4. Immunisierung, Antikörperproduktion Reinigung

IMMUNISIERUNG
Tiere:
Wenn wir Antikörper aus einem Tier gewinnen möchten, müssen wir im ersten Schritt
das ausgewählte Tier immunisieren.
Die Gesichtspunkte der Auswahl von den Tieren sind:

monoklonale Antikörper – Maus oder Ratte

poliklonale Antikörper – Kaninchen, Schaf, Ziege
Antigen:
Um das Tier zu immunisieren, muss man das Antigen in entsprechender Form herstellen.
Die Moleküle, die kleiner als 5-10 kDa sind (Hapten), können keine effektive Immunantwort
auslösen. In solchen Fällen können verschiedene Trägermoleküle verwendet werden. Man
kann bei der Immunisierung native / modifizierte Moleküle (1) oder Zellen (2) verwenden.
(1) Gabe: muskulär, subkutan, oder intrakutan
Adjuvantien (Hilfsmittel) sind nötig, um die richtige Immunantwort auszulösen. Sie haben
eine Doppelfunktion:
1. sie verursachen eine längere Expositionszeit der Antigene für das
Immunsystem
2. sie stimulieren das Immunsystem aspezifisch (Makrophagenaktivation), sie
führen eine erhöhte Antikörperproduktion herbei
Die am häufigsten verwendete Adjuvantien sind:
1. inkomplette
Adjuvantien
auf
Mineralölbasis
(inkomplette
Freundsche
Adjuvantien)
2. das komplette Freundsche Adjuvant – ein abgetötetes Mycobacterium
tuberculosis in Mineralöl-Emulsion
3. Aluminium-Hydroxid Gel- auf dem das Proteinantigen absorbiert wird
4. Muramil-Dipeptide (die für adjuvante Mycobacterium tuberculosis Wirkung
verantwortliche Komponente)
5. bakterielle Impfstoffe, die gleichzeitig gegeben werden, erhöhen die
Antikörperproduktion gegen das Immunogen z.B.: Bortedella pertussis
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6. Liposomen –die in Liposomen geschlossenen Proteinantigene können eine
effektivere Antikörperproduktion auslösen
(2) Gabe: intraperitoneal oder intravenal
Um ein hochaffines Serum zu entwickeln, ist die Ausnutzung der Sekundärimmunantwort
zu
empfehlen,
deshalb
folgen
der
Primärimmunisierung
eine
oder
mehrere
Erinnerungsimmunisierungen (medizinische Anwendung: Protokoll der Schutzimpfungen).
Die Sekundärimpfung findet 2-6 Wochen nach der Primärimpfung statt, und wird in 7-10
Tagen später wiederholt, wenn es nötig ist. Die Menge der produzierten Anikörpermoleküle
wird aus dem Serum bestimmt. Wenn IgM Immunglobulin entwickelt werden soll, soll er die
Primärimmunantwort ausnutzen. Den Antikörper kann man am häufigsten aus dem Serum
reinigen.
Das Blut wird nach einstündiger Inkubationszeit bei 37 ˚C gerinnt. Nach 12 Stunden
Inkubationszeit wird das Serum bei 4˚C für die Entfernung der zellulären Komponenten
zentrifugiert. Zugabe von Mertiolat oder Sodium-Azid kann die bakterielle Invasion im
Serum hemmen. Ohne diesen Prozess kann das Serum bei -30 ˚C gelagert werden, wenn es
unter sterilen Verhältnissen genommen wurde.
Das Testen der Antikörper (Titer und Spezifizität) soll im gleichen System stattfinden, wo es
später benutzt wird.
Antikörperreinigung
Eine wichtige Frage ist, ob man Immunglobulinklassen oder einen bestimmten
Antikörpertyp mit gewisser Spezifität isolieren will. Im ersten Fall können wir mit
Proteinreinigungsmethoden das Ziel erreichen, im anderen Fall mit antigenspezifischen
Methoden.
Immunglobulinisolierungsprozesse
Die hängen von dem Spezies des benutzten Untersuchungstieres und dem Typ der
gewünschten Antikörper (Mono- oder Polyklonal) ab.
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IgM kann durch sein Molekülgewicht oder seine Löslichkeit isoliert werden. Weitere
Reinigung kann mit Affinitätschromatographie oder Dichtegradientenzentrifugierung
durchgeführt werden.
IgG: kann bei pH 6,4 mit 1,39 M
(NH4)2SO4
ausgefällt werden. Mit
Affinitätskromatographie kann es auch mit Protein A von S. aureus oder mit Protein G von
Streptococcus sp. gereinigt werden.
IgA,
D,
E:
Reinigung
in
mehreren
Schritten.
Bei
IgA
kann
man
Ionaustauschkromatographie nach der Immunglobulinausfällung mit Zn anwenden.
Immunosorbente Methoden
Eine bestimmte Spezifizität zeigende Antikörperlösung wird durch die Anwendung
von antigenspezifischen Methoden entwickelt, wobei das spezifische Antigen an ein
großflächiges Trägermolekül (Sepharose, Zellulose oder Poliakrilamid) gebunden wird. Ob
der Antikörper monospezifisch ist, hängt von der Reinigung des Antigens ab. Die Elutio kann
mit Haptenmolekülen durchgeführt werden, aber in solchen Fällen werden die HaptenAntikörperkomplexe von der Säule herunterkommen. Man kann die Elemente dieser
Komplexe in weiteren Schritten voneinander trennen.
HYBRIDOM-TECHNIK, HERSTELLUNG DER MONOKLONALEN ANTIKÖRPER
Mithilfe der Hybridom-Technik können spezifische aktivierte Immunzellen mit
begrenzter
Lebenserwartung zur Antikörperproduktion ausgewählt,
in
vitro
für
unbeschränkte Zeitdauer am Leben gehalten und zur Proliferation fähig gemacht werden.
Die Grundlage der Technik ist, dass wir in vitro eine aktivierte Immunzelle mit
einer Tumorzelle fusionieren (vereinigen). Von diesen Zellen sind solche Zellen nützlich,
die eine kromosomale Stabilität zeigen, und die gewünschten immunologischen Fähigkeiten
haben (Anitkörper- oder Faktorproduktion) und immortalisiert sind. Solche Zellen kommen
am häufigsten vor, wenn die Fusionspartnerzellen dieselben genetischen und funktionalen
Eigenschaften haben. Die stabilsten Hybridomzellen können durch Mäusezellfusion
hergestellt werden. Im Fall der B-Zellen werden am häufigsten Myelomazellen, im Fall der TZellen Thymomazellen benutzt. Die wichtigsten Merkmale der Partnerzellen von den
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Immunzellen bei der Fusion sind die leichte Kultivation, die große Teilungsfähigkeit, keine
Immunglobulinsekretion und keine BcR- oder TcR-Tragung auf der Zelloberfläche.
In
diesem Fall hängen diese Eigenschaften der Hybridomzellen ganz sicher von den
Immunzelleingenschaften ab.
1. Zellfusion
Nach der Immunisierung wird die Milz des Untersuchungstieres entfernt und eine
Zellsuspension von diesem Gewebe entwickelt. Bei B-Zellfusion sind die Partnerzellen
meistens nichtsekretierende Myelomzellen aus Balb/C Mäusen (Sp-2/0-Ag14 Zelllinie). Die
Milzzellen und Myelomzellen mischen wir im 1:2 bis 1:10 Verhältnis zusammen, und nach
einem Zentrifugationsschritt wird der Supernatant weggeschüttet. Dann geben wir 0.5-1 ml
PEG (Poly-Ethylen-Glycol) dazu, was die Zellmembranfusion der Partnerzellen erleichtert.
Nach 1-2 Minuten verdünnen wir die Zellsuspension mit 10-20 ml Nährmedium, und mit
Waschung entfernen wir die PEG. (Zellmembrane können sowohl im elektrischen als auch im
magnetischen Feld fusionieren)
2. Die Auswahl der gewünschten Hybridzellen
Die nichtimmortalisierten Milzzellen sterben ungefähr eine Woche nach der Fusion ab,
aber die nichtfusionierten Myelomzellen haben eine unbegrenzte Lebensdauer. Diese Zellen
sollen unbedingt eliminiert werden.
Bei Myelomzellen fehlen die HGPRT (Hypoxantin-Guanin-Phosphoribozil-Transferase) und
TK (Thymidin-Kinase)-Enzyme, deshalb sterben die Sp-2 Zellen ab, wenn die
konventionellen Prozesse der Purin- und der Pyrimidinsynthese in künstlicher Umgebung
blockiert sind. Wenn wir das Zellgemisch in HAT Medium (Hypoxantin, Aminopterin,
Thymidin) halten, wird das Aminopterin die konventionellen Prozesse der Purin- und der
Pyrimidinsynthese hemmen. So findet die selektive Zerstörung der nichtfusionierten
Myelomzellen statt. Die Milzzellen haben diese Enzymmoleküle und so werden sie und ihre
Hybridzellen überleben.
Durch die Toxin-Antitoxin-Methode werden die früher nur mit einem von zwei
Antitoxinmolekülen markierten Partnerzellen in beiden Toxinmolekülen enthaltenes
Nährmedium selektiert und nur die zwei Antitoxin enthaltenen Hybridzellen sind lebensfähig.
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Die Partnerzellen können vor der Fusion mit zwei verschiedenen Fluorochromen
markiert werden, und nach ihrer Membranfusion werden die gleichzeitig zwei
Markermoleküle tragenden Hybridzellen durch FACS von den nur ein Fluorochrom tragenden
Zellen separiert.
3. Auswahl der gewünschten Antikörper-sezernierenden Hybridomzellen
Nach der Fusion werden die Zellen in getrennten Mikrokulturen aufgeteilt. Meistens
verwenden wir eine 96-well-Platte. Man muß die 104-105 Zellen im Rauminhalt von 200 l
Mikrokulturen so verteilen, daß jedes Well nur eine Hybridzelle enthält. Die Zellen können
im selektiven Nährmedium gezüchtet und durch verschiedene lösliche Faktoren
(Wachstumsfaktoren, Inzulin, IL-6, TNF- stimuliert werden.
Zwei-drei Wochen später vermehren sich die Zellen schon in dermaßen, dass man in
dem Supernatant die produzierten Antikörper untersuchen kann. Beim Testen können wir die
sich als die besten erwiesenen Zellen weiterklonen. Das Prinzip dabei ist, die Zellen in solcher
Verdünnung auf ein 96-well-Platte zu legen, dass in jedes Well im Durchschnitt nur eine Zelle
kommt. Das Klonen darf nicht lange verzögert werden, weil das weniger wichtige Klon das
wertvolle überwachsen kann. Das Klonen verläuft richtig, wenn nicht in jeder Kultur ein
Zellklon wächst.
Danach können wir das am besten wachsende, bzw. das die meisten Antikörperproduzierende Klon auswählen, die wir später in einer größeren Menge züchten, um mehr
Supernatante zu bekommen. Es kommt manchmal vor, dass das Zellklon während einer
langfristigen Züchtung seine Antigenproduktionsfähigkeit verliert, oder Antikörper mit einem
veränderten Isotyp produziert. Deshalb ist es nötig, von Zeit zu Zeit die Antikörperproduktion
des Klones zu kontrollieren, bzw. ein neues Klonen zu machen.
Die Anforderungen an diese Methoden sind: die Schnelle, die Zuverlässigkeit, die genügende
Sensitivität, und die Fähigkeit, eine große Zahl von Proben untersuchen zu können. z.B:
ELISA, RIA, FACS
Die Reinigung der monoklonalen Antikörper
Die Konzentration des Supernatanten von Kulturen ist im optimalen Fall max. 10-12
g/ml. Die Reinigung dieses Supernatanten kann von der Spezifizität und dem Isotyp der
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Antikörper abhängig mit Protein G-oder Protein A-Affinitätschromatographie durchgeführt
werden. Eine größere Menge Antikörper kann von Ascites gewonnen werden, dessen
Antikörperkonzentration sogar 10 mg/ml erreichen kann. Die Mäuse können mit BALB/c und
Sp-2-Hybridzellen erfolgreich peritoneal geimpft werden. Die Reinigung der Antikörper von
dem Ascites ist ähnlich der Reinigung des Serums.
NB:In diesem Fall enthält das Präparat auch poliklonale Antikörper des geimpften Tieres.
Die Verwendung der monoklonalen Antikörper
1. Die Reinigung der Proteine
Früher konnte man die Antikörper nur durch mehrstufige Chromatographie und mit
einem niedrigen Wirkungsgrad reinigen. Monoklonale Antikörper (zuerst zur Reinigung von
IFN verwendet) verbessern die frühere Sauberkeit von 1% auf 5000x.
2. Reinigung und Isolierung der Lymphozytenuntergruppen und Klonen
Die
monoklonalen
Antikörper
sind
für
Reinigung
und
Isolierung
solcher
Lymphozytenuntergruppen und Klonen anwendbar, die ein typisches Membranproteinmuster
(CD Marker) haben. z.B.:CD4+ helfer und CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten.
3.Tumordetektierung und Imagining
Es können monoklonale Antikörper gegen tumorspezifische Membranproteine produziert
werden. Das sind solche Proteine, die nur von den Tumorzellen expressiert werden, aber von
den normalen nicht. Nach der Immunisierung der Mäuse mit humanen Lungentumorzellen
waren von 20.000 getesteten Hybridomen nur 80 tumorzellspezifisch. Die Tumoren können
visualisiert werden, indem die tumorspezifischen Antikörper radioaktiv oder mit Gadolinium
(MRI) markiert werden.
Einige Tumoren setzen tumorspezifische Antikörper (Tumormarker) in die Blutbahn frei
(z.B.: CEA, AFP, CA 19-9), die mithilfe der monoklonalen Antikörper aus dem Serum
nachweisbar sind.
Tumorzelltötung:
Die Tumorzellen können durch die mit verschiedenen Toxinen konjugierten monoklonalen
Antikörper eliminiert werden. Dafür sind Rizin, Shigellatoxine oder Diphterietoxine geeignet.
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Diagnostische Ziele:
Es werden heute mehr als hundert diagnostische Methoden eingesetzt, die auf Anwendung der
monoklonalen Antikörper basieren. z.B.: Schwangerschaftstests, Untersuchung der viralen
und bakteriellen Infektionen, HLA- Typisierung, Detektierung des Herzinfaktes, usw.
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