Untersuchungen zu einem neuen Screeningtest

Untersuchungen zu einem neuen Screeningtest
(ProC® Global)
zur Erfassung thrombophiler Zustände
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Heike Spittel, geb. Kämmerer
geb. am 20.07.1966 in Erfurt
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. G. Stein
2 Prof. Dr. med. habil. G. Vogel
3. ___________________________
Tag der öffentlichen Verteidigung: 04.06.2002
Inhalt
Seite
1.
Einleitung und Zielstellung
1
2.
Gegenwärtiger Erkenntnisstand und offene Fragen
3
2.1.
Hereditäre Thrombophilie
6
2.1.1
Thrombophiliediagnostik
8
2.2.
Das Protein-C-System
10
2.2.1.
Protein C
11
2.2.1.1.
Struktur und Wirkungsmechanismus
11
2.2.1.2.
Genetische Defekte
12
2.2.1.3.
Erworbene Mangelzustände von Protein C
13
2.2.1.4.
Labordiagnostik
13
2.2.2
Protein S
14
2.2.2.1.
Struktur und Wirkungsmechanismus
14
2.2.2.2.
Genetische Defekte
15
2.2.2.3.
Erworbene Mangelzustände von Protein S
16
2.2.2.4.
Labordiagnostik
16
2.2.3.
Phospholipidantikörper
17
2.2.3.1.
Pathophysiologie und Klinik
17
2.2.3.2.
Diagnostik der Phospholipidantikörper
19
2.2.4.
Erhöhte Faktor-VIII-Spiegel
20
2.2.4.1.
Pathophysiologie und Klinik
20
2.2.4.2.
Labordiagnostik
21
2.2.5.
Faktor-V-Mutation
22
2.2.5.1.
Pathophysiologie
22
2.2.5.2.
Klinik der Faktor-V-Mutation
23
2.2.5.3.
Labordiagnostik
25
3.
Eigene Untersuchungen
27
3.1.
Material und Methoden
27
3.1.1.
ProC® Global-Test
27
3.1.1.1.
Auswahl der Proben und Probeentnahmen
27
3.1.1.2.
Testprinzip
28
3.1.1.3.
Reagenzien und Testgerät
29
3.1.1.4.
Präzisionskontrolle
30
3.1.1.5.
Durchführung
30
3.1.1.6.
Testauswertung
31
3.1.2.
COATEST® APCTM Resistance
31
3.1.2.1.
Auswahl der Proben und Probeentnahmen
31
3.1.2.2.
Testprinzip
32
3.1.2.3.
Reagenzien und Testgerät
33
3.1.2.4.
Präzisionskontrolle
33
3.1.2.5.
Durchführung
34
3.1.2.6.
Testauswertung
34
3.2.
Ergebnisse
35
3.2.1.
Übersicht über die Untersuchungsergebnisse zum Testsystem
35
ProC® Global
3.2.1.1.
ProC® Global-Werte von Patienten mit genomisch nachgewiesener
37
heterozygoter Faktor-V-Mutation
3.2.1.2.
ProC® Global-Werte von Patienten mit genomisch nachge-
39
wiesener homozygoter Faktor-V-Mutation
3.2.1.3.
Verhalten der ProC® Global-Werte von Patienten ohne
40
genomisch nachgewiesene Faktor-V-Mutation
3.2.2.
Vergleich zweier funktioneller Testsysteme zur Erfassung
43
der APC-Resistenz gleicher Plasmaproben
Vergleich zwischen ProC® Global und COATEST® APCTM Resistance
3.2.3.
Prävalenzuntersuchungen zum Vorherrschen der APC-
45
Resistenz bei Thrombosepatienten anhand des Studiums von
Krankenblattdateien
3.2.3.1.
Aufschlüsselung der Krankenblattdateien weiblicher Probanden
45
3.2.3.2.
Aufschlüsselung der Krankenblattdateien männlicher Probanden
46
3.2.3.3
Charakterisierung der pathologischen Meßergebnisse
47
4.
Diskussion
50
5.
Zusammenfassung
61
6.
Literatur
63
Thesen
74
Anhang
76
1. Einleitung und Zielstellung
Venöse Thrombosen und Embolien stehen in der Häufigkeit kardiovaskulärer
Erkrankungen an dritter Stelle. Die Inzidenz venöser Thrombosen wird in der Literatur mit
1:1000 angegeben (36). Trotz fest etablierter medikamentöser und mechanischer
Maßnahmen der Thromboseprophylaxe im Klinikalltag treten thromboembolische
Ereignisse immer noch relativ häufig auf. Sie können zum einen durch Entwicklung einer
Lungenembolie den Patienten akut gefährden. So führen in der Bundesrepublik
Deutschland Thromboembolien jährlich zu 100.000 Todesfällen (99). Andererseits geht die
Herausbildung eines postthrombotischen Syndroms mit einer lebenslangen Behinderung
einher.
Die Ursachen einer Thrombose sind vielfältig und lassen sich selten auf einen einzelnen
Risikofaktor
zurückführen.
Neben
den
klassischen
Risikofaktoren
wie
Alter,
Immobilisation, Trauma, orale Kontrazeption und Schwangerschaft stehen in den letzten
Jahren zunehmend die angeborenen und erworbenen Gerinnungsdefekte im Mittelpunkt.
Besondere Aufmerksamkeit soll im weiteren der hereditären Thrombophilie geschenkt
werden. 1965 identifizierte die Entdeckung von Egeberg (27) über angeborenen AT IIIMangel und die damit verbundene Prädisposition venöser Thrombosen den 1.
Pathologischem Mechanismus der Hyperkoagulation. Fast 20 Jahre später wurde durch
Beobachtungen gehäuften Auftretens hereditären Protein-C- und Protein-S-Mangels in
Familien mit Thromboseneigung ein weiterer Zusammenhang zwischen Hyperkoagulation
und hereditärer Thrombophilie beschrieben (13, 14, 39). Mit der Identifikation dieser
Störungen konnten lediglich für 10-15% der zunächst ungeklärten Thromboembolien eine
Ursache nachgewiesen werden. Die Prävalenz dieser Defekte ist relativ niedrig, sie werden
höchstens bei 2-5% der Patienten mit Thrombosen gefunden. 1993 brachte die Entdeckung
eines bisher unbekannten genetischen Defektes, der mit Thrombophilie einher geht,
nämlich die sogenannte Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C, eine deutliche
Änderung der Situation (21, 22).
Dahlbäck beobachtete, daß es im Plasma bestimmter Thrombosepatienten bei In-vitroZusatz von aktiviertem Protein C nicht zu einer Verlängerung der Gerinnungszeit kam, wie
dies im Plasma gesunder Patienten der Fall ist und nannte diesen Defekt „Resistenz gegen
aktiviertes Protein C“. Wie Bertina et al. (5) sowie andere Autoren (38, 93) 1994 zeigten,
verbirgt sich hinter dem Begriff der APC-Resistenz in ca. 90% der Fälle eine
Punktmutation im Faktor-V-Gen. Dabei ist im Exon 10 in Position 1691 Guanin durch
Adenosin ersetzt. Diese Mutation führt im Faktor-V-Protein in der Aminosäureposition
506 zu einem Austausch von Arginin durch Glutamin. Sie ist derzeit der häufigste
bekannte genetische Defekt, der mit einem erhöhten Risiko thromboembolischer
Ereignisse einhergeht. Nach ihrem Entdeckungsort wird diese Mutation auch Faktor-VLeiden-Mutation genannt.
Durch die Mutation kann aktiviertes Protein C seiner antikoagulatorischen Wirkung, der
proteolytischen Spaltung der Faktoren Va und VIIIa, nicht mehr nachkommen. Daraus
resultiert eine erhöhte Gerinnungsfähigkeit des Blutes.
Andere mögliche Gründe für das Vorliegen der APC-Resistenz wären eine Dysfunktion
oder ein Mangel von Protein C oder S, erhöhte Konzentrationen von Faktor VIII oder das
Vorliegen eines Lupus-Antikoagulans. In jüngster Zeit wurde eine weitere Ursache für
APC-Resistenz im Auftreten einer 2. Mutante des Faktor-V-Gens (sogenannte HR 2
Mutation) gefunden. Theoretisch denkbar wären auch bisher unbekannte Defekte im
Faktor-V- oder Faktor-VIII-Protein.
Die Fortschritte in
der Gerinnungs- und Fibrinolysephysiologie zwingen den
Wissenschaftler immer wieder, sich mit diagnostischen Methoden auseinanderzusetzen
und diese zu überarbeiten. Aufgrund der hohen Prävalenz der Faktor-V-Mutation ist eine
umfassende Gerinnungsdiagnostik ohne Überprüfung des Protein-C-Systems undenkbar.
Unter
Berücksichtigung
ökonomischer
Interessen
kommt
dabei
vorgeschalteten
Suchmethoden eine besondere Bedeutung zu.
Bisher konnten Störungen des Protein-C-Systems nur mit Einzeltesten erfaßt werden, was
mit
einem
hohen
Untersuchungsaufwand
einherging.
Im
Rahmen
des
Thrombophiliescreenings scheint es daher sinnvoll, vor Bestimmung der einzelnen
Komponenten, einen sogenannten Suchtest voranzustellen. In Abhängigkeit von dem
Testergebnis kann dann das weitere Vorgehen festgelegt werden.
Ein Screeningtest zur Erfassung von Störungen im Protein-C-System ist der ProC® GlobalTest.
In der vorliegenden Arbeit soll Stellung zur Sensitivität und Spezifität dieses Testes
bezogen werden.
2. Gegenwärtiger Erkenntnisstand und offene Fragen
Störungen der Hämostase, die sich klinisch durch Blutungsneigung oder durch
thromboembolische Erscheinungen ausdrücken, haben große Bedeutung sowohl für den
einzelnen Patienten als auch für die Gesundheitspolitik. Die Kosten für Diagnostik und
Therapie thromboembolischer Erkrankungen beliefen sich in den letzten Jahren in den
alten Bundesländern auf 12 Milliarden DM pro Jahr.
Mit der zunehmenden Aufdeckung erblicher Störungen im Gerinnungssystem und deren
Nachweis geht eine gesteigerte Ursachenklärung thromboembolischer Ereignisse einher.
Durch genaue Kenntnis der zugrundeliegenden Störung kann für den Betroffenen neben
einer
entsprechenden
Therapie,
in
bestimmten
Situationen
ein
gesteigertes
Thromboserisiko abgeschätzt und eine adäquate Thromboseprophylaxe durchgeführt
werden.
Des
weiteren
können
durch
gezielte
Familienuntersuchungen
asymptomatische
Merkmalsträger aufgedeckt werden, bei denen in bestimmten Expositionssituationen durch
konsequente Thromboseprophylaxe das Auftreten thromboembolischer Ereignisse
vermeidbar ist. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit der Entwicklung geeigneter
Testsysteme zum Nachweis hereditärer Gerinnungsdefekte. Die Frage nach dem
Blutungsrisiko ist im allgemeinen durch routinemäßig schnell durchführbare Globalteste,
wie Thromboplastinzeit, aktivierte partielle Thromboplastinzeit und Thrombozytenzahl,
feststellbar. Die Frage nach einem gesteigerten Thromboserisiko hingegen ist schwerer zu
beantworten, da neben den thrombosebegünstigenden klassischen Risikofaktoren wie
Immobilisation,
Operation,
Infektionen,
Schwangerschaft
und
Einnahme
oraler
Kontrazeptiva eine genetische Disposition zu berücksichtigen ist. Aus ökonomischer Sicht
und in Kenntnis der Vielfalt dieser Defekte gewinnen Screeningtests zunehmend an
Bedeutung. Da bekannt ist, daß ca. 80% aller heute meßbaren „thrombophilen Faktoren“
das Protein-C-System betreffen, wäre es sinnvoll, für diese mit Abstand häufigsten
Veränderungen einen Screeningtest verfügbar zu haben, der Veränderungen innerhalb des
Protein-C-Systems erkennt. Dieser soll einfach und in jedem Labor durchführbar sein.
Durch die Besonderheit der Screeningteste, mehrere Komponenten eines bestimmten
Systems zu erfassen, haben diese Teste Vorteile gegenüber der gezielten Bestimmung einer
Einzelkomponente.
Da man davon ausgehen kann, daß die Summe aller derzeit verfügbaren Parameter immer
noch nicht die vollständige biologische Realität erfaßt, kann eine unerklärliche
Aktivitätsminderung
eines
Screeningtestes
Hinweise
auf
bisher
unbekannte
Gerinnungsdefekte geben, wenn gleichzeitig sämtliche, zu diesem Zeitpunkt bekannte
Einzelkomponenten des betroffenen Systems im Normbereich liegen.
Im Gegensatz zu den herkömmlichen funktionellen Testsystemen zum Nachweis einer
APC-Resistenz ist ProC® Global ein Suchtest zur Erfassung der antikoagulatorischen
Kapazität des gesamten Protein-C-Systems im humanen Plasma. Das heißt, daß das
Testergebnis vom Verhalten des Protein-C-Systems in der untersuchten Probe abhängig ist
(49, 61).
Das als ProC® Global bezeichnete Testverfahren wurde 1997 eingeführt. In Abhängigkeit
vom jeweiligen Testergebnis kann entschieden werden, ob ein hereditärer oder erworbener
Defekt im Protein-C-System unwahrscheinlich ist oder ob mit hoher Wahrscheinlichkeit
eine Störung vorliegt. Dadurch wäre es möglich, Patienten mit normalem Testergebnis von
einer aufwendigen und kostenintensiven weiterführenden Diagnostik auszuschließen oder
bei positivem Ergebnis eine genaue Analyse des Protein-C-Systems vorzunehmen. Nach
entsprechenden Untersuchungen (5, 38, 93) sind ca. 90% aller Probanden mit einer
verringerten APC-Sensitivität Träger der Faktor-V-Mutation, d.h., daß mit diesem Test der
derzeit am häufigsten vorkommende erbliche Gerinnungsdefekt nachgewiesen werden
kann.
Ebenso
werden
hereditäre
oder
erworbene
Protein-C-
oder
Protein-S-
Mangelzustände, sowie erhöhte Faktor-VIII-Konzentrationen oder Phospholipidantikörper
(Lupusantikoagulans) erfaßt.
Wird eine Plasmaprobe vor der APTT-Messung mit einer standardisierten Menge APC
über einen definierten Zeitraum inkubiert, kommt es normalerweise zum proteolytischen
Abbau der Faktoren Va und VIIIa. Somit wird die Thrombinbildung verlangsamt und die
Zeit bis zur Fibrinbildung verlängert.
Bei den herkömmlichen funktionellen Testsystemen zum Nachweis einer APC-Resistenz
wurde die Gerinnungskaskade durch direkten Zusatz von APC gestartet. Im Gegensatz
dazu wird beim ProC® Global-Test das zu untersuchende Plasma mit einem Protein-CAktivator (Bestandteil des Schlangengiftes von Agkistrodon contortrix) versetzt. Ein
Vorteil des Protein-C-Aktivators besteht darin, daß er stabiler als APC ist und auch durch
Einfrieren diese Stabilität nicht verliert (21, 95).
Unter Zugabe von Calciumionen wird endogenes Protein C aktiviert und somit die
intrinsische Gerinnungskaskade gestartet. Das aktivierte Protein C inaktiviert im
Zusammenspiel mit dem in freier Form vorkommendem Protein S die Cofaktoren Va und
VIIIa. So wird die Zeit bis zur Gerinnselbildung verlängert, wobei in Plasmen mit
verringerter Wirkung des Protein-C-Systems die Gerinnungszeit weniger stark verlängert
ist. Die so bestimmte Zeit wird als PCAT (Protein C Activity dependent Clotting Time)
bezeichnet.
Zur Erkennung von Störfaktoren wie hohe Heparinkonzentrationen oder Mangel an
prokoagulatorischen Faktoren dient eine als PCAT/0 bezeichnete Verfahrensweise. Hierbei
wird statt des Protein-C-Aktivators ein Puffer mit Heparin-Neutralisator zugesetzt. Die
PCAT/0 soll kleiner oder gleich 60 Sekunden sein. Ansonsten besteht die Gefahr, daß eine
verringerte Kapazität des Protein-C-Systems durch eine Verlängerung der Gerinnungszeit
überlagert wird. Bei Verlängerung der PCAT/0 >60 sec wird eine Vorbehandlung mit
einem heparinabbauenden Enzym empfohlen.
Die beiden bestimmten Zeiten PCAT und PCAT/0 werden nachfolgend ins Verhältnis
zueinander gesetzt.
Durch Zugabe von Faktor-V-Mangelplasma wird der Einfluß anderer Faktoren minimiert.
Vom Hersteller ist sichergestellt, daß das Faktor-V-Mangelplasma eine normale
Konzentration an Faktor VIII enthält, da sonst eine Verfälschung der Ergebnisse durch zu
hohe (falsch positive) oder zu niedrige (falsch negative) Konzentrationen an Faktor VIII in
der Patientenprobe nicht ausgeschlossen werden kann. Ein unter Zugabe von Faktor-VMangelplasma erhaltener verminderter Wert ist fast ausschließlich auf die Mutation im
Faktor-V-Gen zurückzuführen.
Auch kann durch Zugabe von Faktor-V-Mangelplasma das Vorliegen der APC-Resistenz
im Plasma von Patienten unter oraler Antikoagulation getestet werden. Nach einigen
Untersuchungen (50, 60, 91) sind die Ergebnisse der mit Faktor-V-Mangelplasma
untersuchten antikoagulantienhaltigen Proben vergleichbar mit den Ergebnissen, welche
von antikoagulantienfreien Proben erhalten wurden. Diese Beobachtungen wurden sowohl
an Plasmen mit APC-Resistenz als auch an Plasmen ohne APC-Resistenz gemacht.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit besteht darin, Daten darüber zu beschaffen, in welchem
Maß der ProC® Global-Test als Screeningmethode für thrombophile Zustände verwendbar
ist.
2.1. Hereditäre Thrombophilie
Die physiologische Blutstillung befindet sich in einem sensiblen Gleichgewicht von
fördernden und hemmenden Reaktionspartnern. Störungen dieses ausgewogenen Systems
führen entweder zur reduzierten Blutstillung, auch hämorrhagische Diathese genannt, oder
gehen mit einer Tendenz zur erhöhten Gerinnungsneigung, der thrombophilen Diathese
oder Thrombophilie einher. Nach Lechner (51) kann „Thrombophilie als ein Zustand
definiert werden, bei dem das Risiko des Auftretens thromboembolischer Erkrankungen
erhöht ist und der zugrundeliegende Risikofaktor in Störungen der Hämostase oder der
Fibrinolyse besteht“.
Zur Aufrechterhaltung der Fluidität des Blutes und der Durchgängigkeit der Gefäße sind
eine intakte Endothelfunktion und das Vorhandensein physiologischer Inhibitoren der
plasmatischen Gerinnungsfaktoren erforderlich. Sind diese komplexen Interaktionen
gestört, kann es zur Blutgerinnung am falschen Ort und damit zur Entstehung
thromboembolischer Komplikationen kommen. Thrombophile Reaktionslagen kommen
bei bestimmten genetischen Defekten, verschiedenen Krankheitsbildern oder passageren
Zuständen vor. Als Ursachen wären Mangel oder Dysfunktion einer der physiologischen
Gerinnungsinhibitoren, hier insbesondere von AT III, Protein C und Protein S, bestimmte
Formen der kongenitalen Dysfibrinogenämie, ein vermindertes fibrinolytisches Potential,
Lupusantikoagulanzien, proteolytische Enzyme, und nicht zuletzt die Mutation im FaktorV-Gen, zu nennen. Aber auch bei Vorhandensein bestimmter exogener Faktoren wie z.B.
Immobilisation, Operation, Schwangerschaft und orale Kontrazeption wird die
Thrombinbildung induziert.
Nach Vogel (96) kann die Entstehung einer Thrombose in ähnlicher Weise wie die einer
Infektionskrankheit beschrieben werden. Danach manifestiert sich die Krankheit, wenn bei
gegebener Disposition eine Exposition erfolgt. Die Disposition beinhaltet dabei die häufig
sogar lebenslang bestehende Veränderung im Hämostasesystems, die Exposition ergibt
sich aus o. g. exogenen Faktoren. So kann bei extremer Exposition bereits bei geringster
Disposition eine Thrombose entstehen. Umgekehrt reicht bei starker Disposition oftmals
eine
nur
minimale
Expositionssituationen
Exposition
häufig
zur
nicht
Ausbildung
umgehen
einer
lassen,
Thrombose.
ist
für
eine
Da
sich
adäquate
Thromboseprophylaxe die Kenntnis einer Disposition von besonderer Wichtigkeit.
Hereditäre Thrombophilie umfaßt die Gesamtheit der Zustände, bei denen die
Hyperkoagulabilität auf angeborene o. g. Defekte zurückzuführen ist. Am häufigsten
lassen sich Mangel oder Dysfunktion der Gerinnungsinhibitoren als auslösende Defekte
identifizieren, zu denen neben AT III vor allem das Protein-C-System gehört.
2.1.1. Thrombophiliediagnostik
Die Durchführung einer entsprechenden Thrombophiliediagnostik ist angezeigt bei
Patienten mit venöser Thrombose vor dem 40. Lebensjahr, bei Patienten mit
ungewöhnlichem arteriellen Verschluß, insbesondere intracraniellen, bei Frauen mit
wiederholtem Abort und bei Patienten mit rezidivierenden Thromboembolien oder
atypischen venösen Thrombosen (z.B. Mesenterialvenenthrombose). Auch sollte bei
Patienten mit Autoimmunerkrankungen, bei Thrombosen aus geringfügiger oder nicht
eruierbarer Ursache, den sogenannten „Spontanthrombosen“ und bei familiärer
Thrombosehäufung eine Thrombophiliediagnostik erfolgen.
Aufgrund des hohen Vorherrschens der Faktor-V-Mutation und des nachgewiesenen
gesteigerten Thromboserisikos bei gleichzeitiger Einnahme oraler Kontrazeptiva wird die
Durchführung einer entsprechenden Diagnostik auch vor Erstverschreibung hormoneller
Verhütungsmittel diskutiert (92).
Zur Prävention einer Rezidivthrombose, zur Abschätzung der Dauer einer oralen
Antikoagulation nach stattgehabter Thrombose und zur Beurteilung des Thromboserisikos
bei
erforderlicher
Immobilisation
ist
zur
Durchführung
einer
adäquaten
Thromboseprophylaxe eine umfassende Thrombophiliediagnostik unumgänglich.
Auch empfiehlt es sich, bei Nachweis eines Gerinnungsdefektes bei symptomatischen
Patienten
und
deren
blutsverwandten
Familienangehörigen
eine
umfassende
Gerinnungsdiagnostik durchzuführen, da durch mehrere Studien (44, 45) belegt ist, daß
genetische Inhibitordefekte kombiniert auftreten können, wodurch das Thromboserisiko
gesteigert wird.
Insbesondere bei jungen Patienten mit Manifestation thromboembolischer Ereignisse ohne
Risikofaktoren sind ursächlich genetische Defekte der Blutgerinnung zu vermuten.
Für die Abklärung einer hämorrhagischen Diathese stehen empfindliche Sreeningteste zur
Verfügung. Das Thromboembolierisiko ist hingegen sehr viel schwerer abzuschätzen, da
zur umfassenden Abklärung eine Vielzahl z. T. aufwendiger und kostenintensiver
Untersuchungen
erforderlich
ist.
Außerdem
sind
diese
Testsysteme
nur
in
Speziallaboratorien durchführbar. Da Störungen im Protein-C-System, hier insbesondere
die Faktor-V-Mutation, die häufigsten hereditären Ursachen thrombophiler Diathese
darstellen, wäre die Anwendung eines Sreeningtests zur Feststellung der Funktionalität des
Protein-C-Systems ein wichtiger richtungsweisender Vortest, welcher ökonomisch
vertretbar, routinemäßig in jedem Labor durchführbar sein sollte.
Neben der Testung auf APC-Resistenz umfaßt eine ausführliche Thrombophiliediagnostik
die Bestimmung der AT-III-Aktivität und ggf. der Konzentration, die Bestimmung der
funktionellen Aktivität des Protein C sowie der Protein-C-Konzentration, die Bestimmung
der Protein-S-Aktivität einschließlich des Anteils des freien Protein S an der
Gesamtkonzentration. Die Thrombophiliediagnostik beinhaltet weiterhin die Untersuchung
der Fibrinolysekapazität, die Bestimmung der Faktor-VIII-Konzentration und der
Thrombozytenanzahl, die Bestimmung von Homocystein und des Prothrombinspiegels,
sowie die Testung auf Phospholipidantikörper. Die Bestimmung des Tissue factor pathway
inhibitors (TFPI) steht erst seit kurzer Zeit zur Verfügung.
2.2. Das Protein-C-System
Die hoch effizienten prokoagulatorischen Reaktionen von Thrombin sind physiologisch
wichtig an Standorten vaskulärer Verletzung und Voraussetzung einer effizienten
Hämostase. Jedoch können dieselben Reaktionen zu einer Bedrohung des Organismus
werden, wenn diese Mechanismen unkontrolliert ablaufen (16). Während AT III eine
direkte Hemmwirkung auf Thrombin ausübt, indem es einen irreversiblen ThrombinAntithrombin-Komplex bildet,
wirkt Protein C
indirekt
durch
Hemmung der
Thrombinaktivierung. Die Aktivierung von Protein C selbst erfolgt durch einen Komplex
von Thrombin mit membrangebundenen Thrombomodulin. Somit erfährt Thrombin eine
Wandlung von einem prokoagulatorischen zu einem antikoagulatorischen Enzym.
Thrombomodulin wird von den Endothelzellen synthetisiert und hat neben seiner
Rezeptorfunktion für Thrombin eine Cofaktorfunktion bei der Aktivierung von Protein C.
Aktiviertes Protein C zerstört die aktivierten Cofaktoren Va und VIIIa. Damit wird die
Neubildung von Thrombin und letztlich auch Fibrin drastisch reduziert. Verstärkt wird
diese Reaktion durch Protein S als Cofaktor.
Störungen des Protein-C-Systems können prinzipiell an verschiedenen Stellen entstehen:
-
Protein-C-Mangel bzw. funktioneller Protein-C-Defekt
-
Protein-S-Mangel bzw. funktioneller Protein-S-Defekt
-
Phospholipidantikörper (Lupusantikoagulanzien)
-
Faktor-V-Mutation
Störungen dieses sensiblen Systems können auch durch erhöhte Faktor-VIII-Spiegel
vorgetäuscht werden.
Insbesondere die Mutation im Faktor-V-Gen ist aufgrund ihrer Häufigkeit von besonderem
Interesse.
2.2.1. Protein C
2.2.1.1. Struktur und Wirkungsmechanismus
Protein C ist ein Proenzym, welches Vitamin-K-abhängig in der Leber als einkettiges
Polypeptid synthetisiert wird (98). Es besteht aus einem hydrophoben Signalopeptid und
einem Propeptid. Das Signalopeptid ist für das Processing und die Sekretion notwendig,
während das Propeptid die Erkennungssequenz für das y-Carboxylasesystem enthält, durch
das bestimmte Glutaminsäurereste Vitamin-K-abhängig zu y-Carboxyglutaminsäure
carboxyliert werden. Erst nach dieser letzten Synthesestufe erlangt Protein C seine
Funktionsfähigkeit. Das einkettige Molekül wird im Golgi-Apparat in ein zweikettiges
Molekül gespalten und in einem weiteren Schritt glykolysiert. Das im Plasma zirkulierende
Glykoprotein hat ein Molekulargewicht von 62 kD und besteht aus einer leichten und einer
schweren Kette. Beide sind durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. In der
leichten
Kette
sind
die
y-carboxylierten
Glutaminsäurereste,
welche
für
die
calciumabhängige Bindung des Proteins an Phospholipidoberflächen erforderlich sind,
enthalten. Die schwere Kette trägt das aktive Zentrum der Serinprotease und das
Aktivierungspeptid, das bei der Aktivierung des Proenzyms durch Thrombin abgespalten
wird. Die normale Plasmakonzentration beträgt 2-6 mg/l bzw. 65- 150%, die Halbwertszeit
liegt zwischen 6-8 Stunden. Seit der Aufklärung der Nukleotidsequenz des Protein-C-Gens
sind sehr viele Mutationen identifiziert worden. In der von Reitsma et al. (69)
zusammengestellten Database sind 160 verschiedene Mutationen enthalten.
Protein C wird durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex aktiviert und inaktiviert
durch proteolytische Spaltung die Gerinnungsfaktoren Va und VIIIa unter Mitwirkung
negativ geladener Phospholipide, Calciumionen und Protein S. Wahrscheinlich wirkt bei
der Inaktivierung von Faktor VIIIa neben Protein S auch intakter Faktor V (17, 94). Der
mutierte Faktor V kann diese Cofaktorfunktion nicht mehr wahrnehmen, woraus das
prokoagulatorische System eine weitere Stärkung bezieht. Zusätzlich steigert aktiviertes
Protein C die fibrinolytische Aktivität durch Bindung des Plasminogen-AktivatorInhibitors (98).
In vitro kann Protein C in Gegenwart von Calciumionen und Phospholipiden durch den
Bestandteil eines Schlangengiftes, das den Herstellernamen Protac trägt, aktiviert werden.
Durch Komplexbildung mit Protein-C-Inhibitor wird Protein C inaktiviert.
Neben Thrombosen der tiefen Beinvenen und oberflächlichen Thrombophlebitiden sind
auch atypische Thromboembolien (Mesenterial- und Hirnvenenthrombosen) beobachtet
worden. Als eine besondere Manifestationsform des Protein-C-Mangels ist die
Kumarinnekrose zu Beginn einer Therapie mit oralen Antikoagulanzien zu nennen. Als
Ursache
dieser
Erscheinung
wird
eine
initiale
Verschiebung
des
Gerinnungsgleichgewichtes zugunsten der prokoagulatorischen Faktoren verantwortlich
gemacht. Infolge der unterschiedlichen Halbwertszeiten der Gerinnungsfaktoren kommt es
zum Überwiegen der Gerinnung, wobei beim vorbestehenden Protein-C-Defekt der
kritische Punkt der intravasalen Gerinnung im Bereich der Hautgefäße früher erreicht wird
und dadurch die Hautnekrose entsteht.
2.1.1.2. Genetische Defekte
Protein-C-Defekte werden autosomal-dominant vererbt. Wie beim AT-III-Mangel
unterscheidet man beim angeborenen Protein-C-Mangel zwei Formen. Der Protein-CMangel vom Typ I geht mit einer verminderten Konzentration und Aktivität einher,
wohingegen der Typ II durch eine erheblich verminderte Funktion bei normaler
Plasmakonzentration
infolge
Synthese
eines
abnormalen
Protein-C-Moleküls
gekennzeichnet ist (69). Den Typ-II-Defekten liegen unterschiedliche Mutationen des
Protein-C-Gens zugrunde, so daß der Protein-C-Mangel formalgenetisch homozygot,
heterozygot und „compound-heterozygot" vererbt werden kann. Heterozygote Defekte
werden zu 5-8% bei jungen Patienten mit klinisch manifester erster Thrombose angetroffen
(35). Im Alter von 45 Jahren hat ungefähr die Hälfte dieser Merkmalsträger ein
thromboembolisches Ereignis durchgemacht (2). Dabei handelt es sich oft um
Spontanthrombosen oder es liegen geringfügige Expositionen zugrunde. Die Häufigkeit in
der Gesamtbevölkerung beträgt 0,2% (84).
Sowohl der homozygote als auch der „compound-heterozygote“ Protein-C-Mangel
manifestieren sich wenige Stunden nach der Geburt mit dem klinischen Bild der Purpura
fulminans und enden, sofern nicht sofort eine entsprechende Substitution eintritt, letal.
Die klinische Erscheinung der Thrombophilie des heterozygoten Protein-C-Mangels
variiert
zwischen
einer
ausgeprägten
Thromboseneigung
und
einer
fehlenden
Thrombosedisposition trotz vergleichbarer Verminderung der Protein-C-Konzentration.
Dieser Erscheinung trägt die hypothetische Benennung „klinisch autosomal dominant“ und
„klinisch autosomal rezessiv“ Rechnung. Derzeit geht man davon aus, daß die
unterschiedliche Ausprägung der Thromboseneigung auf der Kombination mehrerer
genetischer Defekte beruht. Die Annahme, daß diese Diskrepanz auf die unterschiedlichen
Mutationen des Protein-C-Gens zurückzuführen sind, wurde nicht bestätigt (20).
Koelemann et al. (44) zeigten in einer Studie, daß 19% der Personen mit einem
heterozygoten Protein-C-Mangel gleichzeitig heterozygot für die Faktor-V-Leiden
Mutation sind und Träger beider Defekte früher und häufiger eine Thrombose
entwickelten. Eine andere Studie beschreibt ein gehäuftes Auftreten der heterozygoten
Faktor-V-Mutation beim symptomatischen Protein-S-Mangel (45).
2.2.1.3. Erworbene Mangelzustände von Protein C
Erworbene Ursachen eines Protein-C-Mangels treten als Synthesestörungen insbesondere
bei Lebererkrankungen, bei Vitamin-K-Mangel oder auch unter Kumarintherapie auf.
Erhöhter Umsatz von Protein C kommt bei der Verbrauchskoagulopathie, postoperativ,
nach Polytrauma, bei insulinpflichtigem Diabetes mellitus und bei fortgeschrittener
Niereninsuffizienz vor.
2.2.1.4. Labordiagnostik
Die Bestimmung von Protein C kann immunologisch (ELISA, Laurell-Elektrophorese)
oder funktionell durch Testung des Inaktivierungsvermögens von aktiviertem Protein C auf
Faktor VIIIa und Faktor Va erfolgen, wobei letztere sowohl Defekte vom Typ I als auch
Defekte vom Typ II erfaßt. Dadurch bedingt wird der letzteren Bestimmungsmethode der
Vorzug gegeben. Praktisch wird die vorverdünnte Probe mit Protein-C-Mangelplasma
versetzt. Dann erfolgt die Zugabe eines Schlangengiftbestandteiles, welches Protein C
aktiviert. Da der Testansatz alle Gerinnungsfaktoren im Überschuß enthält, hängt die
Verlängerung der Gerinnungszeit in Bezug zur gemessenen Gerinnungszeit ohne ProteinC-Aktivierung allein von der Protein-C-Aktivität der Probe ab. Bei der Auswertung der
erhaltenen Ergebnisse ist der Zeitpunkt der Probeentnahme von besonderer Bedeutung. Da
die funktionellen Testsysteme auch verschiedene andere Gerinnungskomponenten
erfassen, ist bei der Blutentnahme in der akuten Phase einer Thrombose zu bedenken, daß
Faktor-VIII-Konzentrationen als Ausdruck einer Akuten-Phase-Reaktion erhöht sind und
die koagulometrisch arbeitenden Testsysteme positiv ausfallen können, auch wenn normale
Protein-C-Spiegel
vorliegen.
Andererseits
werden
unter
oraler
Antikoagulation
verminderte Protein-C-Spiegel gemessen, da die Proteinsynthese Vitamin-K-abhängig ist.
2.2.2. Protein S
2.2.2.1. Struktur und Wirkungsmechanismus
Protein S ist wie Protein C ein Vitamin-K-abhängiges Plasmaprotein. Bildungsorte sind
neben der Leber auch Endothelzellen und Megakaryozyten, so daß es, im Gegensatz zum
Protein C, bei Lebererkrankungen kaum vermindert ist. Ebenso wie beim Protein C ist das
Signalopeptid verantwortlich für das intrazelluläre Processing, während das Propeptid die
Erkennungssequenz für das y-Carboxylasesystem enthält. Es entsteht als einkettiges
Molekül und wird intrazellulär glykolysiert. Das Molekulargewicht beträgt 69 kD. Die
Gesamtplasmakonzentration beträgt 20-25mg/l bzw. 60-120%. Davon liegen im
Normalfall 7-10mg/l bzw. 23-49% in freier Form vor.
Protein S fungiert als Cofaktor des aktivierten Protein C bei der Inaktivierung der Faktoren
Va und VIIIa und wirkt somit gleichfalls als Inhibitor im Gerinnungssystem (98). Protein S
hat eine hohe Affinität zu negativ geladenen Phospholipidoberflächen, an die es in
Gegenwart von Calciumionen das aktivierte Protein C bindet.
Protein S kommt im Plasma zu 40% als freies Protein vor. Nur dieser Anteil ist funktionell
aktiv (42). 60% sind an das C4b-BP gebunden. C4b-BP fungiert als Regulatorprotein des
klassischen Komplementsystems und besteht aus 7 identischen y-Ketten und einer
einzelnen ß-Kette. Über diese ß-Kette bindet C4b-BP an Protein S. Die Ankopplung von
Protein S an C4b-BP stört nicht die Funktion von C4b-BP als Regulatorprotein der
Komplementkaskade, jedoch kann an C4b-BP gebundenes Protein S nicht als
Gerinnungsinhibitor fungieren.
Im Plasma liegen alle C4b-BP Moleküle, die eine ß-Kette erhalten, an Protein S gekoppelt
vor. So wird die Konzentration des freien Protein S von der Plasmakonzentration des C4bBP bestimmt. Damit ist verständlich, daß der bei Entzündungsreaktionen beobachtete
Anstieg der C4b-BP-Plasmakonzentration mit einem Abfall der Konzentration von freiem,
gerinnungsphysiologisch wirksamen Protein S einhergeht.
Wie beim Protein-C-Mangel kommt es gehäuft zum Auftreten vorwiegend venöser
Thromboembolien oder oberflächlicher Thrombophlebitiden; es scheinen jedoch häufiger
arterielle Thrombosen vorzukommen (1).
2.2.2.2. Genetische Defekte
Ebenso wie der Protein-C-Mangel wird der Protein-S-Mangel autosomal dominant vererbt.
Der hereditäre, heterozygote Protein-S-Mangel ist mit einem erhöhten Risiko für
thromboembolische Komplikationen assoziiert und klinisch dem Protein-C-Mangel sehr
ähnlich (98). Die Prävalenz des heterozygoten Defektes wird bei Patienten mit
thromboembolischen Erkrankungen zwischen 2-5% und 5-8% angegeben (16, 35). Die
Häufigkeit in der Gesamtbevölkerung ist nicht bekannt. Das gesteigerte Thromboserisiko
soll nach vorliegenden Familienstudien ähnlich dem eines Protein-C-Mangels und einer
heterozygoten Faktor-V-Mutation sein.
Es werden 3 Typen des hereditären Protein-S-Mangels unterschieden (55).
Der Typ I umfaßt eine Verminderung der Konzentration und somit auch der Aktivität
sowohl des gesamten als auch des freien Protein S. Beim Typ II ist ausschließlich die
Protein-S-Aktivität bei normaler Konzentration des gesamten und freien Protein S
vermindert. Der Typ III hingegen ist durch eine verringerte Konzentration des freien
Protein S und somit einer verminderten Aktivität bei normaler Konzentration des gesamten
Protein S gekennzeichnet. Bisher sind vom Typ III nur Einzelfälle berichtet worden. Es ist
derzeit noch unklar, ob es sich bei diesem Typ wirklich um einen hereditären Defekt oder
um eine reaktive Erkrankung im Rahmen der Komplementaktivierung handelt.
Die homozygote Form des Protein-S-Mangels verursacht, ebenso wie homozygoter
Protein-C-Mangel, das klinische Bild der Purpura fulminans.
2.2.2.3. Erworbene Mangelzustände von Protein S
Erworbener Protein-S-Mangel kann im Rahmen von Synthesestörungen, wie z.B. bei
Lebererkrankungen, Vitamin-K-Mangel oder unter Kumarintherapie vorkommen. Protein
S wird im Gegensatz zum Protein C auch in Endothelzellen oder Megakaryozyten gebildet.
Daher ist Protein S bei Patienten mit schweren Lebererkrankungen im Vergleich zu
Gesunden zwar signifikant, jedoch nicht so stark wie Protein C vermindert.
Protein S kann ebenfalls durch enteralen oder renalen Verlust reduziert sein. Zusätzlich
kommt es bei entzündlichen Krankheitsbildern zu einer Verminderung des freien Protein S
durch Erhöhung des C4b-BP, so daß beim nephrotischen Syndrom oder bei chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen zwei voneinander unabhängige Mechanismen zu einer
Konzentrationsminderung des freien Protein S führen. Grundsätzlich ist bei allen
Erkrankungen, die mit einer Aktivierung des Komplementsystems einhergehen
(entzündliche Erkrankungen, Malignome), von einer C4b-BP vermittelten Reduzierung des
freien Protein-S-Anteils auszugehen.
Physiologischer Protein-S-Mangel wird in der Schwangerschaft beobachtet und erreicht
zum Geburtstermin seinen Höhepunkt. Ähnlich wie in der Schwangerschaft kommt es
durch die Gabe oraler Kontrazeptiva zu einem Protein-S-Abfall, wobei dieser Abfall von
der verabreichten Östrogenkonzentration abhängig ist.
2.2.2.4. Labordiagnostik
Die Bestimmung von Protein S kann als Aktivitätsbestimmung koagulometrisch oder
immunologisch mittels ELISA oder Laurell-Elektrophorese erfolgen (4). Durch geeignete
Verfahren wird zwischen gesamtem Protein S, freiem Protein S und gebundenem Protein S
unterschieden.
Wie beim Protein-C-Mangel können Bestimmungen während einer Akuten-PhaseReaktion zu falsch positiven Ergebnissen führen. Unter oraler Antikoagulation sind ebenso
verminderte Konzentrationen zu erwarten.
2.2.3. Phospholipidantikörper
2.2.3.1. Pathophysiologie und Klinik
Phospholipidantikörper sind eine heterogene Familie von Immunglobulinen (IgG, IgM),
welche die Fähigkeit besitzen, Phospholipid-Protein-Komplexe zu erkennen und zu binden
(10). Paradoxerweise führt ihre Anwesenheit in vitro zu einer Verlängerung der
Gerinnungszeit und in vivo zur Thromboseneigung. Ihre Gegenwart ist mit einem
gesteigerten Risiko für das Auftreten arterieller und venöser Gefäßverschlüsse,
rezidivierenden intrauterinen Fruchttodes und einer meist leichten Thrombozytopenie
verbunden. Das Vorhandensein all dieser Störungen wird als Antiphospholipidsyndrom
bezeichnet. Die Prävalenz für thromboembolische Ereignisse wird mit ca. 30% angegeben
(4). Historisch wurde diese Gruppe von Antikörpern häufig präoperativ vor geplanter
Tonsillektomie oder Adenoidektomie bei Kindern gefunden, wobei die verlängerten
Gerinnungszeiten nicht selten zu einer Zurückstellung der geplanten Operation und einer
aufwendigen Labordiagnostik führten, ohne das eine Thromboseneigung bestand (59).
Phospholipdantikörper werden klassifiziert in autoimmun und alloimmun (88, 89). Zu den
erstgenannten zählen Antikörper, welche in Verbindung mit systemischen Lupus
erythematodes und anderen Bindegewebskrankheiten auftreten. Zu Letzteren gehören die
Phospholipidantikörper, die bei Infektionskrankheiten oder Malignomen nachgewiesen
werden.
Weiterhin
können
Phospholipidantikörper
in
Anticardiolipin-Antikörper
und
Lupusantikoagulanzien unterteilt werden.
Lupusantikoagulanzien sind die häufigsten erworbenen Gerinnungsinhibitoren. Definiert
werden sie als Immunglobuline, die phospholipidabhängig in vitro zu einer Verlängerung
der Gerinnungszeit führen, ohne die Aktivität bestimmter Gerinnungsfaktoren zu hemmen
(88). Zwei Plasmaproteine, ß2-Glucoprotein I und Prothrombin wirken als Cofaktoren,
indem sie die Bindung an die Phospholipide vermitteln.
Durch verschiedene Untersuchungen (9, 33) wurde gezeigt, daß Immunglobuline IgG oder
IgM, welche aus lupusantikoagulanzienhaltigen Plasmen isoliert wurden, die Aktivierung
von Protein C durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex oder die Bindung von
Thrombin an Thrombomodulin hemmen. Andere Autoren (7, 63) fanden ein reduziertes
Tempo der Inaktivierung des Faktors Va durch aktiviertes Protein C bei Patienten mit
Lupusantikörpern, wahrscheinlich bedingt durch die Protein S vermittelte, gestörte
Bindung von APC an Phospholipidoberflächen. Außerdem demonstrierten Freyssinet et al.
(33),
daß
die
durch
Phospholipide
hervorgerufene
Steigerung
der
Thrombomodulinaktivität durch Zugabe von o.g. Immunglobulinen neutralisiert wird. Des
Weiteren wurde gezeigt, daß in Seren von Patienten mit systemischem Lupus
erythematodes auch Antikörper gegen Endothelialzellantigene anwesend waren, die eine
vaskuläre Verletzung bewirken können und darüber eine Gerinnungsaktivierung erfolgen
kann (11).
Da Lupusantikoagulanzien zuerst beim systemischen Lupus erythematodes nachgewiesen
wurden, werden sie fälschlicherweise so bezeichnet. Sie sind aber auch bei einer Reihe
anderer
Erkrankungen,
lymphoproliferativen
insbesondere
Erkrankungen
bei
nachweisbar.
Autoimmunerkrankungen
Daneben
findet
man
oder
sie
bei
dialysepflichtigen Patienten, im Rahmen eines Myokardinfarktes, medikamentös induziert
(Phenothiazine, Penicillin) oder auch spontan. Sie können auch in Verbindung mit
Infektionskrankheiten (Hepatitis C, Malaria, Infektionen mit Pneumocystis carinii)
auftreten und verschwinden nach der Genesung (30, 66).
Mit dem Auftreten von Lupusantikoagulanzien können Hypoprothrombinämien,
Autoimmunthrombozytopenien oder Thrombozytenfunktionsstörungen vergesellschaftet
sein, woraus eine erhöhte Blutungsneigung resultieren kann. Die klinische Bedeutung liegt
jedoch im gehäuften Auftreten thromboembolischer Komplikationen (75, 89). 1963 wurde
erstmalig von Bowie und Mitarbeitern (8) über eine Beziehung zwischen Thrombose und
Phospholipidantikörpern
berichtet.
Die
häufigsten
venösen
thromboembolischen
Komplikationen sind die tiefe Beinvenenthrombose mit oder ohne Lungenembolie und die
häufigsten arteriellen Ereignisse cerebrale Ischämien (88). Schwangere mit einem
Lupusantikoagulans haben ein erhöhtes Risiko bezüglich eines Abortes oder intrauterinen
Fruchttodes, verursacht durch plazentare Thrombose oder Ischämie (87).
2.2.3.2. Diagnostik der Phospholipidantikörper
Diagnostisch hinweisend ist eine verlängerte PTT, nicht selten in Verbindung mit einer
leichten Thrombozytopenie. Der Nachweis von Lupusantikoagulanzien erfolgt mittels
Plasmaaustauschversuch, durch Bestimmung der Kaolin clotting time oder durch
Bestimmung der Russell Viper venom time (4). Beim Plasmaaustauschversuch werden
Patientenplasma und Normalplasma in verschiedenen Konzentrationen miteinander
vermischt und die PTT gemessen. Der Test ist positiv, wenn die Gerinnungszeit in der 1:1Mischung von Patientenplasma und Normalplasma um mindestens 5 sec verlängert ist. Die
Bestimmung der Kaolin clotting time ist der derzeit empfindlichste Test. Dazu wird das zu
untersuchende Plasma mit dem Oberflächenaktivator Kaolin inkubiert und dann
rekalzifiziert. Auch dieser Test gilt als positiv, wenn die gemessene Gerinnungszeit des
Mischplasmas um mindestens 5 sec verlängert ist.
Bei der zuletzt genannten Methode aktiviert ein Enzym, welches im Gift der Russell-Viper
enthalten ist, den Faktor X direkt in Anwesenheit von Phospholipiden. Da dabei Einflüsse
von möglichen Verminderungen der Vorphasen-Faktoren umgangen werden, kann mit
diesem Test differentialdiagnostisch zwischen Lupusantikoagulans und Faktor-VIIIInhibitor unterschieden werden. Die Auswahl geeigneter Testsysteme hängt davon ab, ob
Sensitivität oder Spezifität im Vordergrund stehen. Wird besonderes Augenmerk auf die
Sensitivität gelegt, empfiehlt sich die Anwendung der Kaolin clotting time. Wenn die
Spezifität wichtiger ist, sollte die Russell viper venom time bestimmt werden.
2.2.4. Erhöhte Faktor-VIII-Spiegel
2.2.4.1. Pathophysiologie und Klinik
Bezugnehmend auf die Leiden-Thrombophilie-Studie (93) stellen hohe Faktor-VIIIKonzentrationen einen wichtigen Risikofaktor für das Auftreten thromboembolischer
Erkrankungen dar. Nach Angaben von Siegemund et al. (81) sind hohe Faktor-VIII:CSpiegel (>150%) häufiger als alle bisher bekannten angeborenen und erworbenen
thrombogenen Risikofaktoren. Das relative Thromboserisiko steigt mit der Höhe der
gemessenen Aktivität und geht bei hohen Faktor-VIII-Aktivitäten (>150%) mit einem 4,8fach
gesteigerten
Thromboserisiko
einher
(93).
Damit
entspricht
das
relative
Thromboserisiko in etwa dem einer heterozygoten Faktor-V-Mutation (61). Aus
Veröffentlichungen (46, 62, 93) geht hervor, daß ca. 25% der Patienten mit einer tiefen
Beinvenenthrombose erhöhte Faktor-VIII-Spiegel aufweisen.
Im Gegensatz zur Faktor-V-Mutation kann die erhöhte Aktivität von Faktor VIII eine
vorübergehende, erworbene Störung darstellen. Sie tritt häufig im Zusammenhang mit
Akuten-Phase-Reaktionen auf und kann bei vielen Erkrankungen und in vielen Situationen
(Streß!) erhöht sein. Daher sind erhöhte Faktor-VIII-Spiegel postoperativ, nach
Polytraumen, im Rahmen von Lebererkrankungen (hier insbesondere bei der aktiven
aggressiven Hepatitis), bei Tumoren oder Gefäßerkrankungen und bei entzündlichen
Prozessen anzutreffen. In diesem Rahmen können sie eine Störung im Protein-C-System
vortäuschen.
Mehrere Untersuchungen belegen einen Zusammenhang zwischen erhöhten Faktor-VIIIAktivitäten
und
den
Blutgruppeneigenschaften,
wobei
in
Plasmen
mit
den
Blutgruppeneigenschaften A, B und AB höhere Faktor-VIII-Spiegel als in Plasmen mit der
Blutgruppeneigenschaft 0 gefunden wurden (58, 62, 65). Auch während der
Schwangerschaft und unter oraler Kontrazeption werden vermehrt erhöhte Faktor-VIIIKonzentrationen angetroffen (62). So ist zu bedenken, daß in bestimmten Situationen
selbst bei milder Hämophilie die Bestimmung des Faktor-VIII-Spiegels normal ausfallen
kann.
Andererseits wird von einer genetisch bedingten Ursache für eine Faktor-VIII-Erhöhung
ausgegangen, da nach einer Studie von O´ Donell und Mitarbeitern (62) nicht alle
Patienten mit einer objektiv nachgewiesenen Thrombose und erhöhten Faktor-VIIIKonzentrationen auch die dabei zu erwartende Erhöhung anderer Entzündungsparameter
aufwiesen.
Syntheseorte des Faktor VIII sind Nieren und Leber. Das Molekulargewicht beträgt
280000 D. Die normale Plasmakonzentration beträgt 0,15 mg/l, bzw. 50-150%. Im
Blutplasma ist Faktor VIII an sein Trägerprotein, den von-Willebrand-Faktor, gebunden.
Ohne Bindung an dieses Trägerprotein ist seine Halbwertszeit äußerst kurz, so daß einige
Autoren (62) einen möglichen Zusammenhang zwischen erhöhten Faktor-VIII-Spiegeln
und einen gesteigerten Nachweis des von-Willebrand-Faktors vermuten.
Faktor VIII wirkt in der plasmatischen Gerinnung als Cofaktor der Serinprotease Faktor
IXa, welche Faktor X aktiviert. Faktor VIII wird durch Thrombin aktiviert und durch
aktiviertes Protein C inaktiviert. Der aktivierte Faktor VIII beschleunigt die Aktivierung
von Faktor X durch Faktor IXa um ein Vielfaches. Eine mögliche Erklärung für das
gehäufte Auftreten venöser Thrombosen und hoher Faktor-VIII-Konzentrationen könnte
das mit erhöhten Faktor-VIII-Spiegeln einhergehende Ungleichgewicht zwischen
prokoagulatorischen und antikoagulatorischen Faktoren sein.
2.2.4.2. Labordiagnostik
Die Bestimmung des Faktor VIII erfolgt mit klassischen Gerinnungstestsystemen, die auf
der Messung der PTT basieren. Dazu wird nahezu Faktor-VIII-freies-Plasma, welches
durch Verdünnung aus Plasma von Patienten mit schwerer Hämophilie A gewonnen wird,
verwandt. Nach Zusatz der zu testenden Probe erfolgt die Bestimmung der PTT, wobei die
gemessene Gerinnungszeit allein von der Faktor-VIII-Konzentration der Probe abhängig
ist.
Die immunologische Methode basiert auf dem Nachweis des Faktor-VIII-Antigens. Eine
Bestimmung mit chromogenen Substrat ist ebenfalls möglich.
2.2.5. Faktor-V-Mutation
2.2.5.1. Pathophysiologie
Dahlbäck (21) beobachtete 1993, daß es im Plasma bestimmter Thrombosepatienten bei
Zusatz von aktiviertem Protein C nicht zu einer Verlängerung der Gerinnungszeit kam, wie
es im Plasma gesunder Personen der Fall ist. Er benannte dieses Phänomen „Resistenz
gegen aktiviertes Protein C“. Da dieser Mechanismus in 2 voneinander unabhängigen
Familien mit gehäuften thromboembolischen Ereignissen identifiziert wurde, ging er davon
aus, daß dieses Phänomen eine wichtige Ursache familiärer Thrombose ist.
Bertina et al. (5) und andere Arbeitsgruppen (38, 101) zeigten 1994, daß diesem Defekt
ursächlich eine Punktmutation im Faktor-V-Gen zugrunde liegt. Im Exon 10 in Position
1691 ist Guanin durch Adenosin ersetzt, was im Faktor-V-Protein zu einem Austausch in
der Aminosäureposition 506 von Arginin durch Glutamin führt. Nach dem Ort ihrer
Entdeckung wird die Mutation auch Faktor-V-Leiden genannt.
Durch diese Mutation wird die proteolytische Spaltung von Faktor V durch aktiviertes
Protein C erheblich verzögert. Die Spaltung erfolgt normalerweise an 3 Peptidbindungen,
und zwar an den Arginin-Bindungen 306, 506 und 679, wobei zunächst an Arg 506
gespalten wird und dadurch die anderen Spaltstellen für APC zugänglich werden. Bei
Vorliegen der Mutation läuft die Spaltung in Position 506 etwa zehnmal langsamer ab.
Daraus resultiert eine nicht ausreichende Inaktivierung von Faktor Va und somit eine
erhöhte Gerinnungsbereitschaft des Blutes, zumal die prokoagulatorische Funktion von
Faktor V hingegen nicht inhibiert wird. Kontrovers diskutiert wird die Frage, ob die
fehlende Spaltbarkeit des Faktor V die einzige Ursache der APC-Resistenz ist. Einige
Autoren (40) sehen das Vorhandensein dieser Mutation und die damit verbundene fehlende
Spaltbarkeit des Faktor V als einzige Ursache an. Andere Autoren (17, 23) gehen
zusätzlich von einer Cofaktorfunktion des nicht aktivierten Faktor V zur Inaktivierung von
Faktor Va und VIII a durch aktiviertes Protein C aus. Sie vertreten die Meinung, daß der
mutierte Faktor V auch dieser Funktion nicht mehr nachkommt.
Das mutierte Faktor-V-Allel ist nur in der kaukasischen Bevölkerung gefunden worden, in
der asiatischen Bevölkerung findet man es fast nicht, ebenso nicht bei afrikanischen,
amerikanischen und australischen Ureinwohnern (68, 85). Diese Tatsache dürfte unter
anderem ein Grund für die geringe Thromboseinzidenz in einigen Ländern sein.
Die hohe Prävalenz der Faktor-V-Mutation in der westlichen Welt resultiert aus einem
Foundereffekt. Es wird vermutet, daß die Häufigkeit der Mutation auf einen
Selektionsvorteil in der Evolution zurückzuführen sein könnte, weil die mit der Mutation
verbundene Hyperkoagulabilität ein Schutz vor Blutverlusten war. Das damit verbundene
gesteigerte
Thromboserisiko
kam
offenbar
weniger
zum
Tragen,
da
andere
thrombosebegünstigende Risikofaktoren wie Immobilisation, Operation und Einnahme
oraler Kontrazeptiva nicht zum Lebensstil der damaligen Zeit gehörten. Wie die „LeidenThrombophilie-Studie“ (93) zeigte, liegt die Häufigkeit der Faktor-V-Mutation in der
Gesamtbevölkerung Europas bei 5 %. In der westlichen Welt herrschen in der allgemeinen
Population beträchtliche Unterschiede. Eine hohe Prävalenz besteht in Südschweden,
Griechenland und Israel (bis zu 15%). Nach einer kürzlich veröffentlichten Studie (28)
kommt die Faktor-V-Mutation in Deutschland bei 7,5% der Normalbevölkerung vor. In
den Niederlanden, Großbritannien und den USA sind ca. 3-5% der Population Träger der
Mutation.
Die Prävalenz der Mutation bei Thrombosepatienten wird in der Literatur zwischen 17%
und 40% (47, 83, 90) angegeben, einige Autoren fanden sogar eine Prävalenz bis 60%
(72). In Deutschland wurde durch entsprechende Untersuchungen (28) bei 27,2% der
untersuchten Thrombosepatienten die Mutation nachgewiesen.
2.2.5.2. Klinik der Faktor-V-Mutation
Die Mutation wird autosomal dominant vererbt, so daß auch heterozygote Defektträger
symptomatisch werden können. Verschiedene Studien (18, 74) zeigten, daß heterozygote
Merkmalsträger ein 6-8fach höheres Thromboserisiko gegenüber Normalpersonen und
homozygote sogar ein 30-140fach gesteigertes Thromboserisiko haben. Auch manifestiert
sich die Thrombose bereits im jüngeren Lebensalter. So fanden Rosendaal und Mitarbeiter
(73) ein mittleres Manifestationsalter für homozygote Träger von 31 Jahren und für
heterozygote Merkmalsträger von 44 Jahren.
Die
häufigsten
klinischen
Manifestationen
sind
oberflächliche
oder
tiefe
Beinvenenthrombosen mit oder ohne Lungenembolie, aber auch Thrombosen an eher
ungewöhnlichen Manifestationsorten (cerebral, mesenterial und retinal) sind beschrieben
worden (78). Über einen Zusammenhang zwischen der Faktor-V-Mutation und arteriellen
Verschlüssen ist bei jungen Patienten mit transitorisch ischämischen Attacken berichtet
worden (24). Auch zeigten Sampran et al. (79) ein erhöhtes Vorkommen der APCResistenz
bei
Patienten
mit
objektiv
nachgewiesener
peripherer
arterieller
Verschlußkrankheit auf. Ein signifikant höheres Vorkommen der Mutation ist bei
männlichen Patienten mit koronarer Herzkrankheit ebenso nachgewiesen worden, jedoch
wurde kein gehäuftes Auftreten akuter Myokardinfarkte bei Trägern der Mutation
gefunden (57).
Nach Untersuchungen von Martinelli et al. (56) ist das Thromboserisiko geringer als bei
Defekten von Protein C, Protein S oder AT III. Außerdem wurden weniger
schwerwiegende thromboembolische Ereignisse beobachtet. Thrombosen treten in ca. 60%
der Fälle spontan auf. In ca. 40 % der Fälle entwickeln sie sich in Zusammenhang mit
exogenen Faktoren wie Operation, Immobilisation, Schwangerschaft und Geburt, oder
unter Einnahme oraler Kontrazeptiva (99). Eine Untersuchung von Conrad (15) an 51
Frauen mit nachgewiesener Faktor-V-Mutation zeigte, daß bei 79% die Thrombosen im
Zusammenhang mit Schwangerschaft oder Einnahme oraler Kontrazeptiva und nur bei 9%
der untersuchten Frauen spontane Thrombosen auftraten. Lindqvist et al. (52) publizierten,
daß Frauen, die Trägerinnen der Faktor-V-Mutation sind, während der Schwangerschaft
ein 8-fach gesteigertes Risiko haben, an einer venösen Thromboembolie zu erkranken. Bei
Frauen mit bestehender Faktor-V-Mutation und Einnahme oraler Kontrazeptiva liegt die
Inzidenz von Thromboembolien bei 28,5% gegenüber 3,0% bei Frauen ohne Mutation und
nur alleiniger Einnahme hormoneller Kontrazeptiva (92). Auch beschrieben Faioni et al.
(31) die Ausbildung einer APC-Resistenz bei 60% gesunder Frauen im letzten Trimenon
der Schwangerschaft, welche postpartal wieder verschwand.
Das Thromboserisiko ist lebenslang erhöht und steigt mit zunehmendem Alter (19). Nach
einer Untersuchung von de Stefano et al. (25) ist das Risiko rezidivierender tiefer
Beinvenenthrombosen bei heterozygoten Trägern der Faktor-V-Mutation insbesondere bei
gleichzeitig vorliegender Mutation im Prothrombin-Gen erhöht.
Durch die Entdeckung der Mutation sind identifizierbare Gründe familiärer Thrombophilie
von 5-10 % auf 60-70% angewachsen (76).
2.2.5.3. Labordiagnostik
Der Nachweis einer Faktor-V-Mutation kann durch einen funktionellen Test im Plasma
(Phänotyp) oder durch direkten Nachweis der Mutation im Faktor-V-Gen durch
molekularbiologische Methoden (Genotyp) erfolgen.
Nach einer Studie von Wankmüller und Mitarbeitern (97) wiesen 81% der untersuchten
Patienten mit APC-Resistenz die Faktor-V-Mutation auf, nach Untersuchungen von
Bertina und Mitarbeitern (6) war der Phänotyp „ APC–Resistenz“ in über 90% mit dem
Genotyp Faktor-V-Leiden identisch. Somit wird unterstrichen, daß diese Punktmutation
die wichtigste Ursache für die Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C darstellt. Neben
den bereits genannten anderen möglichen Ursachen einer APC-Resistenz sind auch andere
Defekte im Faktor-V-oder Faktor-VIII-Protein theoretisch denkbar.
Der funktionelle Test basiert auf der von Dahlbäck und Mitarbeitern in den ersten Studien
verwendeten Methodik (21). Er beruht auf einer Messung der APTT ohne und mit Zusatz
von APC. Nach Zugabe von APC ist normalerweise mit einer Verlängerung der APTT zu
rechnen. Die beiden gemessenen Gerinnungszeiten werden zueinander ins Verhältnis
gesetzt. Der dabei erhaltene Quotient wird als Ratio bezeichnet. Erfahrungsgemäß wird
eine dabei erhaltene Ratio >2 meistens bei Gesunden angetroffen. Eine Ratio zwischen 1,3
und 2 trifft man bei heterozygoten, und eine Ratio <1,3 bei homozygoten Defektträgern an.
Da durch Studien bekannt ist, daß eine APC-Resistenz nicht immer auf die Faktor-VMutation zurückzuführen ist, ist eine ausbleibende Verlängerung der Gerinnungszeit nicht
immer hinweisend auf eine Faktor-V-Mutation (6, 97). Daher wird für eine spezifischere
funktionelle Bestimmung von Faktor-V-Leiden empfohlen, die zu untersuchende Probe vor
Einsatz in diesem Testverfahren mit Faktor-V-Mangelplasma in den Verhältnissen 1:3 oder
1:4 zu mischen (50, 91). Dadurch wird gewährleistet, daß das erhaltene Ergebnis allein von
der in der zu untersuchenden Probe vorhandenen funktionell aktiven Faktor-VKonzentration abhängig ist.
Heparin in Plasmaproben führt zu einer Verlängerung der Gerinnungszeit sowohl in Anals auch in Abwesenheit von APC. Daher empfiehlt es sich, die Plasmaproben vor
Testbeginn mit einem Heparinneutralisator zu behandeln oder Testsysteme zu gebrauchen,
die einen Heparinantagonisten enthalten.
Die Durchführung einer DNA-Analyse ist erforderlich, um sicher zwischen heterozygoten
und homozygoten Defekten zu unterscheiden. Außerdem sollte eine genomische
Diagnostik zum Ausschluß der Leiden-Mutation insbesondere bei grenzwertigen
Ergebnissen durchgeführt werden. Zum Nachweis des Genotyps findet am häufigsten die
von
Bertina
(5)
angegebene
Methode
Verwendung.
Mit
Hilfe
der
Polymerasekettenreaktion wird ein 267 Basenpaare großes Fragment von Exon 10 des
Faktor-V-Gens amplifiziert. In diesem Fragment ist die Mutation der Faktor-V-LeidenVariante lokalisiert. Bei vorhandener Mutation geht eine der Schnittstellen für das
Restriktionsenzym Mnl 1 verloren. Nachfolgend weist die veränderte Auftrennung der
Spaltprodukte mittels Elektrophorese die vorliegende Mutation nach.
3. Eigene Untersuchungen
3.1. Material und Methoden
3.1.1. ProC® Global-Test
3.1.1.1. Auswahl der Proben und Probeentnahmen
Als Untersuchungsmaterial für den 1. Teil der vorliegenden Arbeit diente Plasma von 285
Patienten mit objektiv gesicherten thromboembolischen Ereignissen. Die Patienten wurden
stationär in der Inneren Klinik, in der Klinik für Neurologie, in der Klinik für Gynäkologie
und Geburtshilfe, in der Orthopädischen und in der Chirurgischen Klinik des Klinikums
Erfurt
behandelt.
Patienten
unter
oraler
Antikoagulation
oder
mit
schweren
Leberfunktionsstörungen wurden ausgeschlossen. Die Plasmaproben wurden im Zeitraum
von 1993 bis 1998 gewonnen.
Die zum Vergleich zweier funktioneller Testsysteme herangezogenen Plasmen stammen
von Patienten, welche von Mai bis August des Jahres 1998 im Klinikum Erfurt/Innere
Abteilung stationär unter dem Verdacht einer Thromboembolie aufgenommen wurden.
Das Blut wurde nach einer Stauung von etwa 30 Sekunden aus einer Armvene entnommen.
Zur
Blutentnahme
wurden
Sarstedt–Monovetten
verwendet,
bei
denen
ein
Mischungsverhältnis Natriumzitrat zu Blut von 1:9 eingehalten wurde. Das Zitratblut
wurde 20 Minuten in einer Kühlzentrifuge bei 5000 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert. Anschließend wurden die Plasmaproben in Plasteröhrchen pipettiert und bei
–70°C eingefroren. Die Untersuchungen zu ProC® Global wurden im August und Oktober
des Jahres 1998 durchgeführt.
Um Aktivitätsverluste von labilen Gerinnungsfaktoren bzw. die Bildung von
Kryopräzipitaten zu vermeiden, wurden die Plasmaproben vor jeder Messung im
Wasserbad bei +37°C innerhalb von 10 Minuten aufgetaut. Danach waren sie bei
Zimmertemperatur ca. 2 Stunden haltbar.
3.1.1.2. Testprinzip
Wird eine Plasmaprobe vor der APTT-Messung mit einer standardisierten Menge APC
über einen definierten Zeitraum inkubiert, kommt es normalerweise zum proteolytischen
Abbau der Faktoren Va und VIIIa. Somit wird die Thrombinbildung verlangsamt und die
Zeit bis zur Fibrinbildung verlängert, woraus eine Verlängerung der Gerinnungszeit
resultiert.
Bei anderen funktionellen Testsystemen zum Nachweis einer APC-Resistenz wurde die
Gerinnungskaskade durch direkten Zusatz von APC gestartet. Im Gegensatz dazu wird
beim ProC® Global-Test das zu untersuchende Plasma mit einem Protein-C-Aktivator
(Bestandteil des Giftes von Agkistrodon contortrix) versetzt. Unter Zugabe von
Calciumionen wird das in der Plasmaprobe enthaltene Protein C aktiviert und die
intrinsische Gerinnungskaskade gestartet. Durch die Zugabe des Protein-C-Aktivators ist
die nachfolgend gemessene Gerinnungszeit allein von der Kapazität des Protein-C-Systems
der zu untersuchenden Probe abhängig. Das aktivierte Protein C inaktiviert, im
Zusammenspiel mit dem in freier Form vorkommenden Protein S, die Cofaktoren Va und
VIIIa. Dadurch wird die Zeit bis zur Gerinnselbildung verlängert, wobei in Plasmen mit
verringerter Wirkung des Protein-C-Systems die Gerinnungszeit weniger stark verlängert
ist. Die so bestimmte Zeit wird als PCAT (Protein C Activity dependent Clotting Time)
bezeichnet. Vor Zugabe von APC wird die Ausgangs-APTT der Plasmaprobe (PCAT/0)
bestimmt. Aus der nach und vor Zugabe von APC gemessenen Gerinnungszeit wird
anschließend ein Quotient gebildet, welcher als Ratio bezeichnet wird.
Da die Ergebnisse zwischen unterschiedlichen Laboratorien aufgrund verschiedener Geräte
schwanken können, wird die Berechnung der normierten Ratio (NR) empfohlen. Dazu
wird das Testergebnis auf ein Standard-Human-Plasma (SHP) bezogen, indem der
Quotient aus PCAT und PCAT/0 mit einem Kalibrationsfaktor (KF) multipliziert wird. Der
Kalibrationsfaktor wird bestimmt, indem für das verwendete SHP ebenso der Quotient aus
der Gerinnungszeit nach und vor Zugabe des Protein-C-Aktivators gebildet wird. Durch
Division des Sensitivitätswertes (SW) für SHP (wird vom Hersteller angegeben) durch die
Ratio von SHP entsteht der Kalibrationsfaktor. Der Kalibrationsfaktor muß monatlich für
jedes Gerät und jede Reagenzcharge neu ermittelt werden.
NR= (PCAT: PCAT/0)Probe x KF
KF= SW/ (PCAT: PCAT/0)SHP
3.1.1.3. Reagenzien und Testgerät
Die gebrauchsfertigen Lösungen wurden von der Firma Behring Diagnostics GmbH
geliefert.
ProC® Global-Test-Kit der Firma Behring Diagnostics GmbH (67) bestehend aus:
APTT-Reagenz für ProC Global, flüssig:
Siliciumdioxid–Partikel, pflanzliche
Phospholipide, Natriumchlorid (2,4 g/l) und HEPES (14,3 g/l), pH 7,6
Konservierungsmittel: Natriumazid (< 1 g/l)
Der Inhalt ist nach kurzem Aufschütteln gebrauchsfertig und wird bei Raumtemperatur
eingesetzt.
Aktivator–Reagenz für ProC Global, lyophilisiert: Extrakt aus dem Gift von
Agkistrodon contortrix, HEPES (50 mmol/l), Heparinneutralisator Hexadimethrinbromid
(15 mg/l), pH 7,4
Konservierungsmittel: 5–Chlor–2–methyl–4–isothiazol–3-on (7,5 mg/l)
2–Methyl–4–isothiazol–3–on (2,5 mg/l)
Das Reagenz wird in 5 ml destilliertem Wasser gelöst und mindestens 5 Minuten bei
+15°C bis +25°C unter gelegentlichen Schwenken inkubiert.
Puffer für ProC
Global,
flüssig:
HEPES
(50 mmol/l), Heparinneutralisator
Hexadimethrinbromid (15 mg/l), pH 7,4
Konservierungsmittel: 5 Chlor–2-methyl–4–isothiazol–3–on (7,5 mg/l)
2–Methyl–4–isothiazol-3–on (2,5 mg/l)
Nachdem die Pufferlösung auf +15°C bis +25°C erwärmt ist, ist sie gebrauchsfertig.
Zusätzlich benötigte Materialien:
Calciumchlorid–Lösung 0,025 mol/l
Standard-Human-Plasma
Kontroll-Plasma N
ProC Kontroll-Plasma
Die Calciumchlorid–Lösung ist vor ihrem Einsatz auf +37°C zu erwärmen. Die anderen
zusätzlich benötigten Materialien sollen vor Gebrauch auf Zimmertemperatur erwärmt
werden.
Die Untersuchungen wurden an dem Gerinnungsautomaten Electra 1400 durchgeführt.
3.1.1.4. Präzisionskontrolle
Zur Präzisionskontrolle für ProC® Global dienen Kontroll–Plasma N und ProC KontrollPlasma (67).
Vor jeder Meßserie wurde eine Präzisionskontrolle durchgeführt. Die erhaltenen
Analysenwerte lagen innerhalb der angegebenen Sollwert-Bereiche.
3.1.1.5. Durchführung
Die Teströhrchen mit den zu untersuchenden Plasmaproben wurden vor Testbeginn im
Wasserbad innerhalb von 10 Minuten auf +37°C temperiert.
Nach abgeschlossener Qualitätskontrolle und Bestimmung des KF wurden die
Gerinnungszeiten PCAT/0 und PCAT unter Zugabe der Pufferlösung und danach unter
Zugabe des Aktivator–Reagenz nach folgendem Pipettierschema photometrisch gemessen.
Pipettierschema:
ProC Global
PCAT
Citratplasma
100 l
Aktivator-Reagenz für ProC Global
100 l
100 l
100 l
Puffer für ProC Global
APTT-Reagenz für ProC Global
PCAT/0
100 l
100 l
100 l
100 l
3 Minuten bei 37°C inkubieren
Calciumchlorid-Lösung ( +37°C )
Nach der vorgegebenen Inkubationszeit wird durch Zugabe von
Calciumchlorid-Lösung die Messung gestartet und die Gerinnungszeit
photometrisch gemessen.
3.1.1.6. Testauswertung
Als Entscheidungsgrenze für das Vorliegen einer Störung im Protein-C-System wurde für
ProC® Global eine normierte Ratio von 0,8 ermittelt (23). Bei Werten <0,8 ist eine weitere
Abklärung des pathologischen Testergebnisses durch Einzelteste bzw. Gentechnik
erforderlich.
3.1.2. COATEST® APCTM Resistance
3.1.2.1. Auswahl der Proben und Probeentnahmen
Die zum Vergleich eines anderen funktionellen Testsystems mit ProC® Global
verwendeten Ergebnisse wurden mit dem Testsystem COATEST® APCTM Resistance von
Chromogenix bestimmt. Die Plasmaproben für diesen Vergleich wurden von Patienten, die
sich von Mai bis August des Jahres 1998 im Klinikum Erfurt/Innere Abteilung wegen
objektivierter Thromboembolie in stationärer Behandlung befanden, entnommen.
Mit diesem Testsystem wurden ebenso die für die Prävalenzstudie herangezogenen
Ergebnisse bestimmt. Bei diesen ausgewählten Patienten erfolgte während eines
stationären Aufenthaltes im Jahre 1996 im Klinikum Erfurt/Innere Abteilung eine
entsprechende Thrombophiliediagnostik bei Verdacht auf ein thromboembolisches
Geschehen.
Für beide Untersuchungsserien wurde jeweils frisch gewonnenes Citratplasma verwendet.
Das Blut wurde durch Punktion einer Armvene nach ca. 30 Sekunden Stauung entnommen.
Auch hier dienten Sarstedt-Monovetten mit einem Mischungsverhältnis 1:9 Natriumzitrat
zu Blut als Entnahmeröhrchen. Zur Plasmagewinnung wurde das Zitratblut nachfolgend 20
Minuten in einer Kühlzentrifuge bei 5000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.
3.1.2.2. Testprinzip
Das zu untersuchende Plasma wird über eine standardisierte Zeit mit dem APTT-Reagenz
inkubiert (12). Durch Hinzufügen von CaCl2, einmal mit und einmal ohne humanes APC,
wird die Koagulation ausgelöst und die Zeit bis zur Gerinnselbildung gemessen.
Bei dieser Untersuchungsmethode ist für die zuverlässige Messung eine wichtige
Voraussetzung, daß der APTT-Wert innerhalb des Normalbereiches liegt. Deshalb ist für
heparinisierte Proben, bei Erhöhung der APTT durch Faktorenmangel des endogenen
Systems oder bei Vorhandensein von Antiphospholipid-Antikörpern keine zuverlässige
Aussage möglich. Auch sollte eine bestehende Therapie mit Vitamin-K-Antagonisten vor
geplanter Testung für ca. eine Woche bis zum Erreichen des normalen Quick-Wertes
unterbrochen werden.
3.1.2.3. Reagenzien und Testgerät
Die Bestimmung der APC Ratio erfolgte am Gerinnungsautomaten ELECTRA 1600.
COATEST® APCTM Resistance-Kit der Firma Chromogenix bestehend aus:
CaCl2
1 Flasche
8 ml Calciumchlorid, 0,025 mol/l in Trispuffer mit 0,5% Rinderserumalbumin.
APTT Reagenz
1 Flasche
16 ml gereinigte Phospholipide mit kolloidalem Silika als Kontaktaktivator. Enthält ein
Konservierungsmittel. Vor Verwendung vorsichtig auf einem Vortex Mischer mischen.
APTT/ CaCl2
4 Flaschen
Humanes APC, lyophilisiert in Kombination mit CaCl2. Auflösen mit 2,0 ml Wasser
NCCLS Typ II13. 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und vor Verwendung
vorsichtig mischen.
Zusätzlich benötigte Materialien:
Kontrollplasmen Level 1 und 2
Wasser NCCLS Typ II13
3.1.2.4. Präzisionskontrolle
Zur Qualitätskontrolle werden Kontrollplasmen Level 1 und 2 verwendet. Level 1 zeigt
eine normale Reaktion auf APC, Level 2 eine anormale Reaktion. Bei jeder Charge wird
der Bereich der zu erwartenden APC Ratios angegeben.
3.1.2.5. Durchführung
Alle Reagenzien wurden vor Verwendung auf Raumtemperatur gebracht. Nachfolgend
wurde eine entsprechende Menge CaCl2 und APC/CaCl2 auf 37°C erwärmt. Im nächsten
Schritt wurde ein Teil Plasma und das gleiche Volumen APTT-Reagenz bei 37°C über 5
Minuten inkubiert. In einem ersten Ansatz wurde die Zeit bis zur Gerinnselbildung nach
Zugabe von CaCl2 gemessen. Dem zweiten Ansatz wurde anstelle von CaCl2 APC/CaCl2
hinzugegeben und abermals die Zeit bis zur Fibrinbildung gemessen.
3.1.2.6. Testauswertung
Das Ergebnis wird als APC Ratio angegeben.
Die Berechnung der APC Ratio erfolgt nach folgender Formel:
APC Ratio =Gerinnungszeit APC/CaCl2 / Gerinnungszeit CaCl2
Für das verwendete Gerät wurde ein Normalbereich >2,2 bestimmt, Meßergebnisse mit
einer Ratio zwischen 2,0 bis 2,2 werden als kontrollbedürftig, Ergebnisse mit einer Ratio
<2 werden als pathologisch angesehen.
3.2. Ergebnisse
3.2.1. Übersicht über die Untersuchungsergebnisse zum Testsystem ProC® Global
Es
wurden
285
Plasmaproben
von
Patienten
mit
objektiv
nachgewiesenen
thromboembolischen Ereignissen sowohl genotypisch als auch phänotypisch auf das
Vorliegen der Faktor-V-Mutation untersucht. Darunter waren 189 Frauen und 96 Männer
(66% Frauen und 34% Männer). Die häufigste thromboembolische Manifestationsart war
mit 76% die tiefe Beinvenenthrombose mit oder ohne Lungenembolie. Seltene
thromboembolische
Komplikationen
wie
Sinusvenenthrombose
und
Mesenterialvenenthrombose wurden nur bei jeweils 2 Patienten objektiviert. Einen
ausführlichen Überblick über die Manifestationsarten verleiht Tabelle 1.
Bei 98 dieser Patienten wurde mittels Genanalyse die Faktor-V-Mutation aufgedeckt.
Darunter befanden sich 7 Patienten mit homozygoter Faktor-V-Mutation.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß 34,4% aller getesteten 285 Patienten die FaktorV-Leiden-Mutation aufweisen.
Die Bestimmung mittels ProC® Global zeigte bei insgesamt 222 Proben einen
pathologischen Wert, wobei bei 127 Proben ein positives Ergebnis ermittelt wurde, ohne
daß genomisch die Faktor-V-Mutation nachweisbar war (siehe Tabelle 2). Diese hohe
Anzahl positiver ProC® Global-Werte ist nicht ganz unerwartet, da zum einen mit diesem
Gerinnungstest auch andere Störungen im Protein-C-System erfaßt werden. Zum anderen
wird von einem Screeningtest erwartet, daß mehr positive Ergebnisse bestimmt werden, als
schließlich mit speziellen Tests bestätigt werden.
Bei 60 der auf das Vorliegen einer Faktor-V-Mutation untersuchten Proben wurde sowohl
genotypisch ein normales Gen, als auch phänotypisch ein normaler ProC® Global-Wert
diagnostiziert.
Hinsichtlich der mittleren ProC® Global-Werte sind unter den positiven Ergebnissen
Unterschiede bezüglich des genotypischen Nachweises einer homozygoten, einer
heterozygoten oder eines fehlenden Mutationsnachweises erkennbar. Die Tabelle 3 zeigt
eine Gegenüberstellung der mittleren pathologischen ProC® Global-Werte in Abhängigkeit
vom genomisch erhobenen Befund.
Tab. 1: Manifestationsarten thromboembolischer Ereignisse der untersuchten
Patienten
Thromboembolische Manifestationsarten
Beinvenenthrombose
Patientenanzahl
177 (62,1%)
Beinvenenthrombose mit Lungenembolie
39 (13,7%)
Lungenembolie
20 (7,0%)
Armvenenthrombose
12 (4,2%)
Thrombophlebitis
10 (3,5%)
Apoplex
9 (3,2%)
Arterielle Thrombose
5 (1,8%)
Transistorisch ischämische Attacke
4 (1,4%)
Akuter Myokardinfarkt
3 (1,1%)
Fehlgeburten
2 (0,7%)
Mesenterialvenenthrombose
2 (0,7%)
Sinusvenenthrombose
2 (0,7%)
Tab. 2: Gegenüberstellung der positiven genotypischen Testergebnisse und der
pathologischen ProC® Global-Werte
Anzahl
der
genomisch
Proben
mit Anzahl
der
Proben
mit
®
nachgewiesener positiven ProC Global-Werten
Faktor-V-Mutation
(NR < 0,8)
n=98
n=222
Tab. 3: Gegenüberstellung der mittleren pathologischen ProC® Global-Werte in
Abhängigkeit zur molekularbiologischen Analyse
Plasmen
mit Plasmen
mit Plasmen ohne
homozygoter
heterozygoter
MutationsnachMutation (n=7) Mutation (n=88) weis (n=127)
0,31
0,47
0,63
Mittlerer
ProC®
Global-Wert (NR)
3.2.1.1. ProC® Global-Werte von Patienten mit genomisch nachgewiesener
heterozygoter Faktor-V-Mutation
Bei 91 der untersuchten Plasmen wurde mittels Genanalyse eine heterozygote Faktor-VMutation nachgewiesen. Darunter befanden sich 58 Frauen und 33 Männer. Die ProC®
Global-Testergebnisse zeigten bei 88 dieser Plasmen einen erniedrigten Wert. Nur 3 der
untersuchten Proben wiesen normale ProC® Global-Werte auf (siehe Tabelle 6). Somit läßt
sich für das Testsystem eine Sensitivität von 96,7% zur Erfassung heterozygoter Defekte
berechnen.
Die mittlere NR der Proben mit heterozygoter Mutation betrug 0,47.
Hinsichtlich des Geschlechts wiesen die mittleren ProC® Global-Ergebnisse nur
unwesentliche Abweichungen auf.
Für die Patienten mit nachgewiesener heterozygoter Faktor-V-Mutation wurde ein
mittleres Manifestationsalter für thromboembolische Ereignisse von 45,3 Jahren berechnet.
Bezüglich des mittleren Manifestationsalters zeigt sich ein geschlechtsspezifischer
Unterschied. So wurde für die untersuchten Frauen ein mittleres Manifestationsalter von 41
Jahren bestimmt. Für die untersuchten Männer liegt das mittlere Manifestationsalter etwas
höher, nämlich bei 53 Lebensjahren (siehe Tabelle 4).
Die häufigste thromboembolische Manifestationsart war die tiefe Beinvenenthrombose,
welche bei 79 Patienten (86,8%) objektiviert wurde. In 15 Fällen trat die
Beinvenenthrombose kombiniert mit einer Lungenembolie auf. Das alleinige Auftreten
einer Lungenembolie ohne Nachweis einer Beinvenenthrombose wurde bei 9 Patienten
diagnostiziert. Einen genauen Überblick über die objektivierten Thromboemboliearten
liefert Tabelle 5.
Tab. 4: Mittleres Manifestationsalter der Patienten mit heterozygoter Faktor-VMutation in Abhängigkeit vom Geschlecht
Gesamtzahl
der Frauen
mit Männer
mit
Patienten
mit heterozygoter
heterozygoter
heterozygoter
Mutation (n=58) Mutation (n=33)
Mutation (n=91)
Mittleres
Manifestationsalter
(in Lebensjahren)
45,3
41
53
Tab. 5: Thrombosearten der Patienten mit genomisch nachgewiesener
heterozygoter Faktor-V-Mutation
Thromboembolische Manifestationsarten
Patientenanzahl
Beinvenenthrombose
63 (69,2%)
Beinvenenthrombose mit Lungenembolie
14 (15,4%)
Lungenembolie
8 (8,8%)
Thrombophlebitis
2 (2,2%)
Armvenenthrombose
1 (1,1%)
Apoplex
1 (1,1%)
Arterielle Thrombose
1 (1,1%)
Fehlgeburt
1 (1,1%)
Tab. 6: Gegenüberstellung der falsch negativen und richtig positiven ProC®
Global-Werte von Patienten mit nachgewiesener heterozygoter Mutation
Anzahl der
Ergebnisse
falsch
negativen Anzahl der
Ergebnisse
n=3
richtig
positiven
n=88
Tab. 7: ProC® Global-Werte der 3 falsch negativen Plasmen
Plasma 1
ProC®
GlobalWert (NR)
Plasma 2
Plasma 3
0,88
1.05
0.8
3.2.1.2. ProC® Global-Werte von Patienten mit genomisch nachgewiesener
homozygoter Faktor-V-Mutation
Bei 7 Patienten wurde mittels Genanalyse eine homozygote Faktor-V-Mutation
nachgewiesen. Die von diesen Patienten untersuchten Plasmen wiesen alle einen
pathologischen ProC® Global-Wert auf, so daß die Sensitivität des Testsystems zum
Nachweis homozygoter Defekte 100% erreicht. Die mittlere NR beträgt 0,31 und liegt
somit deutlich unter der mittleren NR der Patienten mit nachgewiesener heterozygoter
Mutation. Auch liegt das mittlere Manifestationsalter mit 32,9 Jahren deutlich unter dem
mittleren Manifestationsalter der Patienten mit heterozygoter Faktor-V-Leiden-Mutation
(siehe Tabelle 8).
Die klinische Manifestation war bei allen 7 Patienten die tiefe Beinvenenthrombose, davon
zweimal in Kombination mit einer Lungenembolie. Von den Patienten mit homozygoter
Mutation waren 5 Patienten weiblichen und 2 Patienten männlichen Geschlechts.
Tab. 8: Vergleich des mittleren Manifestationsalters und der mittleren Testergebnisse zwischen Patienten mit genomisch nachgewiesener
homozygoter und heterozygoter Faktor-V-Mutation
Homozygote
Merkmalsträger (n=7)
32,9
Mittleres Manifestationsalter in Jahren
0,31
Mittlerer ProC® GlobalWert (Angabe in NR)
Heterozygote
Merkmalsträger (n=91)
45,3
0,47
3.2.1.3. Verhalten der ProC® Global-Werte von Patienten ohne genomisch
nachgewiesene Faktor-V-Mutation
Insgesamt konnte bei 187 der untersuchten Plasmen eine Mutation im Faktor-V-Gen
mittels Polymerasekettenreaktion ausgeschlossen werden. Von diesen 187 Plasmen wurde
jedoch bei 127 ein pathologischer ProC® Global-Wert bestimmt. Nur bei 60 Patienten
wurde eine Übereinstimmung zwischen normalem Testergebnis und fehlendem
genomischen Mutationsnachweis beobachtet.
Pathologische ProC® Global-Werte von Patienten ohne nachgewiesene Faktor-VMutation (falsch positive Werte)
Bei 127 der untersuchten Plasmen wurden pathologische ProC® Global-Werte bestimmt,
ohne daß eine Mutation im Faktor-V-Gen nachgewiesen wurde. Unter diesen Patienten
befanden sich 87 Frauen (69%) und 40 Männer (31%). Die mittlere NR betrug bei beiden
Geschlechtern 0,63. In Abbildung 1 ist die Häufigkeitsverteilung der gemessenen ProC®
Global-Werte der Plasmen ohne genomisch nachgewiesene Faktor-V-Mutation aufgeführt.
Abb. 1: Häufigkeitsverteilung der pathologischen ProC® Global- Werte
Häufigkeitsverteilung
45
Häufigkeit
40
35
30
25
20
15
10
5
0
<
0,393
0,3931
0,4751
0,4752
0,5572
0,5573
0,6393
0,6394
0,7214
0,7215
0,8035
0,8036
0,8856
0,8857
0,9677
0,9678
1,0498
1,0499
1,1319
1,132
1,214
1,2141
1,2961
1,2962
>
Klassen
Auch hinsichtlich des klinischen Manifestationsalters thromboembolischer Ereignisse gab
es keine Unterschiede zwischen Männern und Frauen, es lag bei 47,6 Jahren. Die häufigste
klinische Manifestation war auch hier die tiefe Beinvenenthrombose mit oder ohne
Lungenembolie (siehe Tabelle 9).
Tab. 9: Thrombosearten der Patienten mit pathologischen ProC®Global-Werten
ohne nachgewiesene Faktor-V-Mutation
Thromboembolische Manifestationsarten
Patientenanzahl
Beinvenenthrombose
74 (58,3%)
Beinvenenthrombose mit Lungenembolie
18 (14,2%)
Lungenembolie
10 (7,9%)
Armvenenthrombose
9 (7,1%)
Thrombophlebitis
6 (4,7%)
Apoplex
2 (1,6%)
Arterielle Thrombose
2 (1,6%)
Transistorisch ischämische Attacke
2 (1,6%)
Akuter Myokardinfarkt
1 (0,8%)
Fehlgeburt
1 (0,8%)
Mesenterialvenenthrombose
1 (0,8%)
Sinusvenenthrombose
1 (0,8%)
Normale ProC® Global-Werte mit genomisch ausgeschlossener Mutation im
Faktor-V-Gen (richtig negative Ergebnisse)
Unter den 60 Patienten, bei denen mittels Gentechnik eine Faktor-V-Mutation
ausgeschlossen werden konnte und normale ProC® Global-Werte gemessen wurden,
befanden sich 40 Frauen (66,7%) und 20 Männer (33,3%).
Das mittlere Manifestationsalter dieser Patienten betrug 48 Jahre, wobei diesbezüglich kein
wesentlicher geschlechtsspezifischer Unterschied erkennbar war. Bei den untersuchten
Frauen lag es bei 47,4 Jahren und bei den Männern bei 49,2 Jahren.
Die mittlere gemessene NR betrug sowohl bei den Frauen als auch bei den Männern 0,96.
Bemerkenswert ist, daß die mittlere NR der als falsch positiv bezeichneten Ergebnisse
deutlich niedriger ist (siehe Tabelle 11).
Eine Auflistung der thromboembolischen Manifestationsarten ist in Tabelle 10 gegeben.
Tab. 10: Thrombosearten der Patienten ohne genomisch nachgwiesene
Faktor-V-Mutation und normalen ProC® Global-Wert
Thromboembolische Manifestationsarten
Beinvenenthrombose
Apoplex
Patientenanzahl
35 (58,3%)
6 (10%)
Beinvenenthrombose mit Lungenembolie
5 (8,3%)
Akuter Myokardinfarkt
2 (3,3%)
Arterielle Thrombose
2 (3,3%)
Armvenenthrombose
2 (3,3%)
Lungenembolie
2 (3,3%9
Thrombophlebitis
2 (3,3%)
Transistorisch ischämische Attacke
2 (3,3%)
Mesenterialvenenthrombose
1 (1,7%)
Sinusvenenthrombose
1 (1,7%)
Tab. 11: Gegenüberstellung der mittleren Testergebnisse der als falsch positiv und
der als richtig negativ bezeichneten Ergebnisse
Falsch positive Test- Richtig negative Testergebnisse (n=127) ergebnisse (n=60)
Mittleres
Testergebnis
(Angabe in NR)
0,63
0,96
3.2.2. Vergleich zweier funktioneller Testsysteme zur Erfassung der APCResistenz gleicher Plasmaproben
Vergleich zwischen ProC® Global und COATEST® APCTM Resistance
Ein weiterer Abschnitt der vorliegenden Arbeit soll darlegen, inwieweit ProC® Global das
Vorliegen einer APC-Resistenz im Vergleich zu einem anderen funktionellen Testsystem
erfaßt. Dazu wurden gleiche Plasmaproben sowohl mit ProC® Global als auch mit dem
Testsystem COATEST® APCTM Resistance untersucht und die Ergebnisse miteinander
verglichen.
Die getesteten Plasmen stammten von 26 Männern (42%) und 36 Frauen (58%), bei denen
eine Thromboembolie objektiviert wurde. Auch hier war die häufigste Manifestationsart
die tiefe Beinvenenthrombose mit und ohne pulmonale Embolie (siehe Tabelle 12).
Die Bestimmung der APC-Resistenz mit dem Testsystem COATEST® APCTM Resistance
erfolgte mit frischem Plasma. Demgegenüber waren die Plasmen vor Bestimmung der
APC-Resistenz mittels ProC® Global ca. 2-6 Monate eingefroren (siehe Kapitel 3.1.1.1.).
Eine Übereinstimmung der Ergebnisse war nur bei 27 Patienten (13 Frauen und 14
Männer) gegeben. Bei 35 Patienten (23 Frauen und 12 Männer) war keine
Übereinstimmung ersichtlich.
Bei dieser Gegenüberstellung wurde mit der funktionellen Testmethode COATEST®
APCTM Resistance nur bei 5 Patienten eine verminderte APC Ratio gemessen, wohingegen
bei 40 der 62 untersuchten Plasmen ein verringerter ProC® Global-Wert auffiel (siehe
Tabelle 13).
Das mittlere Manifestationsalter lag bei 51,5 Jahren. Hinsichtlich des Geschlechts ist ein
Unterschied des mittleren Manifestationsalters auffällig. So wurde für die weiblichen
Untersuchten ein niedrigeres Manifestationsalter als für die männlichen Untersuchten (48.
Lebensjahr versus 56. Lebensjahr) bestimmt.
Leider liegen von diesen Patienten keine molekularbiologischen Untersuchungsergebnisse
zur Faktor-V-Mutation vor.
Tab. 12: Thrombosearten der sowohl mit ProC® Global als auch mit COATEST®
APCTM Resistance getesteten Patienten
Thromboembolische Manifestationsarten
Patientenanzahl
Beinvenenthrombose
18 (29%)
Beinvenenthrombose mit Lungenembolie
11 (17,7%)
Lungenembolie
9 (14,5%)
Koronare Herzkrankheit
6 (9,7%)
keine Thromboembolie
5 (8,1%)
Transistorisch ischämische Attacke
4 (6,4%)
Apoplex
2 (3,2%)
Armvenenthrombose
2 (3,2%)
Thrombophlebitis
2 (3,2%)
Arterielle Embolie
1 (1,6%)
Periphere arterielle Verschlußkrankheit
1 (1,6%)
Pfortaderthrombose
1 (1,6%)
Tab. 13: Vergleich zwischen der Anzahl pathologischer ProC® GlobalWerte und pathologischer APC Ratio gleicher Plasmaproben
Pathologische
Ratio
5
Patientenanzahl (n)
APC Pathologischer ProC®
Global-Wert
40
Tab. 14: Gegenüberstellung der Anzahl übereinstimmender und nicht übereinstimmender Untersuchungsergebnisse
Patientenanzahl (n)
Übereinstimmung vorhanden
27
Fehlende Übereinstimmung
35
3.2.3. Prävalenzuntersuchungen zum Vorherrschen der APC-Resistenz bei
Thrombosepatienten anhand des Studiums von Krankenblattdateien
Zur Prävalenzbeurteilung des Vorherrschens der APC-Resistenz bei Thrombosepatienten
diente das Studium von 127 Krankenblättern von Patienten, die unter dem Verdacht einer
Thromboembolie 1996 stationär im Klinikum Erfurt aufgenommen worden waren. Unter
diesen 127 Patienten befanden sich 65 Männer (51%) und 62 Frauen (49%). Bei 23 dieser
Patienten konnte der Thromboseverdacht mit objektiven Untersuchungsmethoden
widerlegt werden. Bei 46 der untersuchten Frauen und 58 der untersuchten Männer wurde
die Diagnose einer Thromboembolie bestätigt. Die Untersuchungen auf das Vorliegen der
APC-Resistenz erfolgten mit dem Testsystem COATEST® APCTM Resistance.
Einen Überblick über Anzahl und Verteilung der Manifestationsarten der objektivierten
thromboembolischen Ereignisse gibt Tabelle 15. Die häufigste klinische Manifestation war
auch hier mit 82,2% die tiefe Beinvenenthrombose mit oder ohne Lungenembolie oder der
isolierte Nachweis einer Lungenembolie. Das mittlere Manifestationsalter lag bei 50,7
Jahren.
Tab. 15: Aufschlüsselung der Manifestationsarten hinsichtlich der Geschlechtsund Häufigkeitsverteilung
Thromboembolische
Gesamtanzahl Anzahl der Anzahl der
Manifestation
Frauen
Männer
Ober-und Unterschenkel35
12
23
venenthrombose
Ober- und Unterschenkel21
10
11
venenthrombose
mit
Lungenembolie
Lungenembolie
13
6
7
Beckenvenenthrombose
10
4
6
Apoplex
7
4
3
Armvenenthrombose
5
5
0
Beckenvenenthrombose
4
1
3
mit Lungenembolie
Transitorisch ischämische
2
2
0
Attacke
Arteria carotis Stenose
Ischämische Kolitis
Periphere
arterielle
Verschlußkrankheit
Nierenarterienstenose
Thrombophlebitis
Koronare Herzkrankheit
Verschluß arteriovenöser
Fistel
1
1
1
0
0
1
1
1
0
1
1
1
1
0
0
1
0
1
1
0
1
3.2.3.1. Aufschlüsselung der Krankenblattdateien weiblicher Probanden
Das mittlere Manifestationsalter der Frauen mit objektivierten thromboembolischen
Ereignissen liegt bei 47,6 Jahren. Die mittlere gemessene APC Ratio beträgt 2,96.
Von diesen Frauen hatten 19 positive Familienanamnesen, bei 28 war die
Familienanamnese leer und bei 3 Patientinnen waren in den Krankenblättern keine
Angaben dazu vermerkt.
Nur
7
Patientinnen
nahmen
weibliche
Hormonpräparate
ein.
Andere
thrombosebegünstigende Expositionen waren in 15 Fällen vorausgegangen. Bei einer
Patientin lag als thrombosebegünstigender Faktor ein metastasierendes Tumorleiden vor,
eine andere war an Multiple Sklerose erkrankt. Außerdem wurde bei einer weiteren
Patientin der Verdacht auf eine unklare Speicherkrankheit geäußert.
3.2.3.2. Aufschlüsselung der Krankenblattdateien männlicher Probanden
Das mittlere Manifestationsalter der Männer lag bei 53,1 Jahren und liegt somit ca. 6 Jahre
über dem der Frauen. Eine vorausgegangene Exposition ließ sich bei 19 Patienten eruieren.
Bei 9 der untersuchten Männer bestand zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ein
Tumorleiden.
Die Befragung zur Familienanamnese bezüglich thromboembolischer Ereignisse fiel nur
bei 15 Patienten positiv aus. Bei 2 der Untersuchten waren keine Angaben zur
Familienanamnese gemacht worden. Die mittlere gemessene APC Ratio lag nur
unwesentlich höher als bei den Frauen, es wurde ein mittleres Ergebnis von 3,05 bestimmt.
Tab. 16: Überblick über die geschlechtsspezifische Verteilung bezüglich
vorausgegangener thrombosebegünstigender Ereignisse aller Probanden
mit objektivierter Thromboembolie
Gesamtheit aller Patienten mit vorausgegangenen
thrombosebegünstigenden
Ereignis
34
Anzahl der Frauen
mit vorausgegangenen
thrombosebegünstigenden Ereignis
15
32,3%
14,3%
Anzahl der Männer mit
vorausgegangenen
thrombosebegünstigenden Ereignis
19
18%
3.2.3.3. Charakterisierung der pathologischen Meßergebnisse
Insgesamt fiel die Bestimmung der APC Ratio bei 13 der 104 untersuchten
Thrombosepatienten pathologisch aus (Werte im kontrollbedürftigen Bereich wurden
eingeschlossen). Dabei wurde bei 9 der männlichen Untersuchten und bei 4 der weiblichen
Untersuchten eine pathologische APC Ratio bestimmt. Somit läßt sich eine Häufigkeit des
Vorkommens der APC-Resistenz bei Patienten mit objektivierten Thromboembolien von
12,5% berechnen. Hierbei muß berücksichtigt werden, daß von diesen 13 Patienten leider
nur bei einem Patienten eine Genanalyse vorlag. Bei einem dieser Patienten fiel der
Nachweis von Lupusantikoagulanzien positiv aus. Ein Protein-C-Defekt wurde bei einer
anderen Patientin nachgewiesen. Erwähnenswert ist, daß bei einer Probe genomisch eine
heterozygote Mutation objektiviert wurde, jedoch die Bestimmung der APC Ratio einen
Normalwert erbrachte, welcher bei 2,46 lag.
Bei 5 der 9 männlichen Untersuchten mit pathologischer APC Ratio war ein
vorausgegangenes thrombosebegünstigendes Ereignis eruierbar, wohingegen bei allen 4
Patientinnen ein solches Ereignis nicht nachweisbar war. Die klinische Manifestationsart
der Thromboembolie war bei 12 der Patienten die tiefe Beinvenenthrombose, welche in 6
Fällen mit einer Lungenembolie einherging. Eine Charakterisierung der Patienten mit
pathologischer APC Ratio ist Tabelle 17 und 18 gegeben.
Tab. 17: Charakterisierung der weiblichen Probanden mit pathologischer APC
Ratio
Patientin 1
Patientin 2
Manifesta- Manifestations- APC
tionsalter
art
Ratio
(in Jahren)
75
Beinvenen2,14
thrombose mit
Lungenembolie
17
Beinvenen1,72
thrombose
Patientin 3
43
Nachgewiesene
Gerinnungsdefekte
Homocysteinämie
Besonderheiten
Heterozygote
Faktor-VMutation
/
Hormonelle
Kontrazeption
/
/
Beinvenen1,93
thrombose mit
Lungenembolie
Patientin 4
59
Beinvenen2,17 Protein-C/
thrombose
Defekt
Tab. 18: Charakterisierung der männlichen Probanden mit pathologischer APC
Ratio
Manifestationsalter
(in Jahren)
Patient 1
45
Patient 2
30
Patient 3
58
Thrombosemanifestationsart
Beinvenenthrombose
Beinvenenthrombose mit
Lungenembolie
Beinvenenthrombose
APC Nachgewiesene BesonderRatio Gerinnungsheiten
defekte
1,78
/
/
1,36
1,96
Positiver
Nachweis von
Lupusantikoagulanzien
/
Glioblastom
/
Patient 4
52
Patient 5
68
Patient 6
68
Patient 7
39
Patient 8
41
Patient 9
70
Ischämische
Kolitis
Beinvenenthrombose
Beinvenenthrombose mit
Lungenembolie
Beinvenenthrombose mit
Lungenembolie
Beinvenenthrombose
Beinvenenthrombose
2,16
/
1,93
/
1,69
/
1,79
Fibrinolysedefekt
/
1,5
Fibrinolysedefekt
Fibrinolysedefekt
/
2,14
/
/
Akuter
Myokardinfarkt
/
4. Diskussion
Durch die zunehmende Identifizierung angeborener Gerinnungsdefekte ist eine
differenziertere Ursachenklärung thromboembolischer Ereignisse möglich. In vielen
Situationen, bei denen thrombosebegünstigende exogene Risikofaktoren vorliegen,
interessiert den behandelnden Arzt, ob ein besonders hohes Thromboserisiko infolge
potenzierender
hereditärer
Gerinnungsdefekte
besteht.
Mit
einem
gesteigerten
Thromboserisiko einher geht zum einem die damit verbundene akute Gefährdung des
Patienten durch Lungenembolie oder Phlegmasia coerulea dolens. Zum anderen ist die
Vermeidung von Thromboembolien auch von volkswirtschaftlichem Interesse. So
forderten allein thromboembolische Erkrankungen in den zurückliegenden Jahren 12
Milliarden DM pro Jahr. Somit ist die Vermeidung von Thromboembolien und
Rezidivthrombosen durch eine gezielte adäquate Thromboseprophylaxe auch von großer
ökonomischer Bedeutung. Neben der Einschätzung exogener Risikofaktoren kommen
dabei
vorgeschalteten
Screeningsystemen
zur
Erfassung
angeborener
thrombosebegünstigender Defekte sowohl aus ökonomischer als auch aus labortechnischer
Sicht eine besondere Bedeutung zu.
Mit Hilfe dieser vorgeschalteten Testsysteme soll primär eine Anzahl kostenintensiver und
aufwendiger Untersuchungen umgangen werden. Sie sollen sicher, schnell und einfach, in
jedem Labor zu handhaben sein. Ihre Ergebnisse sollen verläßlich über die Notwendigkeit
einer weiterführenden Diagnostik entscheiden, so daß von Screeningtesten neben einer
entsprechenden Spezifität insbesondere eine hohe Sensitivität gefordert wird.
Die vorgelegten Untersuchungen wurden zur Beurteilung von Sensitivität und Spezifität
des Screeningtestes ProC® Global bezüglich der Faktor-V-Mutation durchgeführt. Nach
bereits existierenden Untersuchungen soll der Screeningtest ProC® Global einerseits eine
hohe Sensitivität für die Einzelfaktoren besitzen und andererseits Informationen über die
tatsächliche Funktionalität des gesamten Protein-C-Systems geben (61, 77). Mit diesem
Testsytem sollen sowohl die bekannten angeborenen Defekte, als auch die erworbenen
Defekte des Protein-C-Systems, welche ebenso mit einem gesteigerten Thromboserisiko
einhergehen, erfaßt werden.
ProC® Global wurde an 285 Plasmaproben von Patienten mit objektiv nachgewiesenen
Thromboembolien durchgeführt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse zeigten in 222 Fällen
einen erniedrigten Wert. Die Faktor-V-Mutante wurde jedoch nur bei 98 Patienten
genomisch gefunden. Unter diesen Patienten mit genomischen Mutationsnachweis
befanden sich 7 homozygote und 91 heterozygote Defektträger. 3 Patienten mit
gentechnologisch nachgewiesener Faktor-V-Mutation wurden mittels ProC® Global nicht
erfaßt. Es handelte sich in allen Fällen um heterozygote Merkmalsträger. Warum in 3
Fällen eine Erfassung nicht möglich war, kann nicht erklärt werden.
Homozygote Merkmalsträger wurden allesamt erfaßt. Das bedeutet offensichtlich, daß mit
dem ProC® Global-Test homozygote Defektträger in jedem Falle erfaßt werden.
Bei den vorgelegten Untersuchungen findet sich eine Sensitivität des Testsystems für die
Faktor-V-Mutation von 96,9%. Es finden sich 95 richtig positive, 3 falsch negative, 127
falsch positive und jedoch auch 60 richtig negative Ergebnisse. Aus diesen Angaben läßt
sich ein negativer prädiktiver Wert von 95,2% und ein positiver prädiktiver Wert von
42,8% errechnen.
Die damit nachgewiesene hohe Sensitiviät von ProC® Global zur Erfassung der Faktor-VMutation zeigt eine Übereinstimmung mit den Ergebnissen aktueller Studien (23, 29, 48,
86, 102). Mit der hohen Sensitivität einher geht der hohe negative Vorhersagewert von
95,2%, welcher ebenso durch andere Untersuchungen bestätigt wurde (23, 43, 70).
Jedoch wurden mit diesem Testsystem bei 127 Patienten pathologische Werte gemessen,
ohne das eine Faktor-V-Mutation objektiviert wurde. Dies verwundert nicht, da, wie
eingangs erörtert, ProC® Global ja auch andere Störungen im Protein-C-System, wie
Mangel an Protein C oder S, hohe Faktor-VIII-Spiegel und Phospholipidantikörper erfaßt.
Nach den Kenntnissen aus der Literatur (16, 35, 84) über die Häufigkeit von Protein-Coder Protein-S-Defekten ist es höchst unwahrscheinlich, daß diese falsch positiven
Testresultate allein auf Defekte der zuvor genannten Proteine oder auf die Anwesenheit
von Phospholipidantikörpern zurückzuführen sind. Leider war es aus technischen Gründen
nicht möglich, alle Plasmaproben auf diese Defekte mit zu überprüfen. Andererseits ist
durch Untersuchungen (5,38) belegt, daß das Phänomen der APC-Resistenz in ca. 90% der
Fälle auf die Faktor-V-Mutation zurückzuführen ist. Unter Berücksichtigung dieser
Tatsache ist die Anzahl falsch positiver Ergebnisse nicht nur durch möglicherweise
vorliegende zuvor genannte Störungen erklärbar.
Auch Dati und Mitarbeiter beschrieben (23), daß in einer Gruppe thrombophiler Patienten,
bei denen sowohl eine Faktor-V-Mutation als auch ein Protein-C- oder ein Protein-SMangel/Defekt ausgeschlossen wurde, eine höhere Anzahl pathologischer ProC® GlobalWerte als in der gesunden Kontrollgruppe gemessen wurde. Als Erklärung für diese
Auffälligkeit wurden gesteigerte Konzentrationen von Fibrinogen und Faktor VIII im
Rahmen der Akuten-Phase-Reaktion bei thromboembolischen Geschehen angesehen. Ein
anderer und sehr wichtiger Aspekt für dieses Phänomen ist die in der Literatur (64, 70)
geäußerte Annahme, daß bisher unbekannte Gerinnungsdefekte zu erniedrigten
Ergebnissen dieses Testsystemes führen und somit pathologische Testergebnisse Hinweise
für eine thrombophile Reaktionslage bei bisher unbekanntem Defekt darstellen können.
Die Spezifität des Testsystems ProC® Global für die Faktor-V-Mutation beträgt nach den
vorliegenden Ergebnissen 32,1%. Mit ihr geht, wie zuvor berichtet, ein positiver
prädiktiver Wert von 42,8% einher.
In der Literatur sind unterschiedliche Angaben zum positiven prädiktiven Wert und somit
zur Spezifität zu finden. So fanden Toulon und Mitarbeiter (86) einen positiven prädiktiven
Wert von 44,5%. Die Arbeitsgruppen von Dati et al. (23) und Robert et al. (70)
berechneten einen entsprechenden Wert von 58% bzw. 59%. Dati und Mitarbeiter (23)
vertreten die Auffassung, daß der geringe positive Vorhersagewert in einem Kollektiv von
Thrombosepatienten ebenso auf bisher unbekannte Defekte im Protein-C-System
zurückzuführen sein könnte. Er empfiehlt daher, zur Einschätzung der Spezifität von
ProC® Global, die Ergebnisse einer gesunden Kontrollgruppe heranzuziehen. Hafner et al.
(41) führen die scheinbar niedrige Spezifität des Testsystems ProC® Global auf die
Auswahl der Patienten, welche prädisponiert für Thromboembolien waren, zurück.
Demgegenüber beschreibt Niemann (61) eine Spezifität des Testes von 88%. Dabei ist zu
beachten, daß für diese Studie eine Kontrollgruppe gesunder Blutspender herangezogen
wurde.
Bemerkenswert ist, daß auch andere Untersucher (43) einen hohen positiven prädikativen
Wert von 93% für ProC® Global fanden, wobei auch hier ein Patientenkollektiv mit
durchgemachter Thromboembolie untersucht wurde. Dabei wurde jedoch keine Angabe
über die Zeitspanne zwischen Diagnosestellung und Screeninguntersuchung gemacht.
Daher kann nicht sicher ausgeschlossen werden, daß der angegebene hohe, positive
prädiktive Wert auf ein möglicherweise zeitlich bedeutsames Intervall zwischen
Diagnosestellung und Probeentnahme zurückzuführen ist. So ist nach Abklingen der
Akuten-Phase-Reaktion von einer Normalisierung erhöhter Fibrinogen- und Faktor-VIIISpiegel und somit von höheren Testergebnissen auszugehen.
Von einem guten Test wird neben einer hohen Sensitivität auch möglichst eine hohe
Spezifität erwartet, wobei es sinnvoller erscheint, mit einem Screeningtest mehr falsch
positive Ergebnisse zu erhalten, als möglicherweise Defekte aufgrund einer zu geringen
Sensitivität zu übersehen.
Durch andere Studien (41, 70, 86) wurden Spezifitäten des Testes zwischen 64% und 71%
hinsichtlich der Aufdeckung von Abnormitäten im Protein-C-System gefunden. Dabei
wurden, wie bei den vorliegenden Untersuchungen, nur thrombophile Patienten oder
Patienten mit positiver Familienanamnese einbezogen. Um die jeweiligen Ergebnisse zu
vergleichen, ist es wichtig, auch präanalytische Angaben zu berücksichtigen. Diese
Einbeziehung präanalytischer Verfahren ist von besonderem Interesse, da aus
Veröffentlichungen (23, 77, 80, 99) bekannt ist, daß eingefrorenes plättchenreiches Plasma
zu einer artifiziellen Verkürzung der Gerinnungszeit und somit zu falsch positiven
Ergebnissen führt.
In der angeführten Untersuchung von Niemann (61) sind keine Angaben zum
präanalytischen Vorgehen zu finden. Für die Untersuchungen von Hafner et al. (41)
wurden plättchenfreie Plasmaproben, welche nach doppelter Zentrifugation für maximal
eine Woche bei -20°C eingefroren wurden, verwendet. Für eine Untersuchung der APCResistenz von Gable und Mitarbeitern (34) wurde plättchenarmes Plasma hergestellt und
bei -70°C bis -80°C für mehrere Tage bis zu mehreren Jahren eingefroren. Robert et al.
(70, 71) verwendeten ebenso plättchenarmes, eingefrorenes Plasma, wobei keine genauen
Angaben zur Lagerungsdauer gemacht wurden.
Auch die Gruppe von Toulon et al. (86) untersuchte plättchenfreies Plasma, welches bei 70°C bis maximal 6 Monate gelagert wurde.
Das für die vorliegenden Untersuchungen verwendete Plasma wurde 20 min bei 5000
Umdrehungen zentrifugiert, so daß plättchenfreies Plasma vorlag und somit diese mögliche
Fehlerquelle als Erklärung für die Anzahl falsch positiver Ergebnisse ausgeschlossen
werden kann. Diese Plasmaproben wurden bei -70°C bis zum Zeitpunkt der Untersuchung
bis maximal 5 Jahre gelagert. Beim Studium der Literatur schwankten die Angaben
bezüglich der Lagerungsdauer plättchenarmer Plasmen bei
-20°C bis -70°C zwischen einer Woche und mehreren Jahren (41, 86). Genaue Angaben,
über wie viele Jahre maximal plättchenarmes Plasma eingefroren und nachfolgend
untersucht wurde, war nicht zu eruieren.
Bezugnehmend auf die Gesamtzahl der untersuchten Plasmen weisen 34,4% aller
getesteten Patienten mit objektiv gesicherten Thromboembolien (darunter 31,1%
heterozygote und 2,5% homozygote Merkmalsträger) die Leiden-Mutation auf. Die Anzahl
genotypisch nachgewiesener Defektträger stimmt mit bisherigen Veröffentlichungen (28,
47, 83, 90, 97) zur Häufigkeit des Vorkommens der Faktor-V-Mutation bei
Thrombosepatienten überein.
Das errechnete mittlere Manifestationsalter für thromboembolische Ereignisse der
homozygoten Merkmalsträger liegt bei 32,9 Lebensjahren und das der heterozygoten
Merkmalsträger bei 45,3 Lebensjahren. Damit ist eine weitestgehende Übereinstimmung
mit den Ergebnissen von Rosendaal et al. (73) gegeben. So fanden Rosendaal und
Mitarbeiter ein mittleres Manifestationsalter für homozygote Träger von 31 Jahren und bei
heterozygoten Merkmalsträgern von 44 Jahren. Demgegenüber beschrieben andere
Autoren (28, 53) ein geringeres Manifestationsalter sowohl für heterozygote als auch für
homozygote Defektträger.
Die vorliegenden Untersuchungen bestätigen auch die Angaben aus der Literatur (21, 78,
90) bezüglich der klinischen Thrombosemanifestation. Die mit Abstand häufigste
Manifestationsart der untersuchten Faktor-V-Träger ist die tiefe Beinvenenthrombose mit
oder ohne Lungenembolie. Thrombosen an ungewöhnlichen Manifestationsorten (cerebral,
mesenterial oder retinal) wurden unter den Merkmalsträgern nicht objektiviert.
Eine arterielle Thrombose wurde bei einem Patienten mit heterozygoter Mutation
gefunden. Nach den Untersuchungen von Sampran et al. (79) besteht eine gesteigerte
Frequenz der Faktor-V-Mutation bei Patienten mit objektiv nachgewiesener peripherer
arterieller Verschlußkrankheit. Demgegenüber fanden Siegemund und Mitarbeiter (82)
keinen Zusammenhang zwischen dem Auftreten arterieller Verschlüsse und verringerten
ProC® Global-Werten. Diese Tatsache läßt nun wiederum auf kein gesteigertes
Vorkommen der Faktor-V-Mutation bei Patienten mit arteriellen Gefäßverschlüssen
schließen.
Die Diagnose eines akuten Myokardinfarktes wurde bei keinem Patienten mit
nachgewiesener Faktor-V-Mutation und pathologischem ProC® Global-Wert gestellt.
Bezüglich des Zusammenhanges zwischen akutem Myokardinfarkt und dem Vorliegen
einer Faktor-V-Mutation gibt es in der Literatur unterschiedliche Angaben. Ein signifikant
höheres Vorkommen ist bei männlichen Patienten mit koronarer Herzkrankheit
nachgewiesen worden, jedoch wurde kein gehäuftes Auftreten akuter Myokardinfarkte bei
Trägern der Mutation gefunden (57). Auch Gowda et al. (37) zeigten, daß kein
Zusammenhang zwischen dem Auftreten akuter Myokardinfarkte und einem positiven
Mutationsnachweis besteht. Demgegenüber fanden Makris und Mitarbeiter (54) ein
gesteigertes Vorkommen der Mutation bei Patienten mit gesicherten Myokardinfarkten im
Vergleich zu einer Kontrollgruppe.
Der mittlere Wert der normierten Ratio homozygoter Merkmalsträger beträgt 0,31. Für die
heterozygoten Merkmalsträger ließ sich ein mittleres Ergebnis von 0,47 errechnen. Die
mittlere normierte Ratio der falsch positiven Ergebnisse beträgt 0,63.
Siegemund et al. (82) fanden eine mittlere normierte Ratio von 0,39 für homozygote
Merkmalsträger, von 0,55 für heterozygote Patienten und von 0,87 für den Wildtyp. Zu
ähnlichen Ergebnissen gelangten Dati et al. (23) und Niemann (61). In ihren
Veröffentlichungen gaben sie die mittleren Testergebnisse von Defektträgern mit 0,48 und
0,49 (umfaßt sowohl homozygote als auch heterozygote Defekte) und für gesunde
Blutspender mit 0,98 und 1,06 an.
Dick (26) wies höhere Mittelwerte der normierten Ratio nach. Sie fand für homozygote
Defektträger ein mittleres Testergebnis von 0,46 und von 0,63 für heterozygote
Merkmalsträger. Der Mittelwert für gesunde Blutspender beträgt 1,05. Diese zitierten
mittleren Werte der normierten Ratio für Defektträger liegen deutlich über den
Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Eine mögliche Ursache für diese Diskrepanz könnte
sein, daß die Blutentnahmen für die vorliegende Arbeit unmittelbar nach Diagnosestellung
der Thromboembolie durchgeführt wurden. Die Blutentnahme für die oben genannte
Studie von Dick erfolgte erst 6-8 Wochen nach stattgehabten Ereignis. Bezugnehmend auf
den bereits zuvor angeführten Artikel von Dati und Mitarbeitern (23) sind die niedrigeren
Mittelwerte der normierten Ratio sehr wahrscheinlich auf die mit der Thromboembolie
einhergehenden
Erhöhung
der
Fibrinogen-
und
Faktor-VIII-Konzentrationen
zurückzuführen, zumal durch verschiedene Untersuchungen (17, 18, 61) bekannt ist, daß
erhöhte Faktor-VIII-Spiegel ebenso vom ProC® Global-Test erfaßt werden.
Erwähnenswert ist, daß eine Abhängigkeit zwischen der Höhe des ProC ® Global-Wertes
und der genetischen Veranlagung des Gerinnungsdefektes erkennbar ist. Bei den
homozygoten Merkmalsträgern wurden die
geringsten Testergebnisse bestimmt.
Demgegenüber waren bei Patienten ohne genomisch nachweisbare Mutationen höhere
ProC® Global-Werte auch innerhalb des falsch positiven Bereiches festzustellen.
In einer Studie von Kemkes-Matthes et al. (43) wird ein Zusammenhang zwischen Höhe
des ProC® Global-Wertes und der Anzahl pathologischer Gerinnungsteste einer
entsprechenden Probe festgestellt. Die niedrigsten Testergebnisse wurden bei Patienten mit
kombinierten Gerinnungsdefekten und die höchsten bei Patienten ohne Nachweis eines
derartigen Defektes im Gerinnungssystems gefunden. Aufgrund dieser Tatsache stellt sich
die Frage, inwieweit ProC® Global als Indikator für die aktuelle Thrombosegefährdung
eines einzelnen Patienten gewertet werden kann. Auch diese Autoren (93) gehen davon
aus, daß pathologische ProC® Global-Werte, die mit keinem bekannten Gerinnungsdefekt
erklärt werden können, u.U. einen Hinweis auf bisher unbekannte Defekte geben können.
Ein anderer Punkt der vorliegenden Arbeit umfaßt den Vergleich zweier funktioneller
Testsysteme zur Erfassung der Faktor-V-Mutation. Hierzu wurden Plasmaproben, die zum
gleichen Zeitpunkt von einem und demselben Patienten entnommen wurden, zunächst mit
COATEST® APCTM Resistance und zu einem späteren Zeitpunkt mit ProC® Global auf das
Vorliegen des Defektes untersucht. Es wurden ausschließlich Plasmaproben von
Thrombosepatienten untersucht. Für die Testung mit COATEST® APCTM Resistance
wurden frische Plasmaproben verwandt. Vor Bestimmung der APC-Resistenz mittels
ProC® Global waren die Plasmen aus technischen Gründen ca. 2 bis maximal 6 Monate
eingefroren.
Eine Übereinstimmung der Testergebnisse war nur bei 27 Patienten gegeben. Bei 35
Patienten war keine Übereinstimmung ersichtlich. Die fehlende Übereinstimmung ergibt
sich daraus, daß deutlich mehr pathologische Ergebnisse mit ProC® Global als mit
COATEST® APCTM Resistance gemessen wurden. Die Untersuchungen mit dem
Testsytem COATEST® APCTM Resistance erbrachten bei einer Entscheidungsgrenze von 2
nur bei 5 Patienten eine verminderte APC Ratio. Ein Testergebnis befand sich im
kontrollbedürftigen Bereich. Demgegenüber zeigten 40 der 62 untersuchten Plasmen einen
verminderten ProC® Global-Wert. Eine Übereinstimmung war dahingehend ersichtlich,
daß die 5 Plasmen mit verringerter APC Ratio durchweg die niedrigsten ProC® GlobalWerte aufwiesen. Auch das Testplasma, welches bei der COATEST® APCTM ResistancePrüfung im kontrollbedürftigen Bereich lag, wies einen deutlich verminderten ProC®
Global-Wert auf.
Einer Untersuchung von Ferreira-Gonzalez und Mitarbeitern (32) zufolge liegt die
Sensitivität des Testsystems COATEST® kit (Chromogenix, Molnall, Sweden) bei 50%
und die Spezifität bei 93%. Aufgrund der niedrigen Sensitivität favorisieren die Autoren
trotz technisch einfacher Durchführung des funktionellen Testsystems die Genanalyse.
Ähnliche Ergebnisse fanden Zehnder et al. (100) bei der Überprüfung auf APC-Resistenz
durch andere kommerzielle Testsysteme. Der gewählte cut-off der zuletzt genannten Studie
lag ebenso bei 2. Besonders in dem Bereich zwischen 2 bis3 waren bei diesen
Überprüfungen Überlappungen der Ergebnisse heterozygoter Merkmalsträger mit den
Ergebnissen gesunder Kontrollpersonen auffällig. Daraus kann eine mangelnde
Aufdeckung heterozygoter Defektträger abgeleitet werden.
Auch Arkel et al. (3) fanden bei einem Vergleich mehrerer funktioneller Testsysteme zur
Bestimmung der APC-Resistenz eine Sensitivität für das Testsystem Coatest APC KitTM
(Chromogenix, Sweden) von 42% und eine Spezifität von 94%. Auch aufgrund dieser
Ergebnisse könnte auf einen mangelnden Nachweis der APC-Resistenz durch dieses
Testsystem geschlossen werden.
Somit wäre die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen der beiden, mit einander
verglichenen Testsysteme, zum Teil erklärbar. Theoretisch denkbar wären ebenso falsch
positive ProC® Global-Werte durch Verwendung eingefrorener plättchenhaltiger Plasmen,
wobei auch für diese Untersuchungen die Plasmen vor dem Einfrieren durch doppelte
Zentrifugation von Plättchen entfernt wurden.
Da die getesteten Plasmaproben von gleichen Patienten stammten und zur gleichen Zeit
entnommen wurden, ist von jeweils gleich hohen Spiegeln an Faktor VIII und Fibrinogen
auszugehen. Somit ist eine Erklärung der deutlich vermehrten pathologischen ProC®
Global-Werte,
bedingt
durch
erhöhte
Faktor-VIII-Spiegel
im
Rahmen
der
Komplementaktivierung eher unwahrscheinlich, da dieser erhöhte Faktor über eine
Verlängerung der Gerinnungszeit beide funktionelle Testsysteme beeinflußt.
Leider lagen für diese Plasmaproben keine Genanalysen vor, so daß nicht sicher gesagt
werden kann, welche der beiden Methoden überlegen ist.
Bezugnehmend auf die eigenen Untersuchungen und die oben angeführten Literaturstellen
wäre zu vermuten, daß der ProC® Global-Test dem Testsystem COATEST® APCTM
Resistance bezüglich der Sensitivität zur Erfassung der Faktor-V-Mutation überlegen ist.
Die vorliegende Arbeit untersuchte weiterhin die Prävalenz der APC-Resistenz bei
Thrombosepatienten anhand des Studiums von Krankenblättern. Es sollte sich hierbei nur
um grob orientierende Untersuchungen handeln, da die Hauptaufgabe der vorgelegten
Arbeit in der Bewertung des Testsystems ProC® Global bestand.
Die dabei verwendeten 104 Krankenblätter stammten von Patienten mit objektiv
gesicherten Thromboembolien. Die Testung auf APC-Resistenz wurde mit dem Testsystem
COATEST® APCTM Resistance durchgeführt. Hierbei zeigten nur 13 der getesteten
Plasmen einen pathologischen Wert, d.h. daß bei 12,5 % dieser Patienten mit hoher
Wahrscheinlichkeit eine APC-Resistenz vorliegt. Unter den Patienten mit pathologischem
Testergebnis waren 9 männlichen und 4 weiblichen Geschlechts. Leider lag von diesen 13
Patienten nur bei einer Patientin ein molekularbiologisches Untersuchungsergebnis vor.
Dieses wies eine heterozygote Mutation nach.
Demgegenüber steht die molekulargenetische Prävalenzstudie der deutschen Bevölkerung
von Ehrenforth und Mitarbeitern (28). Für diese Studie wurden 1200 Patienten mit
gesicherten Thrombosen rekrutiert und mittels Genanalyse auf das Vorliegen der Faktor-VMutation untersucht. Bei 27,2% der untersuchten Patienten lag die Faktor-V-Mutation vor.
Darunter waren 23,1% heterozygote und 4,1% homozygote Merkmalsträger.
Auch liegt die in der vorliegenden Arbeit anhand pathologischer ProC® Global-Werte von
den 285 Plasmen berechnete Prävalenz mit 34,4% deutlich über der Prävalenzberrechnung
unter Einsatz des Testsystems COATEST® APCTM Resistance.
Eine mögliche Ursache für die Diskrepanz der Ergebnisse bezüglich der Prävalenz der
APC-Resistenz bzw. der Faktor-V-Mutation könnte in der Wahl des funktionellen
Testsystems bestehen. Wie zuvor beschrieben, liegt nach o.g. Untersuchungen (32, 100)
die Empfindlichkeit des anderen funktionellen Testsystems zur Erfassung der APCResistenz nur bei ca. 50%. Das heißt, das mit diesem Testsystem ein Teil der Träger einer
APC-Resistenz nicht erfaßt werden. Somit wäre denkbar, daß die Prävalenz der Faktor-VMutation bei Thrombosepatienten deutlich über 12,5 % liegt.
Geographische Unterschiede als weitere mögliche Ursache für die Diskrepanz anzuführen
scheint wenig plausibel, da Ehrenforth und Mitarbeiter (28) für ihre Prävalenzstudie
Patienten aus ganz Deutschland untersuchten.
Die Untersuchungen von Ehrenforth und Mitarbeitern (28) zeigten, daß die häufigste
Manifestationsart mit 81,3% die tiefe Venenthrombose im Bein- und Beckenvenenbereich
war. Bei 14,4% wurde eine Thrombose in atypischer Lokalisation und bei 4,3% eine
isolierte Lungenembolie nachgewiesen.
Auch beim Studium der Krankenblätter war die häufigste Manifestationsart die tiefe
Venenthrombose im Bein- und Beckenvenenbereich mit oder ohne Lungenembolie. Diese
Ergebnisse stimmen mit anderen Angaben aus der Literatur überein (21, 78, 90) .
Das mittlere Manifestationsalter der Patienten mit erniedrigter APC Ratio lag bei 51,1
Jahren.
Bei
5
der
9
männlichen
Untersuchten
war
ein
vorausgegangenes
thrombosebegünstigendes
Ereignis
eruierbar,
wohingegen
bei
allen
weiblichen
Untersuchten ein solches Ereignis nicht nachweisbar war.
Demgegenüber lag bei den Untersuchungen von Ehrenforth et al. (28) das Alter bei
Erstthrombose deutlich niedriger, bei homozygoter Mutation betrug es 27 Lebensjahre und
bei heterozygoter Mutation 30 Lebensjahre.
Bezüglich des Vorhandenseins prädisponierender Faktoren wurde in der zuvor zitierten
Studie (28) ein höherer Prozentsatz angegeben. Bei 63,5% aller Patienten war eine
thrombogene Risikosituation vorausgegangen.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das Testsystem ProC® Global, bedingt
durch seine hohe Sensitivität, durchaus als Screeningtest empfohlen werden kann. Es ist
sinnvoller, mehr falsch positive Proben zugunsten einer hohen Sensitivität einzubeziehen,
als bereits mit einem Screeningtest mögliche Defektträger aufgrund einer geringeren
Sensitivität bei höherer Spezifität des angewandten Testes von einer weiterführenden
Diagnostik auszuschließen.
Wird der ProC® Global-Test unmittelbar nach Diagnosestellung einer Thromboembolie im
Rahmen der Thrombophiliediagnostik eingesetzt, ist zu berücksichtigen, daß in diesem
Zeitintervall falsch positive Ergebnisse gemessen werden können, die durch erhöhte
Fibrinogen- und Faktor-VIII-Spiegel bedingt sind.
Ein negatives Testergebnis schließt eine Störung im Protein-C-System jedoch mit sehr
hoher Sicherheit aus.
Die mit dem Testsystem ProC® Global angestellten Prävalenzuntersuchungen zum
Vorkommen der Faktor-V-Mutation konnten bereits vorliegende Untersuchungen
bestätigen. Jedoch erbrachten die mit dem Testsystem COATEST® APCTM Resistance
durchgeführten Prävalenzuntersuchungen eine Prävalenzrate, die deutlich unter den
Ergebnissen bisheriger Untersuchungen liegt.
Auch geht aus dem Vergleich beider Testsysteme eine mögliche geringere Sensitivität des
Testsystems COATEST® APCTM Resistance hervor.
Ebenso wurden bereits vorliegende Untersuchungen zu wichtigen Aspekten wie
Thromboembolieart und Manifestationsalter sowohl homo- als auch heterozygoter
Mutationsträger bestätigt.
5. Zusammenfassung
Venöse Thrombosen sind aufgrund ihrer Häufigkeit sowohl für den Einzelnen als auch für
die Volkswirtschaft von großem Interesse. Neben thrombosebegünstigenden exogenen
Risikofaktoren
spielen
Gerinnungsdefekte
eine
in
den
besondere
letzten
Rolle.
Jahren
zunehmend
Insbesondere
zur
die
angeborenen
Vermeidung
von
Rezidivthrombosen, zur Festlegung der Dauer einer oralen Antikoagulation nach
Thromboembolie und zur Abschätzung des Thromboserisikos bei familiärer Disposition ist
eine aufwendige Diagnostik erforderlich. Daher scheint es sinnvoll, sogenannte
Screeningtestsysteme vor aufwendigen Einzelbestimmungen durchzuführen.
Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, eine Aussage zu treffen, inwieweit
das als ProC® Global bezeichnete Testsystem den derzeit häufigsten angeborenen
Gerinnungsdefekt, die Mutation im Faktor-V-Gen, aufdeckt. Dieser Screeningtest erfaßt
das Protein-C-System in seiner Gesamtheit, so daß neben der Faktor-V-Mutation auch
Protein-C- und Protein-S-Mangel bzw. funktioneller Protein-C- und Protein-S-Defekt,
Phospholipidantikörper und erhöhte Faktor-VIII-Spiegel erfaßt werden.
Die vorliegenden Untersuchungen zeigten eine hohe Sensitivität dieses Testsystems für die
heterozygote Faktor-V-Mutation. Sie beträgt 96,7%. Homozygote Mutationen wurden
allesamt erfaßt. Daher kann das Testsystem ProC® Global, bedingt durch seine hohe
Sensitivität, durchaus als Screeningtest empfohlen werden. Ein negatives Testergebnis
schließt eine Störung im Protein-C-System jedoch mit sehr hoher Sicherheit aus.
Bei der Auswertung der Testergebnisse fiel auf, daß eine relativ hohe Anzahl falsch
positiver Meßwerte bestimmt wurde. Das ist zum einen dadurch erklärbar, daß die
Blutentnahmen für die Messungen unmittelbar nach Diagnosestellung erfolgten und somit
erhöhte Faktor-VIII- und Fibrinogenspiegel im Rahmen der Komplementaktivierung
Störungen im Protein-C-System vortäuschen können. Möglicherweise können erniedrigte
ProC® Global-Werte auch Ausdruck einer thrombophilen Reaktionslage bei bisher
unbekanntem Defekt sein.
Außerdem ist es sinnvoller, mit einem Screeningtest mehr falsch positive Ergebnisse zu
erfassen und somit mehr Proben einer weiterführenden Diagnostik zukommen zu lassen,
als mögliche Defekte zugunsten einer hohen Spezifität und einer damit einher gehenden
geringeren Sensitivität zu übersehen.
Weiterhin wurden bereits publizierte Daten zu Prävalenz, Manifestationsalter und
Thromboselokalisation mit den vorliegenden Patientendaten verglichen. Bezüglich der
Lokalisation der Thromboembolien und des Manifestationsalters sowohl homo- als auch
heterozygoter Merkmalsträger war eine Übereinstimmung mit bereits existierenden
Untersuchungen
ersichtlich.
Die
mit
Abstand
häufigste
thromboembolische
Manifestationsart war die Beinvenenthrombose mit oder ohne Lungenembolie.
Homozygote Merkmalsträger erkranken mehr als 10 Jahre eher erstmals an einer
Thrombose im Vergleich zu heterozygoten Defektträgern. Anhand vorliegender
Untersuchungen wurde für homozygote Mutationsträger ein mittleres Manifestationsalter
von 32,9 Jahren und für heterozygote von 45,3 Jahren errechnet.
Die mit dem Testsystem ProC® Global angestellten Prävalenzuntersuchungen zum
Vorkommen der Faktor-V-Mutation bestätigten bereits vorliegende Untersuchungen.
Danach ist bei 34,4% aller Patienten mit gesicherten Thrombosen die Faktor-V-Mutation
nachweisbar.
Ein weiterer Teil der Arbeit umfaßte grob orientierende Untersuchungen zum Vorkommen
der Faktor-V-Leiden-Mutation bei Thrombosepatienten. Diese wurden mit dem Testsystem
COATEST® APCTM Resistance durchgeführt. Die dabei ermittelte Prävalenzrate liegt mit
12,5% deutlich unter den Ergebnissen bisheriger Untersuchungen. Als mögliche Ursache
für diese geringe Prävalenzrate ist eine, im Vergleich zum ProC® Global-Test, geringere
Sensitivität des Testsystems COATEST® APCTM Resistance für die Faktor-V-Mutation
anzunehmen.
Zusammenfassend ist festzustellen, daß das Testsystem ProC® Global durchaus als
Screeningtest zur Erfassung der Faktor-V-Mutation empfohlen werden kann.
Durch weiterführende Untersuchungen gilt es zu klären, inwieweit und welche bisher
unbekannten Defekte zu verminderten Testergebnissen führen.
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Thesen
1.
Venöse Thrombosen haben eine außerordentlich große Bedeutung sowohl für den
Einzelnen als auch für die Volkswirtschaft.
2.
Es hat sich in den letzten beiden Jahrzehnten gezeigt, daß Thrombosen vielfach auf
individuellen oder familiären Risikofaktoren genetischen Charakters beruhen. Die
Suche nach Risikofaktoren ist für eine kontinuierliche Therapieüberwachung,
insbesondere für die Festlegung der Dauer der Antikoagulation nach stattgehabter
Thromboembolie, von besonderer Wichtigkeit.
3.
Zur Zeit sind mehr als zwanzig humorale und zelluläre Risikofaktoren bekannt, für
die ein Zusammenhang mit dem gehäuften Auftreten von Thrombosen gesichert ist.
Für die praktische Diagnostik ergibt sich daraus die Schwierigkeit eines
ausgesprochen hohen materiellen und personellen Aufwandes.
4.
Daher erlangt die Frage, wie zuverlässig Screeninguntersuchungen vorliegende
Gerinnungsdefekte aufdecken, eine besondere Bedeutung. Seit einigen Jahren ist
der sogenannte ProC® Global-Test als Screeningmethode in Anwendung.
5.
Das Testsystem ProC® Global erfaßt das Protein-C-System in seiner Gesamtheit.
Neben Mangel oder Dysfunktion von Protein C und Protein S wird insbesondere
der derzeit am häufigsten vorkommende Gerinnungsdefekt, die Mutation im
Faktor-V-Gen, aufgedeckt.
6.
Die Sensitivität des Testsystems zum Nachweis der Faktor-V-Mutation ist sehr
hoch. Sie beträgt für heterozygote Mutationen 96,7%. Homozygote Mutationen
werden allesamt erfaßt.
7.
Daher kann das ProC® Global-Testsystem als Screeningmethode zur Erfassung der
Faktor-V-Mutation durchaus empfohlen werden.
8.
Die ermittelten ProC® Global-Werte korrelieren mit der Art der genetischen
Mutation. So weisen Plasmen homozygoter Merkmalsträger niedrigere Werte als
Plasmen heterozygoter Defektträger auf.
9.
Die relativ geringe Spezifität des Testsystems ist einerseits durch erhöhte FaktorVIII-Konzentrationen
im
Rahmen
der
Akuten-Phase-Reaktion
erklärbar.
Andererseits
scheint
es
durchaus
möglich,
daß
bisher
unbekannte
Gerinnungsdefekte mit der als ProC® Global bezeichneten Methode erfaßt werden.
10.
Als
häufigste
klinische
Manifestationsart
der
Faktor-V-Mutation
wurden
Thrombosen der tiefen Beinvenen mit oder ohne Lungenembolie objektiviert.
11.
Homozygote Defektträger werden im Vergleich zu heterozygoten bereits in
jüngeren
Jahren
klinisch
auffällig.
Das
Manifestationsalter
homozygoter
Merkmalsträger liegt mit 32,9 Lebensjahren deutlich unter dem heterozygoter, für
welche ein Manifestationsalter von 45,3 Lebensjahre ermittelt wurde.
12.
Die Sensitivität von ProC® Global zur Erfassung der Leiden-Mutation ist im
Vergleich mit dem funktionellen Testsystem COATEST® APCTM Resistance als
höher einzuschätzen.
Anhang
Verzeichnis der Abkürzungen
Abb.
Abbildung
APC
Aktiviertes Protein C
APC-Resistenz
Resistenz gegen aktiviertes Protein C
APTT
Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
AT III
Antithrombin III
CaCl2
Calciumchlorid
C4b-BP
C4b- Bindungsprotein
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
SHP
Standardhumanplasma
n
Anzahl
NR
Normierte Ratio
KF
Kalibrationsfaktor
PTT
Partielle Thromboplastinzeit
sec
Sekunden
SW
Sensitivitätswert
Tab.
Tabelle
TFPI
Tissue factor pathway inhibitor
Danksagung
Nach Abschluß meiner Arbeit möchte ich mich herzlich bei meinem Mentor, Herrn Prof.
Dr. med. habil. G. Vogel, für das Überlassen des Themas und seine jederzeit fördernde
Unterstützung und richtungbestimmenden Hinweise bei der Themenbearbeitung bedanken.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. G. Stein für seine Hilfe beim Einreichen
der Arbeit.
Außerdem danke ich herzlich Herrn Dr. rer. nat. W. Kalkofen und den medizinischtechnischen Assistentinnen des Hufeland Krankenhaus Bad Langensalza GmbH für die
Unterstützung bei der Durchführung der Gerinnungsanalysen.
Den medizinisch-technischen Assistentinnen des Gerinnungslabors am Klinikum Erfurt
GmbH danke ich für die Vorarbeiten zur Durchführung der Gerinnungsanalysen.
Ehrenwörtliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, daß mir die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Schiller-Universität bekannt ist,
ich die Dissertation selbst angefertigt habe und alle von mir benutzten Hilfsmittel,
persönlichen Mitteilungen und Quellen in meiner Arbeit angegeben sind,
mich folgende Personen bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der
Herstellung des Manuskripts unterstützt haben: Herr Prof. Dr. med. habil. G. Vogel und
Herr Dr. rer. nat. W. Kalkofen,
die Hilfe eines Promtionsberaters nicht in Anspruch genommen wurde und daß Dritte
weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen von mir für Arbeiten erhalten
haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen,
daß ich die Dissertation noch nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder andere
wissenschaftliche Prüfung eingereicht habe und
daß ich die gleiche, eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere Abhandlung
nicht bei einer anderen Hochschule als Dissertation eingereicht habe.
Gebesee, den 15.02.01
Lebenslauf
Name:
Spittel, Heike
Anschrift:
Gartenstraße 04
99189 Gebesee
Geburtsdatum:
20.07.1966
Geburtsort:
Erfurt
Familienstand:
verheiratet, 1 Kind
Schulbesuch:
09/1973-08/1983
Polytechnische Oberschule Gebesee
09/1983-08/1985
Erweiterte Oberschule Neudietendorf
Abschluß: Abitur
09/1985-08/1986
Vorpraktisches Jahr an der
Medizinischen Akademie Erfurt
09/1986-08/1988
Studium der vorklinischen Semester
an der Universität Leipzig
09/1988-08/1993
Studium der klinischen Semester an
der Medizinischen Hochschule Erfurt
Abschluß: Staatsexamen
09/1993-03/1995
Ärztin im Praktikum in der
Fachrichtung „Innere Medizin“
Hufeland Krankenhaus
Bad Langensalza
04/1995-12/1999
Assistenzärztin in der Abteilung
„Innere Medizin“ Hufeland
Krankenhaus Bad Langensalza
seit 01/2000
Assistenzärztin der Abteilung für
Internistische Intensivmedizin am
Südharzkrankenhaus Nordhausen
Hochschulstudium:
berufliche Tätigkeit:
Gebesee, den 15.02.01