Biochemische Identifizierung von Enterobacteriaceae
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1 Praktikum der Medizinischen Mikrobiologie und Immunologie Praktikumsteil Bakteriologie und Mykologie Sommersemester 2008 2 Kursbedingungen Die Bescheinigung über die regelmäßige und erfolgreiche Teilnahme am Praktikum der Mikrobiologie und Immunologie erhalten Sie, wenn die folgenden Bedingungen erfüllt sind: Regelmäßige Teilnahme: Erforderlich ist die Teilnahme an allen Kurstagen. Nur bei triftigen Gründen für die Verhinderung (etwa Krankheit) dürfen höchstens zwei Kurstage versäumt werden. Der nachträglich erarbeitete Stoff jeder versäumten Kursstunde ist im Protokoll festzuhalten. Eine schriftliche Entschuldigung ist Frau Moser vorzulegen. Erfolgreiche Teilnahme: Protokollheft: Sie sollen ein gebundenes Protokollheft A4 täglich führen. Für die Bakteriologie, Mykologie, Virologie und für die Parasitologie. Das Protokollheft muss jeweils enthalten: 1. Aufgabennummer und Datum 2. Ergebnis, Aufgabenlösung, farbige Originalzeichnung des mikroskopierten Präparates. 3. Kurze Diskussion des Versuchs und des Ergebnisses 4. Kurze Erläuterung zu den angewandten Nährmedien und Untersuchungsmethoden. Das Protokollheft muss handschriftlich erstellt werden; es ist der/dem DozentIN in der praktisch/mündlichen Prüfung vorzulegen. Praktisch/mündliche Prüfung: In der praktisch/mündlichen Prüfung werden Sie in Gruppen eingeteilt und einem Prüfungsplatz (römische Ziffer) mit 2 Prüfern zugeteilt. Bei nicht bestandener praktisch/mündlicher Prüfung können Sie später an der mündlichen Wiederholungsprüfung teilnehmen. Sie sind automatisch angemeldet, sollten Sie nicht teilnehmen wollen, ist eine Abmeldung erforderlich. Klausur-Teil IMMIP: 20 Fragen werden aus dem IMMIP gestellt. Die Antworten der IMMIP-Fragen bitte auf dem Lösungsblatt in der Klausur eintragen (Letzte Seite). Sie haben 20 Minuten Zeit zur Lösung der Fragen. Klausur-Teil Virologie: Infos durch das Institut für Virologie 3 Vorsichtsmaßnahmen zur Vermeidung von Infektionen Im Kurssaal liegen die Unfallverhütungsvorschriften der Berufsgenossenschaft aus. Bitte lesen und beachten Sie diese Vorschriften! Im folgenden finden Sie eine Aufzählung von Punkten, die wir Ihnen besonders ans Herz legen möchten: Im Kurssaal tragen Sie bitte stets einen weißen Schutzkittel. Diesen Laborkittel dürfen Sie nicht in anderen Instituten oder Kliniken verwenden. Wir empfehlen Ihnen, den Laborkittel während des Semesters im Kurssaal (in dem Fach neben Ihrem Arbeitsplatz) zu belassen. Nach Beendigung des Kurses müssen Sie den Laborkittel auskochen; am besten mit dem Kochwaschgang in der Waschmaschine. Essen, Trinken, Rauchen und Kaugummikauen sind im Kurssaal verboten! Bitte vermeiden Sie es, Mund oder Augen mit den Fingern zu berühren. Pipetten sind grundsätzlich nur mit einer Pipettierhilfe zu verwenden. Es darf keinesfalls mit dem Mund pipettiert werden! Nehmen Sie bitte keine Schreibstifte in den Mund! Vermeiden Sie es, das Kursmanuskript oder Ihr Protokollheft mit infektiösem Material zu kontaminieren! Nach Beendigung der Kursstunde (und ggf. unverzüglich nach Kontamination der Finger mit infektiösem Material) führen Sie eine Händedesinfektion mit dem am tafelfernen Ende des Kurssaals in Dosierspendern vorhandenen Desinfektionsmittel durch. Erst nach einminütigem Ineinanderreiben der mit Desinfektionsmittel reichlich benetzten Hände waschen Sie dieselben mit Wasser und Seifenlösung. Melden Sie jedes Verschütten oder Verspritzen infektiösen Materials einem Kursassistenten! Sollte Ihnen infektiöses Material in den Mund gelangen, schlucken Sie es bitte nicht hinunter, sondern spucken Sie es in das nächste Abwurfglas aus. Melden Sie sich danach unverzüglich bei einem Kursassistenten. Verletzungen während des Kurses melden Sie bitte unverzüglich einem der Kursassistenten. Bitte lassen Sie Kulturgefäße nicht offen stehen. Halten Sie Kulturschalen und –röhrchen stets nur an den Außenflächen fest, ohne die Ränder zu berühren. Glühen Sie Impfösen und –nadeln vor und nach Gebrauch vorsichtig aus (anhaftendes Material darf nicht verspritzen!). Bedenken Sie bitte, daß die Öse vor Kontakt mit Mikroorganismen abgekühlt sein muß, wenn die Kleinstlebewesen den Kontakt überleben sollen. Stellen Sie Impfnadel und –öse bitte nach Gebrauch in den dafür vorgesehenen Ständer. 4 Ausrüstung des Arbeitsplatzes Jeder Kursteilnehmer erhält zum eigenen Gebrauch: 1 auf dem Arbeitsplatz: 1.1 ein Mikroskop mit Zubehör: 3 Objektive (10:1, 45:1, 100:1 Ölimmersion) 1 Binokular (10 ) 1.2 eine Impföse mit Halter 1.3 eine Impfnadel mit Halter 1.4 eine Färbepinzette 1.5 zu zweit: ein Fläschchen mit Immersionsöl 1.6 ein Gefäß mit Vaseline und Glasstab 1.7 ein Gefäß mit Desinfektionslösung zur Entsorgung gebrauchter Objektträger von selbst angefertigten Präparaten 1.8 Farblösungen 1.9 zu dritt: Toilettenpapier nur zur Reinigung der Fertigpräparate. 2 in dem zu jedem 2.Kursplatz gehörigen Schubfach: 2.1 Streichhölzer 2.2 einen Filzschreiber 2.3 ein Fließpapierblöckchen zum Trocknen gefärbter Objektträger 2.4 je ein Kästchen mit Objektträgern 2.5 Deckgläschen 2.6 eine Pipettierhilfe 2.7 in Alufolie verpackte Transferpipetten 2.8 im Umschlag Reinigungpapier nur für das Objektiv (Ölimmersions) 1:100 Anleitung für das Mikroskop Laborkittel bitte in einer Plastiktüte in der Garderobe aufbewahren. Garderobe in der Garderobe aufhängen und nicht mit in den Kurssaal nehmen. (Ausnahme: Klausurtag!) Sie erhalten die aufgeführten Gerätschaften in einwandfreiem und gebrauchsfähigem Zustand. Bitte gehen Sie sorgsam damit um, damit auch Ihre Nachfolger in diesem Kurs eine intakte Ausstattung vorfinden können. Bitte melden Sie ggf. Beschädigungen oder Verluste unverzüglich den Institutsmitarbeitern. 5 Arbeitshinweise und Verhaltensmaßregeln 1 Die Gaszufuhr für die Gasbrenner ist neu geregelt, bitte Anweisung der Kursleitung beachten. 2 Die Flamme des Bunsenbrenners ist bei Gebrauch zu entleuchten (Luftzufuhr aufdrehen). 3 Die Objektive und das Okular der Mikroskope sollen nach jeder Kursstunde von Ihnen gereinigt werden. Bitte benutzen Sie dazu das bereitliegende Spezialreinigungspapaier. 4 Der Schalter für die Mikroskopbeleuchtung befindet sich hinten unten am Stativfuß. Wenn Sie nicht (mehr) mikroskopieren und das Gerät gereinigt ist, decken Sie die Mikroskope ab. 5 Vorsicht beim Umgang mit Färbelösungen! Farbflecken auf Kleidungsstücken lassen sich meist nicht vollständig entfernen. Für evtl. auftretende Schäden wird seitens des Instituts nicht gehaftet! Sollte ein Farbfleck auf den Tisch kommen, bitte sofort mit Alkohol entfernen, da sonst Flecken zurückbleiben. 6 Alle selbst gefärbten oder selbst angefertigten Präparate werfen Sie bitte in die kleinen, zylindrischen, desinfektionsmittelgefüllten Abwurfgläser. 7 Ausgeteilte gefärbte Kurspräparate werden wieder eingesammelt. Bitte reinigen Sie diese so mit Toilettenpapier, dass die Präparate voll auf dem Tisch und nicht in der Hand liegen (Bruchgefahr in der Mitte). Papier, Streichhölzer, Filterpapierstreifen und andere feste, nicht infektiöse Abfälle werfen Sie bitte in die bereitstehenden flachen Abfallschalen, nicht in die Färbebecken oder die Abwurfgläser! 6 Herstellung von Präparaten für die Lichtmikroskopie Anfertigung eines Trockenpräparates zur Gramfärbung 1 Geben Sie mit der Öse auf die Mitte eines Objektträgers ein sehr kleines (!) Wassertröpfchen, in das eine Öse voll Kulturmaterial eingerieben wird. Streichen Sie das Tröpfchen zu einer dünnen, breiten Schicht (etwa 2x fingernagelgroß) aus (Bakterienaufschwemmungen oder flüssige Kulturen werden direkt auf dem Objektträger ausgestrichen). 2 Lassen Sie das Präparat völlig lufttrocknen (dabei nicht erwärmen!). 3 Präparat fixieren: Ziehen Sie den Objektträger mit der Schichtseite nach oben dreimal durch die volle Flamme des Bunsenbrenners. 4 Präparat färben: 5 Präparat trocknen: Legen Sie das Präparat zwischen die Blätter des Fließpapierblöckchens und streichen Sie vorsichtig darüber. (nicht wischen!); lassen Sie es anschließend an der Luft vollständig trocknen. Anfertigung eines „Hängenden Tropfens“ (ungefärbtes Nativpräparat) 1 Umranden Sie die Aushöhlung eines hohlgeschliffenen Objektträgers mit wenig Vaseline. 2 Legen Sie ein Deckglas auf das schwarze Holzböckchen. 3 Geben Sie mit einer Impföse ein kleines Tröpfchen der zu untersuchenden Suspension von Mikroorganismen (z.B. Bouillonkultur) auf die Mitte des Deckglases. 4 Legen Sie den vorbereiteten Objektträger mit der Aushöhlung nach unten auf das materialbeschickte Deckglas. 5 Drehen Sie den Objektträger um, so daß das Deckglas oben liegt. Das zu untersuchende Tröpfchen sollte nun frei in der durch Hohlschliff und Deckglas gebildeten, luftdicht mit Vaseline abgeschlossenen feuchten Kammer hängen. Falls dies nicht erreicht wurde, wiederholen Sie bitte die Schritte 1 bis 5 mit frischen Materialien. 6 Mikroskopieren Sie das Präparat. Stellen Sie dazu zunächst den Rand des Tropfens erst mit der schwachen, dann mit der mittleren Vergrößerung scharf. Erhöhen Sie durch Abblenden die Schärfentiefe des mikroskopischen Bildes! Heben Sie den Tubus, geben Sie dann einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckgläschen. Stellen Sie das Ölimmersionsobjektiv ein (vorsichtig scharfstellen!). Das Deckglas darf nicht springen (das Präparat würde sonst unbrauchbar, außerdem bestünde u.U. auch Infektionsgefahr)!. 7 Bakteriologische Färbeverfahren Färbung nach Gram 1 Präparat als Trockenpräparat vorbereiten, lufttrocknen, fixieren. 2 Legen Sie das Präparat auf die Färbebank. 3 Bedecken Sie das Präparat vollständig mit Karbol–Gentianaviolettlösung; lassen Sie die Farblösung 2 Min. lang einwirken. 4 Spülen Sie den Farbstoff unter Anheben des Präparates mit LUGOLscher Lösung (Jodjodkaliumlösung) kurz ab, tropfen Sie etwas Lösung nach und lassen Sie erneut 2 Minuten einwirken; (auf der Färbebank) 5 Gießen Sie die LUGOLsche Lösung ab. 6 Entfärben Sie mit 96 %igem Alkohol, bis keine Farbwolken mehr abgehen (nur kurz abspülen, dann den Entfärbevorgang auf der Färbebank beobachten; ca. ½ bis 1 Minute je nach Schichtdicke des Präparates). 7 Spülen Sie sofort mit reichlich Wasser ab, bis keine Schlierenbildung mehr zu sehen ist. 8 Bedecken Sie das Präparat vollständig für die Gegenfärbung mit Safraninlösung und lassen Sie diese ungefähr eine halbe Minute einwirken. 9 Spülen Sie das Präparat mit Wasser kurz ab; trocknen Sie es zwischen den Blättern Ihres Fließpapierblöckchens. Lassen Sie das Präparat an der Luft vollständig trocknen. 10 Stellen Sie das Präparat mit dem Immersionsobjektiv ein (Immersionsöl nicht vergessen; es wird direkt auf das Präparat getropft). Beachte: Die Entfärbezeit (Schritt 6) ist abhängig von Material und Schichtdicke. Eiterpräparate benötigen längere Zeit als Präparate von Reinkulturen. In Eiterpräparaten sollen sich die Kerne der Leukozyten rot–violett, ihr Zytoplasma blaß–rosa darstellen. Polkörnchenfärbung nach Neisser 1 Das Präparat liegt als Trockenpräparat vor, legen Sie es auf die Färbebank. 2 Bedecken Sie das Präparat mit Farblösung NEISSER I (Mischung aus essigsaurer Methylenblau– und alkoholischer Kristallviolettlösung) und lassen Sie diese 5 s lang einwirken. 3 Gießen Sie die Farblösung ab (nicht mit Wasser abspülen) und färben Sie 10 s lang mit Farblösung NEISSER II (Chrysoidinlösung) nach. 4 Gießen Sie die Farblösung ab (nicht mit Wasser abspülen). 5 Trocknen Sie das Präparat zwischen den Blättern Ihres Fließpapierblöckchens. 6 Mikroskopieren Sie mit dem Immersionsobjektiv. 8 Färbung nach Ziehl–Neelsen 1 Das Präparat liegt als Trockenpräparat vor; legen Sie es auf die Färbebank. 2 Bedecken Sie das Präparat vollständig mit Karbolfuchsinlösung. 3 Erhitzen Sie das Präparat dreimal mit dem Bunsenbrenner von unten (mit „Fleischerhaken“–Aufsatz) bis zur Dampfbildung (nicht kochen!). Die Färbelösung darf dabei nicht eintrocknen. 4 Entfernen Sie den „Fleischerhaken“–Aufsatz vom Brenner; das Präparat 2–3 Min. lang abkühlen lassen. 5 Entfärben Sie mit Salzsäurealkohol (3% HCl) kräftig, bis keine Farbwolken mehr abgehen (1 Min.). VORSICHT: Achten Sie darauf, daß der Alkohol nicht in die Nähe der offenen Flamme kommt! 6 Spülen Sie gut mit Wasser ab. 7 Färben Sie 30 s lang mit Methylenblau (Gegenfärbung). 8 Spülen Sie kurz mit Wasser ab. 9 Trocknen Sie das Präparat zwischen den Blättern Ihres Fließpapierblöckchens. 10 Mikroskopieren Sie mit dem Immersionsobjektiv (Immersionsöl nicht vergessen!). Das 1:100 Objektiv muss nur am Ende der Kursstunde mit dem Speziallinsenpapier im Umschlag (Schublade) gereinigt werden. 9 Gebrauchsanleitung für das Mikroskop Da die in der Mikrobiologie zu untersuchenden Objekte (Bakterien, Pilze, Parasiten) in der Regel sehr klein sind, muß für die mikroskopische Untersuchung ein gutes Gerät zur Verfügung stehen. Weiterhin muß darauf geachtet werden, daß durch eine sachgemäße Einstellung und saubere Objekte und Okulare garantiert ist, daß das Mikroskop wirklich die bestmögliche Leistung erbringt. Die Köhlersche Beleuchtung ist eine Grundvoraussetzung für die Leistungsfähigkeit des Mikroskops. Sie dient dazu, die verschiedenen optischen Ebenen des Mikroskops in eine Beziehung zu bringen, die physikalisch gesehen, eine möglichst gute Bildentstehung gewährleistet. Einmal eingestellt, sollte die Köhlersche Beleuchtung nicht mehr verändert werden. Gelegentlich sollte kontrolliert werden, ob das System nicht versehentlich verstellt wurde. Einstellung der Köhlerschen Beleuchtung Bezugsebene ist das Präparat. Ohne Präparat kann die Einstellung nicht vorgenommen werden. 1 Schalten Sie die Mikroskopbeleuchtung ein. 2 Legen Sie ein Präparat auf den Objekttisch 3 Öffnen Sie sowohl die Aperturblende im Kondensor wie auch die Leuchtfeldblende im Stativfuß. Die Frontlinse des Kondensors muß sich im Strahlengang befinden. 4 Bringen Sie das 10er Objektiv in den Strahlengang und stellen Sie mit Hilfe des Fokusiertriebes das Präparat scharf ein. 5 Schließen Sie die Leuchtfeldblende (Stativfuß). 6 Heben Sie den Kondensor langsam, während Sie das Gesichtsfeld im Mikroskop beobachten. Es kommt dann ein Punkt, wo Sie das Bild der Leuchtfeldblende (Sechseck) scharf im Präparat abgebildet sehen. Ist das Mikroskop völlig dezentriert, wandert das Beleuchtungsfeld seitlich aus dem Gesichtsfeld heraus. 7 Mit Hilfe der beiden symetrisch angebrachten Zentrierschrauben am Kondensor können Sie das Beleuchtungsfeld wieder in die Mitte des Gesichtsfelds holen und die Fokussierung der Leuchtfeldblende durch Höher- und Tieferstellen des Kondensors vervollständigen. Der Endzustand sollte sein, daß Sie das mikroskopische Objekt scharf sehen und gleichzeitg das kleine Sechseck der Leuchtfeldblende scharf in der Mitte des Gesichtsfeldes 8 Nun öffnen Sie, während Sie das Gesichtsfeld des Mikroskops beobachten, die Leuchtfeldblende so weit,daß das Gesichtsfeld völlig ausgeleuchtet ist. Damit ist die Köhlersche Beleuchtung eingestellt. Sie sollte nicht geändert, sondern nur gelegentlich überprüft werden. Die Aperturblende im Kondensor dient ausschließlich der Regulierung des Kontrastes, d.h. bei gut gefärbten Präparaten sollte diese Blende nur wenig zugezogen werden, da hoher Kontrast zwangsläufig mit einer Verminderung der Auflösungsfähigkeit einhergeht. Für die meisten Fälle kann man die richtige Einstellung der Aperturblende dadurch finden, daß man das Gesichtsfeld bei geöffneter Blende beobachtet, dann langsam die Blende schließt bis zu dem Punkt, wo eine geringfügige Abnahme der Helligkeit im Gesichtsfeld zu beobachten ist. 10 Aufgabe 1: Gramfärbung und Mikroskopie: Sie finden an Ihrem Arbeitsplatz ein zur Gramfärbung vorbereitetes, hitzefixiertes Präparat, welches Granulozyten, Erythrozyten, Sproßpilze, gramnegative Stäbchenbakterien und grampositive Kokken enthält. Bitte führen Sie die Gramfärbung durch und zeichnen Sie den mikroskopischen Befund (mit Beschriftung). Aufgabe 2: Beschriften Sie die Columbiablutagarplatte auf Ihrem Tisch mit Ihrer Platz-Nr. und dem Aufstellungsort (Fenster/ oder Tisch), stellen Sie die Platten dort auf und öffnen Sie die Deckel; 1 Stunde offen stehen lassen; dann zur Mitte des Ganges geben, sie werden von der Kursassistentin eingesammelt und bei 37 Grad bebrütet Aufgabe 3 Anlegen eines fraktionierten Ausstriches auf Columbiablutagar; bitte mit frakt. Ausstrich, Platz-Nr .und Kurs beschriften. Sie finden an Ihrem Arbeitsplatz ein Röhrchen mit einer Bouillonkultur von Escherichia coli bzw.E.coli und S.epidermidis Glühen Sie eine Impföse in der Brennerflamme aus und lassen Sie die Öse abkühlen. Nehmen Sie eine Öse Bouillonflüssigkeit und verteilen Sie das Material auf dem ersten Drittel der Nähragarplatte, indem Sie die Öse leicht, fast ohne Druck zickzackförmig auf der Agaroberfläche hin– und herbewegen.(Halten Sie die Agarplatte während dieses Arbeitsgangs in der Hand.) Glühen Sie die Öse aus. Ziehen Sie eine sterile (abgekühlte!) Öse einmal durch das erste, beimpfte Drittel der Agaroberfläche und verteilen Sie die dabei aufgenommenen Bakterien in entsprechender Weise auf dem zweiten Drittel der Agarplatte, ohne nochmals mit der Öse in das erste Drittel hineinzugelangen. Mit einer sterilen Öse wiederholen Sie den eben durchgeführten Schritt, wobei Sie nun jedoch einmal durch das zweite Drittel der Agaroberfläche hindurchstreichen, bevor Sie mit der Öse zickzackförmig das letzte Agaroberflächendrittel beimpfen Ist die Columbiablutagarplatte nach dem beschriebenen Verfahren beimpft („klassischer Drei–Ösen–Ausstrich“), lassen sich Einzelkolonien erzielen. Platten bitte zum Mittelgang geben, damit sie eingesammelt und bei 37 Grad inkubiert werden können. 11 Aufgabe 4: Sterilisatoren–Prüfung Material: 1 Sporenteststreifen in Papierhülle 1 Röhrchen mit Traubenzucker–Bouillon Geben Sie den Sporenteststreifen mit einer abgeflammten Pinzette in das Bouillonröhrchen. Falls die Sporen nicht abgetötet wurden, wachsen sie aus. Das Bakterienwachstum wird durch Trübung und Säurebildung (Gelbfärbung des Indikators Bromkresolpurpur) angezeigt. Aufgabe 5: Wäschedesinfektions-Keimträgerversuch wird nur demonstriert und abgelesen In diesem Versuch wird der Einflußfaktor „Einwirkungsdauer“ eines phenolischen Desinfektionsmittels untersucht. Material: Der Versuch wird zu zweit, zu dritt oder als Demonstration durchgeführt. 4 Stückchen Baumwollstoff kontaminiert mit Escherichia coli in einer Kulturschale 1 Gefäß mit Tween–80–Lösung 1% in Aqua dest. 4 Röhrchen mit Bouillon 1 Gefäß mit 2%iger Sagrotanlösung (=Mischung aus Phenolen) 4 leere kleine Kulturschalen Beschriften Sie die vier kleinen Kulturschalen sowie die vier Bouillon–Röhrchen mit „1/2 Min“, „1 Min“, „5 Min“ bzw. „10 Min“. Verteilen Sie die 1%ige Tween–80–Lösung gleichmäßig auf die vier kleinen Kulturschalen. Geben Sie die 2%ige Sagrotanlösung in die Kulturschale mit den vier mit Bakterien kontaminierten Stückchen Baumwollstoff. Entnehmen Sie nach 1/2 min 1 min 5 min 10 min je einen der kontaminierten Keimträger. . Spülen Sie jeweils unverzüglich von jedem entnommenen Baumwollstoffstückchen die anhaftende Sagrotanlösung in einem entsprechend beschrifteten Kulturschälchen mit 1%iger Tween–80–Lösung ab. Geben Sie jeden Keimträger in ein Bouillonröhrchen, das mit der Einwirkungsdauer des Sagrotans beschriftet ist. Der Keimträger muß in der Bouillon schwimmen; um das zu erreichen, schieben Sie jenen mit einer sterilen Impföse in die Bouillon hinunter. Die Bouillon–Röhrchen werden eingesammelt und mindestens 24 h lang bei 37C bebrütet. Versuchsbewertung: Protokollieren Sie bitte, welche Einwirkungszeit unter den gegebenen Versuchsbedingungen erforderlich war, um die Bakterien auf den Keimträgern abzutöten. 12 Aufgabe 6: Fingerdesinfektionsversuch Pro cm² Haut sind normalerweise ca. 10 000 Bakterien zu finden. Durch 70%igen Isopropylalkohol kann die Keimzahl nachhaltig reduziert werden. Material: 1 Schale mit 70%igem Isopropyl–Alkohol 1 Blutagarplatte Teilen Sie die Kulturschale mit dem Blutagar auf der Außenseite des Plattenbodens durch einen Strich in zwei Hälften und kennzeichnen Sie eine Hälfte mit vorher, die andere mit nachher. Schreiben Sie außerdem Ihre Platznummer und den Kurs auf den Boden der Agarplatte. Drücken Sie vier Finger einer Hand vorsichtig auf dem Agar ab (verwenden Sie die Hälfte, die mit vorher gekennzeichnet ist). Tauchen Sie die Fingerspitzen derselben Hand 3 Min. lang in Alkohol; (nicht auf dem Boden der Platte absetzen!) Lassen Sie die Finger anschließend an der Luft trocknen. Drücken Sie die Finger erneut auf dem Blutagar ab (andere Hälfte benutzen "nachher“). Die Blutagarplatten bitte zum Mittelgang geben, sie werden mindestens 24 h lang bei 37C bebrütet. Vergleichen Sie Menge und Phänotyp der Kolonien auf dem Blutagar vor und nach dem Einwirken des Alkohols auf die Fingerspitzen. Aufgabe 7: Identifizierung von Sproßpilzen aufgrund ihrer biochemischen Leistungen („Bunte Reihe“) Material: „Bunte Reihe“ zur Sproßpilz–Differenzierung, bestehend aus Tween–80– Hochschichtagar, Dextrose–, Maltose–, Laktose–, Saccharose–, Galaktose–, Raffinose–Bouillon und Harnstoff–Schrägagar, bewachsene Sabouraud–Platten (nummeriert mit 1, 2, 3 und 4), isotonische Kochsalzlösung. Beimpfung der „Pilz-Bunten Reihe“: Suspendieren Sie mit der abgeflammten Öse eine Kolonie von der auf Ihrem Platz liegenden numerierten Sabouraud–Platte in der NaCl–Lösung. Hiervon ausgehend beimpfen Sie die übrigen Substratröhrchen. Das 1. Röhrchen Tween 80 wird nur mit einem Stich mit der Impfnadel beimpft, nachdem zuvor Material aus der beimpften NaCL entnommen wurde. Die Röhrchen 2-6 (Dextrose bis Raffinose durch Indikator Bromthymolblau grün; bei Zuckerspaltung und Säurebildung später ggf. gelb) werden mit 1-2 Tropfen aus der NaCL mit einer Transferpipette beimpft. Anschließend legen Sie bitte eine Reinheitskontrolle fraktioniert auf Sabouraud- oder Candidaselectagar an. –Vergessen Sie nicht die Beschriftung ! (Platznummer und Stammnummer und Kurs) Die von Ihnen beimpften Substratröhrchen werden eingesammelt und 24– 48 h bei 36 C bebrütet. 13 Aufgabe 7: Ablesen der „Bunten Reihe“: Protokollieren und beurteilen Sie das Ergebnis der von Ihnen angelegten „Bunten Reihe“ zur Sproßpilz–Differenzierung unter Angabe der Stammnummer nach folgendem Differenzierungsschema: Tween 80 Dextrose Maltose Laktose Saccharose Galaktose Raffinose Harnstoff C. albicans Psm /+ + + C. tropicalis Psm +/ + + +H / C.(T.) glabrata C. krusei (-) Psm Teststamm + = Wachstum unter Säurebildung1, = Wachstum unter Gas– und Säurebildung2, = kein Wachstum, Psm = Pseudomycel, H = Häutchenbildung, 1 2 Säurebildung: Farbumschlag von grün nach gelb. Gasbildung: Gasblasen im Gärröhrchen 14 Aufgabe 8: Bouillonverdünnungstest zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Gentamicin -Test liegt zur Auswertung vor- Material 3 ml Isosensitest–Bouillon mit Gentamicin in einer Konzentration von 32 mg/l 1 Röhrchen à 6 ml Suspension von Escherichia coli (105 koloniebildende Einheiten/ml) und 1 Röhrchen à 6 ml Suspension von Enterococcus faecalis (105 koloniebildende Einheiten/ml) 1 Mikrotiterplatte mit 2 Reihen und 12 Vertiefungen 1 Röhrchen mit 6 ml Isosensitest–Bouillon Pipettenspitzen gelb Pipette Pipettieren Sie in jede Vertiefung der Reihen 1 und 2 je 0,1 ml Isosensitest– Bouillon hinein . Geben Sie nur in die erste Vertiefung der Reihen 1 und 2 0,1 ml der Gentamicin–haltigen Isosensitest–Bouillon. Mischen Sie, indem Sie die Lösung mit der Pipette aufziehen und wieder ablassen. Überführen Sie aus der 1. Vertiefung 0,1 ml in die zweite und mischen Sie erneut gut durch. Überführen Sie aus der zweiten 0,1 ml in die dritteVertiefung. Verfahren Sie – ausgehend von der dritten Vertiefung– entsprechend weiter, bis Sie in der elften Vertiefung eine Verdünnungsreihe (Verdünnungsfaktor: 2) der Gentamicinlösung hergestellt haben Die 0,1 ml aus der elften Verdünnung verwerfen Sie bitte in die Desinfektionslösung. Die 12. Vertiefung bleibt Gentamicin frei und dient als Wachstumskontrolle. Geben Sie nun bitte in jede der 12 Vertiefungen jeweils 0,1 ml der Suspension der Bakterien, deren MHK bestimmt werden soll. (Escherichia coli in Reihe 1 und Enterokokken in Reihe 2. Kleben Sie die Folie auf. Legen Sie die MHK-Mikrotiterplatte auf das Tablett, welches durchgereicht wird. Es erfolgt eine Inkubation von 16 bis 18 Stunden bei 37 Grad. Protokollieren Sie Ihre Ergebnisse; beurteilen Sie anhand der bei reichlicher Bakterienvermehrung entstandenen Trübung und der von Ihnen zu errechnenden Gentamicinkonzentrationen in den Vertiefungen die minimale Hemmkonzentration von Gentamicin gegenüber den untersuchten Bakterien 15 Aufgabe 9: Agardiffusionstest Material: 1 Mueller–Hinton–Agarplatte Dispenser am Pult beschickt mit folgenden Testplättchen 1 Nitrofurantoin 2 Ciprofloxacin 3 Oxacillin 4 Ampicillin 5 Sulbactam + Ampicillin oder Amoxicillin + Clavulansäure 6 Cephalothin 7 Gentamicin 8 Sulphamethoxazol/Trimethoprim An jedem Platz finden Sie eine Nähragarplatte mit einem der zu untersuchenden Bakterienstämmen: Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa 1 Röhrchen mit je 2 ml steriler isotonischer Kochsalzlösung. 1 steriler Wattetupfer (im 2er Päckchen ; auch für Aufgabe 10) Geben Sie eine Kolonie mit einer sterilen Öse oder mit dem Wattetupfer (nur bei Reinkulturen) in das Röhrchen mit Kochsalzlösung. Suspendieren Sie die Bakterien in der Kochsalzlösung vorsichtig, indem Sie den sterilen Wattetupfer darin wie einen Quirl hin– und herdrehen. Streichen Sie die Bakteriensuspension auf der beschrifteten Mueller–Hinton–Agarplatte (Platz–Nr., zu untersuchender Bakterienstamm und Kurs) mit dem sterilen Wattetupfer gleichmäßig aus: Gehen Sie nun zum Pult und bedienen den Dispenser. Einmal kräftig drücken und die Antibiotikaplättchen fallen auf Ihre Agarplatte. Die Mueller–Hinton–Agarplatten bitte zum Mittelgang geben, sie werden 1618 h bei 37C inkubiert. Bestimmen und protokollieren Sie die Hemmhofdurchmesser (in mm) und beurteilen Sie die Wirksamkeit der einzelnen Antibiotika. Bitte tauschen Sie dabei die Mueller–Hinton–Agarplatten mit dem Nachbarn aus, so daß jeder die Ergebnisse zu allen angebotenen Bakterienarten protokolliert hat! 16 Auswertungstabelle zur Resistenzbestimmung Resistent <14 <15 <15 <13 (28) <13 (19) Nitrofurantoin (F) (300) Ciprofloxacin (CIP) (5) Oxacillin (OX) (5) Ampicillin *(AMP) (10) A.+Clavulansäure* (AMP) (30) Cephalzolin (KZ) (30) <18 Gentamicin (GN) (10) <16 Cotrimoxazol (SXT) (25) <15 Intermediär 15-16 16-20 -14-21 (-) 14-17 (-) Sensibel >17 >21 >16 >22 (29) >18 (20) 19-23 17-20 16-21 >24 >21 >22 in Klammern: Werte für Staphylococcus aureus 17 Aufgabe10a: Agardiffusionstest mit den Antibiotikaplättchen im Dispenser von Aufgabe 9 und zusätzlich Vancomycin, als einzelnes Plättchen zum Auflegen in der Mitte der Müller-Hintonagarplatte. Material zu zweit: 1 Blutagarplatte mit Staphylococcus–aureus–Stamm: Stamm 1 Staphylococcus–aureus–Stamm: Stamm 2 2 Mueller–Hinton–Agarplatten 2 Röhrchen mit steriler isotonischer Kochsalzlösung 2 sterile Wattetupfer Dispenser mit Antibiotikaplättchen am Pult; ebenso einzelne Vancomycinplättchen. Gerade Platznummern verarbeiten Stamm 1; ungerade Platznummern verarbeiten Stamm 2 Beschriften Sie die Mueller–Hinton–Agarplatten jeweils (auf der Unterseite!) mit der Stamm- Ihrer Platz–Nummer und dem Kurs . Streichen Sie die Suspension gleichmäßig auf eine Mueller–Hinton–Agarplatte aus (Technik siehe Aufgabe 9) Gehen Sie zum Pult, drücken den Dispenser mit den Antibiotikaplättchen auf die Müller-Hintonagarplatte und legen in der Mitte das Vancomycinplättchen mit der Pinzette auf. Die Mueller–Hinton–Agarplatten bitte zum Gang geben, sie werden 18–24 h lang bei 36C bebrütet. Bestimmen und protokollieren Sie die Hemmhofdurchmesser sowie Ihre Beurteilung der Antibiotikaempfindlichkeit der beiden S.–aureus–Stämme (gemeinsam mit dem Nachbarn). Zur Demonstration liegt je ein MRSA-Stamm pro Bankreihe zur Ablesung bereit. MHK im E-Test liegt am Pult zur Demonstration und Ablesung bereit. 18 Aufgabe 10b: Untersuchung der –Laktamasefestigkeit von –Laktam–Antibiotika, –Laktamase–Nachweis bei einem Klebsiella–Stamm Material: a b c d 1 Assay–Platte mit Agar, der Bacillus–subtilis–Sporen enthält. 4 Testblättchen (Penicillin G, Ampicillin, Cephalothin, Cefoxitin). 1 Teststamm von Klebsiella pneumoniae. Beimpfen Sie die Assay–Platte in zwei parallel zueinander verlaufenden Strichen von der Breite einer Öse mit Klebsiella pneumoniae (beachten Sie das folgende Schema). Legen Sie – wie im Schema dargestellt – nahe den Enden der beiden Impfstriche jeweils eines der vier antibiotikahaltigen Testblättchen auf. Die von Ihnen beimpften Agarplatten werden eingesammelt und 18–24 h lang bei 37C inkubiert. Protokollieren und interpretieren Sie das Ergebnis. Klebsiella-pneumoniae-Impfstrich Antibiotika– Testblättchen 19 Aufgabe 11: Durchführung einer mikrobiologischen Liquoruntersuchung Lösen Sie diese Aufgabe bei der kulturellen Untersuchung bitte zu Zweit. Sie finden an jedem 2. Arbeitsplatz: Liquorkulturen auf Columbiablutagar–, Kochblut– und MacConkey–Agar . Technik: fraktionierter Ausstrich Bebrütung: 37 Grad, Kerzenflammentopf (O2 –Reduktion) Beschreiben Sie das Aussehen der Kolonien und eventuelle Nährbodenveränderungen bei den Liquorkulturplatten. 11 b) Fertigen Sie jeder ein Grampräparat an und beurteilen Sie den mikroskopischen Befund. Welche Antibiotika würden Sie bei einer eitrigen Meningitis einsetzen, bevor das Antibiogramm vorliegt? Zur Auswertung der Kulturen: Schema zur Aufgabe 11a Erreger Mikroskopie Gramfärbung Wachstum Columbiablutagar E.coli gramnegative Stäbchen Memingokokken Weiterdifferenzierung Kochblutagar MacConkeyagar mittelgroße, graue Kolonien mittelgroße milchige Kolonien jarosa,trübe Kolonien Biochemie, Bunte Reihe gramnegative Diplokokken grautransparente Kolonien grautransparente Kolonien nein u.a. OxidaseReaktion Pneumokokken grampositive Diplokokken transparente Kolonien mit Alphahämolyse transparente Kolonien mit Alphahämolyse nein Gallelöslichkeit Optochin-Test Hämophilus influenzae gramnegative Stäbchen transparente Kolonien Ammenphänomen milchig, transparente Kolonien nein serologische Kapseltypisierung 20 Aufgabe 12 Beurteilung eines gefärbten Grampräparates von Candida albicans mit S. aureus (Größenvergleich!) Mikroskopieren und zeichnen Sie bitte das Präparat (eingedecktes Fertigpräparat wird wieder eingesammelt; -bitte entfernen Sie das Öl für Kurs B sorgfältig-) Aufgabe 13 Betrachtung von Pilzkulturen auf Sabouraud-Agar-Platten sowie mikroskopische Untersuchung Material: Kulturen von Schimmelpilzen auf Sabouraud-Agar-Platten: Aspergillus fumigatus Penicillium sp. Mucor sp. Beschreiben Sie das Aussehen der Fadenpilzkulturen. Fertigen Sie jeweils zu Dritt jeder 1 Präparat von A.fumigatus Penicillium sp. Mucor sp. als Tesafilmpräparat an. 1. Beschriften Sie den Objektträger mit der Schimmelpilzart. 2. Geben Sie 1-2 Tropfen Lactophenol-Wasserblau-Lösung auf den Objektträger. 3. Lösen Sie das Klebeband von der Pilzkultur vorsichtig und kleben es an den Tischrand, Sie benötigen es wieder! 4. Reißen Sie ein Stück Tesafilm ab und nehmen einen Teil des Luftmycels der zu untersuchenden Kultur ab(Fest drücken!). 5. Kleben Sie den mit Pilzelementen behafteten Tesafilmstreifen auf den mit Laktophenol-Wasserblau-Lösung beschickten Objektträger. Lassen Sie dabei keine Luftblasen zwischen Tesafilm und Objektträgeroberfläche entstehen! 6. Bitte verschließen Sie die Pilzkulturen wieder unverzüglich nach Anfertigen des Tesafilmabdrucks mit dem Klebeband, welches sie am Tischrand zwischengelagert haben. Mikroskopieren Sie mit Objektiv 45:1, Kondensor senken, Frontlinse wegklappen Befund zeichnen. Geben Sie die Präparate nach Gebrauch vollständig in die Desinfektionslösung. 21 Aufgabe 14: Abnahme eines Rachenabstrichs und Beimpfung folgender Kulturmedien: Material: 1 Columbia–Blutagarplatte 1 Bacitracin–Kochblutagarplatte 1 steriler Abstrichtupfer in Alufolie 1 Holzspatel zum Niederdrücken der Zunge 1 Testplättchen (NA 30, Nogram = Nalidixinsäure) Beschriften Sie die Columbia–Blutagarplatte und die BacitracinKochblutagarplatte auf der Plattenunterseite mit Ihrer Platznummer und dem Kurs. Drücken Sie mit dem Holzspatel vorsichtig die Zunge mundbodenwärts und entnehmen Sie mit dem Abstrichtupfer einen Rachenabstrich. Bitte beachten Sie die Anleitung des Kursleiters! Streichen Sie mit dem Abstrichtupfer das Material oben mittig auf die Columbia–Blutagarplatte und die Bacitracin-Kochblutagarplatte. Fraktionieren Sie das Material mittels 3–Ösen–Ausstrichen auf beiden Platten. Legen Sie auf den zuerst beimpften Sektor der Columbia–Blutagarplatte ein Nalidixinsäureplättchen (Na–30) auf. Die von Ihnen beimpften Agarplatten bitte zum Mittelgang geben; die Platten werden mindestens 18 h lang bei 37 C und erhöhtem Kohlendioxidpartialdruck bebrütet. In der nächsten Kursstunde erhalten Sie die Columbia–Blutagarplatte und die Bacitracin-Kochblutagarplatte zur Beurteilung zurück. Sowohl den Spatel als auch den Abstrichtupfer nach Gebrauch in der Desinfektionsmittellösung entsorgen. Flora der oberen Luftwege: Reinkulturen wichtiger Bakterienarten/Vergleichsplatten Sie erhalten Reinkulturen einiger Bakterienarten auf Columbia–Blutagarplatten: Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes (beachten Sie den Hemmhof um das Bacitracin– Testblättchen herum!) vergrünende Streptokokken Pneumokokken (beachten Sie den Hemmhof um das Optochin–Testblättchen herum!) Neisseria sicca Haemophilus influenzae mit Amme Haemophilus influenzae auf einer Kochblutagarplatte (je eine Kochblutagarplatte je Bankreihe). Vergleichen Sie die Bakterienkolonien auf den Blutagarplatten des selbst angefertigten Rachenabstrichs mit denen der Reinkulturplatten. Sie finden eine Beschreibung der bei Rachenabstrichen häufig auftretenden Kolonieformen in der Tabelle nächste Seite Beschreiben Sie das Aussehen der Kolonien und das Auftreten von Hämolyse (, ?). Prüfen Sie bei den Reinkulturen von vergrünenden Streptokokken und von Pneumokokken die Gallelöslichkeit, indem Sie auf einige entsprechende Kolonien vorsichtig Desoxycholatlösung auftropfen und abwarten, bis die Lösung nach 20 Min in den Agar eingezogen ist. Protokollieren Sie Ihre Ergebnisse! Tropfen Sie auf einzelne Kolonien der Neisseria–Reinkultur und auf ähnliche Kolonien auf der Rachenabstrichplatte vorsichtig etwas Oxidasereagenz. Im positiven Falle färben sich die Kolonien binnen kurzer Zeit ( 1 min) blau– schwarz. Halten Sie Ihre Ergebnisse in Ihrem Protokollheft fest. 22 Kolonien Durch– Farbe messer nach 24 h Bebrütung Nährboden– Veränderungen im Koloniebereich mikroskopisches Aussehen im Gram– Präparat Wachstum Verdachts– diagnose im NA– Plättchen– Bereich 0.5 –3 mm weiß oder unverändert oder grampositive goldgelb hämolytisch Haufenkokken + Staphylokokken 0.5 –1 mm transpa- grünlicher, hämo- grampositive Kettenkokken rent grau lytischer Hof bis weißlich + vergrünende Streptokokken 1.5 mm weiß, trocken unverändert 2 mm gelblich unverändert oder gramnegative Diplokokken kleiner hämolytischer Hof 0.5 mm grampositive bzw. – + labile Stäbchenbakterien mit keulenförmiger Verdickung transpa– unverändert rent serologische Gruppe – kleine, gramnegative Stäbchenbakterien Bezeichnung Hämolyse – Bemerkungen (apathogene) Corynebakterien (apathogene) Neisserien Oxidasereaktion: + z.T. Haemophilus– Arten Wachstum nur im Ammen- Pigmentbildung bereich (Staphylococcus aureus) Vorkommen und Bedeutung als Krankheitserreger I. mit Gruppen–Antigen („C–Substanz“), das eine Einteilung in die serologischen Gruppen AZ erlaubt A S. pyogenes Angina, Scharlach, Otitis, Nephritis, Erysipel, Phlegmone, Wundeiterung B S. agalactiae , oder Urogenitaltrakt, Rachen, Infektionen bei Säuglingen (Meningitis), Urogenitalinfektionen bei Frauen, gelber Galt bei Rindern C S. equi D Enterokokken: E. faecalis E. faecium , oder Pferd (Druse1 ) normaler Darmbewohner bei Mensch und Tier, fakultativ pathogen (wird beispielweise als Erreger von Harnwegs infektionen gefunden) G obere Luftwege, selten: Angina u.a. Infektionen II. ohne Gruppen–Antigen bzw. ohne speziesspezifische Gruppenantigene Viridans–Gruppe: S. salivarius S. mitis S. sanguis S. mutans 1 normale Bewohner der Mundhöhle, Erreger der Endocarditis lenta Entzündung der Nasen- und Rachenschleimhaut mit Vereiterung der submaxillären Lymphknoten; kommt in dieser Form nur bei Pferden vor. 23 Aufgabe 14a: Grampräparate von Bakterien des eigenen Rachenabstrichs Stellen Sie von einzeln stehenden Kolonien, die auf der Columbiablutagarplatte in Ihrem Rachenabstrich gewachsen sind, ein Ausstrichpräparat her und färben Sie dieses nach Gram. Mikroskopieren Sie Ihr Präparat und zeichnen Sie die Befunde. Aufgabe 15: Mikroskopischer Nachweis von Mycobacterium tuberculosis in Sputumpräparaten Färben Sie das auf der Färbebank liegende, bereits hitzefixierte Sputumpräparat nach Ziehl-Neelsen. Mikroskopieren Sie das Präparat mäanderförmig mit dem Ölimmersionsobjektiv und beurteilen Sie, ob säurefeste Stäbchen (Mycobacterium tuberculosis) vorhanden sind. Zeichnen Sie bitte den Befund. Aufgabe 16: Präparat zur Neisser-Färbung Färben Sie das hitzefixierte Präparat (C. diptheriae ) nach Neisser. Zeichnen Sie bitte den Befund Aufgabe 16a: Art Differenzierung einiger Corynebacterium-Arten mikrosk. Lagerung Polkörnchen Spaltung Glukose C. diphtheriae unregelmäßig vorhanden C.pseudodiphtheriticum palisadenartig C.xerosis unregelmäßig Wachstum Saccharose Maltose Harnstoff Toxinbildung aerob anaerob + - + - + + + fehlen - - - + - + - vorhanden + + + - - + - 24 Aufgabe 17: Blutkulturanlage Stellen Sie sich vor, Sie hätten einem Patienten mit septischen Temperaturen und Durchfällen soeben unter aseptischen Bedingungen venöses Blut abgenommen. Die mit Blut gefüllte Spritze finden Sie an Ihrem Arbeitsplatz. 17b) Beschriften Sie bitte einen Objektträger mit BK= Blutkultur; geben Sie vor Beimpfung der Blutkulturflasche 2 Tropfen aus der Spritze auf den Objektträger; mit der sterilen, abgekühlten Öse verteilen, lufttrocknen lassen und nach Gram färben. Ergebnis bitte zeichnen und protokollieren. Bitte beimpfen Sie jeweils gemeinsam mit Ihrem Nachbarn bzw. Ihrer Nachbarin die BK–Flasche mit je 5 ml Blut: 1 Dazu desinfizieren Sie die Stopfen mit 70% Ethanol und injizieren anschließend je 5 ml Blut in die Flaschen. VORSICHT: Bitte die Kanüle nicht in die Hülse zurückstecken (Verletzungsgefahr), sondern sofort das komplette System (Spritze mit Kanüle) in die Desinfektionslösung geben; dort werden sie später entnommen und in Spritzenabwurfgefäßen ordnungsgemäß entsorgt! Anschließend mischen Sie den Flascheninhalt vorsichtig. 2 Die mit Ihrer Platznummer beschriftete Flasche geben Sie bitte zum Mittelgang. 3 Die BK werden über Nacht bebrütet bei 36 Grad. Aufgabe 17a): Subkultur der Blutkultur Beschreiben Sie das Aussehen der bewachsenen BK Legen Sie zu zweit Subkulturen an: 1 Dazu werden nach Aufschütteln des Flascheninhaltes und Desinfektion des Durchstichstopfens mit einer Spritze etwa 0,2 ml Flüssigkeit entnommen. 2 Columbiablutagar, MacConkeyagar und Kochblutagar mit Platznummern und Kurs beschriften. 3 Jeweils ein Tropfen Blut auf die Columbiablut– ,Kochblut- und auf die MacConkey–Agarplatte auftropfen, und fraktioniert ausstreichen. 4 Geben Sie die Platten zum Mittelgang; sie werden im Kerzenflammentopf bei 37 Grad über Nacht bebrütet. Aufgabe 17a): Ablesen der Blutsubkulturen Beurteilen Sie das Kulturergebnis der Blutsubkultur vom letzten Kurstag: Beschreiben Sie das Aussehen der gewachsenen Kolonien auf den Columbiablut-, Kochblut – und MacConkey–Agarplatten. Falls Sie gramnegative Bakterien isoliert haben sollten, die auf MacConkeyagar gewachsen sind; muß zur Identifizierung eine biochemische Untersuchung für Enterobacteriaceae erfolgen. Diese Biochemie wird in Aufgabe 23 erläutert. 25 Aufgabe 18: Staphylokokken–Differenzierung Nachweis des Verklumpungsfaktors zur Abgrenzung von S. aureus gegen andere Spezies der Gattung Staphylococcus. Material: 1 Blutagarplatte mit getrennten Kulturen von S. aureus und S. epidermidis 1 Tropffläschchen mit Kaninchen–Citratplasma 1 Tropffläschchen mit isotonischer Kochsalzlösung Beschreiben Sie das Aussehen der Kolonien von S. aureus und S. epidermidis sowie eventuelle Nährbodenveränderungen. Führen Sie auf einem Objektträger den Verklumpungsfaktortest mit S. aureus und S. epidermidis durch. Beachten Sie die Anleitung des Kursleiters! Protokollieren Sie den Befund in Ihrem Protokollheft. Wie kommt die Verklumpung zustande ? Aufgabe19: Charakterisierung einer Kultur von Pseudomonas aeruginosa Material: 1 Plattenkultur von Pseudomonas aeruginosa 1 2 Aufgabe 19a: 1 Tropffläschchen mit „Oxidase“–Reagenz Beschreiben Sie das Aussehen der Bakterienkolonien sowie eventuelle Nährbodenveränderungen (Farbe, Geruch ?). Tropfen Sie auf die Bakterienkolonien „Oxidase“–Reagenz auf. Was zeigt eine blau–schwarze Verfärbung der Kolonien an? Beurteilen Sie bitte folgende Reaktionen im Röhrchen King P: Pyocyaninbildung King F: Fluoreszeinbildung Protokollieren Sie die Ergebnisse! 26 Aufgabe 20: a) Mikroskopische Untersuchung bei Verdacht auf Milzbrand Material: 1 gefärbtes Methylenblaupräparat v. B. anthracis Mikroskopieren Sie das vorgegebene Präparat und zeichnen Sie den Befund. Bitte legen Sie die vorgegebenen Präparate nach dem Mikroskopieren auf die Ablage mit den schwarzen Löchern zurück, nachdem Sie das Öl vorsichtig und sorgfältig entfernt haben für den B-Kurs. Welche Therapie ist beim Hautmilzbrand angezeigt? b) Mikroskopische Untersuchung bei Verdacht auf Gasbrand Material: 1 nach Gram gefärbtes Präparat von C.perfringens Mikroskopieren Sie das vorgegebene Präparat und zeichnen Sie den Befund. Bitte legen Sie die vorgegebenen Präparate nach dem Mikroskopieren auf die Ablage mit den schwarzen Löchern zurück, nachdem Sie das Öl vorsichtig und sorgfältig entfernt haben für den B-Kurs. c) Mikroskopische Untersuchung bei Verdacht auf Tetanus Material: 1 gefärbtes Methylenblaupräparat v. C.tetani Mikroskopieren Sie das vorgegebene Präparat und zeichnen Sie den Befund. Bitte legen Sie die vorgegebenen Präparate nach dem Mikroskopieren auf die Ablage mit den schwarzen Löchern zurück, nachdem Sie das Öl vorsichtig und sorgfältig entfernt haben für den B-Kurs. d) Mikroskopische Untersuchung von Clostridium septicum Material: 1 gramgefärbtes Kulturpräparat von Clostridium septicum Mikroskopieren Sie das vorgegebene Präparat und zeichnen Sie den Befund. Bitte legen Sie die vorgegebenen Präparate nach dem Mikroskopieren auf die Ablage mit den schwarzen Löchern zurück, nachdem Sie das Öl vorsichtig und sorgfältig entfernt haben für den B-Kurs. 27 Aufgabe 21: Beurteilung der ausgeteilten Kultur von Bacteroides fragilis . auf anaerob bebrütetem Columbiablutagar (aus dem Gaspacktopf) Beschreiben Sie die Kolonieform, –farbe, –größe der Kultur. Ablesen der orientierenden Antibiotika–Empfindlichkeits–Testplatten (Agardiffusionstest) von B. fragilis Material: Sie erhalten eine bereits bewachsene Antibiotikatestplatte von B. fragilis . Prüfen Sie, bei welchen der eingesetzten Antibiotika ein Hemmhof aufgetreten ist, und tragen Sie Ihr Ergebnis in die Tabelle ein. Tabelle: Aufgabe 21a: Hemmhofbildung Chemotherapeutikum Aufdruck Penicillin G P 10 Ampicillin AM 10 Cephalotin CF 30 Clindamycin CC 2 bzw. CC 10 Gentamicin GM 10 B. fragilis Grampräparat von B. fragilis Fertigen Sie je ein Grampräparat von B. fragilis an. Mikroskopieren und zeichnen Sie den Befund und beschreiben Sie die Zellmorphologie (Zeichnung im Protokollheft) 28 Theoretischer Hintergrund zum Gaspackverfahren GasPack-System zur Anzucht für Anaerobier 1. 2. 3. 4. 5. 6. Körbchen mit Aluminiumkügelchen mit feinverteiltem Palladium umhüllt; diese werden in den Deckel eingeschraubt. Aluminiumbeschichtete Plastikfolie mit je 1 Tablette Natriumborohydrid, Natriumhydrogencarbonat und Zitronensäure. Diese Folie wird mit den Kulturschalen in den Topf gegeben und aktiviert durch Zugabe von 10 ml Wasser (Folie aufschneiden und mit einer Spritze Wasser zugeben. Einen methylenblauhaltigen Indikatorstreifen einhängen und den Topf verschließen. Aus der Natriumborohydridtablette entwickelt sich bei Wasserzutritt ca. 1800 ml Wasserstoff, der ausreicht, um den gesamten Sauerstoff katalytisch zu binden. Gleichzeitig entsteht aus der Tablette mit Natriumhydrogencarbonat und Zitronensäure soviel CO2 , daß die Endkonzentration um 10% liegt. Der Indikatorstreifen verfärbt sich zunächst blau; und entfärbt sich bei zunehmender Kohlendioxidkonzentration . Tritt die Entfärbung nicht ein, so ist entweder der Topf undicht oder der Katalysator unbrauchbar und muß ersetzt werden. 29 Aufgabe 21b: Identifizierung von Bacteroides–Stämmen mittels biochemischer Tests („Bunte Reihe“) Material: Sie erhalten eine bereits fertig beimpfte und anaerob bebrütete „Bunte Reihe“ eines anaeroben, gramnegativen Stäbchens (Bacteroides). Bei den ersten sechs Röhrchen (von links nach rechts) handelt es sich um verschiedene Zucker. Hier wird die Säurebildung anhand der Farbänderung des pH–Indikators Bromkresolpurpur (blauviolett und blaß blau = negativ, goldgelb = positiv) nachgewiesen. Die Paraffinsiegel auf den Medien gewährleisten eine anaerobe Bebrütung ohne Zuhilfenahme von Anaerobiersystemen. Das siebte (=rechts stehende) Röhrchen enthält eine Peptonbouillon, die mit Tryptophan angereichert ist. Manche Bakterienspezies, auch Anaerobier, vermögen aus Tryptophan Indol zu bilden. Dieses ist nach Zugabe von EHRLICHs oder KOVACS' Reagenz (p– Dimethylaminobenzylaldehyd) an einer Pinkfärbung erkennbar. Bei diesem Röhrchen wurde der Paraffinpfropfen bereits nach unten geschoben, um die Zugabe des Reagenz auf das Medium zu ermöglichen. In das rechts stehende Röhrchen hat die Kursassistentin bereits etwa 3– 5 Tropfen Indolreagenz hineingegeben. Das Indolreagenz ist in Wasser unlöslich, setzt sich also nach kurzer Zeit als Ring auf dem wäßrigen Medium ab. Bei den ersten sechs Röhrchen wird (ohne Zusatz von Reagenzien) eine violette bis blaßblaue Farbe als negativ, eine Gelbfärbung als positiv protokolliert. Bei dem siebten (=rechts stehenden) Röhrchen wird ein gelber Ring als negativ, ein pinkfarbener Ring als positiv bewertet. Die Identifizierung des ausgeteilten Stammes erfolgt durch Vergleich mit den biochemischen Reaktionen von B. fragilis, B. thetaiotaomicron bzw. B. vulgatus .Das eigene Ergebnis tragen Sie bitte in die Tabelle ein. Notieren Sie Ihr Differenzierungsergebnis und Ihre Platznummer im Proto-kollheft ! Tabelle: „Zucker–Spaltung“ von B. fragilis, B. thetaiotaomicron und B. vulgatus eigener Stamm B. fragilis B. thetaiotaomicron B. vulgatus Glukose + + + Arabinose – + + Xylose + + + Rhamnose – + + Melezitose – + – Trehalose – + – Indol – + – 30 Vorbereitung zu A 22: Bringen Sie bitte eine erbsengroße Stuhlprobe zum Kurstag Darm 1 und Biochemie mit. (In dem ausgegebenen Röhrchen mit Löffel) Aufgabe 22: Aerob wachsende Normalflora des Darmtraktes ( 1) Material: Eigene Stuhlprobe. Patienten-Stuhlprobe Beschriften Sie eine MacConkey–Agarplatte mit Ihrer Platznummer und dem Kurs und streichen Sie die Probe des eigenen Stuhls auf dem Agar fraktioniert aus.(besonders sorgfältig wegen der hohen Keimzahl!) Streichen Sie auf der anderen MacConkey–Agarplatte, die mit Ihrer Platznummer und Kurs beschriftet wurde, die Patienten-Stuhlprobe aus. .(besonders sorgfältig wegen der hohen Keimzahl!) Die von Ihnen beimpften MacConkey–Agarplatten bitte zum Mittelgang geben , sie werden mindestens 18 h lang bei 36 C bebrütet. Stellen Sie ein Trockenpräparat des eigenen Stuhls in einer Verdünnung mit Leitungswasser her. -Anweisung des Kursleiters beachten!Färben Sie das hitzefixierte Präparat nach Gram, zeichnen und protokollieren Sie den Befund in ihrem Protokollheft. Aufgabe23: Prüfung der biochemischen Leistungen von Enterobacteriaceae aus dem Blutkulturisolat von der MacConkeyagarplatte Material: MacConkey-Agarplatte zur Reinheitskontrolle Kligler–Agarröhrchen, Harnstoff-Agarröhrchen, Ammoniumcitrat–Agarröhrchen, Tryptonbouillonröhrchen, Isolat aus der Blutkultur auf MacConkey–Agar. Geben Sie 1 Kolonie von der MacConkeyplatte (Subkultur der Blutkultur) in die Tryptonbouillon. Von dieser beimpften Tryptonbouillon ausgehend, geben sie je eine Öse Material auf die Schrägflächen der festen Substratröhrchen schlangenlinienförmig. Sie brauchen zwischen durch nicht auszuglühen, sondern tauchen die Öse immer wieder neu in die Tryptonbouillon ein. Das Kligler-Agarröhrchen muß zusätzlich noch mit einer Impfnadel beimpft werden. Tauchen Sie diese in die beimpfte Tryptonbouillon ein und stechen mit der Nadel bis auf den Boden des Röhrchens. Ziehen Sie die Nadel senkrecht heraus und glühen sie aus. Damit sichergestellt ist, daß Sie während der Beimpfung keine anderen Keime eingeschleppt haben, legen Sie eine Reinheitskontrolle an. Sie beschriften die MacConkeyagarplatte mit Reinheitskontrolle; Platznummer und Kurs und entnehmen aus dem beimpften Tryptonbouillonröhrchen 1-2 Ösen Material und streichen es fraktioniert aus. Die beimpfte Bunte Reihe wird eingesammelt und mindestens 18 h lang bei 36 C bebrütet. 31 Biochemische Identifizierung von Enterobacteriaceae Kligler Indikator Glukose Phenolrot Laktose Harnstoff Citrat Gas . + + + gelb gelb Blasen Enterobacter cloacae + +/- + gelb rot / gelb Blasen Proteus mirabilis __ schwärmt auf der Columbiablutagarplatte + gelb/ unter Lampe Salmonella spez. + __ gelb rot Escherichia coli Citrobacter spez. + rot __/+ gelb H2S __ Urease Phenolrot __ Bromthymol blau __ grün beige __ + __ gelb rot Ehrlich`sReagenz + pink farb. Reagenz __ / + __ Spur (+) (pink) blau Reagenz gelblich w + + black pink +/__ w=wechselt __ / + __ Blasen grün/blau w + __ black beige +/__ w=wechselt + / __ Blasen blau /grün Reagenz gelblich w + __ black beige +/__ + __ blau Reagenz gelbich __ __ Blasen Shigella spez. Indol w __ __/+ Blasen __ beige Reagenz gelblich __ Reagenz gelblich 32 Aufgabe 24a: Erwerb von Chemotherapeutikaresistenz durch Plasmidübertragung (Teil 1) Nahezu alle Bakterienarten besitzen neben dem Chromosom wesentlich kleinere zirkuläre DNA–Moleküle, sogenannte Plasmide, auf denen zusätzliche Informationen für die Produktion von Enzymen des Stoffwechsels, Pathogenitätsfaktoren (z.B. Toxine) und, im Falle dieses Versuches, Resistenzfaktoren (meist Antibiotika–inaktivierende Enzyme) kodiert sind. Plasmide können von einem Bakterienstamm auf einen anderen übertragen werden, wobei die Übertragungsfrequenzen von dem Verwandtschaftsgrad der Stämme abhängt; bei Stämmen der gleichen Art und nahe verwandten Arten ist sie besonders hoch, bei entfernt verwandten entsprechend niedriger. Die Übertragung von Resistenzplasmiden (R–Plasmiden) erklärt sehr deutlich, warum sich Resistenzen in einer Mischpopulation rasch ausbreiten können. In diesem Versuch wird die Übertragung eines R–Plasmids (kodiert Ampicillin– und Tetrazyklinresistenz) von einem E.–coli–Stamm (Donor) auf einen Shigella–sonnei– Stamm (Rezipient) beobachtet. Der eingesetzte Shigella–sonnei–Stamm besitzt ein chromosomales Gen für Nalidixinsäureresistenz. Die beiden Bakterienarten lassen sich leicht voneinander unterscheiden: E. coli kann Laktose verstoffwechseln, S. sonnei hingegen nicht. Teil 1 des Versuches zu Zweit Material: 2 MacConkey–Agarplatten 1 Gefäß mit Bouillonkultur von S. sonnei W3110 (5 ml für je zwei Studenten) 1 Gefäß mit Bouillonkultur (5 ml für je zwei Studenten) von E. coli RP Sinn: 2 Pipetten Es soll eine Konjugation von Shigellen mit E.–coli–Zellen erfolgen. Beimpfen Sie eine MacConkey–Agarplatte fraktioniert mit dem Rezipienten– Stamm Shigella sonnei W3110 nachdem Sie die Platte mit Platz-Nr und Kurs sowie R beschriftet haben. (benutzen Sie dazu einen Tropfen aus der Pipette von der entsprechenden Bouillonkultur): Kontrollplatte für spätere Resistenzbestimmung. Der Nachbar benutzt die andere MacConkey–Agarplatte und fraktioniert den Donorstamm Escherichia coli RP, nachdem die Platte mit Platz-Nr. und Kurs sowie D beschriftet wurde. (benutzen Sie dazu einen Tropfen aus der Pipette von der entsprechenden Bouillonkultur): Kontrollplatte für spätere Resistenzbestimmung. Geben Sie zu einem Röhrchen mit 8 ml frischer Nährbouillon 1 ml des Rezipientenstammes S. sonnei W3110 und 1 ml des Donorstammes E. coli RP. und mischen Sie vorsichtig mit der Pipette. Die von Ihnen angelegten Kulturen werden eingesammelt und 18–24 h lang bei 36 C bebrütet. 33 Aufgabe24b: Erwerb von Chemotherapeutikaresistenz durch Plasmidübertragung (Teil 2) Material: 1 MacConkey–Agarplatte mit Antibiotika–Zusatz: Ampicillin und Nalidixinsäure. Sinn: Mischkultur in Nährbouillon aus Aufgabe 24a). Selektion resistenter Shigella–sonnei–Klone (Transkonjuganten) Geben Sie von der in Nährbouillon angelegten Mischkultur von Escherichia coli RP und Shigella sonnei W3110 mit der Öse 1 Tropfen auf die MacConkey–Agarplatte und streichen Sie fraktioniert aus. Wegen des Nalidixinsäuregehalts der MacConkey–Agarplatte kann darauf nur Shigella sonnei W3110 wachsen, dessen chromosomale Nalidixinsäureresistenz hier als Selektionsmerkmal dient. Aufgrund des Ampicillingehalts der Agarplatte sind ferner nur diejenigen Shigellen zur Vermehrung befähigt, die das Resistenzplasmid von Escherichia coli RP empfangen haben (Transkonjuganten). Die von Ihnen angelegten Kulturen werden 18–24 h lang bei 37 C inkubiert. Aufgabe24c: Erwerb von Chemotherapeutikaresistenz durch Plasmidübertragung (Teil 3) Material: Sie arbeiten zu Dritt jeder erhält eine bewachsene MacConkeyagarplatte entweder R, D oder T = Transkonjugant. 3 Mueller–Hinton–Agarplatten; beschriften Sie Ihre Platten mit Platz-Nr. Kurs und D, R oder T. 3 Röhrchen mit gepufferter isotonischer Kochsalz–Lösung 3 Wattetupfer Sinn: Testblättchen (Ampicillin [10µg]; Tetrazyklin [30µg ], Nalidixinsäure [30µg]) Vergleichende Resistenzbestimmung des Donorstammes, des Rezipientenstammes und des Transkonjugantenstammes. stellen Sie eine Suspension in gepufferter isotonischer Kochsalzlösung mit dem Stamm her, den Sie untersuchen sollen. streichen Sie die Suspension mit einem Wattetupfer dicht und gleichmäßig auf einer Müller–Hinton–Agarplatte aus, wie Sie es bei den Resistenzbestimmungen bereits praktiziert haben und legen Sie jeweils 1 Testblättchen A, Te und Na auf. Die von Ihnen beimpften Müller–Hinton–Agarplatten geben Sie bitte zum Mittelgang ; sie werden 1824 h lang bei 37 C inkubiert. Nach der Bebrütung lesen Sie bitte die Antibiogramme der untersuchten Bakterienstämme ab. Protokollieren Sie die Ergebnisse (sensibel oder resistent): Stamm Nalidixinsäure Ampicillin Donor Rezipient Transkonjugant Wurde eine Resistenzplasmidübertragung erreicht? Tetrazyklin 34 zu Aufgabe 22: Untersuchung von Reinkulturen/Vergleichsplatten von Enterobacteriaceae Material: Reinkulturen auf MacConkey–Agarplatten von: Escherichia coli Enterobacter cloacae Proteus mirabilis Salmonella sp. Aufgabe 25: Widal-Reaktion (Nachweis agglutinierender Antikörper im Patientenserum zur Ablesung) Material: Reagenzglasständer mit 7 Röhrchen im 1. bereits je 0,5 ml Serum einer Verdünnung von 1:20 vorgegeben. Serum ungerade Platz-Nr. aus der 1.Krankheitswoche des Patienten gerade Platz-Nr. aus der 3. Krankheitswoche des Patienten. isotonische NaCl im Röhrchen Antigenverdünnung gebrauchsfertig (abgetötete Typhusbakterien =„Widal-Antigen“ im Röhrchen) Pipetten 2 à 2ml Versuchsdurchführung zur Feststellung des Antikörpertiters: . geben Sie in das 1.-7. Röhrchen jeweils 0,5 ml isotonische NaCl vom 1. Röhrchen ausgehend bis zum 6. Röhrchen 0,5 ml überpipettieren. 0,5 ml aus dem 6. Röhrchen verwerfen. Antigenverdünnung gut aufschütteln und in alle Röhrchen 0,5 ml zugeben. die Ständer mit den Röhrchen werden eingesammelt und bei 360 C 18 Std. inkubiert. Die Ablesung und Protokollierung erfolgt am nächsten -Tag. Beschreiben Sie das Prinzip der Widal–Reaktion! Nennen Sie Erkrankungen, bei denen die diagnostisch eingesetzt werden kann. Widal-Reaktion 35 Aufgabe 26: Objektträger–Agglutinationstest (Gruber–Reaktion) mit Salmonellen Material: Polyvalentes Salmonella–Antiserum isotonische Kochsalzlösung „Salmonella–verdächtige“ Kolonien auf der MacConkey–Agarplatte aus dem Patienten-Stuhl (wie ggf. aus der Blutkultur) isolierte, laktosenegative Bakterien agglutinieren: 1 Geben Sie auf einen Objektträger links der Mitte einen Tropfen polyvalentes Salmonella–Antiserum und rechts der Mitte einen Tropfen Kochsalz–Lösung. Die beiden Tropfen sollen recht klein sein, so daß sie nicht ineinander verlaufen und nicht vom Objektträger heruntertropfen, wenn dieser später hin– und hergeschwenkt wird. 2 Nehmen Sie mit einer ausgeglühten, abgekühlten Öse die zu untersuchende Bakterienkolonie auf und setzten Sie einen Teil der Bakterien oberhalb des Salmonella–Antiserums ab. Der an der Öse verbleibende Teil (im Idealfall die Hälfte der Kolonie) darf nicht mit dem Antiserum in Kontakt kommen! 3 Reiben Sie die an der Öse verbliebene Bakterienkulturmasse von oben her in den Tropfen isotonischer Kochsalzlösung ein. Die Bakterienkolonie muß gleichmäßig in den Tropfen suspendiert werden, wobei der Tropfen länglich, parallel zur kürzeren Seite des Objektträgers, ausgezogen werden sollte. 4 Reiben Sie die zuvor abgesetzte Bakterienmasse in entsprechender Weise in das Salmonella–Antiserum ein. 5 Schwenken Sie den Objektträger um eine gedachte, in der Mitte des Objektträgers parallel zu den längeren Seiten liegende Achse vorsichtig hin und her. Sie fassen den Objektträger dazu am besten mit Daumen und Zeigefinger beider Hände an den Ecken an. Bitte achten Sie darauf, daß die Bakteriensuspension weder an Ihre Finger gerät noch am Rand heruntertropft und daß die beiden Tropfen nicht ineinander verlaufen. 6 Geben Sie den Objektträger nach Ablesen des Untersuchungsergebnisses unverzüglich in die bereitstehende Desinfektionsmittellösung. Zur positiven Kontrolle kann eine Agglutination der Reinkultur von Salmonella sp. durchgeführt werden. Aufgabe 27: Objektträger–Agglutinationstest mit Shigella sonnei Material: Blutplatte mit Shigella sonnei Shigella–Mischserum isotonische Kochsalz–Lösung Beschreiben Sie die Kolonieform. Führen Sie eine Objektträgeragglutination mit Shigella–Mischserum durch (Kontrolle: isotonische Kochsalz–Lösung). Arbeitsweise: vgl. Aufgabe 26 36 Aufgabe 28: Cholera: Beweglichkeit von Vibrionen (Hängender Tropfen) Material: 1 apathogener Vibriostamm in alkalischer Peptonbouillon Fertigen Sie aus der vorgegebenen Vibrionen–Kultur ein Präparat des „hängenden Tropfens“ an und prüfen Sie die Beweglichkeit der Bakterien Hinweise des Kursleiters beachten! Geben Sie das Präparat nach der Untersuchung in das desinfektionsmittelgefüllte Gefäß an Ihrem Arbeitsplatz. Sie erhalten einen sterilen Urin–Auffangbecher mit festem Verschluß. : Mittelstrahlurin–Gewinnung Bitte fangen Sie am Morgen des Praktikumstages den eigenen Mittelstrahlurin im Urinbecher auf und bringen ihn mit. Beachten Sie bitte die exakte Entnahme! Mittelstrahlurin: Händewaschen (mit Seife !); Reinigen der Harnröhrenöffnung und des äußeren Genitale mit Wasser und Seife; (bei der Frau: Spreizen der großen Schamlippen, beim Mann: Zurückstreifen der Vorhaut !). Wasserlassen, wobei die ersten 100 ml verworfen, die nächste Portion (z.B. 100 ml) hingegen ohne Unterbrechung des Harnstrahls in ein steriles Sammelgefäß aufgefangen wird; Zügiger Transport (weniger als 4 Stunden) ins Labor oder Einsatz eines Eintauchobjektträger–Kulturverfahrens; . 37 Aufgabe 29: Verarbeitung der eigenen Urinproben Beimpfen Sie mit steriler Öse je eine Blut– und eine MacConkey–Agarplatte fraktioniert mit dem eigenen Urin. Prüfen Sie den Nitritgehalt mit dem Comburstreifen (Streifen eintauchen, Pinkfärbung zeigt positive Reaktion an). Zur Keimzahlbestimmung im Plattentest geben Sie mit steriler Pipette 0.1 ml Ihres Urins auf die Mitte der Nähragarplatte und verteilen die Probe mit einem Glasspatel gleichmäßig über die Platte. Nach einer Bebrütungszeit von 18 h lesen Sie das Kulturergebnis auf Blut– und auf MacConkey–Agar ab. Protokollieren Sie ggf. das Vorhandensein und die Zahl von Bakterienkolonien auf den beiden Medien. zählen Sie die Kolonien im Urin auf den Nähragarplatten aus und errechnen Sie die Keimzahl, die im Urin vorgelegen haben muß. Aufgabe 30: Verarbeitung des Patienten–Urins Legen Sie zur Keimzahlschätzung eine Kultur mit dem Eintauchobjektträger–Verfahren an. Prüfen Sie den Nitritgehalt der Urinprobe mit dem dafür vorgesehenen Teststreifen (Streifen eintauchen). Nach einer Bebrütungsdauer von 18 h schätzen Sie die Keimzahl auf den verschiedenen Medien des Eintauch–Objektträgers durch Vergleich mit den Ihnen vorliegenden Schemata ab. Schätzen Sie nach einer Bebrütung über 18 h die Keimzahl auf den verschiedenen Medien des Eintauch–Objektträgers durch Vergleich mit den Ihnen vorliegenden Schemata ab; protokollieren Sie Ihre Ergebnisse Mikrobiologische Untersuchung bei Verdacht auf Harnwegsinfekt Protokollieren Sie den vollständigen Gang einer bakteriologischen Urin– Untersuchung ! 38 Aufgabe 31: Treponema–pallidum–Partikelagglutination (TPPA) Material: Reagentien liegen aufgelöst und gebrauchsfertig vor. Der Test wird zu zweit durchgeführt Positives Kontrollserum (vorverdünnt, gebrauchsfertig) für 2x2 Studenten 400 µl Zwei Patientenseren für 2x2 Studenten 300 µl Pasteurpipetten ¼ Mikrotiterplatte Verdünnungslösung 1 ml Nicht sensibilisierte Partikel (Tannin behandelt), pro Bankreihe für 3 Paare, 400-500 Mikroliter (bitte mit Pasteurpipette weitergeben) sensibiliserte Partikel (mit Treponema Pallidum-Antigen beschichtete Partikel), pro Bankreihe für 3 Paare, 400-500 Mikroliter (bitte mit Pasteurpipette weitergeben) Pippetierschema: Reihe 1 Reihe 2 Serum Serum Reagentien Patient 2 positives Kontrollserum Patient 1 4 Tr. Verd.- 4 Tr. Verd.- ------ ------ Lösung Lösung 1 Tr. Verd.- 1 Tr. Verd.- ------- -------- Lösung Lösung Reihe 3 1 Tr. Verd.Lösung Reihe 4 1 Tr. Verd.Lösung Kontrolle 1 Tr. Verd.- ------- 1 Tr. Verd.- Lösung Lösung 1 Tr. Verd.- ------- 1 Tr. Verd.- Lösung Lösung dann 1 Tropfen des jeweiligen Patientenserums in Reihe 1, und nach dem Mischen je 1 Tropfen aus der Vertiefung in die 2. von da aus in die 3. und von hieraus in die 4. Reihe überpipettieren, aus Reihe 4 je 1 Tropfen verwerfen, damit die Volumina identisch sind. Positves Kontrollserum (vorverdünnt, gebrauchsfertig): in die 3. und 4. Reihe je 1 Tropfen Kontrollserum tropfen, in Reihe 3 (Patientenseren, pos. Kontrollserum und Reagentien- Kontrolle) je 1 Tropfen nicht sensibilisierte Partikel geben, in Reihe 4 (Patientenseren, pos. Kontrollserum und Reagentien-Kontrolle) je 1 Tropfen sensibilisierte Partikel geben. durch vorsichtiges Anklopfen 30 Sekunden mischen und dann 2 Stunden erschütterungsfrei und abgedeckt stehen lassen Reaktionsbilder Ablesung Bewertung „Zellnetz“ aus agglutinierten Partikeln + reaktiv lila Knopf aus sedimentierten Partikeln – nicht reaktiv 39 Aufgabe 32: Kulturmorphologie von Streptococcus agalactiae Betrachten und beschreiben Sie die Kolonien und deren Hämolyseverhalten auf der Columbia–Blutagarplatte. Aufgabe 33: Beurteilung der Vaginalflora 33a)+33b) Aufgabe 33: Mikroskopieren Sie die Grampräparate eines normalen und eines pathologischen Vaginalabstrichs und zeichnen Sie die Befunde. Präparate bitte für den B-Kurs sorgfältig entölen und auf die schwarze Ablage legen. Grampräparat zur Gonorrhoe 33c) Mikroskopieren Sie das Gonorrhoe–Präparat und zeichnen Sie den Befund. Präparate bitte für den B-Kurs sorgfältig entölen und auf die schwarze Ablage legen. 40 Aufgabe 34: Cardiolipin–Flockungsreaktion Material: 1 2 3 4 5 6 7 1 positives Serum 1 negatives Serum Antigen (Cardiolipin, 1:10 verdünnt) 1 Hohlschliff–Objektträger 3 Pasteurpipetten mit Hütchen Geben Sie 2 Tropfen des ersten Serums auf den Hohlschliffobjektträger. Geben Sie 2 Tropfen des zweiten Serums in eine andere Vertiefung des Hohlschliffobjektträgers. Setzen Sie je 1 Tropfen Cardiolipin zu und mischen Sie gut durch. Schwenken Sie den Objektträger 3 min lang vorsichtig hin und her. Beurteilen Sie, ob eine Ausflockung aufgetreten ist (Ergebnis: positiv) oder nicht (Ergebnis: negativ). Protokollieren und bewerten Sie Ihre Ergebnisse. Beschreiben Sie die diagnostische Bedeutung der folgenden Verfahren zur serologischen Lues–Diagnostik: 1 Cardiolipin–Flockung 2 TPPA 3 FTA–Abs. 4 FTA–Abs.–IgM 41
