von Geweben und Körperflüssigkeiten
Für diagnostische Anwendungen und in der Forschung kann die Analyse von Zellen
bestimmter Gewebearten von großer Bedeutung sein.
Im Fall von Tierversuchen können Zellen direkt von einem bestimmten Organ isoliert werden
(z.B. Thymus, Milz, Lymphknoten) und man erhält eine ziemlich reine Zellpopulation.
Beim Menschen können das Knochenmark, die Gelenkflüssigkeit, die Flüssigkeit der
Bauchwassersucht (Ascites), die Tumor- und Lymphknotenproben zur Diagnoseerstellung,
Einstufung einer Krankheit oder zur Untersuchung eines bestimmten therapeutischen
Nutzeffektes, verwendet werden.
Zellsuspensionen aus Gewebeteilen können entweder mechanisch, enzymatisch oder mithilfe
von Kombinationen aus den Beiden hergestellt werden. Nach Öffnung der Kapsel des
Thymus, der Milz oder des Lymphknotens können die Zellen durch Pressen mit einem
stumpfen Werkzeug oder durch Auswaschen mithilfe einer Spritze isoliert werden.
Aus weicherem Gewebe können Zellen folgendermaßen gewonnen werden: Das Gewebe wird
in kleine Stückchen geschnitten und durch ein Metallsieb gedrückt oder mithilfe einer Spritze
mehrmals durch eine dünne Nadel gepresst. Der Nachteil davon ist, dass die Zellsuspension
bei dieser Form der Zellisolation mit unerwünschtem Zellmaterial kontaminiert wird. Dieses
kann durch Filtern durch ein mehrschichtiges Drahtgeflecht oder durch schlichte
Sedimentation entfernt werden.
In manchen Fällen ist eine enzymatische Vorbehandlung (z.B. mit Kollagenase,
Hyaluronidase) notwendig, um eine einwandfreie Zellsuspension zu erhalten. Von den
erhaltenen Suspensionen können Lymphozyten mittels Ficoll - Gradientenzentrifugation
isoliert werden. Eine enzymatische Behandlung von Geweben zerstört im Normalfall die
Zellen weniger als mechanische Methoden. Die Gewebe können mit Trypsin und DNAse
aufgeschlossen (verdaut) werden und anschließend durch ein Sieb gefiltert werden. Für
kollagenreiches Gewebe wird Kollagenase verwendet. Der Nachteil der enzymatischen
Methode ist, dass die Zelloberflächenstrukturen zum Teil oder aber auch vollkommen verdaut
also aufgelöst werden.
Klassifizierung der Separationsmethoden
Generell:
Negative Separation: Elimination unerwünschter Zellen
Positive Separation: Anreicherung erwünschter Zellen
Leukozyten - separationsmethoden:
I. Verfahren basierend auf physikalischen Parametern:
- Filtration (unterschiedliche Größe der Blutzellen)
- Zentrifugation (unterschiedliche Sedimentationskonstanten der Blutzellen)
II. Verfahren basierend auf Leukozytenanhaftung:
- Nylonwolle: Monozyten, B-Zellen bleiben haften; T-Zellen bleiben nicht haften
- Plastik oder Glasoberfläche: anhaftende Monozyten werden angereichert, Lymphozyten
werden entfernt
III. Separationsmethoden basierend auf Zelloberflächenstrukturen:
-Rosette: Bindung zwischen CD2-Molekül auf menschlichen T-Zellen und den roten
Blutzellen von Schafen (SRBC)
-Immunrosette mit antikörperbeschichteten SRBC (zelloberflächenspezifischer Antikörper)
-Paramagnetische Kügelchen (MACS)
-Zell-Affinitätschromatographie
-Sortierer (FACS)
-Immunopanning
-Elimination von antikörpergekennzeichneten Zellen durch komplementinduzierte Lyse
I.
Verfahren basierend auf physikalischen Parametern
1. Filtration
Aufgrund der Größenunterschiede zwischen Leukozytenpopulationen im Blut können sie
durch Filtration durch Filter unterschiedlicher Porengröße voneinander getrennt werden.
Nachteile: Die Zellen können beim Durchlaufen des Filters zerstört werden. Außerdem
können die Filter leicht verstopfen.
2. Zentrifugation
Ficoll-Gradienten - Zentrifugation: Durch Gradiententzentrifugation kann man eine
lymphozytenreiche Zelllösung aus dem Blut gewinnen. Diese Methode basiert auf der
Grundlage, dass die Dichte der sogenannten Ficoll-Lösung höher ist als die Dichte von
Monozyten und Lymphozyten aber niedriger als die von Erythrozyten und Granulozyten. Die
Dichte der Lymphozyten kann sich allerdings von Spezies zu Spezies leicht unterscheiden,
weshalb die Dichte von Ficoll entsprechend angepasst werden muss (1.077 g/ml für
menschliche Lymphozyten).
Das verdünnte und mit Heparin versetzte Blut wird vorsichtig als oberste Schicht auf eine
Schicht Ficoll-Lösung pipettiert. Die Probe wird nun für 20 Min bei 1000g zentrifugiert. Nach
der Zentrifugation erscheint eine lymphozytenreiche Schicht über der Ficoll-Schicht, während
sich andere Blutzellen unten im Pellet befinden. In der Lymphozytenschicht können sich
ausßerdem noch Monozyten und einige Granulozyten (15-35%) befinden. Die
lymphozytenreiche Schicht wird herauspipettiert und mit PBS gewaschen, um die restlichen
Ficoll-Verunreinigungen loszuwerden. Danach können die Zellen in 10 Tropfen PBS
aufgelöst werden und verwendet werden, um eine Cytoprep herzustellen.
II.
Verfahren basierend auf Leukozytenanhaftung
1. Nylonwolle
B-Zellen und Monozyten haften an Nylonwolle. Um eine T-Zellen-reiche Zellsuspension zu
erhalten, kann also eine Suspension durch ein Nylonnetz gefiltert werden. Auch größere
Gewebeteilchen werden dabei entfernt.
2. Plastik- oder Glasoberflächen
Da Monozyten an Plastik- oder Glasoberflächen (z.B. Petri-Schale, Proberöhrchen) haften
bleiben, können Monozyten von Lymphozyten durch einfaches Einwirken der Zelllösung an
der gegebenen Oberfläche getrennt werden.
III.
Separationsverfahren basierend auf Zelloberflächenstrukturen
1. Rosette
Menschliche T-Zellen und rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) bilden spontan Rosetten.
Die Grundlage dieser Rosettenbildung ist das CD2-Molekül auf T-Zellen. Werden
menschliche Lymphozyten mit SRBC inkubiert, können die T-Zellen nach der
Rosettenbildung durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation abgesondert werden (T-Zellen mit
SRBC befinden sich dann am Boden des Röhrchens, B-Zellen treiben über dem Ficoll).
2. Immunrosette
Direkte Methode: SRBC können vor der Rosettenbildung mithilfe von CrCl3 mit
monoklonalen
Antikörpern
beschichtet
werden,
die
mit
verschiedenen
Zelloberflächenbestandteilen reagieren. Die beschichteten SRBC werden dann mit einer
Zellsuspension gemischt und jene Zellen bilden Rosetten mit den SRBC, die das
entsprechende Antigen zu dem monoklonalen Antikörper auf ihrer Oberfläche expressieren.
Indirekte Methode: Zellen werden mit einem spezifischen primären Antikörper gemischt. Die
SRBC werden mit einem sekundären anti-Ig Antikörper beschichtet. (WICHTIG: Der anti-Ig
muss gegen die kostante Ig-Region gerichtet werden, aus derselben Spezies stammen, aus der
der erste Antikörper stammt!!). Die beschichteten SRBC werden dann mit der Zellsuspension
vermischt und jene Zellen, die mit dem ersten Antiköper beschichtet sind, bilden nun Rosetten
mit den SRBC, die den sekundären Antiköper auf sich tragen. Nach der Rosettenbildung
können die ungebundenen Zellen durch Ficoll-Gradienten-Zentrifugation von den Zellen in
den Rosetten getrennt werden. Dies ist eine sehr effiziente Methode, um Zellen eines
bestimmten Typs von einem Zellgemisch abzutrennen.
3. Paramagnetische Kügelchen (MACS)
MACS verwendet mikroskopisch kleine paramagnetische Kügelchen, die mit monoklonalen
Antikörpern beschichtet werden können. Wenn diese beschichteten Kügelchen mit einer
Zellsuspension vermischt werden, binden die Antikörper an ihr spezifisches Antigen auf der
Zelloberfläche. Durchläuft die Zellsuspension ein starkes magnetisches Feld in einer Säule,
bleiben die Zell-Kügelchen-Komplexe in der Säule, während die freien Zellen augenblicklich
hindurch fließen (negative Selektion). Wird die Säule von dem magnetischen Feld
fortgenommen, können die Zell-Kügelchen-Komplexe zurückgewonnen werden (positive
Selektion). Zellen, die an Kügelchen haften, sind lebensfähig und der Kügelchen-AntikörperKomplex kann von der Zelloberfläche entfernt werden.
Mit AutoMACS ist es möglich, bis zu 10 Millionen Zellen / Sekunde zu sortieren. (Details:
http://www.automacs.info/). Beinahe alle direkten und indirekten MACS-Reagentien können
mit autoMACS zur positiven oder negativen Selektion verwendet werden. Neben Menschen-,
Mäuse- und Rattenzellen ist es möglich, die Zellen einer jeden Spezies abzutrennen bzw. zu
isolieren z.B. CD34+ Vorläuferzellen von peripherem Blut, zytokinpoduzierende oder
disseminierte Tumorzellen. Die Zellen werden mit den MACS-Reagentien vermischt und
nach der Wahl eines entsprechenden autoMACS Programmes können die gewünschten Zellen
innerhalb von Minuten mit hoher Ausbeute getrennt werden (Millionen von Zellen).
MACS ist vollständig FACS-kompatibel. Die beiden Methoden können erfolgreich
kombiniert werden wenn z.B. mit FITC gekennzeichnete Zellen oder mit PE gekennzeichnete
monoklonale Antikörper vorhanden sind und dann anti-FITC oder anti-PE Kügelchen der
Probe zugefügt werden.
Nach der magnetischen Separation kann gleich die
durchflusszytometrische Analyse erfolgen. Mit auto-MACS per-sorting kann man sogar sehr
seltene Zelltypen äußerst präzise auftrennen.
4. Zellaffinitätschromatographie
Bei dieser Methode wird mit einer Matrix gearbeitet, die aus feinen Partikeln besteht
(meistens Gele oder Gießharze). Die Partikel müssen mit einem Antiköper oder einem
Liganden aktiviert werden. Aus diesen aktivierten Partikeln wird eine Säule bereitet, durch
die dann eine Zellsuspension geleitet werden kann. Der Antikörper bzw. der Ligand auf der
Matrix interagiert mit dem Antigen bzw. Rezeptorpaar auf bestimmten Zellen, die deshalb an
die Säule binden. Die gebundenen Zellen können wiedergewonnen werden indem man
entweder den pH oder die Ionenkonzentration des Puffers ändert, oder indem man einen
anderen Antikörper/Ligand in überschüssiger Menge hinzugibt. Weil die Zellen bei der
Eluierung beschädigt werden können, wird diese Methode hauptsächlich für negative
Selektion verwendet.
5. Fluorescence activated cell sorting (FACS) - Durchflusszytometrie
Floureszenzaktivierte Zellsortierung ist möglich wenn eine sortierende Einheit an ein
Durchflusszytometer angeschlossen wird. Durch FACS können Zellen anhand ihrer Göße
oder Granularität oder auch anhand von Floureszenzmarkierung durch monoklonale
Antikörper voneinander sortiert werden. Zellen durchlaufen eine nach der anderen den
Laserstrahl des Durchflusszytometers. Der Computer detektiert die Floureszenzsignale und
schreibt jedem Flüssigkeitstropfen (wo jeder eine Zelle enthält) eine elektrische Ladung zu.
Die Tropfen werden dann aufgrund ihrer elektrischen Ladung in einem elektromagnetischen
Feld getrennt und in Röhrchen gesammelt. Bei dieser Methode erhält man extrem reine,
lebende Zellpopulationen (99%<).
6. Panning
Die Oberfläche einer Petri-Schale wird mit einem monoklonalem Antikörper beschichtet. Die
Zellsuspension wird dann darüber geleert und inkubiert. Zellen, die das Antigen spezifisch für
den Antikörper auf der Schale expressieren, bleiben an der Schale haften. Negative Zellen
können so leicht ausgespült werden. Positive Zellen können entweder durch starkes
Pipettieren oder Eluenten rückgewonnen werden. Bei der indirekten Methode wird die Schale
z.B. mit anti-Maus (oder die entsprechende Spezies) Ig beschichtet. Die Zellmixtur wird
zuerst mit dem ersten Antikörper inkubiert und wird dann über die Oberfläche, die mit dem
sekundären Antikörper beschichtet ist, geleert. Die Rückgewinnung der positiven Zellen
funktioniert ähnlich wie bei der direkten Methode.
7. Complement mediated cell lysis (Durch das Komplementsystem bedingte Zelllysis)
Dies ist eine der einfachsten Zellseparationsmethoden. Zellen werden mit einem Antikörper
vermischt. In Anwesenheit von Serum werden dann jene Zellen, die das entsprechende
Antigen auf ihrer Oberfläche tragen, vom Komplementsystem zerstört. Nach dieser Lysis
können die überlebenden Zellen durch Zentrifugation abgetrennt werden. Der Kalzium- und
Magnesiumgehalt des Reaktionspuffers ist sehr wichtig für die Zelllyse. Normalerweise wird
Hasen- oder Meerschweinchenserum als Komplementquelle verwendet. Sollte die
Antigendichte auf der Zelloberfläche zu niedrig sein, ist es besser, einen polyklonalen
Antikörper zu verwenden um eine effektive Lysis zu erzielen.