5. Immunohistochemie, Immunozytochemie

Immunzytochemie, Immunhistochemie
In den 1950er Jahren entwickelte sich die Immunzytochemie als eine Untergruppe der
Immunologie. Zu dieser Zeit waren die Genauigkeit und auch die Umsetzbarkeit dieser
Methode allerdings noch nicht ganz ausgereift. In den achtziger Jahren wurde sie dank dem
hohen Standard der Antikörperproduktion und –aufreinigung zu einer der meist genutzten
Methoden der Histotechniken. Das Prinzip dieser Technik basiert auf der Antigen-Antikörper
Reaktion.
Im Allgemeinen können alle Verbindungen mit hohem Molekulargewicht (Proteine,
Glykoproteine, Polysaccharide, Fette) Antigene darstellen. Gegen diese Stoffe kann das
Wirtstier (inkl. Mensch) Antikörper produzieren, die aus dessen Serum gewonnen werden
können.
Direkte und indirekte Immunzytochemie
Basis
Vorteile
Nachteile

Direkt
Indirekt
Gekennzeichneter
Primärantikörper –
Einschrittverfahren
Nicht gekennzeichneter
primärer Antikörper +
gekennzeichneter
Sekundärantikörper
(gegen die konstante
Region des primären
Antikörpers) – 2 oder
mehrere Schritte


schnell
nicht arbeitsintensiv

Schwache
Hintergrundsignale
Ökonomisch
Effiziente
Verstärkung





Kennzeichnen des
Antikörpers könnte zu
einer verminderten
Affinität für das
Antigen führen
Wahrscheinlichkeit
starker
Hintergrundsignale
Hoher Arbeitsaufwand
Zeitintensiver Ablauf
Antikörper in der Immunzytochemie
Primärer Antikörper
Aufgrund ihrer Herstellungsart können zwei Hauptgruppen dieser Antikörper unterschieden
werden. Wird der Antikörper aus dem Vollserum eines Tieres aufgereinigt, stammen die
Antikörper von verschiedenen Lymphozytenklonen. Sie erkennen verschiedene Epitope auf
dem Antigen und werden deshalb polyklonale Antikörper genannt. Wird ein Antikörper von,
durch klonale Selektion ausgewählten, Lymphozyten produziert (1 Klon) und aus deren
Überstand gewonnen, so spricht man von monoklonalen Antikörpern. (Klonale Selektion
bedeutet, dass jene Lymphozytenklone ausgewählt werden, die die höchste Affinität zu dem
Antigen besitzen). Köhler & Milstein gewannen 1984 den Nobelpreis für die Entwicklung
ihrer Technik zur Produktion monoklonaler Antikörper (Hybridomatechnik).
Sekundärer Antikörper
Bei der Wahl eines sekundären Antikörpers ist es am wichtigsten zu wissen, welches Tier
verwendet wurde, um den primären Antikörper zu produzieren – Es müssen sekundäre
Antikörper gegen die konstante Region des primären Antikörpers produziert werden (z.B.:
Ziegen anti-Maus Antikörper = produziert in einer Ziege wirksam gegen die konstante Region
eines Maus-Immunglobulins).
Terziäre Reagenzien
In der indirekten Immunozytochemie kann die Reaktion in drei oder mehreren Schritten
fortgeführt werden.
Im Folgenden werden zwei Komplexe beschrieben, die mit Enzymen arbeiten, nämlich der (a)
Peroxidase-Antiperoxidasekomplex (PAP) und die (b) Avidin-Biotin (ABC) methode.
(a) Der PAP Komplex besteht aus (1) einem antigenspezifischen Primärantikörper, (2) einem
Horseradish-Peroxidase (HRPO) spezifischen Antikörper (bindendes Enzym) und (3)
einem dritten “überbrückenden” Antikörper spezifisch für die konstante Region der ersten
beiden (1, 2) Immunoglobulinen (Antikörper (1) und (2) müssen von der selben Spezies
stammen).
(b) Für die ABC-Methode benötigt man Avidin/Streptavidin, welches mehrere
Biotinbindungsstellen aufweist (Biotin = H-vitamin). Wird ein biotinylierter primärer oder
sekundärer Antikörper verwendet, bindet Avidin (Streptavidin oder Extravidin in Kits) zu
dem gekennzeichneten Antikörper. Weil Avidin mehrere Biotinbindungsstellen hat, kann
eine gute Verstärkung des Signals erzielt werden. Das Signal kommt von einem
biotinyliertem HRPO-Molekül, das zu Avidin bindet. (Avidin stammt aus Eiern, während
Streptavidin von Streptokokken gewonnen wird).
Visualisierung der Antigen-Antikörper-Reaktion
Fluorochrome
Primäre sowie sekundäre Antikörper können durch kovalente Bindung mit aromatischen,
ringförmigen Molekülen oder Proteinen (Phycoerythrin-PE) gekennzeichnet werden. Diese
Verbindungen können durch Licht einer bekannten Wellenlänge angeregt werden und geben
wiederum Licht einer anderen Wellenlänge ab. Das am häufigsten benutzte Fluorochrom ist
Fluoresceinisotiocyanat (FITC).
Für Doppelmarkierung kann FITC gemeinsam mit anderen Fluorochromen anderer Farben
verwendet werden (andere Emissionswellenlänge, z.B.: PE, TRITC). Die Reaktion kann unter
dem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden.
Chromogene
Die Reaktion basiert auf der durch das Peroxidase-Enzym ausgelösten Zersetzung von H2O2.
Der dadurch entstehende Sauerstoff kommt frei und kann mit dem Chromogen reagieren. An
der Stelle der Reaktion bildet sich ein unlöslicher, detektierbarer Niederschlag. Außer
Peroxidase können auch andere Enzyme wie zum Beispiel Alkaline Phosphatase (AP) oder βgalactosidase verwendet werden.
Einige allgemein verwendete Chromogene:
3’3 diaminobenzidin (DAB): Bei der Reaktion entsteht ein braunes Fällungsprodukt. (HRPO)
3-amino-9-ethylkarbazol (AEC): Rotes Fällungsprodukt (HRPO)
Nitro-blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (NBT/BCIP): Blau, Violett
(AP)
Die Reaktion kann unter dem Lichtmikroskop kontrolliert werden.
Das Gewebe oder die Zellen müssen vor der Immunreaktion fixiert werden, um die
Antigenstruktur für den Antikörper zu erhalten und manchmal auch um die Durchlässigkeit zu
erhöhen.
Es gibt mehrere Fixierungsmethoden, Aceton ist jedoch das am meisten benutzte Mittel in der
Immunzyto/-histochemie.
Der Nachteil der Fixiermittel Formalin, Paraformaldehyd, Glutaraldehyd ist, dass sie
Quervernetzungen unter den Proteinen herbeiführen. Für intrazelluläre Zielantigene müssen
verschiedene Detergentien (Triton-X100, Tween, Saponine) zur Zellpermeabilisation
(durchlässig machen) verwendet werden.
Blocken nicht-spezifischer Reaktionen
Antikörper können auch zu nicht-spezifischen Bindungsstellen an Geweben und Zellen
binden. Um das zu verhindern, werden diese Stellen vor der eigentlichen Reaktion mit
reaktionslosen Proteinen wie z.B. Albuminen (Rinderserum-Albumin, Ovalbumin) geblockt.
Kontrollen
Um die Verlässlichkeit der Ergebnisse zu erhöhen, sollten positive und negative Kontrollen
eingesetzt werden.
Prüfen der endogenen Peroxidaseaktivität
Vor den Experimenten muss die eigene Peroxidaseaktivität von Geweben und Zellen geprüft
bzw. um einer Verfälschung des Resultats dadurch zu vorzubeugen, verhindert werden. Die
Peroxidaseaktivität kann durch direkte Zugabe einer Substratlösung (z.B.: DAB, H2O2) zu
dem Gewebe geprüft werden. Erfolgt eine Reaktion, muss die endogene Peroxidase vor der
Antikörperreaktion durch z.B. phenyl-hidrasine-hydrochloride, 3% H2O2 unterdrückt werden.
Prüfen von Autofluoreszenz
Soll eine Fluoreszenzmethode zur Anwendung kommen, muss zuerst die eigene Fluoreszenz
des Gewebes bzw. der Zellen gemessen werden. Wird Autofluoreszenz erkannt, kann man vor
der Immunreaktion mit dem Anregungslicht fotobleichen.
Anwendungsbereich
Die Technik wird hauptsächlich von Pathologen, Immunologen und im neuroanatomischen
Bereich angewandt. Nichtsdestotrotz ist diese Methode auch in vielen anderen zytologischen
Experimenten mittlerweile unabdingbar.