5.3. Vergleich von Aminosäuresequenzen für
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Primärstruktur von Calreticulin aus Rinderleber Diplomarbeit vorgelegt von Michael Müller aus Northeim angefertigt in der Inneren Medizin, Abteilung für Klinische Biochemie des Universitätsklinikums der Georg - August - Universität zu Göttingen 1994 Referent : Prof. Dr. H.-D. Söling Korreferent: Prof. Dr. F. Mayer Tag der mündlichen Prüfung: 22. April 1993 2 Danksagung Diese Arbeit entstand an der Universität Göttingen, Abteilung Klinische Biochemie, Zentrum Innere Medizin. Herrn Prof. Dr. H.-D. Söling danke ich für die Betreuung der Arbeit im Fachbereich Biologie und die Möglichkeit der Durchführung der Arbeit in der Abteilung Klinische Biochemie. Besonderen Dank schulde ich Dr. Gottfried Mieskes für die Themenvergabe. Dr. Hans-Ingo Trompeter und Dr. Mieskes, deren Betreuung und Hilfe das Entstehen dieser Arbeit erst ermöglichten und deren Rat und Erfahrungen die entscheidenden Impulse für das Gelingen dieser Arbeit gaben, danke ich herzlichst. Ihre freundliche Hilfe und ihre Unterstützung waren sehr wertvoll für mich. Ebenso danke ich Birte Sönnichsen, deren Vorarbeit und Bereitstellung vieler Arbeitsmittel mir den Einstieg sehr erleichterten. Auf ihren Rat und ihre Hilfe konnte ich mich stets verlassen. Für das angenehme und freundliche Arbeitsklima in der Abteilung danke ich allen Mitarbeitern, die mir freundlich und gerne mit Rat und Tat zur Seite standen. Ohne den Grundstein, den meine Eltern und meine Schwester, Renate Wernery, legten, hätte ich mein Studium weder beginnen, noch beenden können. Für ihre Liebe und Hilfe möchte ich mich hier ebenfalls bedanken. Ebenso bedanke ich mich bei Dr. John Henry Buzanoski, dessen stetige Unterstützung mir die Kraft und das Durchhaltevermögen gab, die an mich gestellten Aufgaben zu erfüllen. 3 Abkürzungen amp AMPPD Ampicillin 3-(2´-Spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3´-phosphoryloxy)-phenyl-1,2dioxetane Asp 718 Restriktionsendonuklease aus Acinetobacter species 718 (Isoschizomer zu Kpn I) Bam HI Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens H BSA Bovine Serum Albumin bp Basenpaare CIAP Calf intestine alkaline phosphatase d Tag dATP Desoxy-Adenosin-5’-triphosphat dCTP Desoxy-Cytosintriphosphat dGTP Desoxy-Guanintriphosphat dTTP Desoxy-Thymidintriphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat DEPDA N,N-Diethyl-p-phenylendiamin x HCl Dig Digoxigenin-11-uridin-5´-triphosphat DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiotreitol E.coli Escherichia coli Eco RI Restriktionsendonuklease aus E. coli EDTA N,N,N’,N’-Ethylendiamintetraacetat Ethbr Ethidiumbromid EtOH Ethanol h Stunde(n) Hind III Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenza H20dd doppelt destilliertes Wasser IPTG Isopropyl--D-Thiogalaktopyranosid K Kilo kb Kilobasen kbp Kilobasenpaare Kpn I Restriktionsendonuklease aus Klebsiella pneumoniae min Minute NS Neutralisationslösung pfu "Plaque forming unit" Pfu-Polymerase Polymerase aus Pyrococcus furiosus Pst I Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii Pvu II Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris PEG Polyethylenglykol RNA Ribonukleinsäure rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) rTth Rekombinante DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus Sal I Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus sec Sekunde SEVAG CHCl3/Isoamylalkohol, 24:1 (v/v) SDS Natriumdodecylsulfat Sma I Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens SSC Natriumcitrat- und Natriumchlorid (s. Lösungen, 2.6) 4 Sst I Taq-Polymerase TBE TE tet Tris TS üN vol WA ws X- Gal Restriktionsendonuklease aus Streptomyces stanford Polymerase aus Thermus aquaticus YT1 Tris-Borat-EDTA-Puffer (s. Lösungen, 2.6) Tris-EDTA-Puffer (s. Lösungen, 2.6) Tetracyclin Trishydroxymethylaminomethan (s. Lösungen, 2.6) Transferlösung (s. Lösungen, 2.6) über Nacht Volumen Weichagar Waschlösung (s. Lösungen, 2.6) 5-Bromo-4- Chloro-Indolyl--D-Galaktosid Fachtermini aus dem Englischen Der Gebrauch folgender Fachtermini ist in molekularbiologischer Literatur üblich: Blot: Transfer von DNA, RNA oder Proteinen von einem Gel auf eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran. Polylinker: Restriktionsschnittstellen an einer Stelle eines Vektors zur Aufnahme der hineinzuklonierenden Fremd-DNA. Primer: Kurzer, komplementärer Einzelstrang aus DNA oder RNA, von dessen 3´-Ende eine DNA- Polymerase die Synthese des Komplementärstranges beginnt. Screening: Durchsuchen einer DNA-Bank nach Klonen. 5 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG 9 1.1. Vorkommen des Calreticulins 9 1.2. Struktur des Calreticulins 9 1.3. Glycosylierung 11 1.4. Transport und Sortierung 12 1.5. Aufgabenstellung 13 2. MATERIAL 14 2.1. Enzyme und Chemikalien 14 2.2. Filter und Membranen 14 2.3. Chemikalien und Nährmedien 15 2.4. Film- und Fotomaterial 15 2.5. Lösungen 2.5.1. Gelelektrophorese 2.5.2. Sequenziergel-Lösungen 2.5.3. Puffer für Restriktionsverdaus 2.5.4. Phosphatase- Behandlung (CIAP) von DNA 2.5.5. Ligation 2.5.6. Phenol (TBE-gesättigt) 2.5.7. Plaque-Filter Behandlung 2.5.8. Southern-Blot 2.5.9. Hybridisation mit Oligonukleotiden 2.5.10. Hybridisation mit doppelsträngiger DNA 2.5.11. Elution von DNA aus Agarosegelen 2.5.12. Herstellung kompetenter Zellen 2.5.13. -Komplementierung 2.5.14. RNA-Präperation und Reverse Transkription 2.5.15. Antibiotika- Zusätze 2.5.16. Nährmedien 2.5.17. Bakterienstämme (Genotypen) 2.5.18. Vektoren 16 16 16 17 17 17 18 18 18 19 19 19 20 20 20 21 21 22 22 6 3. METHODEN 23 3.1. Reinigung und Konzentrierung von DNA 3.1.1. Phenol/Sevag Extraktion 3.1.2. DNA Fällung 23 23 23 3.2. Screening der -ZAP II cDNA Bank aus Rinderleber 3.2.1. Titern der -ZAP II cDNA Bank 3.2.2. Durchsuchung der -ZAP II cDNA Bank mit DIG-markierten DNA Sonden 3.2.3. Dig- Markierung von DNA (Random primed labeling) 3.2.4. Chemilumineszenz - Nachweis 3.2.5. Isolierung positiver Klone 24 24 25 25 26 26 3.3. DNA- Präparation 3.3.1. DNA-Exzision mit dem R 408 Helfer- Phagen 3.3.2. Minipräparation der DNA 3.3.3. Qiagen Maxipräparation 27 27 27 27 3.4. DNA- Analyse 3.4.1. Agarose-Gelelektrophorese 3.4.2. Analytischer Restriktionsverdau von DNA 3.4.3. Größenbestimmung der DNA-Fragmente 3.4.4. Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA 3.4.5. Elution von DNA aus Agarosegelen 3.4.6. Southern-Blot 29 29 29 29 30 30 30 3.5. Subklonierung im Vektor M 13 3.5.1. Restriktionsverdau des M13- Phagen 3.5.2. Dephosphorylierung des Vektors 3.5.3. Ligation 3.5.4. Herstellung kompetenter Zellen 3.5.5. Transformation 3.5.6. Einzelstrang DNA Präparation aus M13 3.5.7. Relative Orientierung der Inserts 3.5.8. DNA-Sequenzierung nach dem Kettenabbruchverfahren (Sanger et al., 1977) 3.5.9. Primersynthese 3.5.10. Polymerase- Kettenreaktion (PCR) 31 31 31 32 32 32 33 33 34 35 36 3.6. RNA-Präparation aus Rinderleber 3.6.1. Vorbereitung für RNase-freies arbeiten 3.6.2. Isolierung der RNA 3.6.3. Reverse-PCR mit RNA 37 37 37 38 4. ALLGEMEINE GRUNDLAGEN ZU DEN VEKTORSYSTEMEN 39 4.1. Der l- ZAP II Phage 39 4.2. E.coli XL1- Blue 40 4.3. M13- Vektor 41 4.4. Auswahl der Vektoren 41 7 5. ERGEBNISSE 43 5.1. Isolierung der Rinder cDNA für Calreticulin aus einer Rinderleber- -ZAP II cDNA Bank 5.1.1. Exzision des Inserts 5.1.2. Subklonierung in M13 5.1.3. Herstellung einer Sonde aus einem Teil der cDNA für Calreticulin von Rind 5.1.4. Subklonierung und Sequenzierung weiterer Klone 43 44 47 49 49 5.2. 51 Reverse PCR mit RNA aus frischer Rinderleber 5.3. Fusion der cDNA Teilfragmente 5.3.1. Vorbereitung des pGEM-4Z Vektor 5.3.2. Aufarbeitung des N-terminalen PCR Fragmentes 5.3.3. Ligation des N-Terminus mit dem vorbereiteten pGEM-4Z Vektor 5.3.4. Transformation von pGEM-4Z in kompetente SURE- Zellen 5.3.5. Präperation des C-terminalen Fragmentes 5.3.6. Ligation der C- und N- terminalen Fragmente 5.3.7. Klonierung des Inserts aus Klon G9 in M13 und pCMV 2 5.3.7.1. Partialverdau von Klon G9 5.3.7.2. Auffüllen der Enden des Inserts 5.3.7.3. Ligation des Inserts In 9 mit M13 mp 18 und pCMV 2 5.3.7.4. Transformation von pCMV 2 in E.coli-SURE 5.3.7.5. Transformation von M13 mp 18 in XL1-Blue- Zellen 6. DISKUSSION 6.1. Isolierung der cDNA 52 52 52 53 53 54 54 56 57 57 58 58 59 64 64 6.2. Analyse der cDNA 6.2.1. Struktur 64 64 6.3. Vergleich von Aminosäuresequenzen für Calreticulin 6.3.1. Struktur des Proteins 6.3.2. Glycosylierungsstellen 6.3.3. Homologie zu anderen Proteinen 65 67 68 69 7. ZUSAMMENFASSUNG 70 8. LITERATUR 71 8 1. EINLEITUNG 0.1. Vorkommen des Calreticulins Calreticulin wurde erstmals 1972 als Ca 2+ -bindendes Protein im sacroplasmatischen Retikulum von Skelettmuskeln identifiziert (MacLennan et al., 1972), später auch im endoplasmatischen Reticulum nichtmuskulärer Zellen (Opas et al., 1988; Fliegel et al., 1989). Als ubiquitäres, hochkonserviertes Protein wurde es bis zu seiner Strukturaufklärung vielfach unter verschiedenen Arbeitsnamen beschrieben, wobei sich die Nomenklatur zumeist an sein Vorkommen oder seine Funktionalität anlehnte. Es ist jedoch jetzt erwiesen, daß Calregulin, CRP55, CaBP3, ERp60 und das "calsequestrinähnliche" Protein alle mit Calreticulin identisch sind (Khanna et al., 1987; Opas et al., 1988, 1991; Nguyen Van et al.,1989; Fliegel et al., 1989; Smith & Koch, 1989; Collins et al., 1989; Treves et al., 1990; Krause et al., 1990; Milner et al., 1991; Michalak et al., 1991). Calreticulin hat sich als Name weitgehend etabliert, trägt er doch sowohl einer möglichen Funktion als auch dem Vorkommen des Proteins Rechnung (Calcium bindendes Protein, vorkommend im endoplasmatischen und sacroplasmatischen Reticulum). Außer in Erythrocyten wurde Calreticulin in allen Körpergeweben, wenn auch in unterschiedlicher Konzentration gefunden. In Magen, Leber und Hoden war es mit Konzentrationen von 200- 500 µg/ g Gewebe am höchsten vertreten (Khanna & Waisman., 1986). Calreticulin ist ein lösliches Protein im Lumen des ER. Allerdings ließ sich Calreticulin unter bestimmten Bedingungen auch im Kern der Zellen durch Immunfluoreszenz nachweisen (Michalak et al., 1994). 0.2. Struktur des Calreticulins Die molekulare Masse von Calreticulin, abgeleitet von seiner cDNA, liegt bei 46 kDa (Fliegel et al., 1989; Smith & Koch, 1989). Im SDS/PAGE läuft Calreticulin jedoch bei ca. 60 kDa. Bedingt durch starke saure Regionen innerhalb des Proteins weicht auch der errechnete isoelektrische Punkt von 4,14 ( Fliegel et al., 1989; McCauliffe et al., 1990) vom nativ gemessenem isoelektrischen Punkt von 4,65-4,67 ab. Während Calsequestrin als hauptsächliches Ca 2+- bindendes Protein im sacroplasmatischen Reticulum fungiert (MacLennan et al., 1983; Cala et al., 1990), scheint dieses im Lumen des endoplasmatischen Reticulums nichtmuskulärer Zellen durch eine Gruppe anderer Ca 2+bindender Proteine wie Calreticulin, Endoplasmin (Grp 94) oder CaBP1 und CaBP2 zu geschehen (Koch et al., 1986, 1989; Macer & Koch, 1988; Van et al., 1989; Nigam & Töpfers, 1990; Milner et al., 1991; Michalak et al., 1991). 9 Durch molekulare Klonierung von Calreticulin (Fliegel et al., 1989; Smith & Koch, 1989; McCauliffe et al., 1990) wurde KDEL als C-terminale Aminosäuresequenz entdeckt. Diese Sequenz ist für die Retention des Calreticulins im ER verantwortlich (Pelham, 1989). Calreticulin verfügt über ähnlich saure Cluster wie Calsequestrin an seinem C- terminalen Ende (Fliegel et al., 1989). Hierdurch läßt sich seine Fähigkeit zur Calciumbindung erklären. Für Calreticulin fand man eine Calciumbindungskapazität von ca. 200 nmol Ca 2+/mg Protein, was einem Verhältnis von 25 mol Ca 2+/ mol Protein entspricht (MacClennan et al., 1972; Treves et al., 1990; Michalak et al., 1991; Baksh et Michalak, 1991). Das Vorhandensein einer Signalsequenz am N-Terminus wurde durch in vitro Translation der für Calreticulin codierenden m-RNA bestätigt (Fliegel et al., 1989; Rokeach et al., 1991). Die Aminosäuresequenz für Ratten-Calreticulin besteht zu ca. 26% aus sauren und zu 13% aus basischen Aminosäuren. Die übrigen Aminosäuren sind neutral. Ca. 38% der Aminosäuren sind polar, 19% hingegen apolar (Birte Sönnichsen, Diplomarbeit, 1991). Vorhersagen der Struktur legen nahe, daß das erste Drittel des Proteins aus 8 anti- parallelen Strängen besteht, mit einem extremen "Helix- turn- Helix"-Motiv am äußersten N-Terminus. Das zweite Drittel ist prolinreich und kann in geladene Bereiche unterteilt werden, die eine Wiederholung eines 17- Aminosäuren langen Stückes enthalten, gefolgt von Prolin-, Serinund Threonin- reichen Sequenzen. Der dritte Teil besteht aus sauren Clustern, die den CTerminus bilden. Obgleich auch mögliche Phosphorylierungsstellen für Proteinase C, Caseinkinase II und Tyrosinkinase gefunden wurden, ließ sich eine Phosphorylierung des Proteins nicht nachweisen (Nguyen Van et al., 1989; Michalak et al., 1992). Auch eine Homologie zur Proteinkinase C (Aminosäuren 215-224) fand keine Umsetzung in eine entsprechende Enzymaktivität (Waisman et al., 1985). Calreticulin enthält einige Regionen, die besonders reich an Prolin, Glutaminsäure, Serin und/ oder Threonin sind (McCauliffe et al., 1990). Diese als "PEST" bezeichneten Regionen (Rogers et al., 1986), bewirken vermutlich eine erhöhte intrazelluläre Degradierung eines Proteins. Desweiteren wurde um Aminosäure 190 herum eine Kernsignalsequenz gefunden (PPKKIKPDP) (McCauliffe et al., 1990; Opas et al., 1991), deren Funktionalität jedoch bisher nicht bestättigt werden konnte (Dr. Trompeter, persönliche Mitteilung). Eine vollständige Aminosäureanalyse mehrerer Spezies (McCauliffe et al., 1990; Opas et al., 1991) hat gezeigt, daß das Protein mit einer Homologie von mindestens 80% zwischen Drosophila und Säugetieren als hochgradig phylogenetisch konserviert vorliegt. Die Homologien zwischen pflanzlichem und tierischem Calreticulin sind noch nicht bestimmt. Beachtlich ist die Tatsache, daß Variationen nur in den Teilen des Proteins vorkommen, die nicht für die Struktur der anti- parallelen Stränge oder der prolinreichen Regionen verantwortlich sind. Artspezifische Unterschiede ergaben sich für die Glycosylierung des Calreticulins. Während sie bei Maus, Kaninchen, Huhn oder Mensch nicht nachgewiesen wurde, wurde sie bei Ratte und Rind im Lebergewebe gefunden. Für Rattenleber- Calreticulin wurde ein komplexes 10 Oligosaccharid vom Hybridtyp mit terminaler Galactose nachgewiesen (Van et al., 1989; Peter et al., 1992), während für Calreticulin vom Rind eine ”high mannose”-Struktur der Oligosaccharidseitenkette gefunden wurde ( Waisman et al., 1985; Lewis et al., 1985; McCauliffe et al., 1990a; Milnet et al., 1991). 0.3. Glycosylierung Artspezifische Unterschiede ergaben sich für die Glycosylierung des Calreticulins. Während ein Glycosylierung bei Maus, Kaninchen, Huhn oder Mensch nicht nachgewiesen wurde (Waisman et al., 1985), ließ sie sich bei Ratte und Rind im Lebergewebe nachweisen. Für Calreticulin aus Rattenleber wurde ein Oligosaccharid vom komplexen Hybridtyp mit terminaler Galactose (Peter et al., 1992) und für Calreticulin vom Rind eine ”high-mannose” Struktur der Oligosaccharidseitenkette (Matsuoka et al., 1994)nachgewiesen. Da die terminale Galactosylierung im Golgie- und Transgolgieapparat geschieht, muß zumindest in Rattenleber-Zellen ein Transport vom ER zum Golgieapparat und zurück zum ER erfolgen. 11 0.4. Transport und Sortierung Analog zu einigen anderen KDEL-Proteinen gehen dem Calreticulin vor der KDEL-Sequenz einige saure Cluster voran. Beobachtet wurde, daß artifiziell mutiertes Calreticulin ohne diese sauren Cluster nur partiell im Lumen des ER zurückgehalten wird (Sönnichsen et al., 1994). Die Entfernung der terminalen KDEL- Sequenz führte zur partiellen Anhäufung der KDELProteine BiP (GRp78) und PDI (Proteindisulfidisomerase) außerhalb des ERs (Munro und Pellham, 1987, Mazzarella et al., 1990), während z.B Cathepsin D, ein lysosomales Protein, oder Lysozym, ein sekretorisches Protein, durch Anfügen der C- terminalen KDEL- Sequenz im ER angereichert wurden (Pellham, 1988). Neuere Untersuchungen (Sönnichsen et al., 1994) postulieren einen dualen, voneinander unabhängigen Sortierungsmechanismus für Calreticulin. Der KDEL- Terminus des Proteins wird von einem KDEL-Rezeptor im Golgi gebunden und der Rezeptor-Ligand-Komplex zum ER zurücktransportiert. Dort dissoziieren Rezeptor und Ligand und der freie Rezeptor kann zum Golgi zurückkehren (Pelham et al., 1991). Da jedoch mit 1,4% pro Stunde (Sönnichsen et al., 1994) nur ein geringer Prozentsatz des Calreticulins das ER verläßt (dieses entspricht in etwa der durchschnittlichen Zellmortalität während des Experimentes), bedarf es eines effizienten Retentionsmechanismuses. Durch Deletion der Ca2+ -bindenden Domäne wurde die Sekretion des mutanten Calreticulins auf 18% in 3 Stunden erhöht (Sönnichsen et al., 1994). Die Deletion der KDEL-Sequenz steigerte die Sekretion des Calreticulins auf 29% in 3 Stunden (Sönnichsen et al., 1994). Der Rententionsmechanismus für Calreticulin bleibt indes noch ungeklärt. Ob das Protein von den Exportstellen des ER ferngehalten wird, oder lediglich nicht in die Exportvesikel verpackt wird, ist nicht bekannt. Letzteres ist wahrscheinlicher, da Calreticulin prinzipiell die Möglichkeit besitzt, das ER zu verlassen. Vermutet wird, daß Calreticulin durch Wechselwirkungen mit sich selbst oder anderen Komponenten des ERs eine Matrix bildet (Booth and Koch, 1989; Suzuki et al., 1991). Nur ein geringer, aus dem ER transportierter Anteil des Calreticulins wird durch den KDELRezeptor zum ER zurückgeführt. Die Kombination beider Sortierungsmechanismen gewährleistet, besonders unter Streß, ein minimales Entweichen des Calreticulins aus dem ER. 12 0.5. Aufgabenstellung Die hohe Sequenzhomologie der bekannten cDNAs für Calreticulin wirft die Frage nach den Ursachen der unterschiedlichen Glycosylierungen auf. Wird Calreticulin in den verschiedenen Spezies unterschiedlich transportiert und sortiert? Ist dafür die jeweilige Primärstruktur oder aber die unterschiedliche, speziesabhängige Umgebung des Calreticulins verantwortlich? Hochgereinigtes Calreticulin aus Rattenleber zeigt im SDS-PAGE eine Doppelbande bei 6063 kDa, bei der die Form mit der geringeren molekularen Masse deutlich prominenter ist. Die dünne Bande, mit der höheren molekularen Masse bindet an Concanavalin A-SepharoseSäulen (Dr. Nguyen Van, persönliche Mitteilung), ein Hinweis auf eine ”high-mannose”Struktur der Zuckerseitenkette. Überexpression der Rattenleber cDNA für Calreticulin in COS-Zellen liefert ebenfalls diese Doppelbande, jedoch erheblich ausgeprägter und gleichmäßiger verteilt. Hier ist die Form mit der höheren molekularen Masse partiell Endoglycosidase F verdaubar und konnte mit dem Lectin Jacalin präzipitiert werden (Sönnichsen et al., 1994), trägt also N-glycosidisch gebundene Zucker mit terminaler Galactose (Peter et al., 1992). Hingegen ist die Form mit der geringeren molekularen Masse gegenüber diesem Enzym resistent (Dr. Mieskes, persönliche Mitteilung). Beide Formen sind zucker-positiv. Rattenleber Calreticulin besitzt nur eine N-Glycosylierungsstelle (NET). Dieses heterogene Bild deutet auf eine komplexe, nicht nur N- sondern eventuell auch OGlycosylierung hin. Demgegenüber zeigt hochgereinigtes Calreticulin aus Rinderleber zu 8090% eine ”high-mannose”- Struktur der Oligosaccharidseitenkette, nachgewiesen durch Bindung an Concanavalin A (Waisman et al., 1985). Die Isolierung und Sequenzierung der cDNA für Rinderleber- Calreticulin sollte Hinweise auf mögliche Sequenzunterschiede zum Rattenprotein, besonders im Hinblick auf NGlycosylierungsstellen geben. Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, die cDNA des Rinder- Calreticulins zu isolieren, zu sequenzieren und die Primärstruktur von Rinder- und Ratten- Calreticulin miteinander zu vergleichen. Diese Sequenz soll die Grundlage für spätere vergleichende Expressionsstudien der Rinderund Ratten cDNA in z.B. COS-Zellen liefern. 13 1. MATERIAL 1.1. Enzyme und Chemikalien Restriktionsendonukleasen und andere Enzyme Asp 718 Boehringer/Mannheim Bam HI Eco RI Hind III Kpn I Pst I Pvu II Sal I Sma I Sst I Die Restriktionsendonukleasen wurden von der Firma Gibco BRL (Eggenstein) bezogen, falls nicht anders vermerkt. Alkalische Phosphatase Gibco/Eggenstein Klenow Boehringer/Mannheim Pfu- Polymerase Stratagene/Heidelberg Proteinase K Sigma/München Qiagen-Kit Dragen/Hilden RNAse A Sigma/München rTth- Polymerase Perkin Elmer Cetus/Weiterstadt T4 Ligase Gibco/Eggenstein T7 Polymerase Pharmacia/Freiburg Taq- Polymerase Perkin Elmer Cetus/Weiterstadt 1.2. Filter und Membranen DEAE- Membranen Gene Screen Plus Hybond Nylon N NAP 5 und NAP 10 Gelfiltrationssäulen Schleicher und Schuell (Dassel) New England Nuclear-Dupont/Bad Homburg Amersham/Braunschweig Pharmacia/Freiburg 14 1.3. Chemikalien und Nährmedien Ampicillin Agarose ATP Bacto- Agar Bacto- Trypton BSA Desoxyadenosin-5´-(-[35S]thio)triphosphat Bayer (Leverkusen) Gibco/BRL (Eggenstein) Boehringer (Mannheim) Difco (Detroit, USA) Difco (Detroit, USA) Sigma (München) NEN/DuPont (1500 Ci/mmol) Ethbr Hefe-Extrakt 1 kb-Ladder ß-Mercaptoethanol Sucrose Serva (Heidelberg) Difco (Detroit, USA) Gibco/BRL (Eggenstein) Sigma (München) Serva (Heidelberg) Alle übrigen Chemikalien wurden von der Firma Merck in Darmstadt bezogen und entsprachen analytischer Qualität. 1.4. Film- und Fotomaterial Agarosegele wurden entweder auf Videokassette Sony E-180 aufgenommen oder mit Polaroid- Filmen, Typ 665 mit Negativ fotographiert. Autoradiogramme wurden in Kassetten mit Saphirschirm mit Kodak/Rochester XAR 5 Röntgenfilmen exponiert. Entwickler und Fixierer Kodak/Rochester 15 1.5. Lösungen 1.5.1. Gelelektrophorese 10x TBE-Puffer: 500 mM Tris 10 mM EDTA pH 8,1 500 mM H3B03 10x TBE-S-Puffer: 890 mM Tris 10 mM EDTA pH 8,1 890 mM H3B03 Blaumarker: 20 % Ficoll 0,125 % Bromphenolblau 0,125 % Xylen-Cyanol Ethbr-Lösung: 10 mg/ml H2Odd TE: 10 mM Tris-HCl pH 7,5 0,1 mM EDTA 1.5.2. Sequenziergel-Lösungen 40 % Acrylamid- Stock Acrylamid N,N´-Methylenbisacrylamid H2Odd ad 76 g 4g 200 ml Die Lösung wurde mindestens 30 min über Biorad AG-501x8 Mischbett- Ionenaustauscher gerührt und danach filtriert. Sie ist maximal 14 Tage bei 4°C im Dunkeln haltbar. Bottom-Gel Stock, 6% Harnstoff Sucrose 10x TBE-S 40 % Acrylamid-Stock 240 g 50 g 125 ml 75 ml Top-Gel Stock, 6% 240 g ----25 ml 75 ml ad 500 ml H2Odd auffüllen, filtrieren und entgasen. Haltbarkeit wie 40 % Acrylamid- Stock. 16 1.5.3. Puffer für Restriktionsverdaus React 2 Hind III, Sst I ,Xba I, Xho I 50 mM 10 mM 50 mM React 3 Eco RI, Bam HI 50 mM 10 mM 100 mM React 4 Tris-HCL, pH 8,0 MgC12 NaC1 Kpn I 20 mM 10 mM 50 mM React 10 Tris-HCL, pH 7,4 MgC12 KC1 Sal I 100 10 150 Puffer B Tris-HCL, pH 8,0 MgC12 NaC1 mM mM mM Tris-HCL, pH 7,6 MgC12 NaC1 Asp 718 20 100 5 1 mM mM mM mM Tris-HCL, pH 8,0 NaCl MgC12 2- Mercaptoethanol Alle Puffer sind als 10-fach Konzentrat angegeben. 1.5.4. Phosphatase- Behandlung (CIAP) von DNA 10x Puffer 500 mM 1 mM 1.5.5. Tris-HCL, pH 8,5 EDTA Ligation 10x Puffer 500 mM 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 MgC12 17 1.5.6. 200 mM DTT 50 µg/ml (w/v) BSA Phenol (TBE-gesättigt) Phenol (fest) wurde mindestens dreimal mit 1 x TBE aufgefüllt und mindestens 30 min gerührt. Das TBE wurde mit Hilfe eines Scheidetrichters entfernt und der pH-Wert der wässrigen Phase bestimmt. Die Prozedur wurde wiederholt, bis dieser 8,0 erreicht hatte. Anschließend wurde eine Spatelspitze 8-Hydroxychinolin zugegeben. 1.5.7. Plaque-Filter Behandlung GS l 0,5 M 1,5 M NaOH NaC1 GS 2 1,0 M 1,5 M Tris-HCl, pH 7,5 NaC1 SSC 150 mM 15 mM NaC1 Na-Citrat x 2 H20 3 M 2 M K-Acetat Essigsäure, pH 4,8 Lösung III 20x SSC 3 M 300 mM NaC1 Na-Citrat x 2 H20 1.5.8. Southern-Blot Transferlösung (TS) 0,4 M 0,6 M NaOH NaC1 Neutralisationslösung(NS) 0,5 M 1 M Tris-HCl, pH 7,5 NaC1 18 1.5.9. Hybridisation mit Oligonukleotiden 100x Denhardt's 2 % (w/v) 2 % (w/v) 2 % (w/v) BSA Ficoll Polyvinylpyrollidon Prähybridisationslösung 6 5 0,5 % x x SSC Denhardt's SDS Heringssperma-DNA 5 mg/ml TE 1.5.10. Hybridisation mit doppelsträngiger DNA Prähybridisationslösung 1 M 50 mM 1 % NaC1 Tris-HCl, pH 7,5 SDS 150 mM 10 mM 1 mM 0,5 % NaC1 Na3P04, pH 6,5 EDTA, pH 8,1 SDS Waschlösung 1.5.11. Elution von DNA aus Agarosegelen LET-Puffer 1 M 0,1 mM 20 mM LiC1 EDTA Tris-HCl, pH 7,5 19 1.5.12. TfB I Herstellung kompetenter Zellen 100 mM 50 mM 30 mM 10 mM 15 % (v/v) RbC12 MnCl2 K-Acetat CaC12 Glycerin mit Essigsäure auf pH 5,8 einstellen und sterilfiltrieren TfB II: 10 mM 10 mM 75 mM 15 % (v/v) MOPS RbC12 CaC12 Glycerin mit NaOH auf pH 7,0, sterilfiltrieren und sofort benutzen IPTG X-Gal 1.5.14. -Komplementierung 200 mg/ml H20dd 20 mg/ml Dimethylformamid RNA-Präperation und Reverse Transkription 10-fach Reverse Transkriptase Puffer 100 mM 900 mM Tris -HCl KCl pH 8,3 Lösung D (Homogenisationslösung) 100 g 117,2 ml 7,04 ml 10,56 ml Guanidiniumthiocyanat DEPC-Wasser 0,75 M Na-Citrat, pH 7,0 10 % Sarcosyl (w/v) 10 ml dieser Lösung wurden mit 7,2 µl -Mercaptoethanol versetzt. 20 1.5.15. Ampicillin: Tetracyclin: Antibiotika- Zusätze 100 mg/ml H20 12,5 mg/ml Ethanol Die autoklavierten Medien wurden auf unter 50°C abgekühlt. Dann wurde 1 ml AntibiotikaStocklösung pro 1 Liter Medium zugesetzt und gut durchgemischt. Tet- haltige Medien dürfen kein Magnesium enthalten. 1.5.16. Nährmedien DYT-Vollmedium 16 g 10 g 5 g ad 1000 ml Bacto-Trypton Yeast Extract NaC1 mit H20, autoklavieren. Lambda-Weichagar/ Weichagarose ad 5 g 5 g 10 g 6 g 1000 ml NaC1 Yeast Extract Bacto-Trypton Agar/ Agarose mit H20 auffüllen, autoklavieren und 20 ml 1 M MgS04 zugeben. LB-Platten ad 10 5 g g Bacto-Trypton Yeast Extract 5 12 g g NaC1 Agar/Agarose 1000 ml mit H20, autoklavieren. 21 1.5.17. Bakterienstämme (Genotypen) E.coli LE 392 supE44, supF58, hsdR514, galK2, galT22, metbl,trpR55, lacY1 (Borck et al., 1976) E.coli SURE e 14-(mcrA), (mcrCB-hsdSMR-mrr)171, sbcC, recB, recJ, umuC::Tn5 (kanr), uvrC, supE44, lac, gyrA96, relA1, thi-1, end A 1, [F´pro AB, lac IqZ M15, Tn 10, (tetr)] (Stratagene) E.coli XL1- Blue supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA46, thi, re1A1, lac-, F'(proAB+, lacIQ, lacZ M15, Tn l0(tetr)) (Bullock, Fernandez und Short, 1987) 1.5.18. Vektoren M13mp18/19 pCMV2 Pharmacia/ Freiburg wurde freundlicherweise von Dr. G. Thiel, Institut für Genetik, Köln zur Verfügung gestellt pGEM 4Z -Zap II Promega/ Madison, WI USA sbh11o, chiA 131, (T amp ColE1 ori lac Z´ T3- Promotor- polycloning site- T7 Promotor 1) sr13o, c1ts 857, sr14o, nin 5, sr15o (Short et al., 1988) 22 2. Methoden 2.1. 2.1.1. Reinigung und Konzentrierung von DNA Phenol/Sevag Extraktion Um Proteine aus einer Lösung zu entfernen, werden gleiche Volumina Phenol / Sevag (1:1) auf die zu extrahiernde Lösung gegeben, gut durchgemischt und 10 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird, ohne Interphase, in ein neues Gefäß überführt und ein- oder zweimal, in der gleichen Weise mit gleichen Volumina Sevag extrahiert, um das restliche Phenol zu entfernen. 2.1.2. DNA Fällung Ethanolfällung 2 bis 3 Vol. EtOH + 1/20 Vol. 5M NaCl werden dem DNA - haltigen Überstand zugegeben, vorsichtig gemischt und mindestens 1 h bei -20°C gefällt. Das Sediment wird mindestens 10 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Isopropanolfällung 0,7 Vol. Isopropanol und 1/20 Vol. 5M NaCl werden dem DNA - haltigen Überstand zugegeben, vorsichtig gemischt, mindestens 1 h bei -20°C gefällt und mindestens 10 min bei 14000 rpm zentrifugiert.. Soll möglichst wenig Salz mitgefällt werden, wird sofort zentrifugiert. Isopropanol fällt kleinere DNA- Fragmente als Ethanol (> 100 bp und > 1 ng / µl). Waschen der Sedimente Das Sediment wird zweimal mit 70% Ethanol und einmal mit EtOH gewaschen, im Vakuum für 5-10 min getrocknet und in der angegebenen Menge TE resuspendiert. Um eventuelle DNasen zu denaturieren werden die Sedimente mindestens 10 min bei 68 °C gelöst. Die DNA- Konzentration wird durch Extinktionsmessung bei der Wellenlänge = 260 nm bestimmt. Dabei gilt E260 = 20,3 für 1 mg/ml DNA. 23 2.2. Screening der -ZAP II cDNA Bank aus Rinderleber 2.2.1. Titern der -ZAP II cDNA Bank Rec A--Test XL1-Blue Zellen wurden aus einem Glycerinstock mit einer sterilen Glaspipette auf eine TetLB Agarplatte ausgestrichen. Ein Nitrocellulosefilter wird für 10 Sekunden auf den Ausstrich aufgelegt und dann auf eine frische Tet-LB (Replika-)Agarplatte gelegt. Die Orientierung des Filters auf der Orginal- und Replikaplatte wird markiert. Die Agarplatte mit dem Orginalausstrich wird für 30 Sekunden einer UV-Bestrahlung (= 254 nm) ausgesetzt. Beide Platten wurden dann üN bei 37°C inkubiert. Die auf der bestrahlten Platte gewachsenen Kolonien sind rec A+ und wurden nicht verwendet. Anzucht der Plattierungsbakterien in Flüssigkultur 18 ml DYT-Medium wurden mit 2 ml 2% Maltose versetzt. Das Medium wird mit einer einzelnen rec A- -Kolonie angeimpft. Unter Schütteln wird diese Kultur bei 37°C bis zu einer OD600 = 0,5 inkubiert. Die Bakterien wurden dann bei 14000 rpm 3 Minuten abzentrifugiert. Das Sediment wurde in einem halben Volumen sterilen 10 mM MgSO4 resuspendiert. Phagenadsorption 200 µl Bakteriensuspension wurden mit 10 µl einer Phagenverdünnung zwischen 1x 10-4 bis 1x 10-7 versetzt. Dieses Gemisch wurde 20 - 30 Minuten bei RT inkubiert. Ausplattierung 3 ml geschmolzene Top-Agarose (45°-48°C) wurden mit 20 µl IPTG (200 mg/ml) und 50 µl X-Gal (250 mg/ml) versetzt, das Bakterien-Phagen-Gemisch hinzugegeben und sofort auf TetLB Agarplatten ausplattiert. Die Inkubation üN erfolgte bei 42°C . Die Plaques, die am nächsten Morgen eine Blaufärbung aufwiesen, gehen aus einer Infektion durch insertlose Phagen hervor. Das Verhältnis farblose Plaques / blaue Plaques sollte mindestens 10/1 betragen. Der durchschnittliche Phagentiter der Phagenbank betrug 9,7x106 Phagen/ µl. Davon waren 91,8% rekombinant. Der Phagentiter der rekombinanten Phagen liegt somit durchschnittlich bei 8,9x 106/ml Phagenbank. 24 2.2.2. Durchsuchung der -ZAP II cDNA Bank mit DIG-markierten DNASonden Die zum ersten Screening benötigte Sonde wurde freundlicherweise von Birte Sönnichsen zur Verfügung gestellt. Sie bestand aus einer kompletten, mit Dig- markierten cDNA für RattenCalreticulin. Für spätere Screenings wurde dann ein Teilklon der Rinder- cDNA nach dem random primed labeling mit Dig markiert. Es wurden 106 Phagen auf 20 Platten ausplattiert. Das entsprach einer Phagendichte von 5x104 Phagen/Platte. Die Phagen wurden wie oben ausplattiert, für 6 Stunden bei 42°C inkubiert und üN bei 4°C gelagert. Von den 20 Platten wurden jeweils ein Orginal- und ein Replikafilter (Nitrocellulosefilter mit einem Durchmesser von 132 mm) luftblasenfrei gezogen, deren Orientierung durch einen Strichcode auf Platte und Filter vermerkt wurde. Die Filter wurden 5 min mit GS 1 denaturiert, 5 min mit GS 2 neutralisiert und 30 min mit 2x SSC gewaschen. Die phagentragende Seite war dabei immer nach oben gewandt, um ein Verwischen des Plaquemusters zu vermeiden. Die Filter wurden dann 2 h bei 80°C geheizt, um die DNA an die Nitrocellulosefilter zu binden. Anschließend wurden die Filter für 1h bei 55°C mit 300 ml Prähybridisierungslösung prähybridisiert, 900 ng Dig- markierte Sonde (Calreticulin aus Rattenleber) hinzugefügt und bei 55°C üN inkubiert. Die Hybridisierungslösung wurde dekantiert und aufbewahrt. Dann wurden die Filter 2 x 5 min in 2x SSC mit 0,1% SDS bei RT und anschließend 2x 15 min in 0,5x SSC mit 0,1% SDS bei 55°C gewaschen. 2.2.3. Dig- Markierung von DNA (Random primed labeling) DNA (zu markierendes PCR- Produkt) Primergemisch (10- fach konzentriert) Dig- DNA- Labeling Mix Klenow- Enzym (10 U/µl) H2Odd Die Inkubationsdauer bei 37°C beträgt 30 min. (500ng) 3 µl 2 µl 2 µl 1 µl 12 µl 25 2.2.4. Chemilumineszenz - Nachweis Die Filter wurden 5 min bei RT im Waschpuffer gewaschen, 30 min bei RT in Blockierungslösung inkubiert und das Anti-Dig-AP-Konjugat (75 mU/ml) in einer Verdünnung von 1:1000 hinzugefügt. Es wurde für 30 min bei RT inkubiert. Die Filter wurden 2x 15 min bei RT in Waschpuffer, 2- 5 min in Äquilibrierungspuffer und 5 min in Substratlösung geschwenkt. Die Substratlösung wurde nach dem Abtropfen durch 3 MMWhatman- Papier abgesaugt und die Filter für ca. 5 min angetrocknet, noch feucht in Plastiksbeutel gelegt und 15 min bei 37°C inkubiert. Sie wurden bei RT zwischen 15 min und 24 h auf Röntgenfilmen exponiert und der Film dann entwickelt. 2.2.5. Isolierung positiver Klone Die Plaques, die sowohl auf dem Original-, als auch auf dem Replikafilter ein positives Signal lieferten, wurden mit der großen Öffnung einer sterilen Pasteurpipette ausgestochen, in 500 µl SM-Puffer + 50 µl Chloroform üN eluier und anschließend der Titer bestimmt (siehe Titern der Phagenbank, 3.2.1). Dieses Screening wurde 2x wiederholt, wobei beim ersten Rescreen die Plaquedichte so verringert wurde, daß nur noch ca. 100 Plaques/Platte erhalten wurden. Beim zweiten Rescreen wurde die Plaquedichte nochmals auf ca. 10 Plaques/Platte reduziert. Die zu isolierenden Plaques wurden so ausgewählt, daß sie möglichst weit von angrenzenden Plaques entfernt waren, um eine Kontamination durch Diffusion so weit wie möglich auszuschließen. 26 2.3. 2.3.1. DNA- Präparation DNA-Exzision mit dem R 408 Helfer- Phagen Eine ÜN-Kultur von XL-1 Blue in DYT- Medium, mit 10 mM MgSO4 und Tet supplementiert, wurde auf eine OD600 =1,0 verdünnt. Vom oben getiterten Phagenlysat und von den R 408 Helfer-Phagen wurden jeweils ca. 1x 107 Pfu hinzugegeben. Die Negativkontrolle enthielt statt des Phagenlysats nur SM-Puffer. Es wurde für 15 min bei 37°C inkubiert, danach wurden 5 ml DYT zugegeben und 3 h bei 37°C gut geschüttelt. Weiteres Bakterienwachstum wurde durch 20 minütiges Erhitzen bei 70°C verhindert. Durch Zentrifugieren für 5 min bei 14000 rpm wurden die Bakterien sedimentiert und der Überstand mit den Phagen kann dekantiert und bei 4°C als Phagenstock für mehrer Monate gelagert wurden. 10 µl Phagenstock und 200 µl XL1-Blue (OD600 = 1,0) wurden für 15 min bei 37°C vorinkubiert. Hiervon wurden 200µl auf Amp-Platten in Orginalkonzentration und in einer 1:50 Verdünnung ausplattiert und üN bei 37°C inkubiert. Eine Einzelkolonie wurde in 6 ml DYT mit Amp überführt und üN bei 37°C aerob auf dem Drehrad inkubiert. 2.3.2. Minipräparation der DNA Obige Bakterienflüssigkultur wurde 5 min bei 14000 rpm zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Bakteriensediment aus 4 ml Suspension wurde in 180 µl Lösung 1 resuspendiert und für 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 360 µl Lösung 2 wurde gut geschwenkt, 5 min auf Eis inkubiert, 270 µl Lösung 3 zugegeben und sehr kräftig geschüttelt. Nach Inkubation von 5 min auf Eis wurde 10 min bei 14000 rpm zentrifugiert, der Überstand dekantiert und mit 800 µl Phenol/Sevag -Gemisch das Protein extrahiert. Die DNA wurde mit 700 µl 100% Isopropanol 1 h bei -20°C gefällt und 10 min bei 14000 rpm sedimentiert. Das Sediment wurde 2x mit 70% Ethanol und 1x mit EtOH gewaschen, 5-10 min im Vakuum getrocknet und in 50 µl TE resuspendiert. 2.3.3. Qiagen Maxipräparation 250 ml DYT, versetzt mit 250 µl Tet und 250 µl Amp, wurden mit einer Einzelkolonie XL1Blue infiziert, die ein inserthaltiges Plasmid trug. Die Selektion erfolgt über die plasmidvermittelte Amp-Resistenz. Die Inkubation erfolgt aerob üN bei 37°C unter Schütteln mit ca. 200 rpm. Die Bakterien wurden bei 8000 rpm für 5 min in 4 Aliquots à 60 ml zentrifugiert und die 4 Sedimente wurden in 2,5 ml P1- Lösung resuspendiert. Je 2 Fraktionen wurden gepoolt und mit je 5 ml P2- Lösung durch Schwenken gut gemischt, um die Bakterien 27 zu lysieren. Nach Inkubation von 5 min bei RT wurden 5 ml Lösung 3 kräftig hineingeschoßen und gut durchmischt. Die Proteine präzipitieren und wurden 30 min bei 10000 rpm und 4°C zentrifugiert. Eine Tip 500 Säule, mit 10 ml QBT äquilibriert, wurde mit dem klaren Überstand beschickt. Die Säule wurde zweimal mit 30 ml QC gewaschen und die DNA mit 15 ml QF eluiert. Das Eluat wurde mit 12.5 ml 100 % Isopropanol gut gemischt, 1h bei -20°C gefällt und 15 min bei 10000 rpm und 4°C zentrifugiert. Das Sediment wurde zweimal mit 70% Ethanol und einmal mit EtOH gewaschen, im Vakuum angetrocknet und in 500 µl TE resuspendiert. Die DNA- Konzentration wurde durch Extinktionsmessung bei der Wellenlänge = 260 nm bestimmt. 28 2.4. 2.4.1. DNA- Analyse Agarose-Gelelektrophorese In 1x TBE- Lösung wurden 0,6 % - 2 % (w/v) Agarose unter Aufkochen im Mikrowellenofen gelöst. Diese Lösung wurde auf ca. 55°C abgekühlt und mit 5µl Ethbr pro 100 ml Lösung versetzt, in ein Gelbett gegossen, ein passender Kamm eingesetzt und nach dem Erkalten mit 1x TBE überschichtet. Je niedermolekularer die zu erwartenden DNA-Teilfragmente sind die durch das Gel aufgetrennt wurden sollen, desto höherprozentig wurde das Gel gegossen. Je nach Bedarf wurde das Gel zwischen 1h bis üN laufen gelassen (Richtwert: 3-4 Volt / cm2). Die aufgetragende Probenmenge variiert je nach erwarteter Länge zwischen 20 ng bis einigen µg. Dazu wurde die Probe mit ca. 20 % (v/v) Blaumarker versetzt. Dieser ermöglicht beim Auftragen das Einsinken der Probe in die Taschen des Gels. Vor dem Auftragen der mit Blaumarker versetzten Proben wurden diese 10 min bei 68°C geheizt. 2.4.2. Analytischer Restriktionsverdau von DNA Es wurden zusammenpipettiert: 1,0 µl DNA aus obiger Minipräparation 1,0 µl React 10- fach Puffer 0,5 µl Restriktionsendonuklease 1 (5U/µl) 0,5 µl Restriktionsendonuklease 2 (5U/µl) oder H2O 6,7 µl H2O 0,3 µl RNAse A Es wurde üN bei 37°C inkubiert. 2.4.3. Größenbestimmung der DNA-Fragmente Um die Größe der DNA- Fragmente bestimmen zu können, wurde ein Längenstandard mitlaufen gelassen. Die BRL 1 kb-Leiter beinhaltet Fragmente der Längen (Hartley & Donelson, 1980): 12,2 kbp; 11,2 kbp; 10,2 kbp; 9,2 kbp; 8,1 kbp; 7,1 kbp; 6,1 kbp; 5,1 kbp; 4,1 kbp; 3,1 kbp; 2,0 kbp; 1,6 kbp; 1,0 kbp; 0,5 kbp; 0,4 kbp; 0,3 kbp und 0,2 kbp Dabei ist die 1,6 kbp- Bande an ihrer erhöhten Konzentration zu erkennen. Der Molekulargewichtsstandard V enthielt Fragmente folgender Länge (Kessler et al., 1985): 587 bp; 540 bp; 504 bp; 458 bp; 434 bp; 267 bp; 234 bp; 213 bp; 192 bp; 184 bp; 124 bp; 123 bp; 104 bp; 89 bp; 80 bp; 64 ; 57 bp; 51 bp; 21 bp; 18 bp; 11 bp und 8 bp. 29 2.4.4. Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA Die Konzentrationsmessung der DNA erfolgt in einer Quarzküvette gegen TE als Referenzwert. Die Extinktion von 1 mg DNA in 1ml Lösung beträgt bei = 260 nm für dsDNA 20.3, für ss- DNA 25.5. Proteine absorbieren bei = 280 nm maximal. Der Quotient OD 260 /280 gibt die Verunreinigung durch Proteine an. Bei reiner DNA kann er maximal den Wert 2 erreichen und sollte den Wert von 1,6 nicht unterschreiten. 2.4.5. Elution von DNA aus Agarosegelen Vor und hinter die zu eluierende Bande wurde in das Agarosegel unter UV- Lichtkontrolle jeweils ein Stückchen DEAE- Cellulose Filterpapier eingefügt. Die DNA- enthaltende Bande wurde bei 120 mA für 1 h in das Filterpapier einlaufen gelassen. Der Filter wurde unter UVLicht so zugeschnitten, daß nur das fluoreszierende Stück weiterbenutzt wurde, mit TE abgespült und in 300 µl LET bei 70°C innerhalb von 1,5 h eluiert. Nach Phenol / Sevag Extraktion mit anschließender Ethanolfällung wurde das Sediment gewaschen, resuspendiert und die Konzentration bestimmt. 2.4.6. Southern-Blot Um die im Agarosegel aufgetrennte DNA zu transferieren, wurde sie unter alkalischen, denaturierenden Bedinngungen durch Kapillarkraft über Nacht auf Nylonmembranen (Gene Screen Plus) überführt (E.M. Southern, 1975, modifiziert nach Chomczynski et al., 1984). Dazu wurde das Gel auf eine Schicht von 3 MM-Papier gelegt, das mit seinen Enden in die Transferlösung reicht, die Nylonmembran direkt auf die nach oben liegende Gelunterseite aufgelegt, mit drei Lagen angefeuchtetem 3MM- Papier und einer ca. 10 cm dicken Schicht aus Papierhandtüchern belegt und das Ganze mit einer Glasplatte, auf die noch ein zusätzliches Gewicht gestellt wurde, gleichmäßig beschwert. Es wurde bei allen feuchten Lagen auf absolute Luftblasenfreiheit geachtet. Die Nylonmembran wurde nach erfolgtem Transfer für 15 min in Neutralisationslösung geschwenkt und anschließend getrocknet. 30 2.5. 2.5.1. Subklonierung im Vektor M 13 Restriktionsverdau des M13- Phagen Im Doppelverdau, bei dem asymmetrisch geschnitten wurde, entstanden nichtkomplementäre Enden, sodaß eine Selbstligation nicht stattfinden konnte. Im Einzelverdau hingegen müssen die komplementären Enden durch Dephosphorylierung am Religieren gehindert wurden. Die Restriktionsendonukleasen wurden in ca. dreifachem Überschuß (1,5 U/µg) eingesetzt und es wurde 2 h bei 37°C inkubiert. M13 mp 18/19 React Eco R I Kpn I (5µg) (10- fach) (15 U) (15 U) 20 µl 4 µl 1,5-3,0 µl 1,5 µl H20dd ad 40 µl 11,5-13,0 µl Nach dem Verdau wurde auf 50 µl aufgefüllt, mit Phenol / Sevag extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Sedimente wurden mit 70% Ethanol gewaschen, im Vakuum angetrocknet und in 50 µl TE resuspendiert. 2.5.2. Dephosphorylierung des Vektors Vektor-DNA geschnitten Puffer CIAP (1:10 Verdünnung) H20dd 10 pmol = 20 pmol Enden 15 µl 10- fach 2 µl 1 U/µl 2 µl 1 µl Je nach Position der abzuspaltenden Phosphatgruppe wurde die Enzymkonzentration, die Temperatur und die Reaktionsdauer variiert. Bei einer Inkubation von 1 h und 37°C wurde die Phosphatgruppe am 3'-Überhang abgespalten. Die Zugabe von 0,5 µl CIAP (10 U/ µl) und die Inkubation bei 50°C für 1 h spaltet die Phosphatgruppe am 5'-Ende ab. 10 min bei 75°C inaktivierten die Phosphatase. Nach Phenol/ SEVAG - Extraktion und anschließender EtOHFällung und Waschung wurden die Sedimente in 100 µl TE resuspendiert. 31 2.5.3. Ligation Berechnung der molaren Verhältnisse von Vektor zu Insert: Für die Ligation wurde ein molares Vektor / Insertverhältnis von 1:2 angestrebt. Da der Vektor fast viermal so lang ist wie das Insert, mußte die achtfache Menge an Vektor eingesetzt werden. Vektor DNA (80 ng/µl) Insert DNA (40 ng/µl) 4 µl 1 µl ATP (10 mM) 1 µl Puffer (10- fach) 1 µl T4- Ligase (0,25 U/µl) 1 µl H20dd 2 µl Die Inkubation erfolgte bei 14 °C üN. 2.5.4. Herstellung kompetenter Zellen Eine einzelne Bakterienkolonie wurde in 6 ml DYT (versetzt mit dem entsprechenden Antibiotikum) aerob bei 37°C unter Schütteln bis zu einer OD600 von 0,3 inkubiert. 100 ml DYT wurden auf 37°C vorgewärmt und mit 5 ml dieser Vorkultur versetzt. Unter starkem Schütteln wurde bei 37°C aerob bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Die Bakterien wurden 10 min in Eiswasser gekühlt und dann bei 4°C für 5 min bei 3 K sedimentiert. Das weitere Procedere fand im Kühlraum statt, wo bereits alle weiteren Geräte und Lösungen vorgekühlt worden waren. Das Bakteriensediment wurde in 30 ml TfB I- Puffer resuspendiert und 60-90 min bei 0°C inkubiert. Nach erneutem Sedimentieren der Bakterien bei 4°C und 2000 rpm für 5 min wurde das Sediment vorsichtig in 2 ml TfB II- Puffer resuspendiert, in 100 µl Aliquots portioniert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. 2.5.5. Transformation Als Kontrolle der Transformationseffizienz wurden 100 µl kompetenter Zellen mit 1 ng M13 RF- DNA transformiert. 100 µl kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut und mit 5 µl (der Hälfte) des Ligationsansatzes für 30 min auf Eis inkubiert. Dann wurden sie einem Hitzeschock von 42°C für 60 sec unterzogen. Es wurden 100 µl einer exponentiellen XL1-Blue Kultur hinzugefügt und der Ansatz in 3 ml WA, supplementiert mit 40 µl X-Gal und 4 µl IPTG, auf Agarplatten mit geeignetem Antibiotikum ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert. Wegen erhöhter Rekombinationswahrscheinlichkeit sollte die Inkubation 12 h nicht überschreiten. 32 Von jeder Platte wurden sofort einige einzelne, inserthaltige (farblose) Plaques ausgestochen und in 1 ml DYT (mit geeignetem Antibiotikum) üN bei 4°C eluiert und gelagert. Zur Kontrolle der ausgestochenen Plaques können zuvor 2 Filter gezogen und die Filter mit einer entsprechenden Sonde hybridisiert werden. 2.5.6. Einzelstrang DNA Präparation aus M13 Eine üN- Kultur von E. coli XL1- Blue wurde 1:100 mit DYT-Tet verdünnt. 7 ml dieser Verdünnung wurden mit 80 µl des Phageneluates 5 h bei 37°C unter Schütteln aerob inkubiert. Die Bakterien wurden 5 min bei 8000 rpm sedimentiert und 1ml des Überstandes wurde,versetzt mit 5 µl Chloroform, als Phagenstock bei 4°C gelagert. Der restliche Überstand wurde mit 1/4 vol eines Gemisches aus 2,5 M NaCl / 20% (w/v) PEG 6000 30 min auf Eis inkubiert. Die gefällten Phagen wurden bei 14000 rpm zentrifugiert und die am Glasrand anhaftende PEG-Lösung wurde durch erneutes Zentrifugieren und Abpipettieren weitestgehend entfernt. Die Sedimente wurden in 50 µl TE/ ml PEG- Fällung resuspendiert, einmal mit Phenol, zweimal mit Phenol/Sevag und einmal mit Sevag extrahiert und durch Ethanolfällung und -waschung gereinigt. Die DNA-Pellets wurden in 50 µl TE resuspendiert. Zur Kontrolle wurde 1:100 der DNA gelelektrophoretisch analysiert. 2.5.7. Relative Orientierung der Inserts Bei der asymmetrischen Einklonierung der Inserts ist deren Orientierung festgelegt, nicht jedoch wenn das Insert über nur eine Schnittstelle einkloniert wurde. Es kann in beide Richtungen hineinligiert worden sein. Um die relative Orientierung der Inserts zueinander zu ermitteln, wurde das Verfahren nach Howarth et al., 1981 angewandt. Aus den 1 ml Phagenstocks wurden je 15 µl aus zwei verschiedenen Stocks zusammengegeben und 2 µl 2 % (w/v) SDS hinzugefügt. Nach Inkubation bei 65°C für 50 min wurde die Temperatur für 10 min auf 50°C gesenkt und dann 6 µl Blaumarker hinzugefügt. Diese Ansätze wurden auf einem 0,6 % Agarosegel gelelektrophoretisch analysiert. Sind die Inserts in entgegengesetzter Richtung in den Phagen inseriert, so können beide Stränge miteinander hybridisieren und zeigen auf dem Gel ein anderes Laufverhalten als nicht miteinander hybridisierte Stränge gleicher Orientierung. 33 2.5.8. DNA-Sequenzierung nach dem Kettenabbruchverfahren (Sanger et al., 1977) Die Sequenzierreaktion wurde nach der Anleitung des verwendeten USB- Sequenase Kits (Renner/ Dannstadt) durchgeführt. Für die ersten Reaktionen wurden die M13- UniversalPrimer des Kits verwendet, später wurden die entsprechenden Primer selber synthetisiert. Um Kompressionen, die die Auswertbarkeit einer Sequenzierreaktion beeinträchtigen, zu minimieren, wurde sowohl eine dGTP als auch eine dITP Reaktion vorgenommen. Hybridisierungsreaktion Primer Sequencing Buffer ss- DNA H2Odd (0,5 pmol/ µl) (5- fach) (1-2 µg) 1 2 1 6 µl µl µl µl Der Ansatz wurde 2 min bei 70°C inkubiert, über 30 min auf 30°C abgekühlt und kurz zentrifugiert. Markierungsreaktion Hybridisierungsansatz DTT Labeling- Mix 35 S- dATP Sequenase (0,1 M) (1:5) (5 µCi, ca. 1300 Ci/ mmol) (1:8 in Verdünnungspuffer) 10 1 2 0,5- 1 2 µl µl µl µl µl Es wurde 4-5 min bei RT inkubiert und der Reaktionansatz kurz herunterzentrifugiert. Terminationsreaktion Je 2,5 µl der Terminationsmixe A, C, G und T wurden vorgelegt und auf 37°C vorgewärmt. Je 3,5 µl aus obiger Markierungsreaktion wurden am Rand des Eppendorfgefäßes abgesetzt und alle 4 Terminationsansätze gleichzeitig herunterzentrifugiert. Die Ansätze wurden 5 min bei 37°C inkubiert, dann wurde 4 µl Stopplösung hinzupipettiert. Die radioaktiven Proben können bei -20°C bis zu 14 Tagen gelagert wurden. Sequenziergele Zwei Glasplatten - eine ca. 2 cm länger als die andere - wurden sorgfältig mit Spülmittel und viel Wasser von Rückständen gereinigt und mit EtOH abgerieben. Die kleinere Platte wurde 34 mit Surfasil beschichtet, die andere Platte mit 45 µl Haftsilan (Methacryloxypropyltrimethylsilan), das in 15 ml EtOH und 450 µl 10 %- iger Essigsäure gelöst war, behandelt. Getrennt durch 0,4 mm starke Spacer, wurden die Platten nach dem Trocknen des Haftsilans zusammengeklammert. Das untere Ende der Platten wurde durch ein Blockgel, bestehend aus 50 ml Bottomgel- Stock, 350 µl 25 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat (APS) und 250 µl TEMED, versiegelt. 15 ml Bottom-Gellösung wurde mit 12 µl 25 % (w/v) APS und 10 µl TEMED und 125 ml Top-Gellösung wurde mit 90 µl 25 % (w/v) APS und 75 µl TEMED gemischt und in 50 ml Spritzen aufgezogen. Nach dem schnellen Auspolymerisieren des Blockgels wurde zuerst das Bottom-Gel, dann das Top-Gel blasenfrei und ohne Unterbrechung zwischen die Platten gespritzt. Nach 2 Stunden war das Gradientengel durchpolymerisiert und konnte in die Gelkammer eingebaut werden. Durch einen ca. 30 minütigen Vorlauf bei 45 mA wurde das Gel erwärmt. Eine angelegte Aluminiumplatte gewährleistete eine gleichmäßige Wärmeverteilung. Die Proben wurden 2 min bei 95°C denaturiert und davon jeweils 2.5 µl aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte bei 10 - 45 mA, bis der blaue Marker (kurzer Lauf, trennt kurze Fragmente) oder der grüne Marker (langer Lauf) aus dem Gel herausgelaufen waren. Die Gelplatten wurden getrennt und die große Platte mit dem gebundenen Gel in einer Lösung von 10 % Essigsäure, 10 % Methanol für 30 min geschwenkt, um den Harnstoff völlig zu entfernen. Dann wurde die Platte mindestens 3 h bei 80°C getrocknet und für mindestens einen Tag bei RT autoradiographiert. 2.5.9. Primersynthese Es wurden Oligonucleotide einer Größe von 15- bis 53- Basen automatisch nach der Methode von Cauthers et al. (1981) mit einem DNA- Synthesizer 381A (Applied Biosystems/ Weiterstadt) synthetisiert. Über die 3'- Hydroxylgruppe und ein Spacer (organische Seitenkette) wurde das erste Nucleosid an die Matrix ("controlled pore glass") gebunden. Die Kettenverlängerung wurde mit monomeren -Cyanoethyl-Nukleosidphosphoramiditen automatisch vorgenommen. Das Oligonucleotid wurde über 2 Stunden mit 1,5 ml 32 % Ammoniak von der Säule abgetrennt, indem in ca. 10 minütigem Abstand die Säule gespült wurde. Die Ammonolyse der Benzoyl- und Isobutyrylschutzgruppen erfolgte üN bei 56°C in einem verschlossen Eppendorfgefäß. Der Ammoniak wurde durch Überblasen mit gasförmigen Stickstoff abgedampft. In einer Vakuumzentrifuge wurde das Oligonucleotid gefriergetrocknet. Das Volumen wurde mit H2Odd auf 1 ml aufgefüllt und dann das Oligonucleotid über eine NAP10 Säule entsalzt. Das Säuleneluat wurde in 5 Fraktionen à 500 µl aufgefangen und deren OD260 bestimmt. Die Fraktionen mit der höchsten Extinktion wurden vereinigt und hieraus die Konzentration des Oligonucleotids bestimmt. Für Sequenzierreaktionen wurde das Oligonucleotid auf 0,5 pmol/µl verdünnt. Das durchschnittliche Gewicht einer Base wurde mit 330 g/ mol angesetzt. 35 2.5.10. Polymerase- Kettenreaktion (PCR) Template- DNA Puffer dATP dCTP dGTP dTTP Primer (Sense) (100 ng / µl) (10- fach) (40 nmol/µl) (40 nmol/µl) (40 nmol/µl) (40 nmol/µl) (200 pmol/ µl) Primer (Antisense) (200 pmol/ µl) Enzym (Polymerase) (2,5 U /µl) H2Odd ad 1µl 10 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 1 µl 1 µl 1 µl 100 µl Bis auf die Polymerase wurde alles in ein PCR- Reaktionsgefäß gegeben und 5 min bei 92°C denaturiert. Nach kurzem Herunterzentrifugieren des Gemisches wurde das Enzym zugesetzt und das PCR- Programm des Thermocyclers gestartet. Die Denaturierung fand bei 92°C für 90 sec , die Primerhybridisierung (Annealing) bei 65°C für 90 sec und die Kettenverlängerung (Extention) bei 72°C für 90 sec statt. Es wurden 30 - 35 Zyklen gefahren, wobei bei jedem Zyklus die Dauer der Extentionsreaktion automatisch um 1 sec verlängert wurde. Als Polymerasen wurden Pfu und Taq benutzt. Das PCR- Produkt wurde durch Ethanolfällung und -waschung aufgereinigt und in 10 µl TE resuspendiert. 0,5 µl wurden gelelektrophoretisch analysiert. 36 2.6. 2.6.1. RNA-Präparation aus Rinderleber Vorbereitung für RNase-freies arbeiten Es ist wichtig, daß alle Gerätschaften und Verbrauchsmaterialien bei ihrer Verwendung RNase- frei sind. Heizbare Gegenstände wurden dazu 5 h bei 240°C erhitzt. Nicht heizbare Materialien wurden 1 h in 10 N NaOH eingelegt und dannach gut mit DEPC- H2O gespült. Alle Lösungen wurden mit DEPC- Wasser angesetzt und wenn möglich autoklaviert. Pipettenspitzen wurden mit sterilen Handschuhen zum Autoklavieren gesteckt. Zügige und sterile, d. h. in diesem Fall RNase-freie Arbeitsweise war im folgenden zu beachten. 2.6.2. Isolierung der RNA Rinderleber wurde so bald wie möglich nach dem Schlachten des Tieres entnommen, in kleine Stücke geschnitten, sofort in flüssigem Stickstoff tiefgeforen und ins Labor transportiert. 1,6 g Rinderleber wurden abgewogen und unter flüssigem Stickstoff gemörsert. Die pulverisierte Leber wurde mit 16 ml Lösung D versetzt und nach dem Auftauen sofort mit einem UltraTurrax homogenisiert. Nach Zugabe von 1,6 ml 2 M NaAc, pH< 4,0 und 16 ml sauren Phenols (Phenol gelöst in H2Odd) wurde jeweils gut gemischt. Anschließend wurden 3,2 ml SEVAG zugegeben und erneut 10 sec kräftig geschüttelt und 15 min auf Eis inkubiert. Das Homogenat wurde für 20 min bei 4°C und 10000 rpm zentrifugiert, die RNA aus dem Überstand mit dem gleichen Volumen Isopropanol für 2 h bei -20°C gefällt und 5 min bei 5000 rpm sedimentiert. Das Sediment wurde in 4,8 ml Lösung D resuspendiert, erneut mit Isopropanol 1:1 (v/v) gefällt, dann sedimentiert und in 4,8 ml Lösung D resuspendiert. Aliquots von 300 µl wurden 300 µl Isopropanol hinzufügt und die Proben bei -80°C gelagert. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die RNA 10 min bei 4°C und 14000 rpm sedimentiert, mit 70% Ethanol gewaschen und kurz (1-2 min) im Vakuum getrocknet. Das Sediment wurde in 100 µl DEPC-Wasser bei 65°C gelöst und die Konzentration durch Messung der OD260 bestimmt. (1 OD260 µg/ml) 37 2.6.3. Reverse-PCR mit RNA Die RNA wurde wie zur Konzentrationsbestimmung vorbereitet. Für die reverse Transkription der RNA in DNA wurde folgender Ansatz verwendet: rTth- Puffer fach 2 µl MnCl2 10 mM 2 µl dATP 10 mM 0,4 µl dCTP 10 mM 0,4 µl dGTP 10 mM 0,4 µl dTTP rTth- Polymerase Primer - AntisenseRNA DEPC - H2O 10 mM 2,5 U/ µl 60 pMol/µl 240 ng/µl 0,4 µl 2 µl 1 µl 5 µl 3,4 µl 20 µl Die RNA wurde wegen der Gefahr der Degradierung zuletzt hinzupipetteiert. Nach 10 minütigem Annealing bei 60 °C erfolgt die Erststrangsynthese bei 70°C für15 min. Nach der reversen Transkription der RNA in DNA wurde nun die Polymerasekettenreaktion (PCR) gestartet. Dazu wurde der Ansatz folgendermaßen ergänzt: Chelating Buffer MgCl2 Primer - SensePrimer - AntisenseH20 (DEPC) 10- fach (200 pmol) (200 pmol) 8,0 8,0 0,4 1,2 62,4 80,0 µl µl µl µl µl µl Temperaturzyklen: Denaturierungstemperatur : 92°C 2,0 min Annealintemperatur : 60°C 1,5 min Extentionstemperatur : 70°C 1,5 min Zyklenzahl 35- 40 Verlängerung des Extentionszykluses um 1 sec/ Zyklus. 38 3. Allgemeine Grundlagen zu den Vektorsystemen 3.1. Der - ZAP II Phage Der - ZAP II Phage diente als Vektor der Rinder cDNA. Als Derivat des Wildtyp- Phagen (48,5 kbp), der zu den temperenten E. coli Phagen gehört, kann dieser sowohl den lytischen als auch den lysogenen Zyklus durchlaufen. Nachdem der Phage die Wirtszelle infiziert hat, schließt sich seine doppelsträngige, lineare DNA über ihre komplementären Enden zu einem Ring. Wird die DNA nicht in das Genom des Wirtes inseriert (lysogener Zyklus), sondern vervielfältigt und die Genprodukte des Phagen exprimiert, kommt es zur Lyse des Wirtes. Dieser lytische Zyklus kann bei der cIts 857- Mutante durch Inkubation bei 42°C induziert wurden. Dabei wird der temperatursensitive Repressor, das cI- Genprodukt, das die Expression der Phagenhüllproteine reprimiert, inaktiviert und somit der lysogene Zyklus zurückgedrängt und die Lyse des Wirtes eingeleitet. Beim - ZAP II Phagen wurden nicht essentielle Teile des Wildtyp Genoms herausgeschnitten und statt dessen das pBlueskript- Plasmid, ein Derivat des Phagen M 13, hineinkloniert. Über dieses Plasmid läßt sich mit dem Helferphagen R 408 die einklonierte DNA als ss-DNA isolieren. Desweitern verfügt das pBlueskript- Plasmid über einen Polylinker, in welchen dem 40,8 kb langen - ZAP II Vektor Fremd- DNA bis maximal 10 kb Länge einkloniert werden kann. Fremd- DNA haltige - ZAP II-Phagen lassen sich dadurch erkennen, daß die Plaques farblos sind. Dazu wurde im pBlueskript der Polylinker in dem Teil des lacZ- Gens generiert, der den terminalen Anteil des Enzyms - Galaktosidase codiert. Dieses Enzym ist in der Lage, das Substrat X- Gal in einen blauen Indigofarbstoff (5,5'-Dibrom-4,4'dichlorindigo) zu spalten. Sowohl Wirtszelle als auch der - ZAP II Phage tragen ein unvollständiges lacZ- Gen und sind erst gemeinsam in der Lage durch - Komplementierung das funktionsfähige Enzym zu exprimieren. Wurde nun Fremd- DNA über den Polylinker in das lacZ- Teilstück des pBlueskript inseriert, wird diese - Komplementierung verhindert, eine blaue Farbreaktion findet nicht statt. Durch die lacIq- Mutation wird eine 10-fache Überproduktion des lacRepressors bewirkt. Hierdurch soll verhindert wurden, daß eventuell toxische Insertsequenzen exprimiert wurden. Erst bei gleichzeitiger Anwesenheit des starken Induktors IPTG wird die Synthese des lacZ- Genproduktes ermöglicht. 39 3.2. E.coli XL1- Blue Als Wirt für die Phagen M13 und Lambda ist dieser Stamm von E. coli gut geeignet. Durch verschiedene Mutationen erlaubt er eine Selektion auf bestimmte Eigenschaften. Bakterien verfügen zwecks Austausch genetischen Materials über die Möglichkeit der Rekombination. Diese Eigenschaft ist unerwünscht, da sie zur Veränderung der einklonierten Fremd- DNA führen kann. Die recA-- Mutanten haben diese Fähigkeit verloren. Regelmäßig wird durch Bestrahlung mit UV- Licht das Vorhandensein dieser Mutation überprüft, da auch sie verloren gehen kann. Damit XL1- Blue von M13-Phagen infiziert werden kann, muß er zur Ausbildung von F-Pili befähigt sein. Diese Fähigkeit wird durch die Gene des F- Plasmids codiert, welches bei einer Konjugation zweier Bakterien übertragen werden kann. Das Plasmid wird mit einer Häufigkeit von ca. 10-5 pro Generation in das Bakteriengenom inseriert. Besitzt eine Zelle das Plasmid, das die Bildung von F-Pili exprimiert, so besitzt sie den Fertilitätsfaktor und wird als F+ bezeichnet. Über die F-Pili können die F+-Zellen mit F-Zellen konjugieren. Das Plasmid benötigt zur vegetativen Replikation identische Vorraussetzungen wie das Chromosom, verfügt aber über eine eigene Initiation dieses Vorganges. Er beginnt am Replicon oriV und verläuft bidirektional. Haben die mehr als 12 Gene des tra-Operons die Konjugation ermöglicht, so wird ein zweiter Replikationspunkt, oriT, aktiviert und somit eine unidirektionale Replikation eingeleitet. Ein DNA- Einzelstrang wird dabei von der Donor- in die Rezipientenzelle übertragen. In beiden Zellen wird repliziert, sodaß die DNA wieder als Doppelstrang vorliegt. Durch Übertragung des F-Faktors wird eine F--Zelle zu einer F+-Zelle. Andere Merkmale erhält sie dadurch nicht. F+-Zellen aber , die den F-Faktor in ihr Chromosom integriert haben, sind in der Lage, auch andere Gene zu übertragen. Diese hfr-Zellen (high frequency of recombination) besitzen nun zwei Initiationspunkte für eine Replikation. Bei einer Konjugation bricht nun am oriT-Locus der Doppelstrang auf und nicht nur die inserierte Plasmid- DNA wird auf die F--Zelle übertragen, sondern auch ein Teil des Wirtschromosoms. F- Teilchen mit dieser zusätzlichen Information werden als F'- Plasmide bezeichnet. Auf dem übertragenen F'-Teilchen ist das TN10- Transposon mit dem TetracyclinResistenzgen lokalisiert. Eine Anzucht von XL1- Blue auf mit Tetracyclin supplementierten Agarplatten selektioniert also die F'- Plasmid tragenden Zellen. Ebenfalls auf dem F'- Teilchen befindet sich die M15- Deletionsmutation im lacZ Gen. Durch die beschriebene Komplementierung wird durch Expression des - Galaktosidasegens eine Blau / WeißFarbreaktion ermöglicht. 40 3.3. M13- Vektor Als DNA Sequenziermethode ist das Kettenabbruchverfahren durch Didesoxynukleotide nach Sanger et al., (1977) etabliert. Als DNA Matrize liefert einzelsträngige DNA die aussagekräftigsten Ergebnisse. Sie kann sehr einfach und in ausreichenden Mengen durch Subklonierung in den Phagen M13 gewonnen werden. Nachdem M13 die Wirtszelle über deren F- Pili infiziert hat, wird seine einzelsträngige DNA zur doppelsträngigen, replikativen (RF-) Form komplettiert. Als Matrize für die Transkription und Replikation dient der neusynthetisierte Minus- Strang. M13 lysiert seine Wirtszelle nicht, sondern wird aus ihr ausgeschleust. Dieses geschieht, nachdem ca. 100 bis 200 RF- Moleküle synthetisiert wurden. An die neugebildeten Plus- Stränge lagern sich einzelstrangbindende Proteine an und der Komplex wird bei der Ausschleusung aus der Wirtszelle in Hüllproteine verpackt. Die Synthese der Phagenpartikel reduziert das Wachstum der Wirtszelle um den Faktor 3. Plaques im Zellrasen entstehen also nicht durch Zellyse wie bei Lambda, sondern durch verlangsamtes Wachstum. Fremd- DNA kann in die RF- Form von M13 über den Polylinker einkloniert werden. Dieser ist wie oben beschrieben so im lacZ Gen plaziert, daß durch eine Blau / Weiß- Farbreaktion Plaques mit rekombinanter DNA an ihrer fehlenden Blaufärbung identifiziert werden können. M13 mp18 und M13 mp19 unterscheiden sich voneinander durch eine inverse Orientierung ihrer Polylinker. Wird ein Insert über die gleichen Restriktionsschnittstellen asymmetrisch in beide Phagen einkloniert, sodaß die relativen Insertorientierungen einander entgegengesetzt sind, kann es aus beiden Richtungen mit dem -40 Universal Primer des Sequenzier- Kids sequenziert werden. 3.4. Auswahl der Vektoren Der Vektor pGEM-4Z wurde auf Grund der Lage seiner Restriktionsschnittstellen im Polylinker ausgewählt, um das N- terminale Teilfragment zu sichern und stabil für die Fusion mit dem C- terminalen Teilfragment bereitzustellen. Er ermöglicht, zumindest im ersten Schritt, eine Blau / Weiß- Nachweisreaktion. Der Vektor pCMV 2 hatte in unserem Labor bereits gute Ergebnisse bei der Überexpression des Calreticulins aus Ratte geliefert. Durch seinen starken CMV (Cytomegalovirus)- Promoter liefert er eine bis zu 100 fache Überexpression der einklonierten DNA. 41 A B C 42 Abb. 1: Polylinker verschiedener Vektoren. A: -ZAP II mit pBlueskript. Die solitären Schnittstellen im Polylinker sind fettgedruckt dargestellt; B: M13 mp 18 und M13 mp 19; C: pGEM-4Z. 43 4. Ergebnisse Zuerst wurde versucht mit Hilfe einer cDNA Sonde des Ratten- Calreticulins, die freundlicherweise von Birte Sönnichsen aus der Abteilung "Klinische Biochemie Göttingen" bereitgestellt wurde, in einer Rinderleber- -ZAP II cDNA Bank die komplette cDNA für Rinder-Calreticulin zu finden. Die hohe Homologie der cDNA zwischen verschiedenen Spezies (Michalak et al., 1992) ließ diesen Versuch erfolgversprechend erscheinen. Sollte jedoch kein positiver Klon gefunden werden, sollte mit Hilfe der reversen PCR das noch fehlende N-terminale Teilfragment aus Rinderleber Gesamt-RNA amplifiziert werden. Wenn möglich sollten beide Teilfragmente über geeignete Schnittstellen zur kompletten cDNA des Calreticulins zusammenligiert werden. 4.1. Isolierung der Rinder cDNA für Calreticulin aus einer Rinderleber- -ZAP II cDNA Bank Das Titern der Rinderleber- -ZAP II cDNA Bank ergab einen Mittelwert, der bei 9,7 x 106 pfu / µl lag. Davon waren 91,8 % rekombinante Phagen. Der Phagentiter der rekombinanten Phagen beträgt also 8,9 x 106 / µl. Die Phagen wurden in einer Dichte von 5x104 auf 20 Tet- Agarplatten ausgebracht (1x 106 Phagen). Die von den Platten gezogenen Filter wurden mit einer nach der ”random primed labeling” Methode aus der kompletten cDNA des Rattenleber- Calreticulins hergestellten Digmarkierten Sonde hybridisiert. Auf jeder Platte wurden zwischen zwei und acht positive Plaques gefunden. Fünfzig einzelne, positive Plaques wurden ausgestochen, die Phagen eluiert und nach dem Titern erneut derart ausplattiert, daß eine Plaquedichte von ca. 100 Phagen / Platte erhalten wurde. Dieses Rescreening wurde zweimal durchgeführt, um eine Isolierung der positiven Plaques zu gewährleisten. Dazu wurde im letzten Rescreening die Plaquedichte auf ca. 10 Plaques / Platte verringert. Mit Hilfe der R 408 Helfer- Phagen- Exzision wurde die cDNA in XL1-Blue transferiert und amplifiziert, um dann durch Minipräparation isoliert zu werden. Durch geeignete Verdaus mit Restriktionsendonukleasen wurden die Länge und das Restriktionsmuster der cDNA 44 ermittelt. Von der Rattenleber cDNA ist eine Länge von 1251 Basenpaaren im translatierten Bereich bekannt (Diplomarbeit, Birte Sönnichsen). Ein Gesamtklon sollte also mindestens diese Länge aufweisen. Klon 3 5 6 Eco R I- Verdau bp / Fragment 790 / 390 900 460 Eco R I/ Bam H I- Doppelverdau bp / Fragment 350/340 / 250/240 600 / 300 460 Gesamtlänge des Klons in bp 1180 900 460 8 9 10 12 13 1390/500 1240 / 350 590 / 500 810 / 500 1100 750 / 500 / 250/240/150 750 / 350 / 250/240 400 / 250/240 / 200 680 / 500 / 130 750 / 240 / 110 1890 1590 1090 1310 1040 14 15 17 1020 900 / 190 590 780 / 240 550 / 240 / 200 / 100 350 / 240 1000 1090 590 Tab. 1: Restriktionsverdau positiver Klone. Größenangabe der Teilfragmente in bp. Da beim Bankbau die cDNA mit Eco R I einkloniert wurde, konnte sie so auch wieder komplett oder in Teilstücken ausgeschnitten werden. Die Klone 3, 8, 9, 12 und 15 schienen wegen ihrer Länge am geeignetsten zu sein. Klon 8 und 12 wurden für das Sequenzieren ausgewählt und durch Qiagen Maxipräparation (Fa. Diagen/Hilden) genügend DNA für weitere Versuche gewonnen. Die Sedimente der Maxipräparation wurden in 500 µl TE resuspendiert. Ihre Endkonzentration lag bei 1,4 mg/ml für Klon 8 und 3,2 mg/ml für Klon 12. 4.1.1. Exzision des Inserts Da beide Klone eine interne Eco R I- Schnittstelle aufwiesen, war es nicht möglich, das komplette Insert durch diese Restriktionsendonuklease herauszuschneiden. Daher wurden für jeden Klon eine Reihe analytischer Verdaus durchgeführt, um eine geeignete Kombination von Restriktionsendonukleasen zu finden, die es ermöglichte, das Insert möglichst in einem Stück herauszuschneiden. Als Restriktionsendonukleasen kamen diejenigen in Betracht, die auf dem Polylinker des -Zap Vektors eine solitäre Schnittstelle haben. 45 Es wurden 1 µl DNA mit folgenden Restriktionsendonukleasen verdaut (Längen in bp): Restriktionsendonukleasen 1. Eco R I 2. Eco R I / Bam H I 3. Kpn I / Sst I 4. Sst I / Xho I 5. Bam H I / Hind III 6. Hind III / Sst I 7. Sal I / Bam H I Klon 8 500/1390 150/240/250/500/750 1890 1890 250/340/600/700 1890 Klon 12 500/810 150/500/660 600/710 600/710 100/1110 600/710 250/340/600/700 100/1210 Tab. 2: Aus dem Restriktrionsverdau der Klone 8 + 12 entstandene Teilfragmente (in bp) L 1 2 3 4 L 5 6 7 8 L 9 10 11 12 L 13 14 L 3 kb 1,6 kb Foto 15.2.93 500 bp A L 1 2 3 4 L 5 6 7 8 L 9 10 11 12 L 13 14 L Blot B Abb. 2:Restriktionsverdaus der Klone 8 (Spur 1-7) und 12 (8-14)(A.:oben).Spätere Kontrollhybridisierung des Soutern-Blots mit Dig-markierter Sonde (s.5.1.3) (B: unten). L: Lambda DNA / 1kb-Leiter Das Insert des Klon 8 wurde vollständig durch Kpn I / Sst I aus dem Vektor herausgeschnitten. Klon 12 jedoch wurde von allen Enzymkombinationen auch im Insert 46 geschnitten. Da das Insert des Klons 12 maximal 1310 bp lang ist, somit nicht die gesamte Länge der gesuchten cDNA (mit nichttranslatierten Bereich) umfaßt, wurde die Kombination Sal I / Bam H I ausgesucht, die das Insert mit dem längsten Teilfragment erzeugte. Auf die 150 bp, die dabei verloren gingen, wurde keine Rücksicht genommen. Zur Gewinnung der Inserts wurden 50 µg beider Klone präparativ mit 100 U je Enzym verdaut. Klon 8 wurde dazu mit Kpn I / Sst I und Klon 12 mit Sal I / BamH I verdaut. Die Verdaus wurden in einem Elutionsgel aufgetrennt, die Inserts eluiert, gefällt, gewaschen und in TE resuspendiert. Zur Endkontrolle und Konzentrationsbestimmung wurde das Eluat nochmals gelelektrophoretisch untersucht. Insert 8 weißt eine Länge von ca. 1,9 kb und eine Konzentration von ca. 40 ng/ µl und Insert 12 eine Länge von ca. 1,2 kb und eine Konzentration von 60 ng /µl auf. L 1 2 L 2 kb 1,6 kb 1 kb Foto 18.2.93 Abb. 3: Konzentrationsbestimmung und Längenkontrolle der Inserts aus Klon 8 (Spur 1) und Klon 12.(Spur 2) L: Lambda-DNA / 1 kb-Leiter 47 4.1.2. Subklonierung in M13 Als Vektor wurden 10 µg M13 mp18 und M13 mp19, mit Kpn I / Sst I für Insert 8 und für Insert 12 mit Sal I / BamH I verdaut. Die Vektoren wurden auf eine Endkonzentration von 80 ng / µl in TE resuspendiert. Da sie asymmetrisch geschnitten wurden und somit nicht spontan miteinander religieren können, brauchen sie nicht dephosphoryliert zu wurden. Der Vektor wurde mit dem entsprechenden Insert im molaren Verhältnis 1:2 (Vektor:Insert) ligiert, in kompetente XL1-Blue Zellen transformiert und in verschiedenen Konzentrationen auf Tethaltige Agarplatten mit Weichagar ausplattiert. Als Kontrollen wurden ungeschnittener Vektor und linearisierter Vektor ohne Insert, eingesetzt: Ligation A M13mp18 Kpn I / Sst I 20 µl ausplattiert 50 µl ausplattiert 100 µl ausplattiert 61 / 5 259 / 14 452 /37 155 / 5 389 / 15 ~700 /40 3 / 63 10 / 129 417 / 39 12 / 89 21 / 157 48 / 355 Insert 8 B M13mp19 Kpn I / Sst I Insert 8 C M13 mp18 Bam H I / Sal I Insert 12 D M13 mp19 Bam H I / Sal I Insert 12 A2 D2 M13 mp18 Kpn I / Sst I 3 / 32 M13 mp19 Bam H I / Sal I 6 / 200 Tab. 3: Transformation der Insert-DNA in XL1-Blue Zellen. A+B Transformation des Inserts 8, C+D Transformation des Inserts 12, A2 + D2 Negativkontrollen ohne Insert. Die Zahlen geben das Verhältnis farblose zu blaugefärbten Kolonien an. Während die Transformation des Inserts 8 die erwarteten Ergebnisse lieferte, war die Verwendbarkeit des Inserts 12 fraglich, da wesentlich mehr blaugefärbte als farblose Plaques darauf hindeuteten, daß bei der Ligation ein Fehler aufgetreten war. Dennoch wurden, nach dem Ziehen von 2 Filtern zur Kontrollhybridsierung mit der Ratten cDNA Sonde, je 4 Plaques von den Platten A 20 µl; B 20 µl; C 50 µl und D 20 µl gepickt. Aus den Eluaten dieser Plaques wurde die ss- DNA isoliert und in 50 µl TE resuspendiert. Die Kontrollhybridisierung der gezogenen Filter ergab, daß alle ausgestochenen Plaques bis auf D 4 eindeutig positiv waren. Die ss- DNA wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt, um die Konzentration und Reinheit zu bestimmen. Die ss-DNA der M13-Klone A1, B1, C4 und D1 wurde für das Sequenzieren ausgewählt. Für die erste Sequenzierreaktion wurde der Universal -40 Primer des Sequenzierkits eingesetzt. Insert 8 wies eine Poly A Sequenz an seinem Ende auf und deckte, wie sich später herausstellte, den gesamten nichtranslatierten C- terminalen Bereich der cDNA von Calreticulin ab. Im translatierten Bereich waren jedoch die Homologien zur Sequenz der 48 Rattenleber cDNA (Diplomarbeit Birte Sönnichsen) unbedeutend. Dieses Insert war zur weitern Verwendung also ungeeignet. Klon 12 hingegen zeigte ab der internen Bam HI Schnittstelle eine sehr hohe Homologie zur Rattensequenz, die aber nach 154 bp abbrach. Dennoch waren diese 154 bp geeignet, um als spezifische Sonde markiert zu werden: Seq.2 ATCCGGTGTAAGGATGATGAATTTACACATCTATACACGCTGATTGTGCGGCCAGACAAC 540 Seq.2 ACCTACGAGGTGAAAATTGACAACAGCCAGGTGGAGTCGGGCTCCTTGGAGGATGATTGG 600 Sense-Primer Seq.1 GGATCCTGATGCCGCTAAGCCTGAAGACTGGGAC 34 ********* ** ** ***** *********** Seq.2 GACTTTCTGCCGCCCAAGAAGATTAAGGATCCTGACGCTGCCAAGCCAGAAGACTGGGAT 660 Seq.1 GATCGCGCCAAGATCGATGACCCTACAGACTCCAAGCCTGAGGATTGGGACAAGCCTGAG 94 ** ** ******** ******** ***** ************** *********** *** Seq.2 GAACGAGCCAAGATTGATGACCCCACAGATTCCAAGCCTGAGGACTGGGACAAGCCAGAG 720 Antisense-Primer Seq.1 CACATTCCTGACCCTGATGCTAAGAAACCTGAGGACTGGGATGAAGAGATGGACGGAGAG 154 ***** ******************** ************** *********** ****** Seq.2 CACATCCCTGACCCTGATGCTAAGAAGCCTGAGGACTGGGACGAAGAGATGGATGGAGAG 780 Seq.1 GTGTAGAATAAGTGGGAGGCCCCCGGCGCCCC-----CCCGTTTCCC---GCGAGGGGG- 205 ***** ** ** * * * ** * * * **** ** Seq.2 ------------TGGGAA-CCACCAGTGATTCAAAATCCTGAATACAAGGGCGAATGGAA 827 Seq.1 --CGGGGCGGGGTAACAACC--AATTGC--GGGCCGCCGGTGAAATACCACTACTC---- 255 * * * * ****** *** * *** * ** **** ** * Seq.2 GCCACGTCAAATTGACAACCCAGATTACAAGGGTACCTGG----ATAC----ACCCAGAG 879 Seq.1 --TGACGTT--TTTTCACTGACCCGGTG-------------------------------A 280 **** * * *** **** ** * Seq.2 ATTGACAATCCTGAATACTCCCCCGATG-----------CGAATATCTATGCCTATGATA 928 Abb. 4: Seq.1 Bam HI x Sal I Fragment von Insert 12 Seq.2 Rattenleber cDNA Calreticulin (Sönnichsen, 1991) Die PCR-Primer sind in der Abbildung fett/kursiv dargestellt. Ein * zeigt Übereinstimmungen in den Sequenzen an, ein - steht für ein Lücke in der Sequenz. 49 4.1.3. Herstellung einer Sonde aus einem Teil der cDNA für Calreticulin von Rind Vom Anfang und Ende des Bereichs mit der hohen Homologie (Base 1 bis Base 150 der Sequenz 1) wurden Sense- und Antisenseprimer sythetisiert und mit diesen per PCR ein 150 bp langes Fragment aus dem Mittelteil der gesuchten cDNA des Rinder- Calreticulins gewonnen. Dieses PCR- Produkt wurde im "Random primed labeling" Verfahren mit Digoxigenin markiert und als Sonde zur Kontrollhybridsierung des Southern- Blots benutzt, der von dem Verdau der zu Beginn positiv hybridisierten Klone gemacht wurde. Die Klone 3, 9, 12 und 15 hybridisierten mit der Sonde (s. Abb. 2B). 4.1.4. Subklonierung und Sequenzierung weiterer Klone Die Klone 3, 9 und 15 wurden ebenfalls in M13 mp 18 und M13 mp19 über Kpn I / Sst I asymmetrisch subkloniert. Je zwei ss- DNA Präparationen von Klon 3, 9 und 15 wurden für das Sequenzieren ausgewählt. Die beiden Sub-Klone von Klon 3 wurden mit 3A und 3B, die von Klon 9 mit 9C und 9D und die von Klon 15 mit 15E und 15F bezeichnet. Für die erste Sequenzierreaktion wurde der Universal - 40 Primer des Sequenase Kits benutzt. Für anschließendene Sequenzierungen wurden nach dem ”Primer-hopping” Verfahren Oligonukleotide als Primer synthetisiert, die ca. 50 Basen vor dem Ende der bereits gelesenen Sequenz lagen. Sowohl Klon 3A als auch Klon 9C begannen beide 170 Basen hinter dem N- Terminus der Rattensequenz und waren in ihren Sequenzen bis auf wenige Basen identisch. Jedoch endete Klon 3 auf Grund seiner geringen Länge kurz hinter dem Stop- Codon TAG im nichttranslatierten Bereich und wurde deswegen in seinem Mittelteil nicht vollständig sequenziert. Auch in keiner anderen Subklonierung war der N- Terminus enthalten. Klon 9D (Antisense vom Klon 9C) enthielt eine Poly A- Sequenz. In Klon 15E war in antisense- Orientierung die KDEL- Sequenz und somit das Ende des translatierten Bereiches vertreten. Da Klon 15 auch nur ca. 1200 bp lang war und er bereits für den nichttranslatierten Bereich codierte, reichte auch seine Länge nicht an das Start-Methionin heran. 50 Klon 9 Klon 15 Klon 3 0 170 cDNA für Calreticulin aus Rinderleber KDEL 1254 nichttranslatierter Bereich Poly-A Abb. 5: Schematische Darstellung der Länge und relativen Lage der cDNA Teilklone. Die Zahlen geben die Länge der DNA in Basen an. Klon 9, als längster Klon, dem nur die ersten ca. 170 Basen des N- Terminus fehlen, wurde für die weiteren Versuche benutzt. 51 4.2. Reverse PCR mit RNA aus frischer Rinderleber Als nächstes mußte der N- Terminus mit den noch fehlenden ca. 170 Basen gefunden werden. Da jedoch jeder Versuch scheiterte, diesen aus der -ZAP II Bank zu isolieren, wurde aus frischer Rinderleber RNA gewonnen. Aus dieser RNA gelang es mit Hilfe der reversen PCR sowohl den C- Terminus als auch den N- Terminus zu amplifizieren. Die Synthese der gesamten cDNA in einem Stück gelang jedoch nicht, obgleich sowohl die Temperaturen, die Salzbedingungen und die Reaktionszyklen variiert wurden. Als PCR- Primer für den N-Terminus wurde ein Oligonukleotid mit der Signalsequenz der Ratten cDNA plus zusätzlicher Kpn I Schnittstelle (mit 7 weiteren, unspezifischen Basen am 5´-Ende, damit die Restriktionsendonuklease binden und schneiden kann) als Sense-Primer (5’ GTA CAG AGG TAC CAT G CTC CTT TCG GTG CCG CTC CTG CTT GGC CTC CTC G 3‘ ) synthetisiert, sowie ein interner Antisense Primer (5’ CTG TTG TCA ATC TTC ACC TCA TAG G 3’). Beide Primer wurden unter RNAse freien Bedingungen hergestellt und aufbereitet, um eine vorzeitige Degradierung der RNA zu vermeiden. Das PCR- Produkt des N- Terminus wies die anhand der Ratten cDNA errechnete Länge von ca. 570 bp auf und wurde durch erneute PCR amplifiziert. Dabei lieferte die Pfu- Polymerase höhere Ausbeuten als die Taq- Polymerase. Das Produkt wurde im Elutionsgel aufgetrennt, eluiert und die DNA aufgereinigt. Sense-Primer Antisense-Primer PCR-Produkt 0 170 cDNA für Calreticulin aus Rinderleber 504 1254 KDEL Poly-A nichttranslatierter Bereich Abb. 6: Schematische Darstellung der Länge und relativen Lage des PCR-Produktes. Die Zahlen geben die Länge der DNA in Basen an. Bei bp 170 beginnt das C-terminale Teilfragment aus Klon 9; bp 504 zeigt die Eco R I-Schnittstelle. KDEL zeigt die Signalsequenz des Tetrapeptides vor dem Stop-Codon und Poly-A das Ende der cDNA an. Die beiden Teilfragmente des C- und N- Terminus überlappen sich um einen Bereich von ca. 400 bp. In diesem sich überlappenden Bereich liegt eine solitäre Eco R I- Schnittstelle. An dieser Schnittstelle lassen sich beide Teilfragmente zusammenligieren, um so die komplette cDNA zu erhalten. 52 4.3. Fusion der cDNA Teilfragmente 4.3.1. Vorbereitung des pGEM-4Z Vektor Zunächst sollte die N-terminale Sequenz in den pGEM-4Z Vektor kloniert werden. Dieser ermöglichte durch die blau/weiß Farbreaktion eine einfache Propagation des Teilfragmentes. Dazu wurde der pGEM-4Z mit Eco RI und Kpn I asymmetrisch geschnitten und durch Elution aus einem 1,5% Agarosegel gereinigt. Anschließend wurden 20 µg des Vektors (10 pmol DNA entsprechen 20 pmol zu dephosphorylierenden Enden) mit CIAP dephosphoryliert, durch Phenol/Sevag Extraktion, Ethanolfällung und -waschung gereinigt. Die DNA wurde in 100 µl TE resuspendiert. 4.3.2. Aufarbeitung des N-terminalen PCR Fragmentes Das ca. 570 bp lange N- termiale Fragment wurde zuerst analytisch mit Eco RI geschnitten. Es sollte nun eine Größe von ca. 504 bp plus der zusätzlichen 13 bp der hinzugefügten Kpn ISchnittstelle aufweisen. Das Kontrollgel zeigte eine klare Bande bei ca. 520 bp des Längenstandards (s. Abb. 7). 200 ng des N- terminalen PCR- Produktes wurden präparativ mit jeweils 5 U Kpn I und Eco RI verdaut. Die DNA wurde in einem 0,6% Agarosegel aufgetrennt und die nun ca. 510 bp lange Bande eluiert. Die gefällte und aufgereinigte DNA wurde in 10 µl TE resuspendiert. 1µl wurde zur Konzentrationsbestimmung auf ein Agarosegel aufgetragen. Die geschätzte Konzentration betrug ca. 5 ng / µl. 1 L Foto 20.7.93 ----516 bp Abb. 7: Spur 1: Elutionskontrolle des Eco R I / Kpn I gescnittenen N-Terminus; 1µl aus 10µl Gesamtverdau. L: Lambda-DNA / 1 kb-Leiter. 53 4.3.3. Ligation des N-Terminus mit dem vorbereiteten pGEM-4Z Vektor Das molare Ligationsverhältnis Vektor zu Insert betrug 1:2. Als Kontrolle wurde Hind III geschnittene - DNA und dephosphorylierter, Kpn I und Eco R I geschnittener pGEM-Vektor ohne Insert mitligiert. Als Positivkontrolle wurde Eco RI geschnittener Vektor religiert. 4.3.4. Transformation von pGEM-4Z in kompetente SURE- Zellen Die Hälfte des Ligationsansatzes (3 µl) wurde in kompetente SURE- Zellen transformiert. Von den Kontrollen wurden 20 µl und 200 µl, von der Vektor - Insertligation Aliquots von 20, 50, 100 und 200 µl ausplattiert. Als zusätzliche Positivkontrolle wurde 10 ng ungeschnittener Vektor mittransformiert. Es wurden 18 Kolonien (Klone P1-P18)gepickt und damit Minipräparationen durchgeführt. Der Verdau mit Eco R I zeigte, daß bis auf Klon P18 alle Kolonien ein Insert enthielten. Durch einen Eco RI / Kpn I Doppelverdau wurde das Insert wieder herausgeschnitten und auf dem Agarosegel sichtbar gemacht. Von Klon P4 wurde eine Maxipräparation ausgeführt. Die DNA wurde in 480 µl TE aufgenommen und hatte, nach OD260 -Bestimmung, eine Endkonzentration von 1,5 µg / µl. Dieser Klon wurde im folgenden mit pN bezeichnet. 1 2 L 3 3 kb 516 bp Foto 26.7.93 Abb. 8: Eco RI / Kpn I Doppelverdau des Klons pN. Spur 1: Eco R I-Verdau; Spur 2: Eco R I/ Kpn I-Verdau; L: Lambda-DNA / 1 kb- Leiter; Spur 3:p GEM-4Z Vektor-DNA ungeschnitten. 75 µg der in der Maxipräparation gewonnenen DNA des Klons pN wurden präparativ mit 150 U Eco RI verdaut, dephosphoryliert, durch Phenol/Sevag Extraktion, Ethanolfällung und waschung gereinigt und in 300 µl TE resuspendiert. Die Endkonzentration der mit pNEC bezeichneten DNA betrug 100 ng / µl. In dieser Form war der N-Terminus vorbereitet, mit dem ebenfalls Eco RI geschnittenen C- Terminus ligiert zu werden. 54 4.3.5. Präperation des C-terminalen Fragmentes 20 µg DNA des Klons 9 wurden mit 40 U (2 U / µg DNA) Eco RI präparativ verdaut. Es wurden eine Bande mit 332 bp Länge und eine zweite Bande mit ca. 1250 bp Länge erwartet und erhalten. Die ca 1250 bp lange Bande wurde eluiert, durch Phenol/Sevag Extraktion, Ethanolfällung und -waschung gereinigt und in 100 µl TE resuspendiert. Die DNAKonzentration betrug 100 ng / µl. 4.3.6. Ligation der C- und N- terminalen Fragmente 100 ng pNEC-DNA wurden mit 100 ng Eco R I geschnittener Insert-DNA des C- Terminus ligiert. Als Negativkontrolle diente der gleiche Ansatz jedoch ohne Insert-DNA des CTerminus. Als Ligationskontrollen wurden Hind III geschnittene-DNA, sowie 100 ng Eco RI geschnittener, phosphorylierter Vektor pN ligiert. Des weiteren wurde der C- Terminus mit sich selbst ligiert, um zu überprüfen, ob seine Enden intakt sind und sich Konkatemere bilden können. Die Hind III geschnittene-DNA war hochligiert, ebenfalls der nicht dephosphorylierte Eco R I geschnittene Vektor pN. Der dephosphorylierte Vektor pNEC war weniger als ca. 30 % religiert und der C-Terminus hatte mit sich selbst Konkatemere gebildet. Jeweils die Hälfte der Ligationsansätze wurden für die Transformation eingesetzt. Als Transformationskontrolle wurden 13 ng ungeschnittener pGEM Vektor verwendet. Von 24 Kolonien wurde durch Minipräparation DNA gewonnen. Mit einem Eco RI- Verdau wurde die DNA auf die Intergration des C- terminalen Inserts geprüft. Klon G3, G4, G9,G10, G14, G15, G22 und G23 schienen das gesuchte Insert zu enthalten. Da der C- Terminus über Eco RI symmetrisch einkloniert wurde, konnte er sowohl in zwei Orientierungen als auch als Konkatemer integriert worden sein. Durch einen Kpn I Verdau der inserthaltigen Klone wurde überprüft, ob eventuell ein Konkatemer einkloniert wurde. Entstehen neben dem linearisierten Vektor noch andere Banden, so ist eine Konkatemerenbildung anzunehmen, da die zusätzlichen Kpn I Schnittstellen nur durch mehrfachen Einbau des C-terminalen Inserts entstehen können. Klon G9 schien eindeutig linearisiert worden zu sein, während bei Klon G23 nur ein Partialverdau stattgefunden hatte. Die anderen Klone zeigen Banden die auf Konkatemere hindeuten. Um die Orientierung des C- Terminus zu ermitteln, wurden die Klone G9 und G23 einem Bam H I Verdau unterzogen und mit dem Bam HI Verdau der C- und N-terminalen Fragmente verglichen. Bei richtiger Orientierung des Inserts werden Banden der Länge von ca. 700 bp, ca. 630 bp und ca. 230 bp erwartet. Die zu erwartenden Banden bei einem Eco R I / Bam H I Doppelverdau sollten eine Länge von ca. 700 bp, ca. 630 bp, ca. 240 bp und ca. 230 bp aufweisen. Klon G9 wies das erwartete Bandenmuster auf. 55 L 1 2 V 3 4 L ---------1 kb ------516 bp Foto 4.8.93 Abb. 9: Bam HI- und Eco RI / Bam HI- Verdau zur Überprüfung der Insertorientierung. Spur 1+3: Klon G9; Spur 2+4: Klon G23. Spur 1+2: Bam HI-Verdau; Spur 3+4: Eco RI / Bam HI- Verdau. L: Lambda-DNA / 1 kb- Leiter; V: Molekulargewichtsstandard V. Als zusätzliche Kontrolle wurde eine PCR durchgeführt, die bei richtiger Insertorientierung ein kurzes 230 bp langes Fragment als Produkt liefern sollte (Primer B 14 5’> TCC AGC TGG TTT GGA TC<3’; Primer B25 5’> CTG TTG TCA ATC TTC ACC TCA TAG G <3’). Nur von Klon G9 gelang die Synthese dieses Produktes. Von diesem wurde durch Maxipräparation DNA gewonnen (300 ng / µl). Je 1,5 µg der gewonnen DNA wurden mit je 5 U der folgenden Enzyme verdaut: Enzym/e 1. Kpn I 2. Eco RI 3. Bam HI erwartete Fragmentlängen in bp ~ 4400 ~ 1200 , Vektor mit Rest (~3200) ~ 700, 630, 230 4. Eco RI / Bam HI ~ 700, 510, 240, 230, 125 5. Eco RI / Kpn I ~ 1200, 504 6. Asp 718 ~ 4400 erhaltene Fragmentlängen in bp ~ 4400 ~ 3200, 1300 ~ 700, 600, 240 ~ 700, 500, 240, 230, 140 ~ 1300, 500 ~ 4400 Tab 3: Kontrollverdau des Klon G9. 56 L V 1 2 3 4 5 V L 6 Foto 15.9.93 ----1,6 kb ----587 bp Abb. 10: Kontrollverdau des Klon G9:Spur 1: Kpn I; Spur 2: Eco R I; Spur 3: Bam H I; Spur 4: Bam H I/Eco R I; Spur 5: Eco R I/ Kpn I; Spur 6: Asp 718; L: Lambda-DNA / 1 kb- Leiter; V: Molekulargewichtsstandard V. 4.3.7. Klonierung des Inserts aus Klon G9 in M13 und pCMV 2 Das komplette Insert In 9 aus Klon G9 sollte nun aus dem Vektor pGEM herausgeschnitten und mit M13 und pCMV 2 ligiert werden. Das Insert In 9 ließ sich mit Kpn I / Eco R I aus pGEM-4Z herausschneiden, dabei wurde das Insert aber auch intern durch Eco R I einmal geschnitten. Deshalb mußte durch einen Partialverdau durch Eco R I ein Fragment mit der Gesamtlänge gewonnen werden. Würde das Insert In 9 über die Schnittstelle Kpn I / Eco R I in pCMV 2 einkloniert, begänne die Translation des In 9 an dessen C-terminalen Ende. Aus diesem Grund mußte das Insert In 9 über die Sma I Schnittstelle des Polylinkers von pCMV 2 einkloniert werden. Dazu wurden die Enden des Inserts In 9 durch das Klenow- Enzym mit Nucleotiden aufgefüllt. Da dieses jedoch nur 5’-kohäsive Enden auffüllt, Kpn I jedoch Fragmente mit 3’-kohäsiven Enden erzeugt, wurde, statt mit Kpn I, mit dessen Isoschizomer Asp 718 geschnitten, das die entsprechenden 5’-köhäsiven Enden erzeugt. 57 4.3.7.1. Partialverdau von Klon G9 100 µg des Klon G9 wurden durch den Verdau mit Asp 718 linearisiert, durch Phenol/Sevag Extraktion, Ethanolfällung und -waschung gereinigt und in 200 µl TE resuspendiert. Um das Insert In 9 mit Eco RI komplett aus dem Vektor zu schneiden, bedarf es eines Partialverdaus, der die interne Eco RI Schnittstelle nicht spaltet. Während eine Variation der Temperatur und der Reaktionsdauer in den Vorversuchen keine günstigen Bedingungen für den Partialverdau erbrachten, ergab eine Enzymkonzentration von 0,125 U / µg DNA bei 37°C und 40 min Inkubationszeit eine optimale Ausbeute an ungespaltenem Insert. 1 2 3 L 4 5 -------- 1,6 kb Foto 17.9.93 Abb. 11: Partialverdau des Klons G9 mit 0,125 U Eco R I/ µg DNA nach 10 min (Spur 1), 20 min (Spur 2), 30 min (Spur 3), 45 min (Spur 4) und 60 min (Spur 5). L: LambdaDNA / 1 kb-Leiter. Unter diesen Bedingungen wurden 30 µg DNA über 40 min präparativ verdaut. Nach Aufreinigung der DNA durch Phenol/Sevag Extraktion, Ethanolfällung und -waschung wurde sie in 60 µl TE resuspendiert, in einem 0,6 % Agarosegel aufgetrennt und die ~1800 bp lange Bande eluiert. Die Ausbeute betrug 1 µg. 4.3.7.2. Auffüllen der Enden des Inserts Die überstehenden Enden von 400 ng des Inserts In 9 wurden durch 2 U Klenow- Enzym mit Nucleotiden aufgefüllt. Das Insert konnte nun in die mit Sma I geschnittenen und dephosphorylierten Vektoren einkloniert werden. Das aufgereinigte Insert lag in einer Konzentration von 40 ng / µl in 10 µl TE resuspendiert zur Subklonierung vor. 58 4.3.7.3. Ligation des Inserts In 9 mit M13 mp 18 und pCMV 2 Das Insert sollte sowohl in M13 mp18 zur Sequenzierung als auch in pCMV 2 zur Überexpression ligiert werden. Dazu wurden beide Vektoren Sma I geschnitten, dephosphoryliert, durch Phenol/Sevag Extraktion, Ethanolfällung und -waschung gereinigt und in TE resuspendiert, sodaß ihre Endkonzentration 100 ng / µl betrug. Das molare Insert : Vektor Verhältnis sollte ca. 1:1 betragen. Die Länge des Inserts In 9 betrug 1,8 kb, die von pCMV2 4,8 kb und die von M13 7,2 kb. pCMV 2 war somit ca. 2,7 x länger als In 9, es wurden 40 ng Insert In 9 mit 100 ng pCMV2 ligiert. M13 mp18 war 4x länger, sodaß 40 ng Insert mit 160 ng M13 ligiert wurden. Zur Kontrolle wurden die dephosphorylierten Vektoren und Hind III geschnittene -DNA mitligiert. 4.3.7.4. Transformation von pCMV 2 in E.coli-SURE 14 ng (1/10 des Ligationsansatzes) der pCMV 2-Ligationprodukte wurden in frisch hergestellte, kompetenten SURE- Zellen transformiert. 18 ng (1/10 des Ligationsansatzes) der M13 mp18-Ligationprodukte wurden in kompetente Zellen des Stammes XL1- Blue transformiert. Zur Kontrolle wurden Eco R I geschnittener, dephosphorylierter und religierter Vektor und 20 ng ungeschnittener pCMV 2 Vektor mittransformiert. pCMV 2 Menge 20 µl 50 µl 100 µl 200 µl Durchschnitt / 200 µl x EcoRI x CIAP 10 ng 9 9 Ungeschnitten 20 ng > 500 > 1000 x Insert 9 14 ng 2 23 31 30 48 19 Transformationseffizienz / µg 5,0 x 103 2,8 x 105 1,9 x 104 48 Tab. 4: Transformationseffizienz bei der Transformation von pCMV 2 x In 9 in SURE-Zellen. Es wurden 18 solitäre Plaques (Klone C1-C18) ausgestochen und durch Minipräparation die DNA isoliert. Mit einem Kpn I Verdau wurde kontrolliert, ob ein Insert integriert war. Die linearisierte DNA- Bande sollte eine Länge von ca. 6600 bp (4800 bp für den Vektor und ca. 1800 bp für das Insert In 9) aufweisen. Nur Klon C4 entsprach den Erwartungen, indem er im 0,6 % Agarosegel eindeutig bei 6,6 kbp lokalisiert war. 59 Zur Klärung der Orientierung des Inserts wurden mehrere Kontrollverdaus vorgenommen. Kpn I und Hind III linearisierten die DNA von Klon C4. Bei richtiger Orientierung des Inserts sind folgenden Bandenlängen zu erwarten: Klon C4 x Bam H I Eco R I erwartete Fragmentlängen in bp ~ 3800 , 1280 , 700 , 630 , 200 ~ 6000 (Vektor + 1240) , ~ 560 bp gefundene Fragmentlängen in bp ~ 3700, 1300, 700, 600, 300 ~ 6000, 580 Tab. 5: Kontrollschnitt des Klons C4 Mit Bam H I und Eco R I. Klon 4 zeigte eindeutig das erwartete Bandenmuster. Durch zwei Maxipräparationen wurden 77 µg DNA (138 ng / µl) und 350 µg DNA (700 ng / µl) von pCMV 2 x In9 erhalten. 4.3.7.5. Transformation von M13 mp 18 in XL1-Blue- Zellen Die Transformation mit M13 mp18 lieferte nur 9 farblose Plaques und einen blauen Plaque. 8 solitäre farblose Plaques (Klone M1-M8) wurden ausgestochen und üN eluiert. Nach Howarth et al., 1981 wurde die relative Insertorientierung zueinander überprüft. Klon M5 und M7 wurden dazu mit den anderen Klonen hybridisiert. Klone M1 und M5 hybridsierten miteinander, wiesen folglich entgegengesetzte Orientierung auf und wurden zur Sequenzierung ausgewählt. Nach der ss-DNA Präparation der Klone M1 und M5 wurden diese mit dem "-40 Universal Primer" des Sequenzierkits ansequenziert und im "Primerhopping"- Verfahren, von beiden Enden kommend, durchsequenziert. Die kritische Sequenz um die Ligationsstelle herum wurde aus beiden Richtungen doppelt sequenziert, um einen Frameshift auszuschließen. Die vollständige Sequenz ist in Abb. 12 dargestellt: 60 (GCATGCCTT GCAGGTCGAC TCTAGAGGAT CCCCTACC) ATGCTCCTTT CGGTGCCGCT CCTGCTTGGC CTCCTCGGCC TGGCCGCCGC TGATCCCACC B 27 60 GTTTACTTTA AGGAGCAGTT TCTGGACGGA GACGGGTGGA CCGAGCGCTG GATCGAATCC 120 AAGCACAAAC CGGATTTTGG CAAATTCGTT CTCAGTTCCG GCAAGTTCTA TGGTGACCAA 180 GAGAAAGATA AAGGCCTGCA GACTAGCCAG GATGCCCGGT TCTACGCTCT GTCGGCCAGA 240 TTTGAGCCCT TCAGCGACAA GGGTCAGACG CTGGTGGTGC AGTTCACAGT GAAACACGAG 300 CAGAACATCG ACTGTGGGGG CGGCTATGTG AAGCTGTCTC CAGCTGGTTT GGATCAGACA 360 GACATGCACG GAGACTCCGA ATACAACATA ATGTTTGGCC CGGACATCTG TGGCCCTGGC 420 ACCAAGAAGG TTCATGTCAT CTTCAACTAC AAGGGCAAGA ATGTGCTGAT CAACAAGGAT Eco RI ATCCGCTGCA AGGACGATGA ATTCACCCAC CTGTACACGC TGATTGTGCG GCCTAATAAT 480 ACCTATGAGG TGAAGATTGA CAACAGCCAG GTGGAGTCAG GCTCCTTGGA GGACGATTGG 600 B25 540 GATTTCTTGC CACCCAAGAA GATAAAGGAT CCTGATGCCG CTAAGCCTGA AGACTGGGAC 660 GATCGCGCCA AGATCGATGA CCCTACAGAC TCCAAGCCTG AGGATTGGGA CAAGCCTGAG 720 CACATTCCTG ACCCTGATGC TAAGAAACCT GAGGACTGGG ATGAAGAGAT GGACGGAGAG 780 TGGGAACCAC CTGTTATTCA GAACCCAGAG TACAAGGGGG AGTGGAAACC CAGGCAGATC 840 GACAACCCAG AGTACAAGGG CATTTGGATC CATCCAGAGA TTGACAACCC TGAGTATTCC 900 CCTGACAGCA ACATCTATGC CTATGAAAAC TTCGCTGTTC TAGGCTTGGA TCTTTGGCAG 960 GTCAAGTCTG GCACCATCTT TGACAACTTC CTCATCACCA ACGATGAAGC GTATGCTGAG 1020 GAGTTTGGCA ACGAGACGTG GGGTGTTACA AAGGCAGCAG AAAAGCAAAT GAAGGACAAG 1080 CAGGATGAAG AGCAGAGGCT ACATGAGGAG GAGGAGGAGA AGAAAGGCAA GGAGGAGGAA 1140 GAGGCAGACA AAGATGATGA CGAAGACAAG GATGAGGATG AGGAGGATGA AGATGAGAAG 1200 GAAGAGGAGG AGGAAGAAGA TGCTGCCGCT GGCCAGGCCA AGGATGAGCT GTAGGGGCCA 1260 CCTCTGCTTC CAGGGCTGGA CTGAGGCCTG AGCGCTCCTG CCGCAGAGCC GGCTGCGCCA 1320 AATAATGTCT CTATGAGACT GGAGAACTTT GATTTTTTTC CAGGCGGGTT CCAATTTGGG 1380 GTGGATTTTG TTTTTGGCTC CCCCCTCCCC CACTTTTTTT AACTTTTTTT TTTTTTTTTA 1440 ACTGGCATTT TTGTCTCTGA TTCTCTTCAG TCCTCACCCC TGGCCTTCAT CTGTCTTGAT 1500 TGACATCTTT GCTTTCTTCT GTCCCTTCAC TCCAGATCCC TAAGTTCCCT TCCAGCTTGG 1560 GACTCAGGGT GGGATGTGGT GTGGAGGAGA AGCCCCAGGC CCAAAATTCC ATCTATTCTT 1620 CCTGGATCCC AGAGGGAGGG GTAGGAGAAG AGGGTGGCAT CCCCAGCCCC CCAGCACTGA 1680 GGAAGAATGG GGCTCTTAAG GCCTTAGCTC TGATCCCTTC CCCTTTCTCC CTGCCCCCAG 1740 GACTGGGCCA CTTCTGAGTT GGGGCAGCGG GTTCTAGCTC AGCTCATGCT GAGAATGTAA 1800 GAACTACAAA CAAAATTTCT ATTAAATTAA GTTTTGTGTC TTCAAAAAAA AAAAAAAAAA 1860 AAAAAAAAAA AAAAAA(CCT TAACCCCTAG GAGAT) 1876 Sma I 61 Abb. 12: cDNA Sequenz des Calreticulins aus Rinderleber. Die ersten 38 kursiv gedruckten Basen entstammen dem PCR-Primer B27, synthetisiert nach Vorlage der Calreticulin- Sequenz aus Rattenleber. TAG als Stopcodon markiert das Ende des translatierten Bereiches. B25 und B27 zeigen die Lage der Primer für die PCR zur Synthese des N-terminalen Fragmentes. Die unterstrichelte Sequenz bei bp 500 zeigt die Eco RI-Schnittstelle. (Kursiv) und in Klammern angegebene Vektor-Sequenzen stammen aus M13 und pGEM-4Z, unterstrichen ist die zweite Hälfte der Sma ISchnittstelle. Die Asp 718- und Eco R I-Schnittstellen wurden durch das Auffüllen der Blunt-ends nicht restauriert. Eine Restriktionsanalyse der cDNA ergibt folgendes Restriktionsmuster: AflII AlwNI BalI BamHI BanI BanII BanIII BclI BglI BspMI BstEII ClaI EaeI Eco47III Eco81I EcoRI EcoRV EspI HaeII HgiAI MamI NaeI NspII NspHI PstI PvuI PvuII SauI SduI StuI StyI XcmI XhoII XorII 1 2 1 3 3 2 1 1 1 1 1 1 4 2 2 1 1 2 2 1 1 1 3 1 1 1 1 2 3 3 2 1 5 1 0 400 800 1200 1600 +------------+------------+-----------+------------+------+------------+------------+-----------+------------+-#----+--#-----#---+------------+-----------+------------+------+------------+------------+-----------+#-----------+------+------------+------#-----+#----------+------------#------+#-----------#------------+---#-------+------------+------+-------#----+------------+-----------+------------+-#----+------------+-------#----+-----------+------------+------+------------+-#----------+-----------+------------+------+#-----------+------------+-----------+------------+------+------------+------------+---#-------+------------+------+-----#------+------------+-----------+------------+------+------------+-------#----+-----------+------------+------+-----#------+------------+-----------+-#---------#+-#----+---#--------+------------+-----------+-#----------+------+------------+--------#-#-+-----------+------------+------+------------+--#---------+-----------+------------+------+------------+-#----------+-----------+------------+------+------------+------#-----+-----------+------------+---#--+---#--------+------------+-----------+-#----------+------+------------+---------#--+-----------+------------+------+------------+------------+-----------+--------#---+------+------------+------------+-----------+--#---------+------+-------#----+---------#--+-----------+------------+-#----+-----------#+------------+-----------+------------+------+------#-----+------------+-----------+------------+------+------------+-------#----+-----------+------------+------+----------#-+------------+-----------+------------+------+------------+--------#-#-+-----------+------------+------+-------#----+---------#--+-----------+------------+-#----+-----#------+------------+-----------+-#----------+-#----+------------+-----#------+-----------+#-----------+------+------------+------------+-----------+------------+---#--+------------+------#-----+#--#-------+---------#--#------+------------+-------#----+-----------+------------+------- Abb. 13: Restriktionskarte der cDNA für Calreticulin aus Rind aus den wichtigsten 6-er Cutter-Enzymen. Der translatierte Bereich der cDNA umfaßt 1254 Basen. Die sich hieraus ableitende Aminosäuresequenz ist im Einbuchstabencode unter der cDNA geschrieben und in Abb. 14 dargestellt. 62 ATGCTCCTTTCGGTGCCGCTCCTGCTTGGCCTCCTCGGCCTGGCCGCCGCTGATCCCACC M L L S V P L L L G L L G L A A A D P T GTTTACTTTAAGGAGCAGTTTCTGGACGGAGACGGGTGGACCGAGCGCTGGATCGAATCC V Y F K E Q F L D G D G W T E R W I E S AAGCACAAACCGGATTTTGGCAAATTCGTTCTCAGTTCCGGCAAGTTCTATGGTGACCAA K H K P D F G K F V L S S G K F Y G D Q GAGAAAGATAAAGGCCTGCAGACTAGCCAGGATGCCCGGTTCTACGCTCTGTCGGCCAGA E K D K G L Q T S Q D A R F Y A L S A R TTTGAGCCCTTCAGCGACAAGGGTCAGACGCTGGTGGTGCAGTTCACAGTGAAACACGAG F E P F S D K G Q T L V V Q F T V K H E CAGAACATCGACTGTGGGGGCGGCTATGTGAAGCTGTCTCCAGCTGGTTTGGATCAGACA Q N I D C G G G Y V K L S P A G L D Q T GACATGCACGGAGACTCCGAATACAACATAATGTTTGGCCCGGACATCTGTGGCCCTGGC D M H G D S E Y N I M F G P D I C G P G ACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAATGTGCTGATCAACAAGGAT T K K V H V I F N Y K G K N V L I N K D ATCCGCTGCAAGGACGATGAATTCACCCACCTGTACACGCTGATTGTGCGGCCTAATAAT I R C K D D E F T H L Y T L I V R P N N ACCTATGAGGTGAAGATTGACAACAGCCAGGTGGAGTCAGGCTCCTTGGAGGACGATTGG T Y E V K I D N S Q V E S G S L E D D W GATTTCTTGCCACCCAAGAAGATAAAGGATCCTGATGCCGCTAAGCCTGAAGACTGGGAC D F L P P K K I K D P D A A K P E D W D GATCGCGCCAAGATCGATGACCCTACAGACTCCAAGCCTGAGGATTGGGACAAGCCTGAG D R A K I D D P T D S K P E D W D K P E CACATTCCTGACCCTGATGCTAAGAAACCTGAGGACTGGGATGAAGAGATGGACGGAGAG H I P D P D A K K P E D W D E E M D G E TGGGAACCACCTGTTATTCAGAACCCAGAGTACAAGGGGGAGTGGAAACCCAGGCAGATC W E P P V I Q N P E Y K G E W K P R Q I GACAACCCAGAGTACAAGGGCATTTGGATCCATCCAGAGATTGACAACCCTGAGTATTCC D N P E Y K G I W I H P E I D N P E Y S CCTGACAGCAACATCTATGCCTATGAAAACTTCGCTGTTCTAGGCTTGGATCTTTGGCAG P D S N I Y A Y E N F A V L G L D L W Q GTCAAGTCTGGCACCATCTTTGACAACTTCCTCATCACCAACGATGAAGCGTATGCTGAG V K S G T I F D N F L I T N D E A Y A E 60 20 120 40 180 60 240 80 300 100 360 120 420 140 480 160 540 180 600 200 660 220 720 240 780 260 840 280 900 300 960 320 1020 340 63 GAGTTTGGCAACGAGACGTGGGGTGTTACAAAGGCAGCAGAAAAGCAAATGAAGGACAAG E F G N E T W G V T K A A E K Q M K D K CAGGATGAAGAGCAGAGGCTACATGAGGAGGAGGAGGAGAAGAAAGGCAAGGAGGAGGAA Q D E E Q R L H E E E E E K K G K E E E GAGGCAGACAAAGATGATGACGAAGACAAGGATGAGGATGAGGAGGATGAAGATGAGAAG E A D K D D D E D K D E D E E D E D E GAAGAGGAGGAGGAAGAAGATGCTGCCGCTGGCCAGGCCAAGGATGAGCTGTAG E E E E E E D A A A G Q A K D E L * K 1080 360 1140 380 1200 400 1254 417 Abb. 14: Aminosäuresequenz des Calreticulins, abgeleitet aus der cDNA Sequenz. Die ersten 38 kursiv gedruckten Basen und die ihnen entsprechenden Aminosäuren entstammen dem PCR-Primer, synthetisiert nach Vorlage der Calreticulin- Sequenz aus Ratte. Die ersten 17 kursiv gedruckten Aminosäuren gehen als Signalsequenz nicht in das native Protein mit ein. 64 5. Diskussion 5.1. Isolierung der cDNA Auf Aminosäureebene war bereits bekannt, daß zwischen Calreticulin aus verschiedenen Spezies hohe Homologien bestanden (siehe Abb. 15: Michalak et al., 1992). Aus diesem Grund wurde zu Beginn dieser Arbeit versucht, mit einer cDNA für Ratten- Calreticulin als Sonde eine -ZAP II Bank aus Rinderleber zu durchsuchen. Wie sich im nachhinein herausstellte, lag die Homologie zwischen Rinder- und Ratten- cDNA für Calreticulin auch auf cDNA- Ebene bei über 80 %. Dennoch gelang es weder mit dieser, noch mit einer später synthetisierten Sonde aus einem Mittelteil der Rinder cDNA Sequenz, einen Klon aus der Bank zu isolieren, der den gesamten translatierten Bereich des Calreticulins, einschließlich flankierender, nichttranslatierter Sequenzen enthielt. Auch mit Hilfe der PCR wurde in der Bank nicht das fehlende N- terminale Fragment gefunden. Je länger die cDNA für ein Protein ist, desto höher wird die Wahrscheinlichkeit, daß der N-Terminus beim Bau der Bank verloren geht. Mit Gesamt-RNA aus Rinderleber als Template einer Reversen PCR gelang die Synthese und Isolierung mehrerer Teilfragmente der gesuchten cDNA, incl. des N-Terminus. Wegen der Fehlermöglichkeit bei der PCR wurde nur das fehlende N- terminale Fragment aus der PCR zur Ligation mit dem C-terminalen Teilfragment aus der -ZAP II Bank zur Synthese der Gesamt-cDNA des Calreticulins verwendet. 5.2. 5.2.1. Analyse der cDNA Struktur Die erhaltene cDNA für Calreticulin aus Rinderleber weist eine Gesamtlänge von 1876 bp auf. Der translatierte Bereich endet bei 1254 bp mit TAG als Stop- Codon. Der nichttranslatierte Bereich der cDNA endet mit einer Poly- A Struktur. Die N-terminalen 38 Basen entstammen nicht der Rinder cDNA- Sequenz, sondern entsprechen der cDNA für Calreticulin aus Ratte, von welcher der PCR-Primer abgeleitet wurde. Dieses ist für die Translation des Calreticulins aus Rind nicht weiter relevant, da die ersten 17 Aminosäuren (codiert von den ersten 51 Basen) als Signalsequenz beim Eintritt in das ER ohnehin abgespalten werden und sich somit nicht im reifen Protein wiederfinden. Die 4 Aminosäuren vor der Spaltstelle sind bereits aus der cDNA- Sequenz des RinderCalreticulins abgeleitet und sind zu denen der Ratte 100 % homolog. Alanin (Aminosäure Nr. -1)zeigt hier die Spaltstelle zum nativen Protein an. Nur die genomische DNA, bzw. ein eventuell seltener cDNA Klon kann genaue Aufschlüsse über die Sequenz der cDNA im 5’- 65 nichttranslatierten Bereich geben. 17 Nucleotide (Literaturwert: 10-30) ”stromaufwärts” vor dem Poly-A- Schwanz (Position 1800-1806, Abb. 14) liegt die Konsensus-Sequenz ATTAAA. Diese wurde bereits bei den isolierten Calreticulin- Klonen anderer Spezies als Polyadenylierungssignal identifiziert (Fliegel et al., 1989; McCauliffe et al., 1990). Da im pCMV 2 als Expressionsvektor für eukaryontische Zellen alle wichtigen Elemente zur Expression der RNA enthalten sind, ist die Vollständigkeit der cDNA im 5’- Bereich zur späteren Überexpression nicht unbedingt erforderlich. Das aus dem Klon G9 gewonnene Insert In 9 stellt eine vielversprechende Basis zur Etablierung der Überexpression von RinderCalreticulin in COS Zellen dar. 5.3. Vergleich von Aminosäuresequenzen für Calreticulin Die Sequenz der cDNA des Klons G9 zeigt einen offenen Leserahmen (open reading frame) von 417 Aminosäuren (Abb. 14). Kürzlich wurde Calreticulin, isoliert aus 50 Rindergehirnen, auf konventionelle Art durch automatischen Edman-Abbau der N-terminalen Aminosäuren durchsequenziert (Matsuoka et al., 1994). Die so ermittelte Aminosäuresequenz war mit der aus der cDNA abgeleiteten bis auf zwei Aminosäuren identisch. Aminosäure 69 und 96 unterschieden sich. In beiden Fällen handelt es sich um den Unterschied einer einzelnen Base auf cDNA Ebene. Asparaginsäure (Asp, D), die Aminosäure 69 der cDNA- Sequenz wurde durch das Basentriplett GAC codiert. Der Austausch des G gegen ein A würde die Aminosäure Asparagine (Asn, N) codieren, die im Edman- Abbau gefunden wurde. Gleiches gilt für das Serin 96 (Ser, S), die durch TCT codiert wird. TTT oder TTC, also ein Austausch der zweiten Base, würde für das im EdmanAbbau erhaltene Phenylalanin (Phe, F) codieren. Die cDNA- Sequenz wurde mehrfach an dieser Stelle überprüft. Da dieser Teil der Sequenz aus der PCR stammt, ist ein Fehler während der PCR nicht auszuschließen, zumal es sich nicht um einen konservativen Aminosäureaustausch handelt. Die zwei fraglichen Aminosäuren sind in Abb. 15 unterstrichen. Andererseits läßt sich bis auf diese zwei Divergenzen das PCR-Produkt durch den Vergleich mit der im Edman-Abbau gewonnen Sequenz verifizieren. Eine der Aufgabenstellungen dieser Arbeit war der Vergleich der Aminosäuresequenz des Calreticulins zwischen Rind und Ratte, um eventuelle Sequenzunterschiede herauszufinden, welche die verschiedenen Formen der Glycosylierung erklären könnten. In Abb. 15 sind die Aminosäuresequenzen von Rind und Ratte einander direkt gegenübergestellt und zum Vergleich auch die Aminosäuresequenzen für Calreticulin von Mensch, Maus und Kaninchen angefügt. 66 -17 Signalsequenz Rind MLLSVPLLLG LLGLAAA :::::::::: ::::::: Ratte MLLSVPLLLG LLGLAAA Rind Ratte DPTVYFKEQFLDGDGWTERWIESKHKPDFGKFVLSSGKFYGDQEKDKGLQTSQDARFYAL :: .::::::::::.:: ::.::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::: DPAIYFKEQFLDGDAWTNRWVESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDQEKDKGLQTSQDARFYAL Mensch Maus Kanin. EPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYAL DPAIYFKEQFLDGDAWTNRWVESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDLEKDKGLQTSQDARFYAL EPVVYFKEQFLDGDGWTERWIESKHKSDFGKFVLSSGKFYGDQEKDKGLQTSQDARFYAL Rind Ratte SARFEPFSDKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLSPAGLDQTDMHGDSEYNIMFGPDIC :::::::: :::::::::::::::::::::::::: :.:::: ::::::::::::::::: SARFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPGGLDQKDMHGDSEYNIMFGPDIC Mensch Maus Kanin. SASFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPNSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDIC SAKFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPSGLDQKDMHGDSEYNIMFGPDIC SARFEPFSNKGQPLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFPAGLDQKDMHGDSEYNIMFGPDIC Rind Ratte GPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPNNTYEVKIDNSQVESGSLE ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::: GPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLE Mensch Maus Kanin. GPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLE GPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLE GPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRPDNTYEVKIDNSQVESGSLE Rind Ratte DDWDFLPPKKIKDPDAAKPEDWDDRAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEM :::::::::::::::::::::::.:::::::::::::::::::::::::::::::::::: DDWDFLPPKKIKDPDAAKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEM Mensch Maus Kanin. DDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEM DDWDFLPPKKIKDPDAAKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEM DDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKPEDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEM Rind Ratte DGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPEYKGIWIHPEIDNPEYSPDSNIYAYENFAVLGLD ::::::::::::::::::::::::::.::: :::::::::::::: :::::. ::::::: DGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDANIYAYDSFAVLGLD Mensch Maus Kanin. DGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNFGVLGLD DGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDANIYAYDSFAVLGLD DGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDANIYAYDSFAVLGLD Rind Ratte LWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLHEEEEEKKGK :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: ::::.:: : LWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRK Mensch Maus Kanin. LWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRK LWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEDKKRK LWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKTAEKQMKDKQDEEQRLKEEEEEKKRK Rind Ratte EEEEA-DKDDDEDKDEDEEDEDEKEEEEEEDAAAGQAKDEL ::::: ::.:..:.::::..::::::.:: : : ::::::: EEEEAEDKEDEDDRDEDEDEEDEKEEDEE-D-ATGQAKDEL Mensch Maus Kanin. EEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEED-VPGQAKDEL EEEEAEDKEDDDDRDEDEDEEDEKEEDEEE--SPGQAKDEL EEEEAEEDEEDKDDKEDEDEDEEDKDEEEEEAAAGQAKDEL 60 60 120 120 180 180 240 240 300 300 360 360 400 399 401 399 402 Abb. 15: Direkter Vergleich der Aminosäuresequenzen von Rind und Ratte (Sönnichsen, 1991). (:) zeigt Übereinstimmungen der Aminosäuren an;(.)zeigt eine konservativen 67 Austausch von Aminosäuren an. (-) steht für eine Lücke. Die beiden fraglichen Aminosäuren der Rindersequenz sind unterstrichen. Die Aminosäuresequenz für Kaninchen (Kanin.), Mensch und Maus wurden aus den entsprechenden cDNAs abgeleitet (Fliegel et al., 1989; Smith & Koch, 1989; McCauliffe et al., 1990). Die internen KPEDWD-repetitven Sequenzen sind fettgedruckt hervorgehoben. Potentielle N-Glycosylierungsstellen sind doppeltunterstrichen hervorgehoben. Die potentielle Kernsignalsequenz PPKKIKDPD ist punktiert unterstrichen. Verglichen wurden 400 Aminosäuren der Sequenzen von Rind und Ratte. 370 Aminosäuren (92 %) waren homolog und von den 30 unterschiedlichen Aminosäuren waren 13 konservativ ausgetauschte Aminosäuren. 5.3.1. Struktur des Proteins Für das reife Calreticulin beträgt das errechnete Molekulargewicht 46,1 kDa. Es enthält 109 saure und 59 basische Aminosäuren. Das einzige hydrophobe Segment der Proteinsequenz erstreckt sich von Aminosäure 73-80 und ist somit nicht lang genug, um eine Membran durchdringen zu können (Smith & Koch, 1989; Fliegel et al., 1989; McCauliffe et al., 1990). Calreticulin kann also von seiner Struktur her kein Transmembranprotein sein. Wegen der ebenfalls sehr hohen Homologie zum Calreticulin aus Kaninchen, lassen sich die Strukturprognosen (Michalak et al., 1992) auf das Calreticulin aus Rind übertragen. Danach läßt sich das Protein in drei Segmente teilen: Vorhersagen der Struktur legen nahe, daß die erste Hälfte des Proteins (Aminosäuren 1-169), in dem positv, negativ und neutral geladene Reste etwa gleichhäufig wie hydrophobe Reste vorkommen, eine globuläre Domäne, bestehend aus acht anti-parallelen -Strängen mit einem Helix-turn-Helix Motiv am äußeren N-Terminus, bilden. Das hieran anschließende Drittel besteht aus der P-Domäne. Sie besteht in der ersten Hälfte aus Prolin- reichen, repetitiven Sequenzen (Abb. 15), denen in der zweiten Hälfte Prolin-, Serin- und Threonin-reichen Segmente folgen. Diese wurden bereits für das Calreticulin der Maus und des Kaninchenmuskels beschrieben (Smith & Koch, 1989; Fliegel et al., 1989) . Die sich hieran anschließende C-Domäne besteht überwiegend aus negativ geladenen, sauren Clustern. Diesen Clustern, sowie der P-Domäne, sind die Ca2+-bindenden Eigenschaften zuzuordnen (Baksh and Michalak, 1991). Die hohe Homologie des Calreticulins inerhalb der verschiedenen Spezies deutet auf die Wichtigkeit der phylogenetischen Konservation hin. Die Homologie zum RAL-I-Antigen des Nematoden Oncocera volvulus (Unnasch et al., 1988) im Bereich der Prolin-reichen, repetitiven Sequenzen deutet unter Umständen auf den funktionellen Teil des Proteins hin. Auf die beim Eintritt in das ER abgespaltene Signalsequenz wurde bereits oben eingegangen. Sie besteht zum überwiegenden Teil (82%) aus hydrophoben Aminosäuren. 68 Am C-terminalen Ende des Calreticulins findet sich das Tetrapeptid KDEL. Dieses Sequenzmotiv hat das Calreticulin mit vielen löslichen, luminalen Proteinen des ER gemeinsam. Es wird als eine der Erkennungssequenzen betrachtet, die für die Retention des Calreticulins im ER verantwortlich sind (Munro and Pelham, 1987). Natives Calreticulin liegt als Monomer vor (Waisman et al., 1985). Die Aminosäuren 88, 120 und 146 sind Cysteine, die eine interne Disulfidbrückenbindung ermöglichen könnten. Nachgewiesen wurde eine Disulfidbrücke zwischen Cys120 und Cys146 im Calreticulin aus Rind von Matsuoka et al. (1994). Ungeklärt ist bislang noch, ob die putative Kernsignalsequenz PPKKIKDPD (Aminosäuren 186-195) für den Transport des Calreticulins in den Kern verantwortlich ist, wo es unter bestimmten Bedingungen nachgewiesen wurde (Opas et al., 1991). 5.3.2. Glycosylierungsstellen Wie schon zuvor berichtet, liegt Calreticulin aus Rind glycosyliert vor. Als mögliche Glycosylierungsstellen wurde die cDNA nach der Konsensussequenz für N-verknüpfte Oligosaccharidbindungsstellen N-X-S/T abgesucht. Dabei ergaben sich Asn162 und Asn327 als potentielle Glycosylierungsstellen. Während das Calreticulin der Ratte nur über die eine Glycosylierungsstelle Asn327 verfügt und dort mit einer Oligosaccharidseitenkette des komplexen Hybridtyps mit terminaler Galactose verknüpft sein soll (Nguyen Van et al., 1989; Peter et al., 1992), konnten Matsuoka et al. (1994) durch Edman-Abbau zeigen, daß das Calreticulin aus Rind an der Aminosäure Asn162 glycosyliert ist. Sie konnten ebenfalls zeigen, daß Mannose der einzige neutrale Zucker der Oligosaccharidseitenkette des Calreticulins ist. Da alle hydroxyl-haltigen Aminosäuren beim Edman-Abbau frei zugänglich waren, ist eine Oglycosidische Verknüpfung der Zuckerseitenkette unwahrscheinlich. Durch Massenspektroskopie des Rinder- Calreticulins konnten Matsuoka et al. (1994) eine Kohlenhydratzusammensetzung von GlcNac2Man4 -9 (GlcNac = N-acetylglucosamin; Man = Mannose) ermitteln, wobei GlcNac2Man5 in ihrer Präparation am Häufigsten vorlag. 69 5.3.3. Homologie zu anderen Proteinen Eine Homologiesuche in einer Proteinsequenz-Datenbank (PIR) ergab eine hohe Übereinstimmung mit einem anderen ER-Protein, dem Calnexin. Beiden Proteinen waren die prolinreichen, repetitiven Sequenz gemein, jedoch unterschieden sie sich in der zweiten Hälfte der N-Domäne. Dort liegen die hydrophoben Aminosäuren des Calnexins, mit denen es die Membran des ER durchdringt (Helenius et al., 1994). Weitere hohe Übereinstimmungen fanden sich bei den sauren Clustern im C-terminalen Bereich beider Proteine, nur die KDELSequenz fehlte dem Calnexin. Aufgrund dieser Übereinstimmungen könnte die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, daß Calreticulin das lösliche Analogon zum membrangebundenen Calnexin darstellt. Calnexin bindet lectinähnlich die noch nicht fertig prozessierten Oligosaccharidseitenketten der sich faltenden, neusynthetisierten Peptide und ist als Chaperon an der Reifung der Proteine beteiligt. Ob Calreticulin neben seiner Fähigkeit zur Ca2+Bindung eine ähnlich Funktion wie Calnexin erfüllt oder einen Komplex mit ihm oder anderen Chaperons eingeht, ist in Zukunft zu untersuchen. Da im ER ein komplexes System zur Kontrolle der Reifung von Glycoproteinen erforderlich ist, wäre für das Calreticulin eine Calnexin- ähnliche Funktion durchaus denkbar. Während das Calreticulin aus Ratte evtl. terminal galactosyliert vorliegt (Nguyen Van et al., 1989), also zu irgendeinem Zeitpunkt der Reifung zum Golgi-Apparat und zurück transportiert worden sein muß, läßt sich dieses für das Calreticulin aus Rind nicht postulieren. Die Prozessierung der ”high-mannose” Struktur, das ”trimming”, kann im ER durch die Glucosyltransferase I + II und die -Mannosidase I erfolgen. Ob sich dann im Western- Blot, nach erfolgter Überexpression, für das Calreticulin aus Rind wie bei dem Calreticulin aus Ratte zwei Banden zeigen werden, bleibt abzuwarten. Denn diese Doppelbande im Blot wird unter anderem auf die verschiedene Prozessierung der Oligosaccharidseitenkette bei der Ratte zurückgeführt. Außerdem muß berücksichtigt werden, daß der Antikörper gegen Calreticulin aus Ratte ca. 5- 10x schlechter mit dem Calreticulin aus Rind reagiert. Da es sich jedoch um einen polyklonalen Antikörper handelt und die Aminosäuresequenz zwischen Rind und Ratte sehr hohe Homologie aufweist, ist die Wahrscheinlichkeit hoch, daß sich dieser Antikörper für einen Nachweis im Western- Blot eignet. 70 6. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde die cDNA für Calreticulin aus Rinderleber kloniert und sequenziert. Aus dieser Sequenz wurde die Primärstruktur des Proteins abgeleitet und mit den bereits bekannten Sequenzen für Calreticulin anderer Spezies verglichen. Von besonderen Intersse ist der Unterschied in der Struktur der Oligosaccharidseitenkette zwischen Rind und Ratte, die , soweit bekannt, die einzigen Spezies sind, bei denen Calreticulin ein Glycoprotein ist. Da sich die Zuckerseitenketten von Rind und Ratte unterscheiden, sollte diesen beiden Proteinen auch ein unterschiedlicher Prozessierungs- und Reifungsprozess vorangehen, der auch unterschiedliche innerzelluläre Transportwege beschreitet. Während das Protein der Ratte dazu in den trans-Golgi-Apparat und zurück transportiert werden muß, braucht das Calreticulin im Rind dies nicht zwangsläufig zu tun. Alle bekannten Calreticuline verfügen über die KDEL-Sequenz im C- Terminus, die für den Rücktransport des aus dem ER entwichenen Proteins verantwortlich ist. Aus einer -ZAP II cDNA Bank wurde ein Teilklon mit Hilfe einer cDNA Sonde isoliert. Er beinhaltet die Basen 170 bis 1874 (Poly-A-Schwanz)und codiert damit für einen Großteil des Proteins. Es fehlten allerdings ca. 170 bp des N-terminalen Bereiches. Das fehlende Nterminale Fragment wurde mittels Reverser PCR aus Rinderleber- RNA gewonnen und beide Fragment über eine interne Eco R I-Schnittstelle miteinander ligiert. Der komplette Klon, der auch den nichttranslatierten Bereich bis zum Poly-A Schwanz beinhaltete, wurde in den Vektor M 13 subkloniert und sequenziert. Der Klon wurde ebenfalls in pCMV 2 subkloniert und so für eine dieser Arbeit anschließende Überexpression in COS-Säugerzellen vorbereitet. Der Vergleich der Aminosäuresequenz des Calreticulins zwischen Rind und Ratte zeigte eine zusätzliche Konsensussequenz für ein Glycosylierungsstelle beim Rind in Position Asn 327. Diese zusätzliche Glycosylierungsstelle könnte, wenn sie genutzt wird, den Unterschied in der Glycosylierung zwischen Ratte (evtl. komplexer Typ mit terminaler Galaktose) und Rind (im wesentlichen ”high-mannose” Typ) erklären. Das Protein ist zu über 92 % homolog zum entsprechenden Rattenprotein. Damit wird die hohe Konservierung des Calreticulins innerhalb verschiedener Spezies bestätigt. 71 7. Literatur Andres, D. A., Dickerson, I. M. and Dixon, J. E. (1990). Variants of the carboxyl-terminal KDEL sequence direct intracellular retention. J. Biol. Chem. 265, 5952-5955. Baksh, S. and Michalak, M. (1991). Expression of calreticulin in Escherichia coli and identification of its Ca2+ binding domains. J. Biol. Chem. 266, 21458-21465. Birnstiel, M. L., Busslinger, M., Strub, K. (1985). Transcription Termination and 3’ Processing: The End is in Site! Burns, K., Duggan, B., Atkinson, E. A., Famulski, K. S., Nemer, M., Bleackley, R. C. and Michalak, M. (1994). Modulation of gene expression by calreticulin binding to the glucocorticoid receptor. Nature 367, 476-480. Burns, K., Helgason, C. D., Bleackley, R. C. and Michalak, M. (1992). Calreticulin in Tlymphocytes and demonstraion that activation of T cells correlates with increased levels of calreticulin mRNA and protein. J. Biol. 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