Aminosäure

Mittwoch, 22.05.2002
Gruppe 8
Name: Hansjörg Haas
Jens Gesche
Biochemisches Praktikum
Kurstag: Aminosäuren und Proteine
Protokoll
Aminosäuren spielen im Stoffwechsel eine wichtige Rolle (Bausteine von Peptiden,
Proteinen, etc.). Aus diesem Grund ist der Nachweis von Aminosäuren von großer
Bedeutung.
Ionenaustauschchromatographie
In der verwendeten Aminosäure (AS)- Lösung sind statt der acht aufgeführten Aminsäuren
nur folgende sechs enthalten: His, Arg, Phe, Ala, Asp, Glu.
His und Arg liegen in wässriger Lösung als Kationen, Asp und Glu als Anionen vor, während
Phe und Ala nach außen hin elektrisch neutral erscheinen. Im Anionentauscher (Harz Dowex)
wird die Carbonylgruppe des Aminosäurerestes der Anionen an positive funktionelle Gruppen
des Harzes gebunden. Bei Zugabe einer Säure (z.B. Essigsäure) wird diese protoniert und
dadurch vom Harz gelöst. Die Kationen, sowie die elektrisch neutralen Aminosäuren werden
hingegen nicht gebunden.
Bei der Auftragung der einzelnen Fraktionen auf Kieselgelfolie und anschließender
Ninhydrin-Farbreaktion ergab sich folgendes Bild:
Für die anschließende Dünnschichtchromatographie wählten wir die Proben W1 und S4
aufgrund der höchsten Farbintensität (=höchster AS-Gehalt).
Dünnschichtchromatographie
Statt der im Skript erwähnten mit Cellulose beschichteten Glasplatte wurde für die
Chromatographie eine Kieselgelfolie verwendet. Um festzustellen ob und welche AS im Harz
hängen blieben, werden die zwei Fraktionen zusammen mit reinen AS-Referenzlösungen auf
ein DC-Papier aufgetragen und mittels DC analysiert.
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Skizze:
Auswertung:
In der Probe W1 ließen sich im Vergleich mit den aufgetragenen Referenzaminosäuren
nachweisen (wie erwartet die elektrisch neutralen, bzw. nach außen hin positiv geladenen
AS):
Phe, Ala, His und Arg
In der Probe S4 ließen sich im Vergleich mit den aufgetragenen Referenzaminosäuren
nachweisen (wie erwartet die nach außen hin negativ geladenen AS):
Glu und Asp
Im unpolaren Laufmittel wird Phe am weitesten mitgetragen, weil es den größten unpolaren
(hydrophoben) Rest besitzt. Die hydrophile AS werden weit weniger mitgetragen.
Aminosäuren mit nur einer sauren Gruppe (alpha-Carbonylgruppe) werden vom Harz nicht
gebunden, da die ebenfalls positiv geladene NH 3 -Gruppe einer Bindung entgegenwirkt. Die
AS erscheint nach außen hin neutral (isoelektrischer Punkt).
Bestimmung des isoelektrischen Punktes von Casein
Ergebnisse:
Reagenzglasnummer
berechneter
ph-Wert
gemessener
ph-Wert
ml 0,001 M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
4,48
4,33
4,18
4,03
3,87
3,72
3,57
3,42
3,27
7,52
7,20
6,33
5,35
4,48
4,06
3,76
3,55
3,36
0,6
1,25
2,5
5,0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,0
2,0
4,0
8,0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,6
8,4
1,0
7,75
1,0
6,5
1,0
4,0
1,0
8,0
1,0
7,0
1,0
5,0
1,0
1,0
1,0
7,4
1,0
-
-
-
+
++
+++
++
+
-
0,380
0,255
0,405
0,290
0,410
0,295
0,420
0,300
0,110
0,085
0,202
0,140
0,370
0,250
0,395
0,280
0,395
0,280
CH 3COOH
ml 0,01 M
CH 3COOH
ml 0,1 M
CH 3COOH
ml dest. Aqua
ml Caseinlösung
beobachtete
Fällung
Extinktion
Proteingehalt
(mg/ml)
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Auswertung:
Die berechneten pH-Werte weichen von den tatsächlichen pH-Werten ab, da bei der
Berechnung die Zugabe von Casein nicht berücksichtigt wurde. Casein hat einen pH=7 und
erhöht dadurch den pH-Wert der Essigsäurelösung. Darüber hinaus besitzt Casein
Pufferfunktion.
Löslichkeitskurve von Casein
0,35
0,3
Proteingehalt (mg/ml)
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
7,52
7,2
6,33
5,35
4,48
4,06
3,76
3,55
3,36
pH-Wert
Aus den Werten ergibt sich, dass der isoelektrische Punkt des Casein bei einem pH-Wert von
pH  4,5 liegt. Der Proteingehalt im Überstand der Lösung ist bei diesem pH sehr niedrig, da
AS am IEP nach außen hin elektrisch neutral und daher im Wasser schlechter löslich sind
(beobachtete Fällung).
Trennung eine Proteingemisches mit Hilfe der Gelfiltration
Im Proteingemisch sind Dextranblau (2 MDa) und oranges BSA (60 kDa) enthalten (daher die
grüne Farbe des Gemisches!). Als stationäre Phase fungiert die Sephadex G 25 – Gelsäule.
Kleinere Moleküle treten langsamer durch das Gel hindurch, da sie in dessen Poren
aufgehalten werden. Für größere Moleküle sind die Poren undurchlässig, wodurch diese
schneller durch das Gel hindurchtreten. Beim Durchspülen mit destilliertem Wasser bilden
sich zwei deutlich erkennbare:
Das BSA mit einem niedrigeren Molekulargewicht
bildet bereits im oberen Abschnitt eine orange
Farbbanden, während sich das Dextranblau mit
dem höheren MG am Auslauf der Säule
wiederfindet ( siehe Skizze ).
Beim weiteren Durchspülen mit der 0,02M NaClLösung wird zunächst das Dextranblau vollständig
ausgewaschen und schließlich auch das BSA, da
das NaCl die Protein/Sephadex-Wechselwirkung
hemmt.
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