Pränataldiagnostik

20.11.2002
Katja Rey, Jan Grolmus, Christian Menzel
Biochemisches Praktikum
Kurstag: Pränatale Diagnostik
I.
Aufgaben und Ziele pränataler Diagnostik
Als pränatale Diagnostik (PND) bezeichnet man invasive oder nicht-invasive Untersuchungen des
ungeborenen Kindes.
Auf diese Weise können fötale Fehlentwicklungen und Anomalien frühzeitig erkannt und wenn
möglich noch im Mutterleib (z.B. medikamentös) behandelt werden.
Im Idealfall wird so die Manifestation einer Krankheit verhindert.
Da allerdings vor allem bei den invasiven Methoden der PND auch gewisse Risiken bestehen,
sollte eine PND nur unter bestimmten Vorraussetzungen durchgeführt werden.
Dazu gehören:
- hohes Alter der Mutter
- vererbbare Krankheiten bei Eltern, Geschwistern oder anderen Verwandten
- frühere Aborte unklarer Ursache
- u.a.
Eltern, bei denen eine sog. Risikoschwangerschaft nach den o.g. Punkten vorliegt, können somit
schon in einer frühen Schwangerschaftsphase Gewissheit darüber erlangen, ob die Entwicklung
des Kindes normal verläuft oder nicht.
Bei einem pathologischen Befund mit Hilfe der PND stellt sich je nach Schwere der
diagnostizierten Krankheit die Frage eines Schwangerschaftsabbruches, wobei die
Entscheidungskompetenz darüber allein bei den betroffenen Eltern liegt.
Die Vorteile einer möglichst frühen Krankheitsdiagnose sind offensichtlich - dennoch sollen im
Verlauf des Protokolls auch Risiken der pränatalen Diagnostik und ethische Probleme zur
Sprache kommen.
II.
Methodik und Ethik
Invasive Methoden der PND:
Amniozentese:
Punktion der Amnionhöhle und Entnahme von Fruchtwasser.
Der Eingriff wird entweder durch die Bauchdecke oder transzervical durchgeführt.
Meist wird von den im Fruchtwasser befindlichen embryonalen Zellen zu diagnostischen Zwecken
eine Kurz- oder Langzeitkultur angelegt.
Die Amniozentese kann ab der 15. Schwangerschaftswoche durchgeführt werden.
Mögliche Komplikationen sind Verletzungen von Fötus, Nabelschnurgefäßen oder Plazenta, was
wiederum zu einer Fehlgeburt führen kann. Die Gefahr eines Aborts kann durch ständige
Ultraschallkontrolle während des Eingriffes jedoch auf ein Minimum reduziert werden.
Neben der Feststellung von numerischen oder strukturellen Chromosomenaberrationen können
mit Hilfe der Amniozentese bis zu 60 Stoffwechselkrankheiten diagnostiziert werden.
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Chorionzottenbiopsie:
Transcervicale oder transabdominale Biopsie des Chorion frondosum der Plazenta in der 7. – 12.
Schwangerschaftswoche mit Hilfe spezieller Katheter unter Ultraschallkontrolle zur Gewinnung
von Trophoblastzellen.
Diese Methode hat den Vorteil, dass man sie früher als die Amniozentese durchführen kann und
dass keine langwierigen Zellkultivierungen nötig sind. Sie ist jedoch für den Embryo und den
weiteren Verlauf der Schwangerschaft riskanter. So liegt das Abortrisiko bei der
Chorionzottenbiopsie etwa 8 mal höher als bei der Amniozentese.
Nabelschnurpunktion (Chordozentese):
Transabdominale Punktion der Nabelschnurgefäße ab der 19. Schwangerschaftswoche.
Dadurch ist unter anderem möglich:
- Bestimmung des Hämoglobingehalt
- Blutgruppenfeststellung
- Untersuchung auf Antikörper und evtl. Viren-DNA
- Erstellung eines Karyogramms (Feststellung von Chrmosomenaberrationen).
Fetoskopie:
Direkte intrauterine Betrachtung des Fötus mit Hilfe eines Glasfasertubus.
Die Gefahr eines Aborts liegt bei ca. 3 – 5%. Die Fetoskopie wurde jedoch weitgehend durch
Ultraschalldiagnostik ersetzt.
Die Fetoskopie dient dem Ausschluss von morphologisch erkennbaren Besonderheiten der
äußeren Körperform und wird meist zwischen der 18. und der 20. Schwangerschaftswoche
durchgeführt.
Nicht-invasive Methoden:
Ultraschalldiagnostik:
Mit dem Ultraschallgerät können Körperstrukturen unterschiedlicher Dichte (und der daraus
resultierenden unterschiedlichen Reflexion der Schallwellen) sichtbargemacht werden.
Mit Ultraschall kann bereits ab der 5. Schwangerschaftswoche die Morphologie und Biometrie
der Amnion- und Chorionhöhle untersucht werden.
Embryonale Strukturen lassen sich ab der 7. Schwangerschaftswoche erkennen, ebenso wie
Skelettanomalien oder Fehlbildungen der inneren Organe.
Diese Art der Untersuchung stellt keinerlei Gefahr für Fötus oder Mutter dar. Nebenwirkungen
oder negative Langzeitwirkungen sind nicht bekannt.
Blutuntersuchung des mütterlichen Serums:
Eine Proteinbestimmung im mütterlichen Serum kann Hinweise auf eine mögliche Entwicklungsstörung des Fötus geben.
Hier muss besonders das Alpha-Fetoprotein genannt werden, da erhöhte AFP-Werte auf
schwere Fehlbildungen im Bereich des Gehirns und des Neuralrohrs hinweisen.
Ein erniedrigter AFP-Spiegel deutet hingegen auf eine chromosomale Aberration hin, wie z.B. die
Trisomie 21 (Down-Syndrom).
Ethische Probleme der PND
Die Meinungen bezüglich pränataler Diagnostik divergieren extrem. In engem Zusammenhang mit
dieser Problematik steht auch die Frage der Zulässigkeit von Schwangerschaftsabbrüchen. Nicht
ohne Grund wird der §218 StGB immer wieder heftig diskutiert.
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Dank der PND können heute Krankheiten vor der Geburt ausgeschlossen werden. Abtreibungen,
die bisher auf bloßen Verdacht hin durchgeführt wurden, werden auf diese Weise verhindert.
Kritiker hingegen argumentieren, dass PND häufig einen Schwangerschaftsabbruch zur Folge
hat. Diese bedenkliche Entwicklung wirft die Frage auf, ob Menschen überhaupt in der Lage sind,
zu beurteilen, ab wann Leben lebenswert ist. Bei dieser Thematik spielen auch religiöse Aspekte
eine nicht zu unterschätzende Rolle.
Auch wenn dies beinahe unmöglich erscheint, so ist es doch Aufgabe des Gesetzgebers, den
Rahmen für die Anwendung der pränatalen Diagnostik zu schaffen.
Besonders wichtig ist hierbei, dass Gesetze den medizinischen Fortschritt nicht behindern,
einem möglichen Missbrauch der PND jedoch Einhalt gebieten.
III.
Muskeldystrophien
Muskeldystrophie Duchenne
Muskeldystrophie Duchenne ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit
(betrifft überwiegend das männliche Geschlecht), die durch fortschreitende Atrophie
quergestreifter Muskulatur gekennzeichnet ist. Betroffen sind vor allem Rumpf-, Schulter- und
Beckengürtelmuskulatur.
Der Krankheit liegt eine Mutation im Dystrophin-Gen zu Grunde, das auf dem kurzen Arm des XChromosoms lokalisiert ist.
Das Protein Dystrophin ist Bestandteil des Cytoskeletts. Dystrophinmangel führt zu abgeschwächter Muskelkontraktion, Abbau von Muskelgewebe und Ersatz durch Bindegewebe.
Symptome:
- Zw. 1. und 2. Lebensjahr erschwertes Laufenlernen mit erhöhter Fallneigung
(Zehenspitzgang mit Spitzfuß)
- Zw. 5. und 10. Lebensjahr beginnende Schwächung der Muskeln und Gelenkversteifung,
Probleme beim Aufrichten
- Ab 12. Lebensjahr sind die meisten Patienten auf den Rollstuhl angewiesen
- Steigerung des Muskelabbaus bis hin zur völligen Pflegebedürftigkeit
- Skoliosen, Hyperlordosen und daraus resultierende Atembeschwerden
- Scapula alata (abstehende Schulterblätter)
- Verformungen des Thorax
- Übergewicht
- Geistige Retardierung und Sprachstörungen
- Herzmuskelprobleme.
Die meisten Patienten sterben vor Erreichen des 20. Lebensjahres.
Ein Drittel der Erkrankungen sind auf spontane Mutationen zurückzuführen, in den übrigen Fällen
ist die Mutter des Patienten Konduktorin oder selbst erkrankt.
Der Überträgerstatus der Mutter lässt sich in 70% der Fälle anhand eines erhöhten Kreatinkinasespiegels im Blutserum nachweisen.
Die Muskeldystrophie Duchenne ist nach der Mukoviszidose die zweithäufigste Erbkrankheit mit
einer Häufigkeit von 1 auf 3500 Geburten.
Muskeldystrophie Becker
Der Verlauf der Krankheit bei dieser Form der Muskeldystrophie fällt weniger schwer als bei
der o.g. Form aus.
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Hauptsächlich betroffen sind Muskelpartien im Schulter- und Beckenbereich. Am
schwerwiegendsten ist die Schwächung der Herzmuskulatur mit der daraus resultierenden
Herzinsuffizienz, die letztendlich zum Tode führt.
Therapie bei Muskeldystrophien:
Da der Gendefekt selbst nicht behoben werden kann, muss versucht werden, die Muskelkraft
möglichst lange zu erhalten.
Bei Muskeldystrophie Duchenne ist eine Behandlung mit Kortikoiden angezeigt. Bei
Muskeldystrophie Becker ist davon jedoch abzuraten, da daraus eine zusätzliche Schwächung
der bereits geschädigten Herzmuskulatur resultieren kann.
Therapeutisch von Bedeutung sind außerdem:
- Vermeidung von Übergewicht
- psychologische Betreuung
- Krankengymnastik
- Atemschulung
- operative Behandlung von Skoliosen
- regelmäßige EKG und EMG.
Gentherapeutische Ansätze wurden erfolgreich an Mäusen getestet, zeigten beim Menschen
jedoch bislang keine Wirkung.
IV.
Gelelektrophorese
Ziel der Gelelektrophorese ist, Moleküle verschiedener Größe mit Hilfe eines elektrischen Feldes
in einem Gel zu trennen.
Nucleinsäuren liegen bei neutralem pH polyanionisch vor, d.h. viele Phosphatgruppen im
Phosphodiesterrückgrat tragen negative Ladungen. Deshalb wandern die Moleküle im elektrischen
Feld auf die Anode zu, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle von der Molekülgröße
abhängig ist.
Für die Matrix werden verschiedene Gelarten verwendet:
 Agarose-Gel (Grundlage: Seetang)
 Polyacrylamidgel.
Nach der Auftrennung werden die Nucleinsäuren mit Ethidiumbromid angefärbt und somit unter
UV-Licht sichtbar.
Die Größe unbekannter Fragmente lässt sich abschätzen, da die im Gel zurückgelegte
Wegstrecke umgekehrt proportional zum dekadischen Logarithmus der Anzahl der Basenpaare
ist.
V.
DNA-Sequenzierung
Das Ziel der DNA-Sequenzierung ist es, für einen DNA-Strang die Abfolge der einzelnen Basen
zu ermitteln. Hierzu lassen sich verschiedenen Verfahren anwenden.
Chemische Sequenzierung nach Maxam-Gilbert
Zunächst liegt eine Vielzahl identischer DNA-Einzelstränge vor, die nun am 5'-Ende radioaktiv
markiert (P) werden.
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Vier verschiedenen Ansätzen (ein Ansatz pro Base) wird jeweils ein anderes Reagens zugesetzt,
das einen Basentyp modifizieren kann. Die modifizierten Basen lösen sich daraufhin vom Strang,
während das verbleibende Zucker-Phosphat-Rückgrat durch Piperidin abgespalten wird. Die
Konzentration des Reagens wird so gewählt, dass durchschnittlich eine Base pro Strang
verändert wird. Da jede Base mit der gleichen Wahrscheinlichkeit modifiziert wird, wird bei
einer genügend großen Anzahl an Einzelsträngen an jeder möglichen Position gespalten, was zu
unterschiedlich langen Fragmenten führt. Diese werden mittels der Gelelektrophorese nach
Länge sortiert. Nach Durchführung einer Autoradiographie kann aus der Länge eines Fragments
Rückschlüsse von der Base auf eine bestimmte Position im Strang gezogen werden.
DNA-Sequenzierung nach Sanger-Coulson
Dieses Verfahren beruht auf einer enzymatischen Synthese von DNA-Strängen, die mit dem
Einbau eines modifizierten Nucleotids abbricht.
Mit Hilfe eines Primers und einer DNA-Polymerase wird eine Kopie einer als Einzelstrang
vorliegenden DNA angefertigt.
Den zur DNA-Synthese vorhandenen Nucleosidtriphosphaten werden in sehr geringer
Konzentration Didesoxynucleosidtriphosphate beigemischt.
Jede Kette, bei der ein Molekül dieser Didesoxynucleotide eingebaut wird, kann nicht weiter
verlängert werden, da keine 3’-OH-Gruppe vorhanden ist.
Die Ketten werden per Gelelektrophorese getrennt und durch Autoradiographie sichtbar
gemacht. Auch hier kann man auf Grund der Länge des Fragments Rückschlüsse auf die Position
der Base im Strang ziehen.
Aus gesundheitlichen Gründen wird heute bei der DNA-Sequenzierung auf die Verwendung
radioaktiver Stoffe weitgehend verzichtet. Man bedient sich stattdessen fluoreszierender
Farbstoffe.
VI.
Hybridisierung und Blotting
Unter Hybridisierung versteht man ein Verfahren, bei dem man aus einzelsträngiger DNA wieder
doppelsträngige DNA herstellt.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
Es handelt sich um eine molekularzytogenetische Technik, bei der markierte DNA-Sonden direkt
auf Chromosomen hybridisiert und durch Fluoreszenz sichtbar gemacht werden.
Bei der in-situ-Hybridisierung ist die DNA in den Chromosomen (Metaphase) fixiert.
Es erfolgt die DNA-Denaturierung durch Erhitzung.
Beim langsamen Abkühlen kommt es zur Renaturierung des DNA-Doppelstranges.
Als Hybridisierung bezeichnet man die Renaturierung einer DNA mit einem hinzugefügten DNAbzw. RNA-Stück (Sonde) anstatt des ursprünglichen Partnerstrangs.
Eine DNA-Sonde ist ein kleines mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes DNA-Fragment, das
komplementär zu einer gesuchten Sequenz (z.B. Gen) ist.
Durch die langsame Abkühlung lagert sich die Sonde an den DNA-Einzelstrang an und kann mit
Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops auf dem Chromosom lokalisiert werden.
Mit Hilfe dieses Verfahrens kann ein DNA-Fingerprint zur Personenidentifikation für
gerichtsmedizinische Zwecke erstellt werden.
Blotting
Unter Blotting versteht man die Übertragung von DNA oder anderer Makromoleküle aus einem
Elektrophorese-Gel auf Papier, Nitrocellulose-Filter oder ähnliche Träger.
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Southern-Blot:
- Ein DNA-Gemisch wird durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt.
- Die DNA wird auf einen Nitrocellulosefilter übertragen, wobei die Nitrozellulose die
DNA bindet und fixiert.
- Der Nachweis einer gesuchten Sequenz wird durch Hybridisierung des Blots in einer
Lösung durchgeführt, die eine komplementäre Sequenz als radioaktiv markierte Sonde
enthält.
- Da die Sonde nur an komplementäre Sequenzen bindet, kann das Hybrid anhand der
spezifischen Markierung auf der Nitrocellulosefolie nachgewiesen werden.
Wird anstatt DNA RNA auf einem Nitrozellulosefilter fixiert und anschließend mit einer
komplementären, markierten RNA- oder DNA-Sonde detektiert, so spricht man von
Northern-Blot.
Beim Western-Blot werden statt Nucleinsäuren Proteine im elektrischen Feld aufgetrennt und
durch Antikörper nachgewiesen.
Mit Hilfe des Western-Blot-Verfahrens werden z.B. HIV-Infektionen nachgewiesen.
VII.
Klonierung und Restriktionsenzyme
Unter Restriktionsenzymen (=Restriktionsendonukleasen) versteht man Enzyme, die
doppelsträngige DNA spezifisch, d.h. bei einer bestimmten Basenfolge (meist Palindromsequenzen) spalten können. Dabei entehen entweder sog. Sticky- oder Blunt-Ends (klebrige oder
glatte Enden).
Restriktionsenzyme sind für die Klonierung von DNA-Fragmenten von Bedeutung.
Prinzipiell werden bei allen Klonierungstechniken DNA-Sequenzen (z.B. Resistenzfaktoren) in
spezifische Vektoren (Plasmide, Viren) eingebaut und mit deren Hilfe in Wirtszellen vervielfältigt.
Beispiel Plasmidklonierung:
- Die Plasmide werden mit Hilfe von Restriktionsenzymen geschnitten.
- Die Spender-DNA wird mit dem selben Restriktionsenzym geschnitten und enthält meist
einen selektionierenden Faktor (z.B. Antibiotika-Resistenz).
- Die Spender-DNA wird mit dem Vektor durch Ligasen verknüpft.
- Die Vektoren werden in geeignete Wirtszellen übertragen.
- Die Wirtszellen werden auf einem Nährboden kultiviert, der das selektierende
Antibiotikum enthält. Auf diese Art überleben nur die Individuen, bei denen der
entsprechende Vektor eingebaut wurde. Diese vermehren sich und enthalten
dementsprechend abgesehen von Spontanmutationen alle das identische Erbgut (=Klon).
Herstellung einer copyDNA (cDNA):
- Ausgangspunkt ist eine isolierte mRNA des entsprechenden Gens.
- Über die reverse Transkriptase (Enzym aus Retroviren) wird die RNA-Matrize in ein
DNA-Molekül zurückgeschrieben.
- Mit Hilfe der DNA-Polymerase wird aus dem Einzelstrang ein Doppelstrang hergestellt.
Die Vorteile der cDNA liegen darin, keine Introns, sondern ausschließlich die das Genkodierenden Exons zu enthalten.
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