2. Material und Methoden
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Synthese von Protein-DNA-Konjugaten zur Herstellung eines Protein-Micro-Arrays Diplomarbeit des Fachbereichs Chemie der Universität Dortmund vorgelegt von Lars Gogolin aus Kamen-Heeren (Nordrhein-Westfalen) Dortmund, im Mai 2006 Die vorliegende Arbeit wurde am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund in der Abteilung Physikalische Biochemie von Prof. Dr. Roger S. Goody, unter Anleitung von Dr. Christian Becker durchgeführt und von Prof. Dr. Martin Engelhard, Fakultät für Chemie an der Universität Dortmund betreut. Der experimentelle Teil wurde vom 01. Oktober 2005 bis zum 05. Mai 2006 angefertigt. Seite II Eidestattliche Erklärung: Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich diese Arbeit selbständig und nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt habe. Dortmund, den 12. Mai 2006 Seite III Hoffnung ist der erste Schritt auf der Straße der Enttäuschung Seite IV 1. EINLEITUNG 1 1.1 DNA-Chips 1 1.2 Protein-Chips 3 1.3 Protein-DNA-Konjugate 6 1.4 Ypt- und Rab-GTPasen 10 2. MATERIAL UND METHODEN 13 2.1 Verwendete Materialien 13 2.1.1 Chemikalien 13 2.1.2 Instrumentation 14 2.1.3 Lösungen und Puffer für Proteinchemisches Arbeiten 15 2.1.4 Bakterienstämme und Oligonukleotide 17 2.1.5 MALDI-Matrix 17 2.1.6 HPLC-Puffer; Ionenaustausch-Chromatographie-Puffer 17 2.1.7 Medien zur Bakterienzucht 18 2.2 Molekularbiologische Methoden 18 2.2.1 Elektrotransformation von Plasmid-DNA in Bakterienzellen 18 2.3 Proteinchemische Methoden 19 2.3.1 Proteinexpression in E.coli und Proteinreinigung 19 2.3.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 20 2.3.4 Protein Aufreinigung 20 2.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zur Proteinauftrennung 20 2.3.6 Silberfärbung 22 2.4 Chemische Methoden 22 2.4.1 Festphasensynthese von Peptiden 22 2.4.2 Aufreinigung des Peptids 24 2.4.3 Native chemische Ligation des Peptids mit einem Thioester enthaltenden Protein 24 2.4.4 Vorbereitung der Oligonukleotide auf die Kupplungsreaktion 24 2.4.5 Cystein-Modifizierung des Oligonukleotids über HBTU 25 2.4.6 Cystein-Modifizierung des Oligonukleotids über den Pentafluorophenylester 25 2.4.7 Cystein-Modifizierung des Oligonukleotids über HOBt/ DCC 25 2.4.8 Abspaltung der Cys-modifizierten Oligonukleotide von den CPG-Beads und deren Aufreinigung 26 2.4.9 Analytik der Oligonukleotide 26 2.4.10 Entsalzung der Oligonukleotide über C18 ZIP TIPs zur Analytik 26 Seite V 2.4.11 3. UV-photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA 27 ERGEBNISSE 28 3.1 Synthese und Aufreinigung der Cystein-modifizierten Oligonukleotide 28 3.1.1 Synthese von Cys(S-t-Bu)-modifizierten Oligonukleotid A 28 3.1.2 Aufreinigung des modifizierten Oligonukleotids A mittels HPLC 29 3.1.3 Aufreinigung des modifizierten Oligonukleotids A über Aldehyd-funktionalisiertes PEGA-Harz 3.1.4 31 Cystein-Modifikation der Oligonukleotide A, B und C mit veränderter Schutzgruppenstrategie 33 3.1.5 HPLC-Aufreinigung von Cys-Oligonukleotid C mit Hilfe der MMT-Schutzgruppe38 3.2 Expression und Aufreinigung von Sec42, Ypt12C und Cherry-Ypt73 39 3.2.1 Expression und Aufreinigung von Ypt12C 39 3.2.2 Expression und Aufreinigung von Sec42 41 3.2.3 Expression und Aufreinigung von Cherry-Ypt73 42 3.3 Ligationsreaktionen der exprimierten Proteine mit einem Testpeptid 44 3.3.1 Synthese des Testpeptids CGK(ivDde)GHHHHHH 44 3.3.2 Ligation von Ypt12C mit CGK(ivDde)GHHHHHH 45 3.3.3 Ligation von Sec42 mit CGK(ivDde)GHHHHHH 47 3.4 Ligation von RBD mit Cys-Oligonukleotid A 50 3.5 Ligation von Ypt1Δ2C mit Cys-Oligonukleotiden A und B 51 3.6 Ligation von Cherry-Ypt7Δ3 mit Cys-Oligonukleotid C 55 4. DISKUSSION 58 4.1 Cysteinmodifizierung der Oligonukleotide 58 4.2 Expression und Aufreinigung von Ypt12C, Sec42 und Cherry-Ypt73 62 4.3 Test der Reaktivität der Proteinthioester 63 4.4 Ligation der RBD mit Cys-Oligonukleotid A 64 4.5 Ligation von Ypt12C mit Cys-Oligonukleotid A und B 64 4.6 Ligation von Cherry-Ypt73 mit Cys-Oligonukleotid C 65 5. ZUSAMMENFASSUNG 66 6. LITERATUR 67 Seite VI Abkürzungen Abb Abbildung AFM Rasterkraftmikroskopie APS Ammoniumperoxodisulfat CBD Chitin-binding-domain CPG controlled pore glass DCC Dicyclohexylcarbodiimid DCM Dichlormethan DDI DNA-directed-immobilization DIEA Diethylamin DIPEA Diisopropylethylamin DMF Dimethylformamid DNA Desoxyribonukleinsäure E.coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA enzyme-linked immuno-sorbent assay EPL expresssed protein ligation ESI electrospray-ionization GAP GTPase-activating protein GDP Guanosindiphosphat GEF guanine nucleotide exchange factor GFP green fluorescence protein GTP Guanosintriphosphat GTPase Guanosintriphosphat-Phosphatasen HBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphat HOBt 1-Hydroxybenzotriazol HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie IPTG Isopropylthiogalactosid LC liquid chromatography MALDI matrix-assisted laser-desorption-ionization MRNA messenger-RNA ODx Optische Dichte bei Wellenlänge x nm MESNA 2-Mercaptoethansulfonsäure Seite VII MMT Monomethoxytrityl MS Massenspektrum PAGE Polyarylamid-Gelelektrophorese PEGA Polyethylenglykolacrylamid PNA Peptidnukleinsäure Rab Ras genes from rat brain RBD Ras binding domain RNA Ribonukleinsäure RP reversed phase RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat SELDI surface-enchanced laser desorption-ionization SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment SNP single nucleotide polymorphism SPR surface plasmon resonance TCA Trichloressigsäure TCEP Tris(2-carboxyethyl)Phosphin Hydrochlorid TEA-Ac Triethylammonium-Acetat TEA-HFIP Triethylammonium-Hexafluoroisopropanol TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin TFA Trifluoressigsäure TOF time of flight Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan Ypt Yeast protein transport Seite VIII 1. Einleitung 1.1 DNA-Chips Das Konzept der DNA-Mikroarrays wurde erstmals im Jahr 1995 von P. O. Brown eingeführt (Schena et al., 1995). Ein DNA-Mikroarray ist ein monolithischer fester Träger auf dem eine Vielzahl von DNA–Sonden verschiedener Sequenzen immobilisiert sind, welche jeweils komplementäre DNA–Stränge erkennen. Die Stärke der DNA–Chiptechnologie liegt darin, dass auf einer sehr kleinen Fläche eine sehr große Anzahl an unterschiedlichen Sonden aufgebracht werden kann, und somit aus einer einzigen Probenlösung, parallel in einem Schritt, tausende oder gar hunderttausende von DNA–Sequenzen detektiert werden können. So wurden zum Beispiel von Affymetrix durch Photolithographie DNA-Chips mit einer Dichte von 106 Oligonukleotidsequenzen pro cm2 dargestellt (Mcgall et al. 1996). Diese Vorteile eröffnen ein weites Feld von Anwendungen für die Chiptechnologie. So kann zum Beispiel die Bestimmung von Genexpressionsleveln anhand der Detektion verschiedener mRNA–Spezies zum Verständnis von zellulären Zusammenhängen, wie zum Beispiel Signaltransduktionswegen oder metabolischen Vorgängen, beitragen. Genexpressionsstudien können ebenso für ein besseres Verständnis von Krankheiten, wie zum Beispiel Krebs, sorgen (DeRisi et al. 1999). Mutationen in bestimmten Onkogenen können mittels DNA– Mikroarrays erkannt werden. Aufgrund ihrer Eigenschaft, zwischen vollkomplementären Strängen und Einzelbasenmutationen unterscheiden zu können, sind sie in der Lage so genannte Single-nucleotide-polymorphisms (SNPs) im Genom zu identifizieren (Wang et al. 1998). Dies kann zur Entwicklung von SNP-Markern genutzt werden. Ein weiteres Anwendungsgebiet für die DNA–Chiptechnologie ist die Aufschlüsselung von kombinatorisch hergestellten Split-Pool-Molekülbibliotheken (Winssinger et al. 2001). So können zum Beispiel durch PNA–Sequenzen (Peptidnukleinsäure) adressierbare Bibliotheken von organisch synthetisierten kleinen Molekülen auf das Mikroarray aufgebracht werden und anschließend mit einer Proteintargetlösung inkubiert werden. Bindende Moleküle können dann detektiert und durch die PNA–Sequenz identifiziert werden. Mittels DNA–Chips können auch Pathogene, wie Mikroorganismen oder Viren eindeutig erkannt werden. So konnten Vora et al. (2004) anhand von Pathogen-spezifischen DNA- Seite 1 Sequenzen aus einer wässrigen Probe mit einem 63fachen Überschuss an kontaminierender DNA heraus die gesuchten Pathogene erfolgreich nachweisen. Der allgemeine Ablauf eines solchen DNA-Microarray-Assays ist in Abbildung 1 skizziert. Als festes Trägermaterial für die Chips werden am häufigsten Glas oder Silizium-Träger verwendet, da sie einfach zu modifizieren sind (Benters et al. 2001). Auf die aktivierten Oberflächen kann das Oligonukleotid dann durch Mikrospotting (Lamture et al. 1994) oder Inkjetting (Okamoto et al. 2000) aufgebracht und an das Spacer/ Linker- System gekoppelt werden. Bei der Methode der Photolithographie (Mcgall et al. 1996) wird das Oligonukleotid durch Phosphoramiditsynthese direkt auf dem Träger synthetisiert. Bei Zugabe einer Analytlösung, die ein komplementäres Oligonukleotid enthält, hybridisiert dieses an dem immobilisierten Strang und erzeugt ein Signal, das detektiert werden kann. Abb. 1: Die Fängeroligonukleotide sind über ein Linkersystem auf einem aktivierten Glasträger immobilisiert. Nach der Hybridisierung mit einem komplementären Zielstrang wird ein Signal erzeugt und detektiert. Die wohl am meisten genutzte Methode zur Detektion ist die Fluoreszenzmarkierung des Analyten. Es gibt aber auch Methoden, bei denen das Analytoligonukleotid vor der Inkubation auf dem DNA-Chip nicht markiert werden muss, wie zum Beispiel die elektrochemische Detektion (Dominguez et al. 2004), die Detektion durch Surface plasmon resonance (SPR) (Boozer et al. 2006), die Rasterkraftmikroskopie (AFM) (Hansma et al. 1996), eine akustische Detektion (Tombelli et al. 2000) oder die Detektion durch Massenspektrometrie (Ross et al. 1998). Seite 2 1.2 Protein-Chips Die beschriebenen Vorteile von DNA-Mikroarrays haben dazu geführt, dass die MicroarrayTechnologie auch verstärkt auf das Feld der Proteine ausgeweitet wurde. Erste Veröffentlichungen zur Immobilisierung von Proteinen liegen schon 40 Jahre zurück. So haben Silman et al. 1966 biologisch aktive Antikörper auf festen Trägern immobilisiert. Generell kann man unter zwei hauptsächlichen Anwendungen von Protein-Chips unterscheiden. Die erste ist die Quantifizierung von einzelnen Zielproteinen aus komplexen Gemischen, wie Zellysaten oder Blutproben, heraus. Diese Anwendung kann zum Beispiel in der klinischen Diagnostik genutzt werden. Auch für Proteomanalysen sind ProteinMikroarrays nützlich, da mRNA–Studien über DNA–Chips keinerlei posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung, Acetylierung oder Phosphorylierung berücksichtigen können. In der Vergangenheit wurden Proteomanalysen durch 2D–Gelelektrophorese mit anschließendem in-Gel-Verdau und Massenpektrometrie oder durch LC-MS-Methoden, bei denen Ionenaustausch- Reversed Phase- oder Affinitätschromatographie hintereinander gekoppelt werden, durchgeführt. Die Nachteile, wie geringe Sensitivität und schlechte Reproduzierbarkeit, zeitraubende Protokolle und das Fehlen von paralleler Detektion, liegen auf der Hand. Die zweite Anwendung ist die Erforschung von Proteinfunktionen, wie die molekulare Erkennung von Wirkstoffen, Hormonen oder Metaboliten (Fang et al. 2002), die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen (Ramachandran et al. 2004) oder ProteinDNA-Wechselwirkungen (Hall et al. 2004). Auch enzymatische Aktivitäten können untersucht werden, wobei entweder das Enzym immobilisiert wird und die Aktivität nach einer Substratzugabe detektiert werden kann, oder das Substrat immobilisiert wird und die Substraterkennung von Enzymen getestet werden kann. Anwendungen, wie zum Beispiel molekulare Fabriken, werden durch Enzymimmobilisierung möglich (Jung et al. 2004). Dabei werden die jeweiligen Enzyme verschiedener aufeinander folgender biokatalysierter Syntheseschritte auf dem Chip nebeneinander immobilisiert und so das in mehreren Schritten dargestellte Reaktionsprodukt erhalten. Allerdings gilt es einige Schwierigkeiten zu überwinden, bevor diese Anwendungen möglich werden. So muss das Fängermolekül zunächst auf dem Chip immobilisiert werden. Dazu gibt es grundsätzlich vier verschiedene Ansätze: Unspezifisch/ nicht kovalent, unspezifisch/ kovalent, spezifisch/ nicht kovalent und spezifisch/ kovalent. Im folgenden werden Beispiele Seite 3 für die verschiedenen Ansätze vorgestellt. Dabei ist zu beachten, dass für anschließende Messungen bei allen Methoden der Immobilisierung die native Konformation eines Proteins unbedingt erhalten bleiben muss. Ansonsten können seine Aktivität oder Bindungseigenschaften verändert werden oder vollständig verloren gehen. Für einen unspezifisch/ nicht kovalenten Immobilisierungsansatz können Nitrocellulosemembranen (Joos et al. 2000) oder mit Nitrocellulose modifizierte Glasträger, so genannte FAST-slides (Angenendt et al. 2003), verwendet werden. Eine andere Möglichkeit bieten CalixKrone-5-Derivate (Lee et al. 2003). Hierbei sind mit Thiol- oder Aminogruppen versehene Calixarene auf Glasträgern oder Goldoberflächen kovalent gebunden. Über eine Krone-5 Modifizierung des Calixarens können die Aminogruppen von Proteinen an die Oberfläche binden (Abb.2). Abb. 2: Kovalente Immobilisierung von modifizierten Calixarenen an festen Trägern. Das Protein bindet unspezifisch/ nicht kovalent durch Wechselwirkung von Aminogruppen mit Krone-5 Einheiten des Calixarens (Lee et al. 2003). Für den zweiten Ansatz verwendet man funktionalisierte Oberflächen, an die die Proteine kovalent gekoppelt werden. So können die Oberflächen zum Beispiel mit Epoxygruppen (Zhu et al. 2000), Aldehydfunktionen (MacBeath et al. 2000) oder Isothiocyanatgruppen (Benters et al. 2001) versehen werden. Zum dritten Ansatz sollen zwei Beispiele aufgezeigt werden. Nicht kovalent aber hochspezifisch können die Proteine über Affinitätstags oder DNA–Konjugate gebunden werden. So kann die Chip-Oberfläche mit Nickel beschichtet werden und das Protein über einen His-tag binden (Zhu et al. 2001, Becker et al. 2001) oder aber das Protein über eine Seite 4 Biotinmodifizierung an auf den festen Träger immobilisiertes Avidin binden (Lesaicherre et al. 2002). Protein-DNA-Konjugate können über die DNA directed immobilization (DDI) auf übliche DNA–Mikroarrays aufgebracht werden. Durch die spezifische Sequenz ist das Konjugat adressierbar (Becker et al. 2005, Niemeyer et al.1998). Dieser Ansatz verknüpft die Vorteile der DNA-Chips mit der Immobilisierung von Proteinen. Die spezifische, kovalente Immobilisierung kann zum Beispiel durch die Staudinger Ligation (Watzke et al. 2006) oder die native chemische Ligation (Uttamchandani et al. 2004) bewerkstelligt werden. Diese beiden Kopplungsmethoden erhalten ihre hohe Spezifität durch ihre Bioorthogonalität, denn das Azid-Phosphin-Paar und der C-terminale -Thioester kommen in der Natur so nicht vor, wodurch ungewollte Reaktionen vermieden werden. Die Art der Detektion der Analyten und die Nachweisgrenze sind essentiell für die Anwendung. So können auch bei Protein-Arrays Fluoreszenzmethoden verwendet werden (McBeath et al. 2000, Zhu et al. 2001). Bei Antikörperarrays besteht sogar die Möglichkeit eines Sandwichkomplexes mit zwei Antikörpern, was die Spezifität der Analyse stark erhöht. Dies ist zum Beispiel bei einem Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) der Fall. Ein Nachteil ist, dass auch bei Proteinen der Analyt oftmals vor der Messung erst noch fluoreszenzmarkiert werden muss. Auch bei der Detektion via Isotopenmarkierung und durch Chemilumineszenz müssen die Analyten mit Radioisotopen (Zhu et al. 2001) oder funktionellen Einheiten markiert werden. Als weitere Methoden sind MALDI-TOF (matrix-assisted laser-desorption-ionization time of flight) (Heintz et al. 2004) und SELDI-TOF (surface-enchanced laser desorption-ionization time of flight) zu nennen. Vorteile sind, dass die Probe vorher nicht markiert zu werden braucht und dass man über die Probe mehr Informationen erhält, als eine einfache „Ja oder Nein“- Antwort, nämlich die Masse des bindenden Proteins. Allerdings ist es sehr anspruchsvoll mittels Massenspektrometrie zu quantifizieren. Eine in Zukunft immer wichtiger werdende Methode ist auch bei den Protein-Chips die SPR (Salamon et al. 1999). Auch diese Methode ist Label-frei und bietet Echtzeit-Analysen von Antigen-Antikörper, Protein-Protein oder Rezeptor-Ligand Wechselwirkungen. Für Protein-Chip-Untersuchungen werden verschiedenste Fängermoleküle verwendet. Antikörper werden dazu verwendet um Antigene aus komplexen Lösungen heraus zu detektieren. Die Detektionsgrenzen liegen bei etwa 8 fg/ml (Joos et al. 2000), was Antikörperarrays und damit verbundene Protokolle wie den ELISA zu wichtigen Werkzeugen in der klinischen Diagnostik machen. Seite 5 Des weiteren können DNA/RNA-Aptamere verwendet werden, die durch den SELEXProzess (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) generiert werden (Jayasena 1999). Die Bindungseigenschaften sind ähnlich denen der Antikörper und sie sind leicht zu synthetisieren und zu amplifizieren. Allerdings ist die Diversität der Bindungsstellen mit nur vier Nukleobasen gegenüber 20 essentiellen Aminosäuren eingeschränkt. Peptidarrays können herangezogen werden um durch Proteinmimik Studien über molekulare Erkennung zu betreiben (Reimer et al. 2002). So können Protein-Protein oder AntikörperAntigen Wechselwirkungen untersucht werden. Die Peptide sind kostengünstig darzustellen und leicht zu markieren. Außerdem sind sie verglichen mit Proteinen erheblich stabiler gegenüber äußeren Einflüssen. Allerdings ist ihre Affinität als Bindungspartner zu Proteinen nicht so hoch, wie bei einer echten Protein-Protein-Wechselwirkung. Arrays von kleinen organischen Molekülen können dazu verwendet werden Rezeptor-LigandPaare zu finden und zu erforschen (MacBeath et al. 1999). Dies ermöglicht eine schnelle Wirkstoffentwicklung. Die kleinen Moleküle sind stabil und zum Beispiel über kombinatorische Chemie schnell und leicht in großer Anzahl herzustellen. Fusionsproteine werden dazu verwendet Protein-Protein-Wechselwirkungen zu detektieren und damit auch Informationen über die Funktionen von Proteinen zu sammeln. Fusioniert werden die Proteine mit Einheiten zur nicht kovalenten Immobilisierung, wie einem His-tag, dem Chitin-binding-protein, dem Maltose-binding-protein oder mit DNA-Oligonukleotiden. 1.3 Protein-DNA-Konjugate Zur Darstellung von Protein-DNA-Konjugaten können diverse Reaktionen, basierend auf verschiedenen funktionellen Gruppen, herangezogen werden. So können die Proteine beispielsweise durch Aldehyd- und Hydrazingruppen über eine Hydrazonbildung gekoppelt (Kozlov et al. 2004) oder aber durch Maleinimidfunktionalisierung an Thiole addiert werden (Boozer et al. 2006). Auch eine Fusion über die Staudinger Ligation ist möglich (Grandjean et al. 2005). Dabei kann ein Biomolekül, welches ein Azid trägt, nucleophil von einem Phosphin angegriffen werden, was zu einem Phosphazid führt. Durch den Austritt von Stickstoff-Gas bildet sich ein reaktives Azaylid, welches hydrolyseempfindlich ist. Durch das spezielle Design des Phosphans von Bertozzi et al., bei dem ein Methylester in der günstigen ortho-Position zum Phosphor steht, ist eine Reaktion selbst in Wasser möglich (Saxon et al. 2000). Der Stickstoff Seite 6 greift nucleophil den Methylester an und bildet eine Amidbindung und ein Phosphinoxid aus (Abb. 3). Abb. 3: Konjugation zweier Biomoleküle über die Staudingerligation (Grandjean et al. 2005). Eine weitere Methode zur Darstellung von Protein-DNA-Konjugaten ist die native chemische Ligation. Die native chemische Ligation wurde in den 90iger Jahren von Stephen Kent (Dawson et al. 1994) eingeführt, um entschützte Peptide chemoselektiv miteinander zu verknüpfen, was den Weg zur Synthese kleiner bis mittelgroßer vollsynthetischer Proteine eröffnete. Bei dieser Ligationsmethode wird eine native Peptidbindung unter wässrigen Bedingungen und bei physiologischen pH-Wert (7-8) geknüpft. Dabei greift die Thiolgruppe eines N-terminalen Cysteins eines Peptidsegmentes nucleophil den C-terminalen -Thioester eines zweiten Peptidsegmentes an. Anschließend findet ein SN Acyltransfer der Aminogruppe des Cysteins statt, welcher irreversibel ist und die native Peptidbindung knüpft. Diese Art der Umlagerung wurde schon 1953 von Wieland et al. beschrieben. Allerdings gelingt es mit dieser Methode nicht Proteine beliebiger Größe herzustellen. Um große Proteine für Untersuchungen zugänglich zu machen hat sich der natürliche Vorgang des Protein-Splicing als nützlich herausgstellt. Das Protein-Splicing ist ein posttranslationaler Prozess bei dem aus einem Vorläuferprotein durch intramolekulare Umlagerungen ein Teil des Proteins herausgeschnitten wird (Intein) und die beiden „Enden“ (Exteine) wieder durch eine native Peptidbindung verknüpft werden (Noren et al. 2000). Seite 7 Abb. 4: Schematische Darstellung des Protein-Splicing. Im ersten Schritt findet ein S N Acyltransfer des NExteins an die SH-Gruppe des N-terminalen Intein-Cysteins statt. Im nächsten Schritt wird das N-Extein in einer intramolekularen Umesterung auf ein N-terminales Cystein des C-Exteins übertragen. Durch eine Cyclisierungsreaktion des C-terminalen Intein-Asparaginrestes wird das Intein abgespalten und die beiden Exteine durch einen SN Acyltransfer irreversibel miteinander verknüpft (Muir 2003). Der Mechanismus des Protein Splicings ist in Abbildung 4 dargestellt. Im ersten Schritt findet ein NS (NO) Acyltransfer statt. Dabei wird das N-Extein an die SH- bzw. OH-Gruppe des N-terminalen Cysteins oder Serins des Inteins transferiert. In einem zweiten Schritt wird das N-Extein in einer intramolekularen Umesterung auf ein N-terminales Cystein oder Serin des C-Exteins übertragen. Durch eine Cyclisierungsreaktion des Asparaginrestes am CTerminus des Inteins, welche zu einem Succinimidderivat führt, wird das Intein abgespalten. In einer abschließenden Reaktion werden die Exteine durch eine SN (ON) Acylumlagerung irreversibel in Form einer Amidbindung verknüpft. Seite 8 Abb. 5: Mit Hilfe der CBD wird das Fusionsprotein gereinigt und durch eine Mutation im Intein kann nur der erste Schritt des Splicing vollzogen werden. Nach Zugabe von Thiolen wird das N-Extein abgespalten und dabei in den korrespondierenden -Thioester überführt. Danach kann es durch die Native Chemical Ligation mit einem Peptidsegment oder einem Cystein-modifizierten Oligonukleotid verknüpft werden. Dieser Vorgang wird Expressed Protein Ligation genannt (Muir 2003). Wenn man das C-terminale Asparagin innerhalb des Inteins durch Mutation mit einem Alanin ersetzt, ist der letzte Schritt des Protein-Splicing blockiert. Proteine, welche mit einem solch künstlichen Intein N-terminal fusioniert sind und über einen Affinitätstag, wie der Chitinbinding-domain (CBD) verfügen, können gereinigt und durch Zugabe von Thiolen abgespalten werden. Dabei werden sie in den entsprechenden Protein--Thioester überführt. Dieses Protein kann dann durch die native chemische Ligation mit einem synthetischen Peptidsegment oder einem Cystein-modifizierten Oligonukleotid verknüpft werden (Becker et al. 2005, Burbulis et al. 2005, Takeda et al. 2004). Diese Methode wird Expressed Protein Ligation (EPL) genannt und ist in Abbildung 5 gezeigt (Muir 2003). Seite 9 1.4 Ypt- und Rab-GTPasen Der Transport von Hormonen, Neurotransmittern oder Membranproteinen, wie zum Beispiel Rezeptoren, zwischen Zellkompartimenten geschieht durch Vesikel, welche aus dem DonorKompartiment ausknospen und mit dem Akzeptorkompartiment verschmelzen. Die Proteine der Ypt-/ Rab-Familie (Yeast protein transport/ Ras genes from rat brain) sind dabei bei allen wichtigen involvierten Prozessen beteiligt. So spielen sie zum Beispiel eine regulatorische Rolle bei der Ausbildung und dem Transport von Vesikeln oder dem Andocken der Vesikel an die Akzeptormembran und beim Verschmelzen mit dieser (Abb. 6). Abb. 6: Prozesse mit Ypt-/ Rab-Beteiligung (Segev 2001a). Durch die Aufschlüsselung der Gensequenzen von Hefe und Mensch, weiss man, dass es elf Ypts und mehr als 60 Rab-Proteine gibt. Vier der Ypts (Ypt1, Ypt31/32, Sec4) haben definierte Rollen bei der Exocytose und sind für die Lebensfähigkeit der Zelle essentiell, vier (Ypt51/52/53, Ypt7) sind an der Endocytose beteiligt und nicht unbedingt lebensnotwendig für die Zelle. Die Funktion des Ypt6 ist immer noch umstritten (Segev 2001a). Die Ypt- und Rab-Proteine aus der Hefe bzw. dem Menschen gehören zur Ras-Superfamilie der Guanosintriphosphat-Phosphatasen (GTPasen). GTPasen sind Guaninnukleotid-bindende Proteine, welche durch GEFs (guanine nucleotide exchange factor) in ihre aktive Form überführt werden. Dabei wird das gebundene GDP durch GTP ausgetauscht, wobei eine Konformationsänderung stattfindet, welche die Bindung an weitere Effektoren ermöglicht. Das G-Protein wird wieder in seine inaktive Form überführt, indem durch GAPs (GTPase- Seite 10 activating protein) die intrinsische Hydrolyse des GTP zu GDP angeregt wird. Dadurch kehrt das Protein in seine ursprüngliche inaktive Konformation zurück (Abb. 7). Diese Mechanismen spielen auch bei verschiedenen Krankheiten wie zum Beispiel Choroideremia, dem Griscelli Syndrom oder dem Hermansky- Pudlak Syndrom eine bedeutende Rolle. Daher ist eine Erforschung der genauen Zusammenhänge zwischen den Ypts und Rabs und ihren Effektoren wünschenswert (Seabra et al. 2002). Der Einsatz eines Ypt/ Rab-Microarrays bestehend aus allen Ypt/ Rab-Proteinen wäre ein sehr nützliches Werkzeug zum Erreichen dieses Zieles. Sec4 GEF GAP Sec2 Gyp2, Gyp3, Gyp4 Ypt1 TRAPP Gyp3 Ypt31 TRAPP Gyp3 Ypt32 TRAPP Gyp3 Ypt51 Vps9 Gyp3 Ypt52 Vps9 Ypt53 Vps9 Ypt6 Ric1/Rgp1 Gyp2, Gyp3, complex Gyp4 Vps39 Gyp4 Ypt7 Abb. 7: GEF und GAP vermittelter Aktivierungs- bzw. Inaktivierungszyklus der GTPasen. Auch die GAPs und GEFs sind wiederum von Signalfaktoren reguliert. Durch die GTPasen wird dann das Signal an Effektorproteine weitergeleitet. Tabellarische Auflistung bekannter Ypt GAPs und GEFs (Segev 2001). Seite 11 Zielsetzung: Das Ziel dieser Arbeit ist es Konjugate aus Ypt-Proteinen und Oligonukleotiden mittels Expressed Protein Ligation herzustellen, um diese für die Herstellung eines Ypt-Chips zu nutzen. Dazu werden 5’-aminofunktionalisierte Oligonukleotide an der festen Phase mit Hilfe von Aktivestern über eine Amidbindung Cystein-modifiziert. Die so generierten Oligonukleotide werden dann per nativer chemischer Ligation mit den in E.coli exprimierten Proteinen Sec42, Ypt12C und Cherry-Ypt73 ligiert. Die erhaltenen Fusionsproteine werden dann mit Hilfe von Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie getrennt und durch DNA-directed-immobilization auf einem DNA-Chip nicht kovalent und adressiert immobilisiert. Anschließend werden diese durch Fluoreszenzmethoden nachgewiesen. Seite 12 2. Material und Methoden 2.1 Verwendete Materialien 2.1.1 Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien waren von p.a. Qualität und stammten von den Firmen Aldrich (Heidenheim), Baker (Groß-Gerau), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Riedel de Haen (Seelze), Roth (Karlsruhe), AppliChem (Darmstadt), Serva (Heidelberg) und Sigma (Steinheim). Das DNA Ultrafast Cleavage and Deprotection Reagent wurde bei der Firma Beckman Instruments (Fullerton CA) erstanden. Die für die Zellanzucht verwendeten Antibiotika waren von Calbiochem (Schwalbach) und Gerbu (Gaiberg), Nährmedien (Bacto Trypton und Hefe-Extrakt) von Gibco BRL (Neu Isenburg). Der verwendete LMW-Proteinmarker enthielt -Lactalbumin (14.4 kDa), Trypsininhibitor (20.1 kDa), Carboanhydrase (30 kDa), Ovalbumin (45 kDa), Albumin (66 kDa) und Phosphorylase b (97 kDa) und wurde von Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire) bezogen. Der verwendete Gelfiltrationsstandard enthielt Thyroglobulin (670 kDa), Rinder--Globulin (158 kDa), Hühner-Ovalbumin (44 kDa), Pferde-Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B12 ( 1,35 kDa) und wurde bei Bio-Rad (München) erstanden. Das polymere Trägermaterial für die Festphasensynthese der Peptide wurde von Novabiochem (Schwalbach) bezogen. Seite 13 2.1.2 Instrumentation Die Anzucht von E.coli erfolgte in temperierbaren Schüttlern der Firma Invors AG (Bottmingen) unter aeroben Bedingungen. Die Elektrotransformation kompetenter E.coli Zellen wurde mittels eines E.coli-Pulser der Firma Biorad (München) in Elektroporationsküvetten der Firma Invitrogen (Leek) durchgeführt. Sedimentationen erfolgten in den Zentrifugen RC28S und Avanti J20XP der Firmen Sorvall (Bad Homburg) und Beckmann Coulter in den Rotoren F28/36 sowie JLA 8.1000. Der Zellaufschluss wurde durch den Mikrofluidizer des Typs M-110S der Firma Microfluidics Corp. (Newton) durchgeführt. Die Chitin beads wurden von der Firma New England Biolabs (Ipswich MA) bezogen. Polyacrylamid-Gelelektrophoresen erfolgten mit dem Mini-PROTEAN III-System der Firma Biorad. Zur Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) wurden Anlagen der Firmen Beckmann (System Gold) und Waters verwendet. Die verwendeten Säulen wurden von den Firmen Bischoff Chromatography, YMC und Vydac bezogen. Für Größenausschluss- und Ionenaustausch-Chromatographie wurden Systeme der Firmen Waters und Amersham Biosciences benutzt, die entsprechenden Säulen waren von Amersham Pharmacia und Phenomenex (Aschaffenburg). Zur Messung von Massenspektren wurde ein Voyager-DE Pro MALDI-Massenspektrometer von Perseptive Biosystems (Weiterstadt) sowie das ESI-MS LCQ Advantage MAX (Finnigan) verwendet. UV-Messungen wurden am Bio Photometer von Eppendorf (Hamburg), am GeneQuant von Pharmacia Biosystems und am DU 640 Spectrophotometer von Beckman Coulter vorgenommen. Fluoreszenzmessungen wurden am Fluoromax-5000 von FujiFilm vorgenommen. Zum Einengen von Proben und Entfernen von Lösungsmitteln wurde die Speed vac Plus SC110A von Savant verwendet. Seite 14 2.1.3 Lösungen und Puffer für Proteinchemisches Arbeiten 2.1.3.1 Schägger-Jagow Gele Tabelle 1: Inhaltstoffe der Schägger-Jagow Puffer Puffer Inhaltstoffe Anodenpuffer 0,2 M Tris pH 8,9 Kathodenpuffer 0,1 M Tris pH 8,25 0,1 M Tricine 0,1 % SDS SDS-Gelpuffer 3 M Tris pH 8,25 0,3 % (w/v) SDS SDS-Probenpuffer 2x 120 mM Tris pH 8,0 6 % (w/v) SDS 35 % (v/v) Glycerin 3,55 % (v/v) Monothioglycerol 0,05 % (w/v) Bromphenolblau in Wasser 2.1.3.2 Lämmli Gele Tabelle 2: Inhaltstoffe der Lämmli Puffer Puffer Trenngelpuffer Inhaltstoffe 1,5 M Tris pH 8,8 0,4 % (w/v) SDS Sammelgelpuffer 0,5 M Tris pH 6,8 0,4 % (w/v) SDS Laufpuffer 25 mM Tris 0,2 M Glycin 1 % (w/v) SDS SDS-Probenpuffer 2x 950 µl Lämmli sample buffer (Bio-Rad) 50 µl -Mercaptoethanol Seite 15 2.1.3.3 Silberfärbung Tabelle 3: Zusammensetzung der Lösungen zur Silberfärbung Lösung (je 50 ml) Fixierlösung Inhaltstoffe 40 % Methanol 10 % Essigsäure in H2O Inkubationslösung 15 ml Ethanol 3,4 g NaAc3 H2O 0,1 g Na-Thiosulfat5 H2O in H2O Silbernitratlösung 0,05 g AgNO3 30 µl 36 % Formaldehyd in H2O 1 g Na2CO3 1 H2O Entwicklerlösung 15 µl 36 % Formaldehyd in H2O Stopplösung 0,04 M EDTA pH 8,0 10 % Glycerin in H2O 2.1.3.4 Coomassie-Färbung Tabelle 4: Zusammensetzung der Färbe- und Entfärbelösung Lösung Coomassie-Färbelösung Inhaltstoffe 0,1 % (w/v) Coomassie R250 10 % (v/v) Essigsäure 5 % (v/v) Methanol in Wasser Entfärbelösung 10 % (v/v) Essigsäure 5 % (v/v) Methanol in Wasser Seite 16 2.1.4 Bakterienstämme und Oligonukleotide Bakterienstämme: BL21(DE3)RIL Oligonukleotide: Alle folgenden Oligonukleotide wurden von der Firma Metabion (Martinsried) bezogen. A: 5’-C6-Aminolink-AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA–3’ B: 5’-C6-Aminolink-CTG AGG TAG GTA GAT CAC TTG AGG T–3’ C: 5’-C6-Aminolink-ATG TGA CCT GTA TTG TTG GAT GTG AG–3’ 2.1.5 MALDI-Matrix 3-HPA (Oligonukleotide): 3-Hydroxy-Pikolinsäure in MeCN/H2O 50:50 ges./ Diammoniumcitrat in H2O (5 mg/100 µl) 8 : 1 (v/v) 2.1.6 HPLC-Puffer; Ionenaustausch-Chromatographie-Puffer Triethylammonium-Acetat (TEAAc) Puffer: A: 100 mM TEAAc in H2O, pH 7 B: 100 mM TEAAc in H2O/ MeCN 1:1, pH 7 Triethylammonium-Hexafluoroisopropanol (TEA-HFIP) Puffer: C: 90 % (TEA 16,3 mM, HFIP 400 mM, in H20 pH 7,9), 10 % MeOH D: 60 % (TEA 16,3 mM, HFIP 400 mM, in H20 pH 7,9), 40 % MeOH HPLC-Puffer für Peptide: E: H2O + 0,1 % (v/v) TFA F: Acetonitril + 0,08% (v/v) TFA Seite 17 Puffer für den Q-Anionenaustauscher: G: 20 mM Tris pH 8,3 H: 20 mM Tris, 1 M NaCl pH 8,3 2.1.7 Medien zur Bakterienzucht Tabelle 5: Zusammensetzung der Nährmedien LB-Medium 10 g/l Tryptonhydrolysat 5 g/l Hefehydrolysat 10 g/l NaCl LB-Amp-Cam-Medium LB-Medium 125 µg/ml Ampicilin 34 µg/ml Chloramphenicol LB-Amp-Cam-Platten LB-Medium 15 g/l Select Agar 125 mg/l Ampicilin 34 µg/ml Chloramphenicol Ampicilin-Stammlösung 125 mg/ml Ampicilin in Wasser Chloramphenicol-Stammlösung 34 mg/ml Chloramphenicol in Ethanol 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 Elektrotransformation von Plasmid-DNA in Bakterienzellen Ein Aliquot (~ 50 µl) tiefgefrorener, elektrokompetenter Zellen wurde kurz aufgetaut und mit 0,6 µl der auf 0°C vorgekühlten Plasmidlösung (Konzentration etwa 25 ng/15µl) versetzt. Nach Mischen wurde die DNA/Bakteriensuspension ohne Luftblasen zu erzeugen in eine kalte Elektroporationsküvette (Elektrodenabstand 2 mm) pipettiert und mit 1,8 kV elektrotransformiert. Anschließend wurde die Suspension sofort in 950 µl LB-Medium aufgenommen und in ein Reagenzglas überführt. Es wurde 45 min bei 37°C geschüttelt und Seite 18 danach 60 µl des Mediums auf einer LB-Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum ausgestrichen. Die Platte wurde auf dem Deckel liegend im Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert. 2.3 Proteinchemische Methoden 2.3.1 Proteinexpression in E.coli und Proteinreinigung Die Expression des Proteins erfolgte nach einem Standardprotokoll. Dazu wurden die über Nacht auf der Agar-Platte gewachsenen Zellkulturen vollständig in LB-Medium überführt und mit diesem die Expressionskultur angeimpft. Sie wurde bei 37°C bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD578 ~ 0,6) wachsen gelassen. Die Expression des Proteins wurde durch Zugabe von 0,3 mM IPTG über Nacht induziert. Die Temperatur nach der Induktion lag bei 18°C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation isoliert (20 min, 6000 rpm, 4°C) und das Zellpellet in Aufschlusspuffer (0,3 M NaCl, 50 mM NaPi, bei pH 8) resuspendiert. Der Aufschluss der Zellen erfolgte im Mikrofluidizer. Nach der Abtrennung der Zelltrümmer durch Zentrifugation (30 min, 20000 rpm, 4°C) wurde der Überstand dekantiert und die löslichen Proteine erhalten. Die Aufreinigung der Proteine erfolgte mittels Chitinbeads. Das Säulenmaterial wurde mit zehn Säulenvolumen Wasser gewaschen und dann mit zehn Säulenvolumen Waschpuffer (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM Gdp bei pH 7,5) equilibriert. Nach Auftragen des Überstands (Flussrate ~ 1ml/min) wurden die Chitinbeads mit zehn Säulenvolumen Waschpuffer mit 1 % Triton gewaschen. Es folgten zwei weitere Waschgänge mit jeweils zehn Säulenvolumen, wobei der Zweite wiederum 1 % Triton enthielt. 2.3.2 Splicing des Mxe-Fusion-Proteins Die gewaschene Chitin-Säule wurde mit MESNA-enthaltenden Waschpuffer versetzt, sodass eine MESNA Gesamtkonzentration von 500 mM entstand. Diese Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 4°C leicht geschwenkt. Anschließend wurde die Lösung, welche ein Protein mit C-terminalem Thioester enthielt, eluiert. Das Säulenmaterial wurde danach drei mal mit je zehn Säulenvolumen Waschpuffer gewaschen, wobei der zweite Waschgang 1 % Triton enthielt. Seite 19 2.3.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der von Bradford (Bradford, 1976) beschriebenen Methode. Das Absorptionsmaximum des Farbstoffs Coomassie Blue G-250 verschiebt sich bei Bindung an ein Protein mit positiven Seitenketten von 465 nm nach 595 nm. Es wurde 1 µl der zu untersuchenden Probe mit 99 µl Wasser verdünnt und anschließend mit dem Bradfordreagenz auf 1 ml aufgefüllt. Die Messung der Absorption erfolgte nach 10 min. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte an Hand einer Eichgeraden mit dem Standard BSA. 2.3.4 Protein Aufreinigung Nach dem Splicen des Mxe-Fusion-Proteins wird die Protein-enthaltende Pufferlösung im Centricon eingeengt. Es wurden Amicon Ultra Centricons der Firma Millipore mit einem cut off von 5 kDa verwendet. Anschließend wurden die Proteine via Größenausschlusschromatographie mit einer Superdex 75 – Säule (High load, 16/60) aufgereinigt. Analysiert wurden die erhaltenen Proteine durch ESI- bzw. LC-MS. 2.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zur Proteinauftrennung Die Auftrennung von Proteinen erfolgte nach den Methoden von Schägger & Jagow (1987) (Schägger et al. 1987) und Lämmli (Lämmli 1970). Die Proteine wurden mittels elekrophoretischer Trennung in SDS-Polyacrylamidgelen bei einer Spannung von 120 V bzw. 200 V mit einem Anoden-/Kathodenpuffersystem etwa 1 h aufgetrennt. Die Ansätze für jeweils ein Gel sind in den Tabellen 6 und 7 angegeben. Seite 20 Tabelle 6: Pipettierschema für ein Schägger-Jagow Gel Trenngel 12 % Trenngel 16,5 % Sammelgel 4 % 0,9 ml 1,25 ml 180 µl SDS-Gelpuffer 1,25 ml 1,25 ml 0,6 ml Wasser 1,6 ml 1,25 ml 1,45 ml APS 10 % (w/v) 19 µl 19 µl 12,5 µl TEMED 2 µl 2 µl 2 µl Acrylamid/Bisacrylamid (48:1,5) Tabelle 7: Pipettierschema für ein Lämmli Gel Trenngel 15 % Sammelgel 4 % Acrylamid 30 % 3,75 ml 0,45 ml Wasser 1,8 ml 1,8 ml Trenngelpuffer 1,95 ml - Sammelgelpuffer - 0,35 ml SDS 10 % (w/v) 79 µl 27 µl APS 10 % (w/v) 79 µl 27 µl TEMED 2,3 µl 2,6 µl Nach Zugabe von TEMED wurde der Ansatz kurz gemischt und das Gel sofort gegossen. Das Trenngel wurde ca. 1 cm unter dem Probentaschenkamm gegossen und mit Ethanol überschichtet. Nach vollständiger Polymerisation wurde das Ethanol entfernt und das Sammelgel darüber gegossen. Probenvorbereitung: max. 1 mg Protein enthaltene Lösung eins zu eins mit 2 x SDS-Probenpuffer mischen. Zur Abtrennung von störenden Salzen wurden die Proteine bei 0°C mit 10% TCA gefällt. Das abzentrifugierte Präzipitat wurde zwei mal mit 70 % Ethanol gewaschen und anschließend in SDS-Probenpuffer aufgenommen. Nach der Gelelektrophorese bei konstanter Spannung wurden die Gele mit dem Farbstoff Coomassie gefärbt. Der nicht an die aufgetragenen Proteine gebundene Farbstoff wurde mit Entfärbelösung entfernt. Seite 21 2.3.6 Silberfärbung Die Silberfärbung wurde nach dem Verfahren von Schumacher et al. durchgeführt (Schumacher et al. 1983). Zuerst wurde das SDS-Gel 30 Minuten lang in der Fixierlösung geschüttelt. Anschließend zehn Minuten in der Inkubationslösung. Danach wurde das Gel drei mal je fünf Minuten lang mit Wasser gewaschen. Dann wurde es zehn Minuten lang der Silbernitratlösung ausgesetzt, gefolgt von drei weiteren Waschgängen mit Wasser, wobei jeder Waschgang 20 Sekunden nicht überschreiten sollte, da sonst das Silbernitrat wieder ausgewaschen wird. Danach wurde das Gel so lange in die Entwicklerlösung gelegt, bis die Banden ausreichend angefärbt waren. Zuletzt wurde die Entwicklerlösung entfernt und die Stopplösung über das Gel gegeben um eine weitere Anfärbung des Gels zu verhindern. 2.4 Chemische Methoden 2.4.1 Festphasensynthese von Peptiden Das im Rahmen dieser Arbeit verwendete Peptid wurde manuell mittels Festphasensynthese hergestellt. Dabei wurde das in situ Neutralisations- und Aktivierungsprotokoll nach Schnölzer et al. (1992) verwendet. Es wurden Überschüsse von Fmoc-Aminosäuren und Base verwendet, um hocheffiziente Kopplungen zu erreichen. Für die Bildung einer Amidbindung ist die Aktivierung der Carboxylsäuregruppe erforderlich. Ursprünglich wurde dies mit Carbodiimiden und deren Reaktion zu O-Acylisoharnstoff unter Generierung der Aminosäureanhydride erreicht. Diese sind jedoch sehr reaktiv und können Umlagerungen durchlaufen, die zu unreaktiven Spezies oder zur Racemisierung führen können. Deshalb wird heute in der Festphasensynthese von Peptiden häufig HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) oder Derivate davon als Aktivierungsreagenz verwendet (Abb. 8). Seite 22 Abb. 8: HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) und HBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphat Die funktionellen Seitengruppen der verwendeten Fmoc-Aminosäuren waren wie folgt geschützt: Boc-Cys(Trt), Fmoc-Lys(ivDde). Die Synthese wurde im 0,2 mmol Maßstab manuell durchgeführt. Als Reaktionsgefäß diente eine Glasfritte der Porengröße 2. Fmoc-Chemie: Das mittels Fmoc-Strategie hergestellte Peptid wurde an einem Fmoc-AS-Wang-Harz synthetisiert. Das Polystyrolharz wurde vor Beginn der Synthese 60 min in DMF gequollen. Der N-Terminus der ersten Aminosäure wurde durch Zugabe von je 10 ml 20 % (v/v) Piperidin in DMF für zuerst 3 und dann 7 min entschützt. Anschließend wurde das Harz zur Entfernung des Piperidins 1 min mit DMF gewaschen. Für einen 0,2 mmol Ansatz wurden 1 mmol der entsprechenden Fmoc geschützten Aminosäure mit 2,38 eq einer 0,5 M HBTULösung in DMF versetzt und 2 min inkubiert. Anschließend wurden 5 eq DIEA zugegeben und 1 min inkubiert. Die aktivierte Aminosäure wurde für 30 min zum Harz gegeben. Nach jedem Kopplungsschritt wurde das Resin 1 min mit DMF gewaschen Abspaltung des Peptids vom Harz: Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe wurde wie oben beschrieben abgespalten. Vor der Abspaltung wurde das Harz mit DCM gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Peptid wurde mit 5 % TIS und 2,5 % H2O in TFA für 3h bei RT abgespalten. Das Peptid wurde durch Zugabe von eiskaltem Diethylether gefällt und die Lösung 1 h auf Eis gekühlt. Das Rohpeptid wurde abzentrifugiert und drei mal mit kaltem Diethylether gewaschen. Das Pellet wurde in Puffer bestehend aus Wasser/Acetonitril 1:1 + 0,1 % (v/v) TFA aufgenommen und lyophilisiert. Seite 23 2.4.2 Aufreinigung des Peptids Die Aufreinigung des Rohpeptids erfolgte im analytischen Maßstab durch RP-HPLC mit einer C4-Säule der Abmessung 125 x 4 mm und im präparativen Maßstab durch RP-HPLC mit einer C4-Säule der Abmessung 250 x 10 mm bzw. 250 x 22 mm bei Flussraten von 1-10 ml/min. Zur Aufreinigung wurde das Peptid in 50 % (v/v) Puffer E (Wasser + 0,1 % (v/v) TFA) und 50% (v/v) Puffer F (Acetonitril + 0,08% (v/v) TFA) aufgenommen und auf die Säule aufgetragen. Die Elution des hergestellten Peptids wurde mittels verschiedenen, dem Produkt angepassten, Gradienten durchgeführt. Die reinen Fraktionen wurden zusätzlich durch ESI-MS charakterisiert, vereinigt und lyophilisiert. 2.4.3 Native chemische Ligation des Peptids mit einem Thioester enthaltenden Protein Die native chemische Ligation wurde nach zwei unterschiedlichen Protokollen durchgeführt. Zum einen wurde einer ca. 200 µM Lösung des Proteins mit C-terminalen Thioester in 6 M GdnHCl, 300 mM NaPi und 1% (v/v) Thiophenol bei pH 7,2 20 eq. des Peptids mit Nterminalen Cystein hinzugefügt. Beim zweiten Protokoll wurden einer ca. 300 µM Lösung des Thioesters in 100 mM MESNA bei 4 C und einem pH von 7,5 10 Äquivalente des Peptids mit N-terminalen Cystein hinzugefügt. Die Ansätze wurden 2-24 h leicht gerührt. Die Reaktion wurde im ersten Fall durch Zugabe von 3 Volumenäquivalenten des Ligationspuffers und 20 % (v/v) -Mercaptoethanol für 30 min gestoppt. Die entstandenen Disulfide wurden vor der Aufreinigung durch Zugabe einer geringen Menge TCEP für 5 min reduziert. Die Aufreinigung der Ligationsprodukte erfolgte im analytischem Maßstab mittels RP-HPLC über eine C4-Säule (125 x 4 mm) bei einer Flussrate von 1 ml/min. 2.4.4 Vorbereitung der Oligonukleotide auf die Kupplungsreaktion Die Kartusche, welche 1 µmol an CPG-Beads (controlled pore glass) gebundenes Oligonukleotid enthielt, wurde mit 20 ml DCM gewaschen. Anschließend wurde das Oligonukleotid entschützt, indem die MMT-Schutzgruppe (Monomethoxytrityl) mit 40 ml 3 % (w/v) TCA (Trichloressigsäure) in DCM im langsamen Durchfluss abgespalten wurde. Zur photometrischen Bestimmung der Beladung der CPG-Beads konnte die austretende Seite 24 Lösung gesammelt werden. Erneut wurde die Kartusche mit 20 ml DCM gewaschen. Danach wurden die Beads mit 10 ml 3 % (v/v) DIPEA (Diispropylethylamin) in DCM neutralisiert und wiederum mit 20 ml DCM gewaschen. 2.4.5 Cystein-Modifizierung des Oligonukleotids über HBTU Es wurden 1,7 µmol (5 eq.) Fmoc-Cys(S-tBu)-OH in 100 µl DMF/ MeCN 3:1 gelöst und mit 1,7 µmol (5 eq.) HBTU in 100 µl DMF/ MeCN 3:1 gelöst aktiviert. Nach 3 min wurden 0,33 µmol DIPEA (1 eq.) hinzugegeben und nach einer weiteren Minute das an den Glasbeads gebundene Oligonukleotid (0,33 µmol). Diese wurde zuvor mit 3 % (w/v) TCA in DCM entschützt. Diese Reaktionslösung wurde 2 h bei Raumtemperatur (RT) geschüttelt. Anschließend wurde die Reaktionslösung zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Glasbeads 3 x mit je 300 µl DCM gewaschen. Zuletzt wurde das Cystein-modifizierte Oligonukleotid (Cys-Oligonukleotid) mit 200 µl 10 % (v/v) Ammoniak in Methylamin von den Glasbeads abgespalten, durch eine NAP-5 Säule von Amersham Biosciences entsalzt und in 200 µl H2O aufgenommen. 2.4.6 Cystein-Modifizierung des Oligonukleotids über den Pentafluorophenylester Es wurden 1,7 µmol (5 eq.) Fmoc-Cys(S-tBu)-OC6F6 und 0,33 µmol DIPEA (1 eq.) in 300 µl DCM gelöst und das an den Glasbeads gebundene Oligonukleotid (0,33 µmol), welches zuvor mit 3 % (w/v) TCA in DCM entschützt worden ist, hinzugegeben. Diese Reaktionslösung wurde über Nacht bei RT geschüttelt. Anschließend wurde die Reaktionslösung zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Glasbeads 3 x mit je 300 µl DCM gewaschen. Zuletzt wurde das modifizierte Oligonukleotid mit 200 µl 10 % (v/v) Ammoniak in Methylamin von den Glasbeads abgespalten, durch eine NAP-5 Säule von Amersham Biosciences entsalzt und in 200 µl H2O aufgenommen. 2.4.7 Cystein-Modifizierung des Oligonukleotids über HOBt/ DCC Es wurden 3,33 µmol (10 eq.) Fmoc-Cys(S-tBu)-OH, 3,33 µmol (10 eq.) HOBt und 3,33 µmol DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) (10 eq.) in 150 µl DCM gelöst und 6 h gerührt (0RT). Anschließend wurde das an den Glasbeads gebundene Oligonukleotid, welches Seite 25 zuvor mit 3 % (w/v) TCA in DCM entschützt worden ist, hinzugegeben. Diese Reaktionslösung wurde über Nacht bei RT geschüttelt. Anschließend wurde die Reaktionslösung zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Glasbeads 3 x mit je 300 µl DCM gewaschen. Zuletzt wurde das modifizierte Oligonukleotid mit 200 µl 10 % (v/v) Ammoniak in Methylamin von den Glasbeads abgespalten, durch eine NAP-5 Säule von Amersham Biosciences entsalzt und in 200 µl H2O aufgenommen. 2.4.8 Abspaltung der Cys-modifizierten Oligonukleotide von den CPG-Beads und deren Aufreinigung Das modifizierte Oligonukleotid wurde von den CPG-Beads abgespalten, indem es zuerst 20 min bei Raumtemperatur und danach 15 min bei 65C 10 % NH3 in Methylamin ausgesetzt wurde. Die Glasbeads wurden zwei mal mit Wasser gewaschen und anschließend das Lösungsmittel der vereinigten Phasen an der Speedvac bei 60C entfernt und das Oligonukleotid in Wasser aufgenommen. Danach wurde das Oligonukleotid durch eine NAP5 Säule von Amersham Biosciences entsalzt, die Oligonukleotid-enthaltenden Fraktionen vereinigt, an der Speedvac das Lösungsmittel entfernt und das Oligonukleotid erneut in Wasser aufgenommen. 2.4.9 Analytik der Oligonukleotide Die erhaltenen Oligonukleotide wurden per MALDI-TOF Spektroskopie untersucht. Als Matrixsubstanz wurde 3-Hydroxy-Pikolinsäure verwendet. Für die Messung wurden jeweils 0,5 µl der Probe und der Matrixlösung im Verhältnis 1:1 (v/v) miteinander gemischt und langsam trocknen gelassen. 2.4.10 Entsalzung der Oligonukleotide über C18 ZIP TIPs zur Analytik Zuerst wurde das C18-Material des ZIP TIPs mit Hilfe einer 10 µl Pipette durch 2 x 10 µl H2O angefeuchtet und dann 2 x mit je 10 µl H2O gewaschen. Als nächstes wurde der Analyt an das Säulenmaterial gebunden, indem die Probe 10 x ein- und ausgesaugt wurde.. Nach einem erneuten Waschgang von 2 x 10 µl H2O wurde der Analyt eluiert, indem die Elutionslösung (H20/ MeCN 78:22) 5 x ein- und ausgesaugt wurde. Seite 26 2.4.11 UV-photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA Die Konzentration von DNA wurde durch Messung der optischen Dichte bei den Wellenlängen 260 nm und 280 nm bestimmt. Der Nullabgleich wurde mit dem reinen Lösungsmittel durchgeführt. Dabei gilt für die Konzentration einer Lösung in einer Küvette der Schichtdicke 1 cm: ssDNA: 1 OD260 entspricht 30 µg/ml Der Reinheitsgrad von DNA kann aus dem Verhältnis der beiden Absorptionen bei 260 nm und 280 nm abgeschätzt werden. Bei reiner DNA beträgt der Koeffizient aus OD260/ OD280 ~ 1,8. Seite 27 3. Ergebnisse 3.1 Synthese und Aufreinigung der Cystein-modifizierten Oligonukleotide 3.1.1 Synthese von Cys(S-t-Bu)-modifizierten Oligonukleotid A Cys(S-tBu)-NH-C6H12-5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’ M = 7749 g/mol Zur Cystein-Modifizierung der Oligonukleotide wurde ein Fmoc-geschütztes Cystein mit t-Butylthiol-geschützter Seitenkette direkt an ein 5’-aminofunktionalisiertes Oligonukleotid gekoppelt, das noch vollständig geschützt und an die feste Phase gebunden war (Abb. 9). Das Oligonukleotid wurde von der Firma Metabion (Martinsried) bezogen. Die Kopplung wurde zunächst mit Hilfe der drei verschiedenen Aktivierungssysteme DCC/ HOBT in DCM, HBTU/ DIPEA in DMF/ MeCN 3:1 und dem Pentafluorophenylester des Cysteins in DCM im 0.33 µmol Maßstab wie im Abschnitt 2.4 beschrieben getestet. Allerdings boten alle drei Aktivierungsmethoden ähnliche Ergebnisse. Daher wurde aus Kostengründen entschieden in weiteren Synthesen das Cystein mittels DCC/ HOBT in DCM zu aktivieren. N O H2N C6H6 O NH2 N N N O CPG GCGGATAACAATTTCACACAGGA O a) c) b) t-BuS S OR t-BuS S OR t-BuS S N N Fmoc Fmoc HBTU/ DIPEA DCM HOBt/ DCC DMF/ MeCN 3:1 DCM O O N Fmoc N O t-BuS S OPFP N O N CH O H 6 6 Fmoc O NH2 N N N GCGGATAACAATTTCACACAGGA CPG Abb. 9: Syntheseschema der Kopplung des Cystein an das Oligonukleotid über die drei Aktivierungsstrategien a) (HOBt/ DCC), b) (HBTU/ DIPEA) und c) (Pentafluorophenylester). Seite 28 3.1.2 Aufreinigung des modifizierten Oligonukleotids A mittels HPLC Die Reinigung des Cys-modifizierten Oligonukleotids A wurde mittels C18 RP-HPLC (250 x 4,6 mm) bei einer Wellenlänge von 260 nm und mit einem Triethylammonium-Acetat (TEAAc) Puffersystem getestet. Der verwendete Gradient verlief von 5 % (v/v) Puffer B (100 mM TEAAc in H2O/ MeCN 1:1, pH 7) nach 100 % (v/v) Puffer B in Puffer A (100 mM TEAAc in H2O, pH 7) über 30 min mit einer Flussrate von 1 ml/min. Die Verunreinigungen im Chromatogramm (Abb. 10) sind vermutlich auf nicht vollständig ausgewaschenes HOBt, DCC und nicht umgesetztes Cystein zurückzuführen. Der Hauptpeak bei 16,9 min entspricht einem Gemisch aus modifiziertem und nicht modifiziertem Oligonukleotid, was durch MALDI-TOF Messungen gezeigt werden konnte (Abb. 11). Ein flacherer Gradient von 16 % (v/v) Puffer B nach 60 % (v/v) Puffer B in Puffer A über 60 min führte zu keiner besseren Trennung von Edukt und Produkt. Auch in diesem Chromatogramm finden sich Verunreinigungen aus dem Reaktionsgemisch, die beim Waschen der CPG-beads nicht vollständig entfernt wurden. 260 nm 260 nm 1,6 RT = 16,9 min 1,4 RT = 37 min 0,8 1,2 Absorption [Au] Absorption [Au] 0,6 1,0 0,8 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0,0 0,0 -0,2 0 10 20 Retentionszeit [min] 30 40 0 20 40 60 80 Retentionszeit [min] Abb.10: HPLC-Chromatogramm des Oligonukleotids A mit analytischer C18-Säule und einem Gradienten von 5 % Puffer B nach 100 % Puffer B in 30 min (links). HPLC-Chromatogramm des Oligonukleotids A mit analytischer C18-Säule und einem Gradienten von 16 % Puffer B nach 60 % Puffer B in 60 min (rechts). Detektion bei 260 nm. Während der HPLC-Läufe wurden Fraktionen, die eine Absorption bei 260 nm aufweisen, gesammelt und jeweils zwei mal über eine NAP5 Säule entsalzt. Ausgehend von diesen Proben konnten gute MALDI-MS-Spektren erhalten werden. In den vorderen Fraktionen des Seite 29 Hauptpeaks findet sich das nicht modifizierte Oligonukleotid, in den späteren Fraktionen ein Gemisch aus modifiziertem und nicht modifiziertem Oligonukleotid. Es wurden keine Fraktionen erhalten, die nur Produkt enthalten. MALDI-MS-Spektren einer Eduktenthaltenden Fraktion und einer Fraktion, die ein Gemisch aus Edukt und Produkt enthält, sind exemplarisch in Abbildung 11 gezeigt. Dabei entspricht im Falle der Edukt-enthaltenden Fraktion der Peak bei 7586,5 g/mol dem Edukt und der Peak bei 3795,9 g/mol dem zweifachgeladenen Edukt. Die erhaltene Masse für das Edukt weicht von der berechneten Masse von 7558 g/mol um 29 Masseneinheiten ab. Diese Abweichung ist durch die große Halbwertsbreite der Peaks zu erklären. Außerdem konnte das MALDI-MS durch die große Halbwertsbreite nicht kalibriert werden. Im Falle der Mischfraktion von Edukt und Produkt entspricht der Peak bei 7593,1 g/mol dem Edukt und der Peak bei 7743,8 g/mol dem modifizierten Oligonukleotid, der Peak bei 3800,8 g/mol dem zweifach geladenen Edukt und der Peak bei 3876,8 g/mol dem zweifach geladenen Produkt. Die gefundene Produktmasse stimmt mit der berechneten Masse von 7749 g/mol gut überein. 3876,8 7586,5 100 100 80 rel. Intensität [%] rel. Intensität [%] 80 60 3795,9 40 20 0 3000 3800,8 7743,8 7593,1 60 40 20 4000 5000 6000 7000 Masse [m/z] 8000 9000 10000 0 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Masse [m/z] Abb. 11: MALDI-TOF Spektren einer Eduktfraktion (links) und einer Edukt-Produkt-Mischfraktion (rechts). Ein Wechsel des Puffersystems zum Triethylammonium-Hexafluoroisopropanol (TEA-HFIP) System (Gilar et al. 2002) mit einem Gradienten von 5 % (v/v) Puffer D (60 % (TEA 16,3 mM, HFIP 400 mM, in H20 pH 7,9), 40 % MeOH) nach 100 % (v/v) Puffer D in Puffer C (90 % (TEA 16,3 mM, HFIP 400 mM, in H20 pH 7,9), 10 % MeOH) über 30 min mit einer Flussrate von 1 ml/min führte ebenfalls zu keiner Verbesserung der Trennleistung (Abb. 12). In diesem Chromatogramm finden sich neben dem Hauptpeak bei 13,2 min diverse kleinere Peaks, welche auf die Verunreinigungen mit den Reagenzien aus der Synthese und mit Säulenartefakten aufgrund des Pufferwechsels vom TEAAc Puffersystem zum TEA-HFIP Seite 30 Puffersystem hin zu erklären sind, da dabei das Lösungsmittel von Acetonitril hin zu Methanol gewechselt wurde. 260 nm 1,6 RT = 13,2 min 1,4 Absorption [Au] 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0 10 20 30 40 Retentionszeit [min] Abb.12: HPLC-Chromatogramm mit analytischer C18-Säule und einem Gradienten von 5 % Puffer D nach 100 % Puffer D in Puffer C über 30 min. Detektion bei 260 nm. 3.1.3 Aufreinigung des modifizierten Oligonukleotids A über Aldehyd- funktionalisiertes PEGA-Harz Kleine Proteine und Polypeptide, welche ein N-terminales Cystein enthalten, können über ein Aldehyd-funktionalisiertes PEGA-Harz gereinigt werden (Villain et al. 2001). Dieses kann spezifisch über die Bildung eines Thioazolidinringes das Cystein kovalent binden. Die PEGAbeads können dann gewaschen und damit alle Verunreinigungen entfernt werden. Anschließend wird das Peptid oder in diesem Fall das modifizierte Oligonukleotid durch die Zugabe von O-Methylhydroxylamin wieder freigesetzt. Dazu wurden 60 µl einer Suspension aus Aldehyd-funktionalisiertem PEGA-Harz in H2O/ MeCN 1:1 3 x mit je 50 µl Tris Puffer gewaschen (100mM Tris HCl pH 7,5). Anschließend wurden 25 µl der Oligonukleotid-enthaltenden Lösung (c = 8,9 mg/ ml) auf die Beads gegeben und 5 % (w/v) TCEP hinzugefügt. Die Suspension wurde bei RT geschüttelt und nach 1 h, 2 h und 3 h eine Probe von je 4 µl des Überstandes abgenommen. Diese wurden per HPLC mit einer C18 Säule und dem Triethylammonium-Acetat Puffersystem untersucht. Bei t = 0 und t= 3 h wurde jeweils eine Probe des Überstandes zur Konzentrationsbestimmung per UV-Messung bei 260 nm abgenommen. Seite 31 Zur Freisetzung des Harz-gebundenen Cys-modifizierten Oligonukleotids wurde die Suspension 3 x mit Tris Puffer gewaschen und mit 400mM O-Methylhydroxylamin in Zitronensäurepuffern bei verschiedenen pH-Werten (4,0; 4,5; 5,0; 5,5) versetzt und über Nacht bei RT geschüttelt. Eine Probe des Überstands wurde dann durch HPLC (C18 Säule, TEAAc-Puffersystem, 260 nm) untersucht. Der Gradient bei den HPLC Untersuchungen verlief von 5 % (v/v) Puffer B nach 100 % (v/v) Puffer B in Puffer A über 30 min mit einer Flussrate von 1 ml/min. Im Falle der Beladung der Beads zeigte sich schon nach 1 h ein erheblicher Reaktionsfortschritt (Abb. 13), was an der Abnahme des Peaks bei 13,8 min zu sehen ist. Nach 2-3 h war die Beladung abgeschlossen und eine weitere Abnahme der Peakfläche nicht mehr zu detektieren. Nach Vergleich der Peakflächen zu Beginn der Reaktion und nach 3 h lässt sich eine relative Reaktionsausbeute von ca. 80-90 % abschätzen. Im Falle der Abspaltung von den PEGA-Beads ist bei keinem der gewählten pH-Werte ein Peak entstanden. Das Cys-modifizierte Oligonukleotid konnte also unter den gewählten Reaktionsbedingungen nicht von den Beads abgespalten werden. t = 0h t = 1h t = 2h t = 3h 0,6 RT = 13,8 min 1,0 0,4 0,8 Absorption [Au] Absorption [Au] 0,5 t=2h t = 22 h 1,2 0,3 0,2 0,1 0,0 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,1 0 10 20 Retentionszeit [min] 30 -0,2 0 10 20 30 Retentionszeit [min] Abb. 13: HPLC-Chromatogramm über eine analytische C18-Säule mit einem Gradienten von 5 % Puffer B nach 100 % Puffer B in 30 min von der Beladung der PEGA-Beads und von der Abspaltung des modifizierten Oligonukleotids von den Beads. Es wurde bei der Wellenlänge von 260 nm detektiert. Die Konzentrationsbestimmung einer Probe des Überstands bei t = 0 h und t = 3 h über UVAbsorption bei 260 nm ergab, dass nach der Reaktion 69,2 % des eingesetzten Oligonukleotids im Überstand verblieben und somit 30,8 % des eingesetzten Oligonukleotids an die Beads gebunden war, was auf eine relative Reaktionsausbeute der CysteinSeite 32 Modifizierung des Oligonukleotides von ca. 30 % schließen lässt. Dieser gefundene Wert für die Ausbeute passt nicht zu der gefundenen Abnahme der Peakflächen im HPLCChromatogramm. 3.1.4 Cystein-Modifikation der Oligonukleotide A, B und C mit veränderter Schutzgruppenstrategie A: Cys-NH-C6H12-5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’ M = 7661 g/mol B: Cys-NH-C6H12-5’-CTG AGG TAG GTA GAT CAC TTG AGG T-3’ M = 8059 g/mol C: Cys-NH-C6H12-5’-ATG TGA CCT GTA TTG TTG GAT GTG AG-3’ M = 8369 g/mol Aufgrund der Schwierigkeiten der beschriebenen Methoden das modifizierte von dem nicht modifizierten Oligonukleotid zu trennen, wurde die Schutzgruppenstrategie der Synthese geändert (Abb. 14). Es wurde die t-Butylthio-Schutzgruppe der Cysteinseitenkette durch die Monomethoxytrityl-Schutzgruppe (MMT) ausgetauscht. Dadurch wird die Trennung von Produkt und Edukt auf der HPLC-Säule ermöglicht. Das Produkt aus der CysteinModifizierung besitzt im Gegensatz zum Edukt, dem unmodifizierten Oligonukleotid, eine MMT-Schutzgruppe, was die Hydrophobizität des Moleküls stark erhöht. Durch diesen „MMT-on“-Status des Produkts wird seine Retentionszeit auf der RP-Säule deutlich zu höheren Zeiten hin verschoben. Dieses Verfahren wird in der Oligonukleotidsynthese standardmäßig verwendet, um die gewünschte Sequenz nach Abschluss der Synthese mittels RP-HPLC aufzureinigen (Will et al. 1995). Außerdem ermöglicht die Wahl der MMT-Schutzgruppe eine Bestimmung der relativen Reaktionsausbeute. Nach der Modifizierungsreaktion kann die MMT-Schutzgruppe auf den Glasbeads abgespalten werden und somit über das MMT-Kation photometrisch die Ausbeute der Reaktion bestimmt werden. So kann einmalig die relative Ausbeute der Modifizierungs-Reaktion bestimmt werden. In folgenden Reaktionsansätzen kann das geschützte Cys-modifizierte Oligonukleotid von den Glasbeads abgespalten und HPLC-gereinigt werden. Anschließend kann dann die MMTSeite 33 Schutzgruppe abgespalten und das vollständig entschützte Cys-Oligonukleotid erhalten werden. Abb. 14: Das modifizierte Oligonukleotid kann nach seiner Synthese von den Glasbeads mit 10 % Ammoniak in Methylamin abgespalten werden und durch die erhöhte Hydrophobizität der MMT-Schutzgruppe durch RPHPLC aufgereinigt werden. Andererseits kann durch eine Abspaltung der MMT-Schutzgruppe mittels 3 % TCA in DCM auf den Glasbeads photometrisch durch eine Detektion bei 460 nm eine relative Reaktionsausbeute bestimmt werden. Dazu musste zuerst der molare Extinktionskoeffizient des MMT-Kations in 3 % TCA in DCM bei seinem Absorptionsmaximum von 460 nm bestimmt werden. Es wurde eine Verdünnungsreihe von Fmoc-Cys(MMT)-OH hergestellt und jeweils mit einer Lösung aus 3 % TCA in DCM die MMT-Schutzgruppe abgespalten. Die Absorption der einzelnen Lösungen verschiedener MMT Konzentrationen wurde bei 460 nm photometrisch bestimmt und aus ihnen nach dem LAMBERT-BEER’SCHEN Gesetz der molare Extinktionskoeffizient des MMT-Kations 460 in 3 % TCA in DCM bei 20 C bestimmt (Abb. 15). Er beträgt 460 = 29259 M-1cm-1. Absorption [Au] 0,8 0,6 y = 29259x - 0,012 R2 = 0,9966 0,4 0,2 0 0,00E+00 5,00E-06 1,00E-05 1,50E-05 2,00E-05 2,50E-05 Konzentration [M] Abb. 15: Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten des MMT-Kations nach dem LAMBERT-BEER’SCHEN Gesetz Die Oligonukleotide A, B, und C wurden, wie in Punkt 2.4.7 beschrieben, mit Hilfe der Aktivierung durch HOBt und DCC in DCM Cys-modifiziert. Einzige Unterschiede waren, dass der Maßstab der Synthese 1 µmol betrug und dass die Thiolschutzgruppe des Cysteins (MMT) vor dem Abspalten der Oligonukleotide von den Glasbeads entfernt wurde. Dazu Seite 34 wurden die Beads 7 x 5 min mit je 1 ml 3 % TCA in DCM bei RT inkubiert. Die gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und ihre Konzentration photometrisch bei 460 nm bestimmt. Aus der Konzentration des abgespaltenen MMT-Kations ergab sich eine Ausbeute von durchschnittlich 32,3 %. Die HPLC-Läufe zur Aufreinigung der Cys-Oligonukleotide wurden auf einer C18 RP-Säule (250 x 4,6 mm) vorgenommen und der Gradient ging dabei von 5 % (v/v) Puffer B nach 100 % (v/v) Puffer B in Puffer A über 30 min mit einer Flussrate von 1 ml/min. Die Detektion wurde bei 260 nm vorgenommen. Nach der HPLC wurden die Fraktionen je 2 x mittels einer NAP5 Säule entsalzt. In der Abbildung 16 ist das HPLC-Chromatogramm des Cys-Oligonukleotids A gezeigt. Es findet sich lediglich ein Hauptpeak bei 18 min. Das MALDI-MS Spektrum der dazugehörigen Mischfraktion weißt die einfach geladenen Massen von 7606,1 g/mol und 7717,3 g/mol und die zweifach geladenen Massen von 3808,2 g/mol und 3863,5 g/mol auf. Die berechneten Massen sind 7558 g/mol für das Edukt und 7661 g/ mol für das modifizierte Oligonukleotid. So weichen die gefundenen Massen um ca. 50 Masseneinheiten zu höheren Massen hin ab. Das lässt sich allerdings durch die große Halbwertsbreite und die damit verbundene fehlende Kalibrierung des Massenspektrometers erklären. 260 nm 2,5 80 rel. Intensität [%] 2,0 Absorption [Au] 7606,1 100 RT = 18 min 1,5 1,0 0,5 60 3808,2 40 7717,3 3863,5 20 0,0 0 10 20 30 Retentionszeit [min] 40 0 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 Masse [m/z] Abb. 16: HPLC-Chromatogramm des Cys-Oligonukleotids A (links) über eine analytische C18-Säule mit einem Gradienten von 5 % Puffer B nach 100 % Puffer B in Puffer A in 30 min. Detektion bei 260 nm. Das dazugehörige MALDI-TOF Spektrum (rechts). Im Fall des Cys-Oligonukleotids B findet sich nur ein Hauptpeak im Chromatogramm bei 16,8 min (Abb. 17). Die dazugehörigen Massen sind 8013,2 g/mol und 8123,2 g/mol und die Seite 35 10000 zweifach geladenen Massen von 4010,1 g/mol und 4067,4 g/mol. Die berechnete Masse für das Edukt ist 7956 g/mol und 8059 g/mol für das Produkt. Auch in diesem Fall weichen die gefundenen Massen wieder um ca. 55 Masseneinheiten zu höheren Massen hin ab. Aber wie im Falle des Cys-Oligonukleotids A beträgt die Massendifferenz zwischen den beiden Peaks 100 bis 110 Masseneinheiten, was gut mit einem Massenzuwachs von 103 Masseneinheiten für das Cystein übereinstimmt. 260 nm 2,5 8013,2 100 RT = 16,8 min 4010,1 rel Intensität [%] Absorption [Au] 1,5 1,0 0,5 8123,2 4067,4 80 2,0 60 40 20 0,0 0 10 20 30 Retentionszeit [min] 40 0 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 Masse [m/z] Abb. 17: HPLC-Chromatogramm des Cys-Oligonukleotids B (links) über eine analytische C18-Säule mit einem Gradienten von 5 % Puffer B nach 100 % Puffer B in Puffer A in 30 min. Detektion bei 260 nm. Das dazugehörige MALDI-TOF Spektrum (rechts). Im HPLC-Chromatogramm des Cys-Oligonukleotids C (Abb. 18) findet sich nur ein Peak bei 16,8 min. Der Peak weißt eine kleine Schulter auf. Trotzdem konnte nur eine einzelne Masse von 8327,7 g/mol und die dazugehörige zweifach geladene Masse von 4164,7 g/mol detektiert werden. Die berechnete Masse des Eduktes beträgt 8266 g/mol und die des Produktes 8369 g/mol. Die gefundene Masse weicht von der kalkulierten Produktmasse zu kleineren Massen hin 40 Masseneinheiten und von der kalkulierten Eduktmasse zu höheren Massen hin um 60 Masseneinheiten ab. So ist nicht zu entscheiden, ob es sich bei der gefundenen Masse um Edukt oder Produkt handelt. Eine Mischfraktion mit zwei Massen konnte nicht isoliert werden. Aber trotzdem ist Produkt in einer relativen Ausbeute von 33 % bei der Reaktion entstanden. Das zeigte die photometrische Bestimmung der Ausbeute über das MMT-Kation. Seite 36 10000 3,0 8327,7 100 260 nm 2,5 80 rel. Intensität [%] Absorption [Au] 2,0 1,5 RT = 16,8 min 1,0 60 4164,7 40 0,5 20 0,0 0 10 20 30 0 3000 40 4000 5000 Retentionszeit [min] 6000 7000 8000 9000 10000 Masse [m/z] Abb. 18: HPLC-Chromatogramm des Cys-Oligonukleotids C (links) über eine analytische C18-Säule mit einem Gradienten von 5 % Puffer B nach 100 % Puffer B in Puffer A in 30 min. Detektion bei 260 nm. Das dazugehörige MALDI-TOF Spektrum (rechts). Zur Kontrolle wurde unmodifiziertes Oligonukleotid A, welches von Metabion HPLCgereinigt erstanden wurde, der selben Aufreinigungsprozedur unterzogen. Im HPLCChromatogramm (Abb. 19) entspricht der erste Peak einem Injektionspeak und der Hauptpeak bei 17,5 min dem Oligonukleotid A. Der Peak geringerer Intensität bei 25,8 min entspricht einer Verunreinigung des Edukts. Die gefundene Masse, nach einer einfachen Entsalzung durch C18 ZipTips, von 7570,8 g/mol entspricht dem Edukt. 100 260 nm 0,6 3807,1 RT = 17,5 min 0,5 80 rel. Intensität [%] Absorption [Au] 0,4 0,3 0,2 0,1 RT = 25,8 min 7570,8 60 40 20 0,0 -0,1 0 10 20 30 Retentionszeit [min] 40 0 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 Masse [m/z] Abb. 19: HPLC-Chromatogramm des unmodifizierten Oligonukleotids A (links) über eine analytische C18-Säule mit einem Gradienten von 5 % Puffer B nach 100 % Puffer B in Puffer A in 30 min. Detektion bei 260 nm. Das dazugehörige MALDI-TOF Spektrum (rechts). Seite 37 10000 Die zweifach geladene Masse von 3807,1 g/mol verschwindet fast im Rauschen. Auch das reine Edukt weicht schon von der berechneten Masse von 7558 g/mol um 13 Masseneinheiten zu höheren Massen hin ab und die Halbwertsbreite ist ebenso, wie zuvor beobachtet, aufgrund von Salzadukten recht groß. 3.1.5 HPLC-Aufreinigung von Cys-Oligonukleotid C mit Hilfe der MMTSchutzgruppe Wie im Punkt 3.1.4 erwähnt sollte sich die Retentionszeit des Oligonukleotids mit nicht abgespaltener MMT-Schutzgruppe auf der HPLC deutlich zu höheren Zeiten hin verschieben, was bei der Oligonukleotidsynthese standardmäßig verwendet wird, um die Zielsequenz aufzureinigen (Will et al. 1995). Dazu wurde eine Probe des modifizierten Oligonukleotids C von den Glasbeads abgespalten, ohne vorher die MMT-Schutzgruppe zu entfernen. Das abgespaltene Oligonukleotid wurde dann mit Hilfe einer C18 RP-Säule (250 x 4,6 mm) und einem Gradienten von 5 % (v/v) Puffer B nach 100 % (v/v) Puffer B in Puffer A über 30 min mit einer Flussrate von 1 ml/min getrennt (Abb. 20). Es wurde neben dem Peak bei 16,6 min, welcher dem unmodifizierten Oligonukleotid entspricht, ein neuer Peak bei 24,3 min beobachtet. Dieser Peak wurde gesammelt, mit Hilfe der Speed-vac aufkonzentriert und dann mit 3 % TCA in H2O versetzt. 2,5 260 nm RT = 16.3 min 0,5 2,0 RT = 24.3 min 1,5 Absorption [Au] Absorption [Au] 260 nm 0,6 RT = 16.6 min 1,0 0,5 RT = 15.4 min 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 -0,1 0 10 20 Retentionszeit [min] 30 40 0 10 20 30 40 Retentionszeit [min] Abb. 20: HPLC-Chromatogramm des Cys(MMT)-Oligonukleotids C mit analytischer C18-Säule und einem Gradienten von 5 % Puffer B nach 100 % Puffer B in Puffer A in 30 min (links). Detektion bei 260 nm. Chromatogramm des Cys-Oligonukleotids C nach Abspaltung der MMT-Schutzgruppe (rechts). Seite 38 Diese Reaktionslösung wurde nach 20 min erneut auf die HPLC aufgegeben. Dies ergab wieder den Peak bei 16,3 min mit einer Schulter bei 15,4 min. Die Ausbeute der Modifizierung des Oligonukleotids lässt sich über einen Vergleich der Peakflächen auf 25 % schätzen. 3.2 Expression und Aufreinigung von Sec42, Ypt12C und Cherry-Ypt73 3.2.1 Expression und Aufreinigung von Ypt12C Das Ypt1 gehört zur Ypt/ Rab-Familie und ist an der Exocytose beteiligt. Es spielt eine Rolle beim Transport vom endoplasmatischen Retikulum zum cis-Golgi und vom cis-Golgi zum medialen Golgi (Segev 2001b). Zur Expression des Ypt12C wurde das Plasmid pTWIN-1 verwendet. In dem Vektor pTWIN-1 steht das Fragment des Ypt12C-Fusionsproteins unter der Kontrolle des T7-Promotors, welcher durch das lacI-Operon reguliert wird. Somit kann die Expression des Fusionsproteins durch Zugabe von IPTG (Isopropyl--D- thiogalactopyranosid) induziert werden. Bei IPTG handelt es sich um ein nicht hydrolysierbares Analogon des natürlichen Induktors Allolaktose. Das Konstrukt verfügte zu Aufreinigungszwecken und zur Generierung eines C-terminalen Thioesters über ein Cterminales Mxe-Intein und eine Chitin binding domain (CBD). Zur Expression wurden E.coli BL21(DE3)RIL Zellen verwendet. Bei diesen Zellen ist das Gen zur Expression der T7-RNAPolymerase in das Genom integriert und befindet sich unter der Kontrolle des lacUV5Operators. Die über Nacht bei 37C auf der Agar-Platte gewachsenen Kulturen wurden vollständig in LB-Medium überführt und mit diesem die 5 l Expressionskultur angeimpft. In der mittleren logarithmischen Phase (OD ~ 0,6) wurde die Expression durch Zugabe von 0,3 mM IPTG induziert und dann über Nacht bei 18C geschüttelt. Das gewünschte Fusionsprotein wurde überexprimiert und die Zellen mechanisch mit dem Microfluidizer aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (30 min, 20000 rpm, 4°C) von den löslichen Bestandteilen abgetrennt. Der Überstand, der das lösliche Zielprotein enthielt, wurde dekantiert und das Fusionsprotein mit Hilfe von Chitinbeads aufgereinigt. Dazu wurden 20 ml Chitinbeads zuerst mit 10 Säulenvolumen Wasser gewaschen und anschließend mit 10 Säulenvolumen Waschpuffer (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, Seite 39 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 7,5) equilibriert. Anschließend wurde der Überstand aufgetragen und die Fusionsproteine im langsamen Fluss (~1 ml/min) auf die Chitinbeads geladen. Danach wurden die Beads aufeinander folgend mit je 10 Säulenvolumen Waschpuffer mit 1 % Triton, Waschpuffer ohne Triton und erneut mit 10 Säulenvolumen Waschpuffer mit 1 % Triton gewaschen. Zum Splicen des Fusionsproteins wurden die Chitinbeads über Nacht bei 4°C mit 40 ml 0,5 M MESNA in Waschpuffer inkubiert. Anschließend wurde das Ypt12C im Durchfluss gesammelt und die Beads mit 10 Säulenvolumen Waschpuffer ohne Triton und dann mit je 10 Säulenvolumen Waschpuffer mit 1 % Triton und ohne Triton gewaschen. Die Proteinenthaltende Lösung wurde über eine S75 Größenausschluss-Chromatographie-Säule im präparativen Maßstab gereinigt. Die Produkt-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert. Aus einer 5 l Expressionskultur konnten ca. 16 mg Protein gewonnen werden. In Abbildung 21 ist die SDS-PAGE des Ypt12C gezeigt. In der ersten Bahn sind zwei Banden zu sehen. Die obere Bande, bei ca. 30 kDa, entspricht dem Mxe-Intein, die untere Bande bei ca. 25 kDa entspricht dem Ypt12C. Abb. 21: SDS-GEL des Ypt12C (links). In Bahn 1 ist das Ypt1 2C aufgetragen. Das ESI-MS der vereinigten Produkt-enthaltenden Fraktionen nach der Größenausschlusschromatographie (rechts). Außerdem ist in Abbildung 21 das ESI-MS Spektrum und das dekonvolutierte Spektrum des Ypt12C gezeigt. Es treten die Ladungszustände von 12 bis 22 positiven Ladungen pro Molekül von 1928,4 bis 1052,2 g/mol auf. Nach Dekonvolution wird eine Masse von 23129 Seite 40 g/mol erhalten, was mit der berechneten Masse von 23132 g/mol gut übereinstimmt. Die Masse von 22986 g/mol entspricht dem Protein mit hydrolysierten Thioester. 3.2.2 Expression und Aufreinigung von Sec42 Das Sec4 ist ein G-Protein und Mitglied der Ypt/ Rab-Familie. Es ist an der Fusion von Vesikeln mit der Plasmamembran beteiligt (Segev 2001b). Zur Expression des Sec42 wurde das Plasmid pTWIN-1 verwendet. Das Sec42 lag als Fragment in Form eines Fusionsproteins mit einem Mxe-Intein und einer CBD vor. Es wurde in E.coli BL21(DE3)RIL Zellen überexprimiert. Zur Expression wurde eine Kultur von 2,5 l angesetzt. Die Expression erfolgte, wie in 2.3.1 beschrieben. Aufgereinigt wurde das Fusionsprotein mit 30 ml Chitinbeads, wie in 2.3.1 beschrieben. Zum Splicen wurden die Chitinbeads mit 60 ml 0,5 M MESNA in Waschpuffer (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 7,5) über Nacht inkubiert, wobei der C-terminale Thioester des Sec42 generiert wurde. Das Protein wurde dann mit Hilfe einer Größenausschlusschromatographie mit einer präparativen S75-Säule aufgereinigt, die Produkt-enthaltenden Fraktionen vereinigt und aufkonzentriert. Aus 2,5 l Expressionskultur konnten ca. 18 mg Protein isoliert werden. In der Abbildung 22 ist ein SDS-Gel des Sec42 gezeigt. In Bahn 1 ist bei ca. 25 kDa die Bande für das Sec42 zu sehen. Die schwache Bande darunter entspricht einem proteolytischem Degradationsprodukt des Sec42, das während der Expression entstanden ist. Die Bande bei ca. 30 kDa entspricht dem Mxe-Intein. Bei ca. 50 kDa ist noch eine Bande zu sehen, welche dem ungespliceten Fusionsprotein entspricht. Außerdem ist in Abb. 22 das ESI-MS Spektrum und das dekonvolutierte Spektrum des Sec42 gezeigt. Es treten die Ladungszustände von 12 bis 20 positiven Ladungen pro Molekül von 1940,9 bis 1164,7 g/mol auf. Nach Dekonvolution werden Massen von 23273 g/mol, was dem Methionin Spaltprodukt aus der Expression entspricht (23265 g/mol) und 23142 g/mol, was dem Methionin Spaltprodukt mit hydrolysiertem Thioester entspricht, gefunden. Die Masse von 21582 g/mol ist nicht zuzuordnen, entspricht aber wahrscheinlich einem Degradationsprodukt des Proteins während der Expression und Aufreinigung. Seite 41 Abb. 22: SDS-Gel des Sec42 (links). In Bahn 1 ist das Sec42 aufgetragen. Das ESI-MS der vereinigten Produkt-enthaltenden Fraktionen nach der Größenausschlusschromatographie (rechts). 3.2.3 Expression und Aufreinigung von Cherry-Ypt73 Die GTPase Ypt7 gehört zur Ypt/ Rab-Familie und ist am Transport des späten Endosoms zur Vakuole und bei der Verschmelzung des Endosoms mit der Vakuole beteiligt (Segev 2001b). Es wurde als Fusionsprotein mit der GFP-Mutante (green fluorescence protein) Cherry, einem Mxe-Intein und der CBD im Vektor pTWIN-1 exprimiert. Das Cherryprotein soll in einer späteren Chipmessung zur direkten Fluoreszenzdetektion einer Hybridisierung des ProteinDNA-Konjugates mit einem Fängeroligonukleotid verwendet werden. Zur Expression wurden E.coli BL21(DE3)RIL Zellen herangezogen. Die Expressionskultur wurde im 1,5 l Maßstab angesetzt. Durchgeführt wurde sie, wie in 2.3.1 beschrieben. Aufgereinigt wurde das Fusionsprotein mit 18 ml Chitinbeads, wie in 2.3.1 beschrieben. Zum Splicen wurden die Chitinbeads mit 36 ml 0,5 M MESNA in Waschpuffer (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 7,5) über Nacht bei 4C inkubiert. Dabei wurde der C-terminale Thioester des Cherry-Ypt73 generiert. Das Protein wurde mit Hilfe einer Größenausschluss-Chromatographie auf einer präparativen S75-Säule gereinigt, die Produktenthaltenden Fraktionen vereinigt und aufkonzentriert. Aus 1,5 l Expressionskultur konnten ca. 5 mg Protein isoliert werden. Seite 42 In der Abbildung 23 ist ein SDS-Gel des Cherry-Ypt73 gezeigt. In Bahn 1 ist dabei bei ca. 45 kDa die Bande für das Cherry-Ypt73 zu sehen. Die schwache Bande bei ca. 80 kDa entspricht dem ungespliceten Fusionsprotein. Die schwache Bande bei ca. 60 kDa ist nicht zuzuordnen. Außerdem ist in Abb. 23 das ESI-MS Spektrum und das dekonvolutierte Spektrum des Cherry-Ypt73 gezeigt. Es treten die Ladungszustände von 26 bis 63 positiven Ladungen pro Molekül von 1983,9 bis 820,1 g/mol auf. Nach Dekonvolution wird die Masse 51563 g/mol erhalten, welche in guter Übereinstimmung mit der Produktmasse des Cherry-Ypt73 von 51588 g/mol ist. Abb. 23: SDS-Gel des Cherry-Ypt73 (links). In Bahn 1 ist das Cherry-Ypt73 aufgetragen. Das ESI-MS der vereinigten Produkt-enthaltenden Fraktionen nach der Größenausschlusschromatographie (rechts). Seite 43 3.3 Ligationsreaktionen der exprimierten Proteine mit einem Testpeptid 3.3.1 Synthese des Testpeptids CGK(ivDde)GHHHHHH H-CGKGHHHHHH-OH M = 1392 g/mol [mit K3(ivDde)] Um die Reaktivität der Proteinthioester in Ligationsreaktionen zu testen wurde das ein Nterminales Cystein-enthaltende Peptid Boc-CGKGHHHHH-Wang-PS synthetisiert (Becker 2001b). Die Synthese erfolgte im 0,2 mmol Maßstab mittels manueller Festphasensynthese nach der Fmoc-Strategie. Nach der Synthese wurde die Hälfte des Resins zur Abspaltung eingesetzt. Das Peptid wurde mit 5 % (v/v) TIS und 2,5 % (v/v) H2O in TFA vom Harz abgespalten. Das Rohpeptid wurde mittels C4 RP-HPLC (125 x 4 mm) mit einem Gradienten von 5 % (v/v) Puffer F nach 65 % (v/v) Puffer F in Puffer E über 30 min bei einer Flussrate von 1 ml/min analysiert und durch C4 RP-HPLC (250 x 22 mm) und einem Gradienten von 10 % (v/v) Puffer F nach 40 % (v/v) Puffer F in Puffer E über 60 min bei einer Flussrate von 10 ml/min aufgereinigt. 100 RT = 16,8 min 280 nm 214 nm 80 80 rel. Intensität [%] rel. Absorption [%] 1392,5 100 60 40 20 60 40 20 696,8 0 0 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit [min] 30 35 40 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Masse [m/z] Abb. 24: HPLC-Chromatogramm des Testpeptids ( analytische C4-Säule mit einem Gradienten von 5 % Puffer F nach 65 % Puffer F in Puffer E in 30 min bei 214 und 280 nm detektiert) (links). Das dazugehörige ESI-MS Spektrum (rechts). Seite 44 2000 Im analytischen Chromatogramm (Abb. 24 (links)) ist neben kleinen Verunreinigungen ein Hauptpeak bei 16,8 min aufgetreten. Dieser Peak wurde massenspektrometrisch untersucht und entspricht dem Produkt (Abb. 24 (rechts)). Im ESI-MS wurde die einfach (1392,5 g/mol) und die zweifach geladene Masse (696,8 g/mol) des Peptids detektiert, welche sehr gut mit der berechneten Masse von 1392 g/mol übereinstimmt. 3.3.2 Ligation von Ypt12C mit CGK(ivDde)GHHHHHH Zum Test auf die Reaktivität des Ypt12C-Thioesters wurde es mit dem Testpeptid CGK(ivDde)GHHHHHH ligiert. Dazu wurden 200 µg des Proteins (50 µl (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 7,5), c = 4 mg/ml) mit 10 eq. (110 µg, 3,3 µl einer 4,7 M Stammlösung (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 7,5)) des Peptids umgesetzt. Die MESNA-Konzentration wurde auf 100 mM eingestellt und die Reaktionslösung über Nacht bei 4C gerührt. Es wurde jeweils eine Probe bei t = 0 h und t = 14 h abgenommen und per C4 RP-HPLC (125 x 4 mm) mit einem Gradienten von 5 % (v/v) Puffer F nach 80 % (v/v) Puffer F in Puffer E über 30 min bei einer Flussrate von 1 ml/min analysiert. Da die Reaktionslösung trüb wurde, wurde sie vor dem HPLC-Lauf mit 6 M Guanidiniumpuffer versetzt. Für die t = 0 Probe gibt es für das Peptid 2 Peaks im Chromatogramm (10,6 min, 13,3 min), von denen der erste dem Peptid und der zweite einem Disulfid des Peptids entspricht (Abb. 25). Der Peak bei 22,4 min entspricht dem Ypt12C. Nach 14 h ist durch die reduzierenden Bedingungen aufgrund des MESNA der Peak für das Disulfid des Peptids verschwunden. Anstelle des Ypt12C-Peaks bei 22,4 min sind zwei Peaks zu sehen. Der Eine bei 21,4 min entspricht vermutlich dem Ligationsprodukt, der Andere bei 23,6 min dem Ypt12C. Der Shift des Ypt12C-Peaks ist wahrscheinlich einer Druckschwankung der HPLC-Pumpe B zuzuschreiben. Die Intensität der Peaks hat für eine Charakterisierung mittels ESI-MS nicht ausgereicht. Seite 45 100 214 nm 280 nm 60 RT = 10,6 min RT = 13,3 min RT = 22,4 min 80 214 nm 280 nm 50 rel. Absorption [%] rel. Intensität [%] RT = 10,7 min 60 40 20 40 30 RT = 21,4 min 20 RT = 23,6 min 10 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Retentionszeit [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 Retentionszeit [min] Abb. 25: HPLC-Chromatogramm des Ligationsansatzes bei t = 0 h (links) und bei t = 14 h (rechts) über eine analytische C4-Säule mit einem Gradienten von 5 % Puffer F nach 80 % Puffer F in Puffer E in 30 min bei 214 und 280 nm detektiert. Ein SDS-PAGE-Gel der Ligationsreaktion im Vergleich mit dem Edukt Ypt12C (Abb. 26) zeigt für Bahn 1, in der das Ypt12C aufgetragen ist, eine Bande bei ca. 25 kDa, in Bahn 2, in der die Ligationslösung aufgetragen ist, drei Banden. Davon entspricht die Unterste dem Peptid, die mittlere bei ca. 25 kDa dem Protein und die darüber liegende Bande dem Ligationsprodukt. Aus der Intensität der Edukt- und Produktbande heraus lässt sich eine relative Reaktionsausbeute von ca. 50 % abschätzen. Abb. 26: SDS-Gel des Ligationsansatzes (links). In Bahn 1 ist das Edukt Ypt1 2C aufgetragen. In Bahn 2 ist der Ligationsansatz aufgetragen. ESI-MS des Ligationsansatzes nach TCA-Fällung (rechts). Seite 46 40 Da die Intensität der Peaks im HPLC-Chromatogramm nach 14 h zu gering für eine ESI-MSCharakterisierung war wurde nach 36 h eine TCA-Fällung der Ligationsmischung vorgenommen. Das entsprechende ESI-MS ist in Abbildung 26 gezeigt. Es sind die Ladungszustände von 13 bis 22 positiven Ladungen pro Molekül von 1876,3 g/mol bis 1109,1 g/mol zu sehen. Nach der Dekonvolution ergibt sich eine relative Masse von 24379 g/mol, welche sehr gut mit der berechneten Masse für das Produkt von 24378 g/mol übereinstimmt. 3.3.3 Ligation von Sec42 mit CGK(ivDde)GHHHHHH Zum Test auf die Reaktivität des Sec42-Thioesters wurde es mit dem Testpeptid CGK(ivDde)GHHHHHH ligiert. Dazu wurden 3 Versuche angesetzt: Ein Ansatz bei RT, einer bei 4C und ein Ansatz unter denaturierenden Bedingungen bei RT. Für die Ansätze bei RT und bei 4C wurden 4,8 µl (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 7,5; c = 8,9 mg/ml) der Proteinlösung, 33 µmol (20 eq.) des Peptids), 1,5 µl einer 1 M MESNA Stammlösung und 0,2 µl (92 mM Stammlösung) der GDP-Lösung zusammengegeben. Der Ligationspuffer bestand aus 10 mM NaPi, 100 µM MgCl2, pH 7,5. Für den denaturierenden Ansatz wurden anstelle des MESNA 0,5 µl Thiophenol und als Ligationspuffer 6 M Gdn·HCl, 300 mM NaPi, pH 7,6 verwendet. Die drei Ansätze wurden über Nacht geschüttelt. Zu dem unter denaturierenden Bedingungen geführten Ligationsansatz wurden anschließend 3 Volumenäquivalente H2O und 20 % (v/v) -Mercaptoethanol hinzugefügt und diese Lösung 30 min bei RT gerührt. Für die ESI-MS Analysen wurden alle drei Ansätze einer TCA-Fällung unterzogen. In Abbildung 27 sind die ESI-MS Spektren und die dekonvolutierten Spektren der zwei Ansätze unter nativen Bedingungen abgebildet. Im Falle des Ansatzes bei Raumtemperatur treten die Ladungszustände von 12 bis 23 positiven Ladungen pro Molekül von 1938,4 g/mol bis 1012,7 g/mol auf. Nach Dekonvolution wird eine Masse von 23275 g/mol erhalten, welche dem Edukt entspricht. Außerdem werden die Massen 23181 g/mol, 25092 g/mol und 18514 g/mol, welche nicht zuzuordnen sind, erhalten. Die Produktmasse von 24523 g/mol wird nicht gefunden. Im Falle des Ansatzes bei 4C treten die Ladungszustände von 12 bis 25 positiven Ladungen pro Molekül von 1940,93 g/mol bis 933,7 g/mol auf. Nach Dekonvolution wird eine Masse von 23272 g/mol gefunden, welche gut mit der Eduktmasse von 23273 g/mol übereinstimmt. Seite 47 Die Masse 23139 g/mol entspricht dem Edukt mit hydrolysiertem Thioester. Die Produktmasse ist nicht zu detektieren. Abb. 27: ESI-MS des Ligationsansatzes bei RT (links). ESI-MS des Ligationsansatzes bei 4C (rechts). Der Ansatz unter denaturierenden Bedingungen zeigt die Ladungszustände von 12 bis 23 positiven Ladungen pro Molekül von 1947,3 g/mol bis 1007,1 g/mol (Abb. 28). Nach Dekonvolution werden die Massen 23275 g/mol und 23137 g/mol gefunden, welche dem Edukt und dem Edukt mit hydrolysiertem Thioester entsprechen. Die Produktmasse wird nicht gefunden. In Abbildung 28 ist ein SDS-PAGE-Gel der Ligationsansätze gezeigt. In den Bahnen 1 und 2 für die Ansätze bei Raumtemperatur und 4C ist jeweils eine Bande bei ca. 25 kDa, welche dem Sec42 entspricht und eine Bande bei ca. 4 kDa, welche dem Peptid entspricht, zu sehen. Eine neue Bande bei höheren Massen, welche einem Ligationsprodukt entspräche, ist nicht zu sehen. In der Bahn 3, wo der Ligationsansatz unter denaturierenden Bedingungen aufgetragen ist, ist ebenfalls eine Bande bei ca. 25 kDa zu sehen. Das Peptid ging während der TCAFällung, welche zur Probenvorbereitung durchgeführt wurde, verloren. In der Bahn 4 ist zur Kontrollle ein Ligationsansatz ohne Peptid aufgetragen. Die Bande, welche zu sehen ist, liegt auf gleicher Höhe mit den Sec42-Banden der Bahnen 1 bis 3. Die Banden für das Sec42 sind in allen Bahnen verschmiert. Seite 48 Abb 28: ESI-MS des Ligationsansatzes bei RT unter denaturierenden Bedingungen (links). SDS-Gel der Ligationsansätze (rechts). In Bahn 1 ist der Ansatz bei RT, in Bahn 2 der Ansatz bei 4C aufgetragen. In Bahn 3 ist der Ligationsansatz bei RT unter denaturierenden Bedingungen und in Bahn 4 zur Kontrolle ein Ligationsansatz ohne Peptid aufgetragen. Keiner der drei Ansätze ergab Produkt. Darum wurden ca. 800 µg des Proteins über eine C4 RP-HPLC (250 x 10 mm) mit einem Gradienten von 5 % (v/v) Puffer B nach 80 % (v/v) Puffer B in Puffer A über 60 min bei einer Flussrate von 2 ml/min aufgereinigt. Die lyophillisierten Fraktionen wurden erneut unter denaturierenden Bedingungen in einer Konzentration von 170 µM mit 20 eq. des Peptids bei 4C umgesetzt. Abb. 29: Durch Silberfärbung angefärbtes SDS-Gel des Ligationsansatzes In Bahn 1 ist das Edukt zum Vergleich aufgetragen. In Bahn 2 der Ligationsansatz. Seite 49 Dann wurde der Ligationsansatz mit 3 Volumenäquivalenten Puffer verdünnt und 30 min bei RT mit 20 % (v/v) -Mercaptoethanol gerührt. Nach einer TCA-Fällung folgte eine SDSGelelektrophorese, welche durch Silberfärbung angefärbt wurde (Abb. 29). In der Bahn 1 ist das Sec4Δ2 als Vergleich aufgetragen. Die Bande liegt bei ca. 25 kDa. In der zweiten Bahn ist der Ligationsansatz aufgetragen. Es zeigt sich eine zweite Bande zu höheren Massen hin, welche dem Ligationsprodukt entspricht. Es scheint, als wäre das exprimierte Sec4Δ2 nur zu ligieren, wenn es zuvor einer HPLC-Aufreinigung unterzogen wird, um möglicherweise die Ligation inhibierende Substanzen zu entfernen. Dann beträgt die relative Ligationsausbeute 20-30 %. 3.4 Ligation von RBD mit Cys-Oligonukleotid A Zur Ermittlung geeigneter Ligationsbedingungen für die Oligonukleotide wurde das CysOligonukleotid A unter verschiedenen Reaktionsbedingungen mit dem RBD-Thioester umgesetzt. Es wurden jeweils 50 µg der RBD in einem Puffer bestehend aus 50 mM Tris, 150 mM NaCl mit 1 oder 2 eq. des Oligonukleotids in Gegenwart von 0,5 M MESNA oder 0,5 M Thiophenol umgesetzt. Die pH-Werte wurden zwischen 7,0, 7,5 und 8,5 variiert. In Abbildung 30 ist das SDS-Gel der 7 Ligationsansätze nach 2 d abgebildet. Bei allen Ligationsansätzen tritt lediglich die RBD-Bande bei ca. 11 kDa und die Bande für das MxeIntein bei ca. 30 kDa auf. Nur der Ligationsansatz bei pH 8,5 zeigt eine schwache neue Bande bei ca. 21 kDa. 1) pH 7,0; 1 eq. DNA; MESNA 2) pH 7,0; 3 eq. DNA; MESNA 3) pH 7,5; 1 eq. DNA; MESNA 4) pH 7,5; 3 eq. DNA; MESNA 5) pH 8,5; 1 eq. DNA; MESNA 6) pH 7,0; 3 eq. DNA; Thiophenol 7) pH 7,5; 3 eq. DNA; Thiophenol 8) RBD-Vergleichsprobe Abb. 30: SDS-Gel der Ligationsansätze der RBD mit dem Cys-Oligonukleotid A Seite 50 In der folgenden Testreihe wurde der pH-Wert konstant bei pH 8,5 belassen. Die Äquivalente an DNA wurden zwischen 1, 2 und 3 variiert und die MESNA-Konzentration wurde auf 0,5 M eingestellt. Um mögliche Disulfide des Cys-Oligonukleotids zu vermeiden wurden 5 mM TCEP eingestellt. Außerdem wurde in dieser Testreihe die Temperatur zwischen 4ºC, RT und 33ºC variiert. In der Abbildung 31 ist das SDS-Gel der 6 verschiedenen Reaktionsansätze gezeigt. Für alle Ansätze außer dem in Bahn 5 aufgetragenen mit 3 eq. DNA und bei RT zeigt sich eine neue Bande, welche dem Ligationsprodukt entspricht. Beim Ansatz 2 mit 2 eq. DNA bei 4ºC ist die Ligationsbande nur sehr schwach ausgeprägt. Die schwache Bande des zweiten und die fehlende Bande des fünften Ansatzes sind vermutlich auf fehlerhafte Einstellung des pHWertes zurückzuführen. Beim Ansatz 6, bei 33ºC, sind die Banden, vermutlich auf Grund einer Wärmedenaturierung, leicht verschmiert. Am besten hat der Ansatz 3 bei 3 eq. DNA und 4ºC ligiert. Die Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Menge an RBD-Thioester lässt sich aufgrund der Intensitäten der Banden auf ca. 15-20 % schätzen. 1) 1 eq. DNA; 4ºC 2) 2 eq. DNA; 4ºC 3) 3 eq. DNA; 4ºC 4) 2 eq. DNA; RT 5) 3 eq. DNA; RT 6) 1 eq. DNA; 33ºC Abb. 31: SDS-Gel der 6 Ligationsansätze der RBD mit dem Cys-Oligonukleotid A bei konstantem pH-Wert von 8,5. 3.5 Ligation von Ypt1Δ2C mit Cys-Oligonukleotiden A und B Zur Ligation des Ypt1Δ2C mit dem Cys-Oligonukleotid B wurden 50 µg des Oligonukleotids lyophillisiert und in 20 µl Ligationspuffer (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl 2, 2 µM GDP, pH 8,3) aufgenommen. Dann wurden 300 µg Ypt1Δ2C (2 eq.; 77 µl; c = 3,9 mg/ml) in Ligationspuffer dazugegeben. Es wurde eine MESNA Konzentration von 0,5 M eingestellt. Um mögliche Disulfide des Cys-Oligonukleotids zu vermeiden wurden 2 % (v/v) Ethanthiol Seite 51 hinzugefügt. Außerdem vermittelt Ethanthiol ebenso Ligationen wie MESNA und bildet einen aktiveren Thioester. Die Ligationsmischung wurde bei 4ºC über Nacht langsam gerührt. In Abbildung 31 ist ein SDS-Gel des Ligationsansatzes gezeigt. In Bahn 1 und 2 ist zum Vergleich Ypt1Δ2C im ersten Fall verdünnt, im zweiten Fall stärker konzentriert, aufgetragen. In Bahn 3 und 4 ist die Ligationsmischung verdünnt und stärker konzentriert aufgetragen. Für das Ypt1Δ2C sieht man eine Bande bei ca. 25 kDa, welche dem Protein entspricht und eine schwache Bande bei ca. 30 kDa, die dem Mxe-Intein entspricht. Außerdem ist eine schwache Bande bei ca. 50 kDa zu sehen, welche dem nicht abreagiertem Fusionsprotein aus Ypt1 Δ2C dem Mxe-Intein und der CBD entspricht. Im Falle der Ligationsmischung ist zusätzlich bei ca. 33 kDa eine neue Bande zu detektieren, welche vermutlich dem Ligationsprodukt entspricht. Allerdings ist diese Bande nur sehr schwach ausgeprägt. Es lässt sich aus der Intensität der Banden eine Reaktionsausbeute von weniger als 5 % abschätzen. 1) Ypt1Δ2C Vergleich verd. 2) Ypt1Δ2C Vergleich konz. 3) Ligationsmischung verd. 4) Ligationsmischung konz. Abb. 31: SDS-Gel des Ligationsansatzes von Ypt1Δ2C mit dem Cys-Oligonukleotid B. In Bahn 1 und 2 ist das Ypt1Δ2C, in Bahn 3 und 4 der Ligationsansatz, jeweils verdünnt und stärker konzentriert aufgetragen. Es wurde vermutet, dass die Reaktionsausbeute der Ligation des Ypt1Δ2C mit dem CysOligonukleotid B sehr gering war, weil das Cystein mit ungeschützter Seitenkette eingesetzt worden ist. Diese war ungeschützt, da die MMT-Schutzgruppe zur photometrischen Ausbeutenbestimmung auf den Glasbeads abgespalten worden war. Vermutlich ist das Cystein reaktiver, wenn es in situ unmittelbar vor der Ligationsreaktion entschützt wird. Um zu testen, ob die Reaktionsausbeuten dadurch erhöht werden können, wurde ein Ligationsansatz des Ypt1Δ2C mit dem Cys(t-Butylthio)-Oligonukleotid A angesetzt. Außerdem wurde, um zu prüfen, ob das Ypt1Δ2C eine für diese Reaktion ungünstige Konformation besitzt, ein Ansatz unter denaturierenden Bedingungen gestestet. Seite 52 Dazu wurden je 100 µg des Proteins verwendet. Für die Reaktion unter nativen Bedingungen wurden 33 µg des Oligonukleotids lyophilisiert und in 30 µl des Ligationspuffers (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 8,3) aufgenommen. Es wurde eine MESNA Konzentration von 0,5 M und eine TCEP Konzentration von 5 mM eingestellt. Im Fall der Ligation unter denaturierenden Bedingungen wurden 33 µg des Oligonukleotids lyophilisiert und in 50 µl 6 M Gdn·HCl, 300 mM NaPi, pH 7,6 aufgenommen. Es wurden 2 % (v/v) Thiophenol eingestellt. Thiophenol bildet reaktive Thioester und liefert bei der chemischen nativen Ligation von Peptiden in Guanidinium-Puffer unter denaturierenden Bedingungen häufig gute Ausbeuten. Beide Ligationsansätze wurden über Nacht bei 4ºC gerührt. In Abbildung 32 ist das SDS-Gel der beiden Ligationsansätze gezeigt. Dabei ist in der ersten Bahn das Ypt1Δ2C als Vergleich aufgetragen. In Bahn 2 ist der Ligationsansatz unter nativen Bedingungen in Bahn 3 der Ligationsansatz unter denaturierenden Bedingungen aufgetragen. Für das Ypt1Δ2C ist eine Bande bei ca. 25 kDa zu sehen. Außerdem eine Bande bei 30 kDa, welche dem Mxe-Intein entspricht. Für den Ligationsansatz unter nativen Bedingungen findet sich zusätzlich eine neue Bande bei ca. 33 kDa, welche vermutlich dem Ligationsprodukt entspricht. Für den Ligationsansatz unter denaturierenden Bedingungen findet sich ebenso die vermutete Bande für das Ligationsprodukt bei ca. 33 kDa. Bei ca. 45 kDa findet sich eine zusätzliche Bande, welche nicht zugeordnet werden kann. Eine Kontamination des Ligationspuffers, oder des eingesetzten Thiophenols konnte nach einer Überprüfung durch ein SDS-Gel ausgeschlossen werden. Die aus den Intensitäten der Banden geschätzte Reaktionsausbeute beträgt für den Ansatz unter nativen Bedingungen 10-15 %. Der Ansatz unter denaturierenden Bedingungen zeigt ein ähnliches Ergebnis. 1) Ypt1Δ2C 2) Ligationsansatz nativ 3) Ligationsansatz denaturiert Abb. 32: SDS-Gel der Ligationsansätze unter nativen und unter denaturierenden Bedingungen. In Bahn 1 ist das Ypt1Δ2C als Vergleich aufgetragen. In Bahn 2 und 3 sind die Ligationsansätze unter nativen und unter denaturierenden Bedingungen aufgetragen. Seite 53 Anschließend wurde versucht das Ligationsprodukt mittels Ionenaustauschchromatographie aufzureinigen. Das Ypt1Δ2C hat einen isoelektrischen Punkt von 5,17. Darum wurde zur Trennung ein HiTrap Q FF Anionenaustauscher mit einem Volumen von 1 ml gewählt. In den Testläufen wurde ein Gradient gewählt, der für 10 min bei 0 % Puffer H (20 mM Tris, 1 M NaCl pH 8,3) in Puffer G (20 mM Tris pH 8,3) verblieb und dann von 0 % Puffer H nach 100 % Puffer H in Puffer G in 20 min verlief. Im Chromatogramm für das CysOligonukleotid A (Abb. 33) entspricht der erste Peak dem Injektionspeak. Der Peak mit einer Retentionszeit von 26,3 min entspricht dem Cys-Oligonukleotid A. Es eluiert bei 815 mM NaCl. Im Chromatogramm für das Ypt1Δ2C (Abb. 33) entspricht der erste Peak dem Injektionspeak. Der Peak mit einer Retentionszeit von 18,5 min entspricht dem Protein. Das Ypt1Δ2C eluiert bei 425 mM NaCl. Der Peak bei 27,4 min ist nicht zuzuordnen. Auch ein SDS-Gel des gesammelten Peaks bei 27,4 min zeigt keine Bande, welche zur Charakterisierung helfen könnte. 40 254 nm 500 280 nm RT = 18,5 min 35 300 200 RT = 26,3 min 100 Absorption [mAu] 400 Absorption [mAu] RT = 27,4 min 30 25 20 15 10 5 0 0 -5 0 10 20 Retentionszeit [min] 30 0 10 20 30 Retentionszeit [min] Abb.33: Ionenaustauschchromatographie des Oligonukleotids A (links) und des Ypt1Δ2C (rechts) mit einem Gradienten von 10 min 0 % Puffer H in Puffer G, dann von 0 % Puffer H nach 100 % Puffer H in Puffer G in 20 min. Für die Aufreinigung des Ligationsprodukts wurde ein flacherer Gradient gewählt. Dieser hatte einem 10 min Vorlauf von 0 % Puffer H in Puffer G, dann verlief er von 0 % Puffer H nach 100 % Puffer H in Puffer G über 60 min. Das entsprechende Chromatogramm ist in Abbildung 34 gezeigt. Es sind drei Peaks zu sehen, von denen der Erste eine Retentionszeit von 21,4 min (190 mM NaCl), der Zweite eine Retentionszeit von 29,4 min (323 mM NaCl) und der dritte, der Hauptpeak, eine Retentionszeit von 45,5 min (591 mM NaCl) aufweist. Die Seite 54 Peaks mit den Retentionszeiten von 29,4 min und 45,5 min wurden fraktioniert gesammelt und um sie charakterisieren zu können die Fraktionen auf ein SDS-Gel aufgetragen. Für den Peak bei 29,4 min ist keine Bande in der Silberfärbung des Gels zu detektieren. Aber in jeder Fraktion des Peaks bei 45,5 min wurde das Ypt1Δ2C als schwache Bande in der Silberfärbung des Gels detektiert. Das Ligationsprodukt wurde in keiner der Fraktionen detektiert. Es wird vermutet, dass das Ligationsprodukt ebenso wie das Ypt1Δ2C über alle Fraktionen des Peaks bei 45,5 min verteilt ist und deshalb die Sensitivität der Silberfärbung zur Detektion nicht mehr ausreicht. 250 254 nm RT = 45,5 min Absorption [mAu] 200 150 100 RT = 29,4 min 50 RT = 21,4 min 0 0 20 40 60 Retentionszeit [min] Abb. 34: Ionenaustausch-Chromatogramm der Ligationsmischung des Ypt1Δ2C mit dem Cys-Oligonukleotid A mit Hilfe eines HiTrap Q FF Anionenaustauschers mit einem Volumen von 1 ml. Der gewählte Gradient verblieb 10 min bei 0 % Puffer H in Puffer G, verlief dann von 0 % Puffer H nach 100 % Puffer H in Puffer G über 60 min. 3.6 Ligation von Cherry-Ypt7Δ3 mit Cys-Oligonukleotid C Zur Ligation des CherryYpt7Δ3 mit dem Cys-Oligonukleotid C wurden 46 µg des Oligonukleotids lyophilisiert und in 20 µl Ligationspuffer (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 8,3) aufgenommen. Dann wurden 300 µg Cherry-Ypt7Δ3 (103 µl; c = 2,9 mg/ml) in Ligationspuffer dazugegeben. Es wurde eine MESNA Konzentration von 0,5 M und um mögliche Disulfide des Cys-Oligonukleotids zu vermeiden 2 % (v/v) Ethanthiol hinzugefügt. Außerdem vermittelt Ethanthiol ebenso Ligationen wie MESNA und Seite 55 bildet einen aktiveren Thioester. Die Ligationsmischung wurde bei 4ºC über Nacht langsam gerührt. Es wurde eine SDS-PAGE durchgeführt und von ihr ein Fluoreszenzscan bei einer Anregungswellenlänge von 532 nm vorgenommen. Der Scan ist in Abbildung 35 gezeigt. In Bahn 1, wo Cherry-Ypt7Δ3 als Vergleich aufgetragen ist, entspricht die untere Bande bei ca. 45 kDa dem Protein und die Bande bei ca. 80 kDa dem beim Splicen nicht abreagiertem Fusionsprotein von dem Cherry-Ypt7Δ3, dem Mxe-Intein und der CBD. In Bahn 2, wo die Ligationsmischung aufgetragen ist, ist zusätzlich eine neue Bande bei etwa 60 kDa zu detektieren, welche vermutlich einem Ligationsprodukt entspricht. Allerdings ist die Intensität der Bande sehr schwach gegenüber dem nicht umgesetzten Edukt und es lässt sich eine Reaktionsausbeute von höchstens 1 % abschätzen. Abb. 35: Fluoreszenzscan des SDS-Gels der Ligationsmischung des Cherry-Ypt7Δ3 und dem CysOligonukleotid C. In Bahn 1 ist das Edukt Cherry-Ypt7Δ3 als Vergleich, in Bahn 2 die Ligationsmischung aufgetragen. Trotz der geringen Ausbeute wurde der Versuch einer Aufreinigung über eine analytische S2000 Größenausschluss-Chromatographie-Säule von Phenomenex unternommen. Als Puffer diente der YPT-Wasch- und Lagerpuffer (25 mM NaPi, 0,5 M NaCl, 2 mM MgCl2, 2 µM GDP, pH 7,5) und die Flussrate betrug 0,5 ml/min. Das Chromatogramm ist in Abbildung 36 abgebildet. Es sind vier Peaks zu sehen, die stark bei 254 nm absorbieren. Ihre Retentionszeiten sind 27,8 min, 30,7 min, 40,0 min und 41,8 min. Der erste Peak bei 27,8 min entspricht dem Cherry-Ypt7Δ3, der Peak bei 30,7 min entspricht dem Cys-Oligonukleotid C. Der Peak bei 40,0 min ist nicht zuzuordnen. Der Peak bei der Retentionszeit von 41,8 min entspricht dem MESNA aus der Reaktionslösung, oder einer Verunreinigung des verwendeten MESNA. Ein Peak mit einer 254 nm Absorption für ein Ligationsprodukt ist nicht zu detektieren. Seite 56 1.6 254 nm 280 nm 1.4 RT = 41.8 min RT = 30.7 min 1.2 RT = 40.0 min Absorption [Au] 1.0 0.8 0.6 0.4 RT = 27.8 min 0.2 0.0 -0.2 0 10 20 30 40 50 60 Retentionszeit [min] Abb. 36: Chromatogramm der Größenausschluss-Chromatographie der Ligationsmischung des Cherry-Ypt7Δ3 mit dem Cys-Oligonukleotid C über eine analytische S2000-Säule von Phenomenex. Seite 57 4. Diskussion 4.1 Cysteinmodifizierung der Oligonukleotide Zur Modifizierung der Oligonukleotide mit einem Cystein wurde die Strategie gewählt Fmoc-geschütztes Cystein mit t-Butylthio-geschützter Seitenkette, über die Aktivierung der Carboxyfunktion, direkt an ein Festphasen-gebundenes, 5’-Amino-funktionalisiertes Oligonukleotid zu koppeln. Aus der Literatur sind auch andere Cystein-enthaltenden Bausteine zur Modifizierung bekannt. In einem ersten Ansatz von Becker et al. (2005) wird ein Cystein-modifiziertes Thymidin-3’-O-phosphoramidit verwendet, welches über die Phosphoramiditsynthese in das Oligonukleotid eingebaut wird. In einem Ansatz von Takeda et al. (2004) wurde eine Cystein-modifizierte Piperidin-4-Carbonsäure als Baustein verwendet und durch die Aktivierung mittels NHS (N-Hydroxysuccinimid) und HOBt an ein Aminofunktionalisiertes Oligonukleotid gekoppelt. Der Vorteil der in dieser Arbeit gewählten Strategie ist, dass ein kommerziell erhältliches geschütztes Cystein direkt verwendet werden kann, ohne dass vorher noch Reaktionen zur Darstellung des Kopplungsbausteines notwendig sind. Zur Kopplung des Cysteins wurden Aktivierungsstrategien unter Einsatz von HOBt/DCC, HBTU/DIPEA und die Kopplung über den Pentafluorophenylester des Cysteins getestet. Da die Trennung von Edukt und Produkt über die HPLC unter den gewählten Bedingungen nicht möglich war, konnte die Ausbeute nicht durch den Vergleich von Peakflächen aus der HPLC heraus bestimmt werden. So konnte lediglich anhand der MALDISpektren geschätzt werden, welche Aktivierungsstrategie zu den höchsten Ausbeuten führt. Alle drei Systeme lieferten ähnliche Ergebnisse. Die Kopplung wurde im folgendem mittels HOBt/ DCC in DCM durchgeführt, da die Kosten dieser Kopplungsmethode am geringsten waren. Als eine Möglichkeit zur Quantifizierung über photometrische Bestimmung der MMT-Konzentration und durch Vergleich der Peakflächen aus der HPLC-Trennung entwickelt war, stellte sich heraus, dass die Ausbeute der mittels HOBt/DCC durchgeführten Kopplung durchschnittlich 32,3 % beträgt. Diese Modifizierungsreaktion muss noch optimiert werden. So ist zu prüfen, wie die Wahl des Lösungsmittels die Ausbeute der Reaktion an der festen Phase beeinflusst. Die Reaktion an der festen Phase bietet die bekannten Vorteile, wie die leichte Entfernung von Reagenzien, und die Möglichkeit die Modifizierungsreaktion zu Seite 58 automatisieren und direkt an die Oligonukleotidsynthese anzuschließen. Bei einer Reaktion an der festen Phase wird das Oligonukleotid nicht HPLC-gereinigt eingesetzt. So befinden sich noch sämtliche Abbruchsequenzen, die während der Synthese des Oligonukleotids entstehen, in der Reaktionslösung der Cystein-Kopplung und müssen anschließend über die HPLC abgetrennt werden. Ebenso muss getestet werden, ob eine Modifizierungsreaktion in Lösung mit HPLCvorgereinigten Oligonukleotiden bessere Ergebnisse bietet. Erste Versuche der CysteinModifizierung in Lösung zeigten jedoch keine Verbesserung des Reaktionsumsatzes im Vergleich zur Festphasensynthese. Das Cystein-modifizierte Oligonukleotid kann in den folgenden Ligationsreaktionen mit den Proteinthioestern als Gemisch eingesetzt werden, da das nicht-modifizierte Oligonukleotid mit dem Thioester nicht reagieren kann und somit die Reaktion nicht stört. Es ist jedoch trotzdem sinnvoll eine Möglichkeit zu finden das Produkt aufzureinigen. Einerseits kann dadurch die Ausbeute der Reaktion durch den Vergleich der Peakflächen bei einer Absorption von 254 nm bestimmt werden. Andererseits werden durch eine HPLC-Aufreinigung eventuell störende Substanzen aus der Kopplungreaktion entfernt. Die Abtrennung der eingesetzten Kopplungsreagenzien durch die RP-HPLC gelang zwar, aber das Cys-Oligonukleotid konnte vom Oligonukleotid weder durch verschiedene Gradienten im TEAAc-Puffersystem, noch im TEA-HFIP-System getrennt werden (Gilar et al. 2002). Scheinbar wird das Elutionsverhalten des Moleküls durch die Kopplung des Cysteins nur unwesentlich verändert. Da eine Trennung über RP-HPLC unter den gewählten Bedingungen nicht möglich war wurde der Versuch unternommen eine Trennung mittels Aldehyd-funktionalisierten PEGABeads zu erreichen (Villain et al. 2001). Dabei bindet das Cystein spezifisch durch die Bildung eines Thioazolidinringes mit den Aldehydgruppen der Beads an die feste Phase. Die PEGA-Beads können dann gewaschen und somit alle Verunreinigungen entfernt werden. Das Produkt band schon nach 1-2 h nahezu vollständig an die Beads. Über die Abnahme der Peakflächen des Oligonukleotid-Gemisches bei einer Absorption von 254 nm aus HPLCLäufen von Proben zu Beginn und nach Abschluss der Beladung der Beads, kann eine Aussage über die Ausbeute der Modifizierungsreaktion getroffen werden. Ungefähr 80-90 % des Oligonukleotids binden nach diesem Vergleich an die Beads, aber durch UVAbsorptionsmessung bei 260 nm, je einer Probe des Überstands vor und nach der Beladung der Beads, wurde die Ausbeute der Modifizierungsreaktion auf ca. 30 % geschätzt. Eine unspezifische Bindung von nicht modifiziertem Oligonukleotid an die PEGA-Beads etwa Seite 59 über die ungeschützten Aminogruppen der Nukleobasen sollte jedoch gleichermaßen in der UV-Absoptionsmessung zu detektieren sein. Durch spätere Messungen wurde der Wert der UV-Messung von ca. 30 % bestätigt. Deshalb muss davon ausgegangen werden, dass bei der Probe für die HPLC vor Start der Beladung der Beads ein Pipettierfehler vorlag. Nach dem Waschen der Beads und der Entfernung aller Verunreinigungen wird das CysOligonukleotid von den Beads abgespalten, indem diese mit O-Methylhydroxylamin im sauren Puffer inkubiert werden (Villain et al. 2001). In der Literatur wird dafür ein pH-Wert von 2,9 eingestellt, aber zur Vermeidung von Depurinierung der Nukleobasen wurde eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5 verwendet. Laut RP-HPLC-Kontrolle konnte das Cys-Oligonukleotid nicht wieder abgespalten werden. Auch die Herabsenkung des pH-Wertes bis 4,0 zeigte keinen Erfolg. Die Ansätze zur Trennung von Edukt und Produkt über die Aldehyd-funktionalisierten PEGA-Beads und über RP-HPLC führten nicht zum Erfolg und eine eindeutige Quantifizierung durch die HPLC-Ergebnisse war auch nicht möglich. Als Alternative wurde die Seitenkettenschutzgruppe des Cysteins von der t-Butylthio-Schutzgruppe hin zur MMTSchutzgruppe gewechselt. Durch die MMT-Schutzgruppe erhöht sich die Hydrophobizität des Produkts und dieses kann mittels RP-HPLC auf einer C18 Säule durch eine Verschiebung in der Retentionszeit von ca. 7-8 min vom Edukt abgetrennt werden. Dies wird in der Festphasen-Oligonukleotidsynthese mit der Trityl-Schutzgruppe der 5’-OH-Gruppe standardmäßig angewendet (Will et al. 1995). Da nun das Produkt vom Edukt erfolgreich getrennt wurde, kann durch einen Vergleich der Peakflächen auf die Ausbeute der Reaktion geschlossen werden. Dieser Vergleich ergab einen Reaktionsumsatz von 25 %. Dieses Ergebnis passt zu den UV-Absorptionsmessungen vor und nach Beladung der CysteinCapture-Beads von ca. 30 %. Wird die Schutzgruppe dann nach erfolgter Trennung abgespalten, eluiert das Cys-Oligonukleotid wieder bei dem für das nicht modifizierte Oligonukleotid bestimmten Anteil an Puffer B. Wenn man die MMT-Schutzgruppe noch an der festen Phase abspaltet und den Überstand sammelt, kann anhand der Absorption des MMT-Kations bei 460 nm seine Konzentration und damit die Ausbeute der Reaktion berechnet werden. Sie betrug durchschnittlich 32,3 %. Dieser Wert stimmt gut mit dem aus dem Vergleich der Peakflächen während der HPLCTrennung und mit dem aus der UV-Absorptionsmessung während der Beladung der Cysteincapture-Beads überein. Für diese UV-Messung wurde der molare Extinktionskoeffizient des MMT-Kations bei 460 nm in 3 % TCA in DCM durch eine Messreihe bestimmt. Der Seite 60 gefundene Wert von 460 = 29259 M-1cm-1 sollte jedoch noch durch weitere Messreihen bestätigt werden, um einen möglichen Fehler in der Ausbeutenbestimmung zu minimieren. Um das Produkt nach erfolgter Trennung mittels MALDI-TOF charakterisieren zu können muss dieses entsalzt werden. Ansonsten weisen die entsprechenden Peaks im MALDISpektrum durch zahlreiche Salzadukte eine sehr große Halbwertsbreite auf. Dadurch wird eine genaue Zuordnung der Peaks unmöglich. Außerdem führt durch die große Halbwertsbreite der Peaks eine Kalibrierung des MALDI-MS zu keinen genaueren Aussagen über die Masse. Die Qualität der Spektren konnte durch zweimaliges Entsalzen über NAP5 Säulen erheblich verbessert werden. Auch der Einsatz von C18 ZIPTIPs zur Probenvorbereitung führt zu guten MALDI-Spektren. Außerdem ist mit den C18 ZIPTIPs die Probenvorbereitung kürzer als bei der Entsalzung über die NAP5 Säulen und es wird erheblich weniger Material benötigt, um die MALDI-Messung durchzuführen. Für die Oligonukleotide A und B zeigten die MALDI-Spektren jeweils zwei Peaks, welche vermutlich der einfach geladenen Masse des Edukts und des Produkts der Modifizierungsreaktion entsprechen. Die Massenabweichungen von den berechneten Massen betrugen ca. 50 Da, was einem Fehler von 0,7 % entspricht. Aus der Literatur sind MALDIMessungen von Oligonukleotiden mit Massen bis zu 15 kDa bekannt, in denen die Massenabweichungen nach externer Kalibrierung lediglich 10 Da betragen (Jurinke et al. 1996). Der Massenunterschied zwischen den beiden gefundenen Peaks beträgt ca. 100 - 110 Da, was gut mit dem Massenzuwachs, durch die Kopplung eines Cysteins, mit 103 Da übereinstimmt. Für das Oligonukleotid C konnte nur eine Masse gefunden werden. Diese liegt genau zwischen den berechneten Massen für das Produkt und das Edukt. So ist aus den MALDIMessungen heraus keine Aussage über den Reaktionsumsatz der Modifizierung zu treffen. Das Cys-Oligonukleotid C wurde trotzdem in anschließenden Ligationsreaktionen verwendet, da durch die photometrische Ausbeutenbestimmung über das MMT-Kation eine Ausbeute von 33 % gefunden wurde. Seite 61 4.2 Expression und Aufreinigung von Ypt12C, Sec42 und Cherry-Ypt73 Nach der Expression des Fusionsproteins des Ypt12C mit dem Mxe-Intein und der CBD und seiner Bindung an die Chitinbeads wurden alle anderen löslichen Proteine, die sich im Überstand nach der Abtrennung der Zelltrümmer befanden, entfernt. Die Splicing-Effiziens des Ypt12C-Fusionsproteins wird durch Vergleich der Intensitäten der Banden des SDSGels auf 80-90 % geschätzt. Nicht abreagiertes Fusionsprotein wurde während der Größenausschluss-Chromatographie abgetrennt. Dies führte aus einer Expressionskultur von 5 l zu ca. 9 mg reinem Protein, das lediglich durch ein proteolytisches Degradationsprodukt, das während der Expression entstanden ist, verunreinigt war. Da das ungesplicete Fusionsprotein und das Mxe-Intein in der nachfolgenden Ligationsreaktion nicht stören, wurde aber auf eine hohe Reinheit zu Gunsten der Ausbeute an Protein verzichtet. Dadurch konnte die Ausbeute an Protein einer Reinheit von ca. 85-90 % auf ca. 18 mg erhöht werden. Im folgenden muss getestet werden, ob durch eine kontrollierte Expression bei 37ºC, das während der Expression entstehende Degradationsprodukt des Proteins vermieden werden. Bei den Proteinen Sec42 und Cherry-Ypt73 wurden nach der GrößenausschlussChromatographie ebenfalls ungeachtet nicht abreagiertem Fusionproteins und Inteins alle Produkt-enthaltenden Fraktionen vereinigt um die Ausbeute der Expression zu steigern. Für das Sec42 konnten aus 2,5 l Expressionskultur ca. 18 mg Protein isoliert werden und für das Cherry-Ypt73 aus einer Expressionskultur von 1,5 l ca. 5 mg. Das Cherry-Ypt73 hatte also mit 3,3 mg pro l Kultur gegenüber 7,2 mg/l für das Sec42 und 3,6 mg/l für das Ypt12C die geringste Ausbeute. Das lag an einer schlechten SplicingEffizienz auf den Chitin-Beads. Die Ausbeute des Ypt12C fiel trotz der guten Splicingeffiziens gering aus. Der Grund liegt darin, dass zu wenig Chitinbeads verwendet wurden, und dadurch eine große Menge an Protein nicht an Beads gebunden werden konnte. Diese Proteine gingen beim Waschen der Beads verloren. Seite 62 4.3 Test der Reaktivität der Proteinthioester Die Synthese des Testpeptids H-CGKGHHHHHH-OH lieferte hochreines Peptid, welches in den nachfolgenden Testligationen verwendet werden konnte. Die Testligation des Ypt12C mit dem Peptid ergab nach 14 h aus einem Vergleich der Intensität der Banden des nicht umgesetzten Edukts und des Ligationsprodukts in dem SDSGel eine Ausbeute von ca. 50 %. In der HPLC ist nach 14 h zwar ein neuer Peak im Chromatogramm entstanden, welcher im Vergleich mit dem Peak des Ypt12C ebenso auf eine Ausbeute von ca. 50 % schließen lässt, aber die Elution des Eduktpeaks ist ca. 1 min hin zu höheren Retentionszeiten verschoben. Wahrscheinlich ist dies auf Druckschwankungen der Pumpe B zurückzuführen. Außerdem war die Intensität der Peaks für das Edukt und das Ligationsprodukt im HPLC-Chromatogram nicht hoch genug um sie über ESI-MS zu charakterisieren. Darum wurde nach 36 h die Ligationslösung einer TCA-Fällung unterzogen und ein ESI-MS aufgenommen. Nach 36 h zeigte sich ausschließlich die erwartete Masse des Ligationsprodukts. Das heisst, dass die Umsetzung des Ypt12C mit dem Peptid nach 36 h nahezu quantitativ war. Das Peptid, welches im 10fachen Überschuss eingesetzt wurde ging während der TCA-Fällung verloren. Das Ypt12C besitzt also einen aktiven Thioester und kann für die Ligationsversuche mit den Cys-Oligonukleotiden verwendet werden. Das Sec42 jedoch war mit dem Testpeptid selbst unter denaturierenden Bedingungen nicht zu ligieren. Erst nach einem weiteren Aufreinigungsschritt über C4 RP-HPLC konnte das Sec42 mit dem Testpeptid unter denaturierenden Bedingungen ligiert werden. Dann ließ sich aus der Intensität der Banden aus dem Gel heraus eine relative Ausbeute von 20-30 % abschätzen. Wahrscheinlich befinden sich in der Proteinlösung die Ligation inhibierende Verunreinigungen, wie etwa Metallionen. Eine mögliche Quelle ist die Dialysemembran, welche im Falle des Sec42 zum Aufkonzentrieren während der Aufreinigung verwendet wurde, da diese nicht in EDTA-Lösung aufgekocht wurde. Bei den anderen beiden Proteinen wurde dieser Schritt mittels Centricon durchgeführt. Da das Protein für die nachfolgenden Messungen unbedingt in seiner nativen Konformation erhalten bleiben muss, erscheint eine präparative Aufreinigung des Sec42 über RP-HPLC als sinnlos. Denn eine anschließend notwendige Rückfaltung des Proteins müsste erst noch optimiert werden. Lediglich ein Umpuffern des Proteins über Dialyse oder Konzentratoren, Seite 63 um eventuelle Verunreinigungen zu entfernen, könnte die Ligation des Sec42 in seinem nativen Zustand möglich machen. Daher kann das Sec42 nicht ohne weitere Aufreinigung für Ligationsversuche mit den Cys-Oligonukleotiden verwendet werden. 4.4 Ligation der RBD mit Cys-Oligonukleotid A Es wurde versucht durch Ligationen der RBD mit dem Cys-Oligonukleotid A geeignete Reaktionsbedingungen zu finden. In der ersten Testreihe ergab sich lediglich bei einem pHWert von 8,5 eine neue Bande, welche dem Ligationsprodukt entspricht. Aus der Literatur sind Beispiele bekannt in denen die Ligation von Proteinen mit Oligonukleotiden über die chemische native Ligation bei pH-Werten von 8,0 bis 8,5 durchgeführt wurden (Takeda et al. 2004, Lovrinovic et al. 2005). Da die Ligationsbande noch recht schwach war, wurde in der folgenden Testreihe versucht durch TCEP stärker reduzierende Bedingungen einzustellen, um mögliche Disulfide das CysOligonukleotids zu vermeiden. Die Ligation liefert bei 4ºC die besten Resultate. Die Ligationsbande für den Ansatz bei Raumtemperatur ist schwächer ausgeprägt. Bei 33ºC verschmierten die Banden, was vermutlich auf eine Wärmedenaturierung während der Ligation zurückzuführen ist. Das Fehlen der Bande im Ansatz 5 bei 3 eq. DNA und RT und die sehr schwache Bande im Ansatz 2 bei 2 eq. DNA und 4ºC sind vermutlich auf einen fehlerhaft eingestellten pH-Wert zurückzuführen. Dieser wurde auf Grund des Fehlens eines Micro-pH-Meters mit Hilfe von pH-Streifen eingestellt. 4.5 Ligation von Ypt12C mit Cys-Oligonukleotid A und B Die Ligation des Ypt12C mit dem Cys-Oligonukleotid B ergab eine Ausbeute von weniger als 5 %. Die Reaktivität des Ypt12C-Thioesters ist durch die Ligation mit dem Testpeptid H-CGKGHHHHHH-OH nachgewiesen worden und die RBD zeigte für die Ligation mit dem Cys(t-Butylhio)-Oligonukleotid ebenfalls bessere Ausbeuten In diesem Fall wurde modifiziertes Oligonukleotid mit einer MMT-geschützten Cysteinseitenkette verwendet. Vielleicht ist das Cystein, wenn es eine t-Buthylthio-Schutzgruppe an seiner Seitenkette trägt, durch eine in situ Entschützung viel reaktiver, als wenn es ungeschützt in der Ligation eingesetzt wird. Durch die Entschützung während der Ligation ist die Thiolgruppe des Cysteins nur sehr kurz äußeren Einflüssen ausgesetzt. So kann sich beispielsweise Seite 64 eingesetztes TCEP zersetzen und mit dem Cystein Nebenprodukte bilden, welche keine Ligation mehr eingehen können. Tatsächlich ergab der Ligationsansatz mit dem t-Butylthio-geschütztem Cystein des CysOligonukleotids A mit dem Ypt12C ein Ligationsprodukt mit der geschätzten Ausbeute von 10 – 15 %. Der Ansatz unter denaturierenden Bedingungen ergab keine Verbesserung der Ligationsausbeute, was darauf schließen lässt, dass der Thioester nicht durch eine für die Reaktion ungünstige Konformation des Proteins abgeschirmt wird. Zur Aufreinigung des Ypt12C-Ligationsprodukts mittels Q-Anionenaustauscher wurden Testläufe durchgeführt. Das Cys-Oligonukleotid A eluiert mit 815 mM NaCl wie vermutet erst bei hohen Konzentrationen an NaCl. Im Testlauf des Ypt12C der IonenaustauschChromatographie entstand ein Peak bei 27,4 min, was einer Elution bei 870 mM NaCl entspricht. Der Peak wurde fraktioniert gesammelt und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Es konnte jedoch keine Bande detektiert werden. Daher wird angenommen, dass es sich bei diesem Peak um ein Oligonukleotid-Säulenartefakt handelt. Während der Aufreinigung wurde ein flacherer Gradient gewählt um eine Trennung zwischen dem Protein-DNA-Konjugat und dem nicht umgesetzten Oligonukleotid zu erreichen. Dieses muss unbedingt abgetrennt werden, da es während Chipmessungen mit dem Protein-DNA-Konjugat konkurrieren würde, und somit ein Signal während der Messung abschwächen bzw. vollständig verhindern würde. Das nicht ligierte Protein muss nicht abgetrennt werden, da dieses nicht immobilisiert wird und während der Waschprozeduren einer Chipmessung ausgewaschen werden würde. Anstelle zweier Peaks für das Protein und das Oligonukleotid und einem dritten Peak für das Konjugat war nur ein sehr breiter Peak zu sehen, welcher von ca. 500 mM NaCl bis 667 mM NaCl verlief. Ein Silbergefärbtes SDS-Gel des fraktioniert gesammelten Peaks ergab, dass das Protein über die volle Breite des Peaks eluierte. Das Ligationsprodukt konnte in keiner der gesammelten Fraktionen detektiert werden. Es wird vermutet, dass es ebenso wie das Ypt12C über alle Fraktionen verteilt ist, aber durch die starke Verdünnung selbst in der Silberfärbung nicht zu detektieren ist. 4.6 Ligation von Cherry-Ypt73 mit Cys-Oligonukleotid C Die Ligation des Cherry-Ypt73 mit dem Cys-Oligonukleotid C ergab ebenso, wie im Falle des Ypt12C nur eine geringe Ligationsausbeute. Sie betrug höchstens 1 %. Als Grund wird einerseits der Einsatz von Cys-Oligonukleotid mit ungeschützter Cystein-Seitenkette Seite 65 angenommen. Andererseits scheinen die Reaktionsbedingungen ungünstig zu sein, obgleich die selben Bedingungen im Falle des Ypt12C zu einer Ligation von immerhin 10-15 % geführt haben. Trotz der schlechten Ausbeute wurde der Versuch unternommen das Ligationsprodukt über eine Größenausschluss-Chromatographie aufzureinigen, um das Oligonukleotid abzutrennen, welches in einer nachfolgenden Chipmessung mit dem Konjugat konkurrieren und ein Fluoreszenssignal unterdrücken oder ganz verhindern würde. Aber im entsprechenden Chromatogramm ist kein Peak mit einer Absorption bei 254 nm für das Ligationsprodukt zu detektieren. Die aufgetragene Menge an Ligationsprodukt war selbst für eine analytische Größenausschluss-Chromatographie-Säule zu gering. 5. Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei 5’-Amino-funktionalisierte Oligonukleotide mit einer Länge von 24 bis 26 Basen mit einem Cystein modifiziert. Dazu wurden die drei verschiedenen Kopplungsmethoden HOBt/DCC, HBTU/DIPEA und der Pentafluorophenylester des Cysteins getestet. Es wurde eine Möglichkeit gefunden die bestehenden Trennungsschwierigkeiten von Edukt und Produkt auf der RP-HPLC zu lösen, indem das Elutionsverhalten des Produkts verändert wurde. Somit kann das Produkt in hoher Reinheit isoliert werden. Außerdem wurde eine Methode gefunden, um die Ausbeute der Kupplungsreaktion photometrisch oder durch Vergleich zu bestimmen. Des weiteren wurden die drei GTPasen Sec4Δ2, Ypt1Δ2C und Cherry-Ypt7Δ3 als Fusionsproteine mit dem Mxe-Intein und der CBD exprimiert und durch Splicing deren Thioester generiert. Mit Hilfe der RBD wurden Reaktionsbedingungen für die Ligation eines Protein-Thioesters mit Cystein-modifizierten Oligonukleotiden gefunden. Die Ligationsreaktion des Ypt1Δ2C mit dem Cys-Oligonukleotid A war erfolgreich und ergab eine 10-15 %ige Ausbeute. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse sollen dazu dienen einen Ypt/ Rab-Proteinchip zu generieren, welcher zur Identifizierung ihrer Effektoren dienen soll. Damit können Erkenntnisse zu Aufklärung von Krankheiten wie zum Beispiel Choroideremia oder dem Griscelli Syndrom (Seabra et al. 2002) gewonnen werden. Seite 66 6. Literatur Angenendt P., Glökler J., Sobek J., Lehrach H., Cahill D. J. (2003). Next generation of protein microarray support materials: Evaluation of protein and antibody microarray applications. J. Chromatogr. A, 1009, 97-104. Becker C. F. W., Hunter C. L., Seidel R. P., Kent S. B. H., Goody R. S., Engelhard M. (2001a). A sensitive fluorescence monitor for the detection of activated Ras: total chemical synthesis of site-specifically labeled Ras binding domain of c-Raf1 immobilized on a surface. Chemistry & Biology, 8, 243-252. Becker C. F. (2001b) Chemische Synthese von Proteinen: Generierung biologischer Aktivität ohne Nutzung des zellulären Syntheseapparats. 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A., Snyder M.(2001). Global analysis of protein activities using proteome chips. Science, 293, 2101-2105. Seite 71 Danksagung Mein Dank gilt Dr. Christian Becker für die interessante Themenstellung, die Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit und die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe. Bei Prof. Dr. Roger S. Goody bedanke ich mich für die Aufnahme in seine Abteilung und die Begutachtung meiner Arbeit. Ich danke Herrn Prof. Dr. Martin Engelhard für die Betreuung der Diplomarbeit an der Universität in Dortmund. Ferner danke ich Prof. Dr. Christof M. Niemeyer für die Übernahme des Koreferates. Herrn Dr. Ralf Seidel danke ich für viele hilfreiche Diskussionen und experimentelle Ratschläge. Außerdem dafür, dass er uns tagtäglich zeigt, dass wir noch ganz kleine Lichtlein sind und noch ein sehr weiter Weg vor uns liegt. Mein Dank gilt allen Mitarbeitern der Abteilung 3 des MPI für molekulare Physiologie, für die gute Arbeitsatmosphäre, besonders aber Sascha, Kester, Jens, Jörg, Uyen, Miria, Swetlana und Diana für zahlreiche Diskussionen, Unterstützung in jeder Hinsicht und die gemütlichen abendlichen Bierproben. Außerdem sei Nadine, Johann, Annika, Sunanda, Yoann „the rotten french“ und HorstGünther für die gute Arbeitsatmosphäre gedankt. Noch einmal hervorgehoben sei der Dank an Diana Olschewski, welche stete Hilfe angeboten und geleistet hat. Besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich bei meiner Ausbildung in jeder Hinsicht unterstützt haben und allen Freunden, die den Lebensweg begleiten.
