Praktikumsteil „Charakterisierung und Genotypisierung floraler

Praktikumsteil „Charakterisierung und Genotypisierung floraler
homöotischer Mutanten“
I. Vorbereitung
Beantworten Sie zur Vorbereitung auf das Praktikum folgende Fragen (schriftliche Beantwortung
nicht notwendig):
- Was versteht man unter homöotischen Mutationen?
- Wie ist eine Arabidopsis-Blüte aufgebaut (Anzahl und Anordung der Organe)?
- Was sind die grundlegenden Aussagen des ABC-Modells der Blütenentwicklung und welchen
Phänotyp erwarten Sie für eine florale homöotische Mutante der Klasse B?
- Wie funktioniert PCR?
- Was sind Restriktionsenzyme?
II. Arbeitsplan
Jede Gruppe erhält fünf Pflanzen, die Nachkommen entweder eines geselbsteten Elters sind, der
ein mutantes APETALA3 (AP3) oder ein mutantes PISTILLATA (PI)-Allel trägt und ansonsten
genotypisch einem Wildtyp entspricht. Die Eltern der bereitgestellten Pflanzen sind also
entweder ap3/AP3; PI/PI („AP3-Heterozygote“) oder AP3/AP3; pi/PI („PI-Heterozygote“).
Außerdem erhält jede Gruppe eine Wildtyp Pflanze als Referenz.
Aufgabe im Praktikum ist es
- die bereitgestellten Nachkommen phänotypisch zu analysieren und
- hinsichtlich des AP3- bzw. PI-Locus zu genotypisieren
- RNA zu isolieren, cDNA zu synthetisieren und
- mittels RT-PCR die Expression von AP3 und PI in Pflanzen bekannten Genotyps zu analysieren
- die Ergebnisse aller Gruppen zusammenzutragen und gemeinsam zu analysieren
Anmerkung: Die Fragen dienen als Hilfestellung zum Protokollschreiben. Ihre Beantwortung
sollte Teil des Protokolls sein.
Tag 1
1. Einleitung
2. RNA-Isolation aus 2 Pflanzen bekannten Genotyps
Gruppennumer
1-3
4-6
7-9
10-12
13-15
Genotyp der Pflanzen
AP3/AP3; PI/PI Wildtyp
ap3/ap3; PI/PI ap3 homo
AP3/ap3; PI/PI ap3 hetero
AP3/AP3; pi/pi pi homo
AP3/AP3; PI/pi pi hetero
1
AP3: wildtypisches AP3-Allel
PI: wildtypisches PI-Allel
o
o
ap3: mutantes AP3-Allel
pi: mutantes PI-Allel
RNA Geleletrophorese
RNA Konzentrationsbestimmung
3. Morphologische Analyse der Pflanzen unter besonderer Berücksichtigung des BlütenPhänotyps.
o Notieren Sie ihre Beobachtungen. Was erwarten sie bezüglich Anzahl und
Anordnung der Blütenorgane im Wildtyp? Weichen Pflanzen von dieser
Erwartung ab, wenn ja, inwiefern?
4. DNA-Isolation aus 5 Pflanzen unbekannten Genotyps und eines Wildtyps
5. PCR mit der DNA aller 6 Pflanzen, um das AP3- oder PI-Allel zu amplifizieren
Tag 2
6. cDNA Synthese aus RNA aus Schritt 3 vom Vortag (nur 5 Gruppen)
Gruppennumer
1
2
3
4
5
RNA
AP3/AP3; PI/PI
ap3/ap3; PI/PI
AP3/ap3; PI/PI
AP3/AP3; pi/pi
AP3/AP3; PI/pi
Wildtyp
ap3 homo
ap3 hetero
pi homo
pi hetero
7. Restriktionsverdau der PCR-Produkte aus Schritt 5 vom Vortag
8. semiquantitative Reverse Transcription-PCR (RT-PCR), um die Expression von AP3 und PI
mittels RT-PCR in Pflanzen bekannten Genotyps zu untersuchen. Jede Gruppe untersucht
die Expression von
a) APT1 (ADENOSINE PHOSPHOTRANSFERASE1; Haushaltsgen, das in allen Geweben
mehr oder weniger gleich stark exprimiert wird)
b) AP3
c) PI
in Pflanzen mit folgendem Genotyp:
Gruppennumer
Genotyp der Pflanzen
1-3
AP3/AP3; PI/PI Wildtyp
4-6
ap3/ap3; PI/PI ap3 homo
7-9
AP3/ap3; PI/PI ap3 hetero
10-12
AP3/AP3; pi/pi pi homo
13-15
AP3/AP3; PI/pi pi hetero
o
Warum wird im Versuch neben AP3 und PI auch APT1 analysiert?
2
9. Restriktionsverdau auf Agarose-Gel auftragen und analysieren
o Welchen Genotyp besitzen die von Ihnen analysierten Pflanzen? Wie ist dieser mit
dem Phänotyp korreliert?
10. RT-PCR auf Agarose-Gel auftragen und analysieren
11. Ergebnisse aller Gruppen zusammentragen und analysieren
o Tragen Sie die Ergebnisse der genotypischen und phänotypischen Analyse aller
Gruppen zusammen. Welche Aufspaltung erwarten Sie bei der Selbstung von
AP3/ap3- bzw. PI/pi-Eltern? Wie decken sich diese Erwartungen mit dem Ergebnis?
Erläutern Sie mögliche Ursachen für eventuelle Abweichungen.
o Können Sie aus der genotypischen und phänotypischen Analyse der Pflanzen
Rückschlüsse auf die Vererbungsform der AP3 oder PI-Allele treffen? Werden die
mutanten Allele dominant oder rezessiv vererbt? Begründen Sie ihre
Schlussfolgerung.
o Tragen Sie die Expressionsmuster von AP3 und PI aller Gruppen zusammen. Geben Sie
eine mögliche Erklärung für das beobachtete Expressionsmuster an.
III. Methodenprotokolle
1. RNA-Isolation aus Arabidopsisblüten
-
-
-
Mit einem grünen Plastikmörser Pflanzenmaterial zerkleinern, dabei ab und zu vorsichtig
flüssigen Stickstoff dazugeben, damit das Gewebe kalt bleibt, dann die Eppis bis zur weiteren
Verarbeitung in flüssigen Stickstoff lagern
300 µl cell lysis solution (2% SDS, 68 mM sodium citrate, 132 mM citric acid, 1 mM EDTA)
dazugeben und schnell für mehrere Sekunden vortexen und Eppi invertieren bis das Gewebe im
Puffer homogenisiert ist
5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
100 µl protein-DNA precipitation solution (4 M NaCl, 16 mM sodium citrate, 32 mM citric acid)
dazugeben und Eppis invertieren
Für mindestens 10 Minuten bei 4°C inkubieren. Dann bei 4°C für 10 Minuten zentrifugieren.
Den Überstand in ein neues RNA-Eppi übertragen. 300 µl Isopropanol dazugeben und gut
mischen durch Invertieren des Eppis.
4 Minuten bei 4°C zentrifugieren, und den Überstand verwerfen.
Das Pellet mit 600 µl 70% Ethanol waschen und erneut 4 Minuten bei 4°C zentrifugieren.
Das Pellet trocknen und anschließend in 26 µl DEPC-Wasser aufnehmen.
3 µl 10x DNase Puffer and 1 µl (5 units) DNase I (Roche, DNase I, RNase-free) dazugeben und für
30 Minuten bei 37°C inkubieren.
70 µl DEPC-Wasser, 50 µl 7.8 M NH4Ac pH 6.0 und 400 µl 100% Ethanol dazugeben und gut
mischen.
20 Minuten bei 4°C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet mit 600 µl 70%
Ethanol waschen, danach 5 Minuten bei 4°C zentrifugieren.
Pellet trocknen und in 20 µl DEPC-Wasser aufnehmen.
3
2. Gelelektrophorese RNA
-
1 µl RNA zusammen mit 9 µl DEPC-Wasser in ein 1,5 ml RNA-Eppi geben
2µl RNA Ladepuffer dazugeben
Auf ein 1% Agarosegel laden, 6 µl DNA Marker nicht vergessen!
3. RNA Konzentrationbestimmung
-
1 µl RNA zusammen mit 49 µl DEPC-Wasser in ein 1,5 ml RNA-Eppi geben
Gut mischen und alles in eine Küvette pipettieren
Photometrische Konzentrationsbestimmung mit DEPC-Wasser als „blank“
4. DNA-Isolation aus Arabidopsisblättern
Wichtige Vorbemerkung: als erstes ist jeder Pflanze ist eine Nummer zuzuordnen (auf den
jeweiligen Topf schreiben). Diese Nummer bei der DNA-Isolation weiter verwenden, um nach der
Genotypisierung jede Pflanze eindeutig zu identifizieren.
Durchführung:
- je ein Blättchen der Pflanzen abschneiden, in 1,5ml-Eppi geben und bis zur weiteren
Verarbeitung auf Eis lagern
- 400 µl DNA-Extraktionspuffer (0,2 M Tris-HCl pH 8, 0,4 M LiCl, 20 mM EDTA pH 8, 1%SDS)
zugeben
- Blättchen mit Plastikmörser zerkleinern, bis keine größeren Blattbestandteile mehr sichtbar
sind, Homogenat bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis lagern
- 5 min bei max. rpm zentrifugieren
- Überstand (300 µl) in neues 1,5ml-Eppi geben, 300 µl Isopropanol zugeben, gut mischen
durch invertieren des Eppis (nicht vortexen)
- 10 min bei max. rpm zentrifugieren
- Überstand entfernen (abschütten), Eppi kurz auf sauberem Papiertuch abklopfen, 300 µl 70%
EtOH zugeben
- 5 min bei max. rpm zentrifugieren
- Überstand entfernen (abschütten), Eppi gut auf sauberem Papiertuch abklopfen Eppi so
umgedreht stehen lassen (bis der Alkohol auf dem Papiertuch getrocknet ist)
- Eppi umdrehen und Pellet bei geöffnetem Eppi-Deckel bei Raumtmperatur weiter trocknen
lassen (ca. 5-10 min)
- Pellet in 50 µl ddH2O aufnehmen (mit Pipettenspitze „durchrühren“, nicht auf- und
abpipettieren) und für mind. 15 min bei 50 °C inkubieren; eventuell durch „Anschnippen“
Pellet weiter resuspendieren
- DNA-Lösung im Kühlschrank lagern
5. Bestimmung des Genotyps für PI
Genotypisierung mittels Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) PCR
Grundlage: verschiedene Allele des gleichen Gens tragen unterschiedlich viele Schnittstellen
für ein bestimmtes Restriktionsenzym
4
Sequenz-Ausschnitt aus Wildtyp-PI-Allel:5’-AAA CTA TGG GAT GCT↓ AAG CAT…-3’
Sequenz-Ausschnitt aus pi-1 Mutante: 5’-AAA CTA TGA GAT GCT↓ AAG CAT…-3’
Wildtyp Allel trägt Schnittstelle für Restriktionsenzym BseGI (unterstrichen)
mutantes Allel: pi-1  EMS-induzierte Punktmutation: TGG (kursiv)TGA; dadurch entsteht
vorzeitiges STOP-Codon (trunkiertes Protein ist für mutanten Phänotyp verantwortlich) und:
Schnittstelle für BseGI geht verloren
Durchführung:
a)
Amplifikation des entsprechenden DNA-Fragments mittels PCR






Wichtig: die Komponenten werden „auf Eis“ zusammengemischt. Das Enzym
wird als letztes dazugegeben
Ein Reaktionsansatz enthält:
Konzentration bzw. Menge Ausgangsim Reaktionsansatz
konzentration
Reaktionspuffer
1fach
10fach
dNTPs
0,2 mM
2 mM
Primer ‘pi-1fwd CAPS’
1 µM
5 µM
(forward Primer)
Primer ‘pi-1rev CAPS’
(reverse Primer)
1 µM
5 µM
taq-Polymerase
DNA-Lösung
Gesamtvolumen (mit ddH2O
auffüllen)
0,75 units
1,5 µl
25 µl
1 unit/µl
---
Negativkontrolle, bei der ddH2O an Stelle der DNA-Lösung eingesetzt wird, mit
ansetzen
Da mehrere PCR-Ansätze vorzubereiten sind, kann ein Master-Mix, der alle
Reaktionskomponenten für die Einzel-PCRs außer der DNA-Lösung enthält,
angesetzt werden; um Pippettierfehler zu korrigieren, wird für den Master-Mix
eine Reaktion mehr als eigentlich benötigt angesetzt
Der Master-Mix wird gut gemischt (vortexen), die einer Einzelreaktion
entsprechende Menge wird jeweils auf informativ beschriftete 0,5 ml-Eppis
verteilt, 1,5 µl der DNA-Lösung (bzw. ddH2O für die Negativkontrolle) werden
zugegeben und die PCR wird gestartet
PCR-Programm:
95 °C
95 °C
58 °C
72 °C
72 °C
5 min
30 sec
30 sec
45 sec
10 min
35x
5
b)
Restriktionsverdau der PCR-Fragmente

Ein Reaktionsansatz enthält:
- 15 µl PCR-Produkt
- 1fach konzentrierter Reaktionspuffer Tango, Stammlösung ist 10x
konzentriert
- 0,5 µl BseGI
- Gesamtvolumen: 20 µl (mit ddH2O auffüllen)

Ähnlich wie bei der PCR kann auch hier ein Master-Mix, der alle
Reaktionskomponenten mit Ausnahme des PCR-Produkts enthält, angesetzt
werden
Inkubation der Reaktion für 2 h bei 55 °C
Zugabe von 5 µl Ladepuffer zur Gesamtreaktion
20 µl dieses Gemisches auf 1 % (w/v) Agarose-Gel auftragen
Außerdem pro Gel in separaten Slots auftragen (Proben werden bereitgestellt):
 Zur Größenabschätzung: 6 µl DNA-Marker
Erwartung: Bandengröße für
 WT-Allel:
320 bp
 mutantes Allel: 670 bp





6. Bestimmung des Genotyps für AP3
Genotypisierung mittels derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (dCAPS) PCR
Grundlage: Allele werden durch PCR amplifiziert, Primer werden dabei so gewählt, dass bei
Amplifikation eines Allels eine Schnittstelle vor einem Sequenzunterschied (z.B. Punktmutation
entsteht), im anderen Allel aber nicht
Reverse complement
 Wild-type:
GAATAAACCATTTCTTCTCTTTGAATACGTCACTTG
 ap3-3:
GAATAAACCATTTCTTCTCTTTGAATACGTCACTTA
 MunI:
CAATTG
 ap3-3.rev:
GAATAAACCATTTCTTCTCTTTGAATACGTCAATT
 nach PCR:
WT-Allel besitzt Schnittstelle für Mun I (5’-CAA TTG-3‘), wird verdaut
mutantes Allel: ap3-3  EMS-induzierte Punktmutation: CAA (kursiv)TAA;
dadurch entsteht vorzeitiges STOP-Codon (trunkiertes Protein ist für
mutanten Phänotyp verantwortlich) und: Schnittstelle für MunI kann durch
PCR nicht eingebaut werden, PCR-Produkt wird nicht verdaut
Durchführung:
a) Amplifikation des entsprechenden DNA-Fragments mittels PCR


Wichtig: die Komponenten werden „auf Eis“ zusammengemischt. Das Enzym
wird als letztes dazugegeben
Ein Reaktionsansatz enthält:
6
Reaktionspuffer
dNTPs
Primer ‘ap3-3fwd dCAPS’
(forward Primer)
Primer ‘ap3-3rev dCAPS’
(reverse Primer)
taq-Polymerase
DNA-Lösung
Gesamtvolumen (mit ddH2O
auffüllen)




Konzentration bzw. Menge
im Reaktionsansatz
1fach
0,2 mM
1 µM
Ausgangskonzentration
10fach
2 mM
5 µM
1 µM
5 µM
0,75 units
1,5 µl
25 µl
1 unit/µl
---
Negativkontrolle, bei der ddH2O an Stelle der DNA-Lösung eingesetzt wird, mit
ansetzen
Da mehrere PCR-Ansätze vorzubereiten sind, kann ein Master-Mix, der alle
Reaktionskomponenten für die Einzel-PCRs außer der DNA-Lösung enthält,
angesetzt werden; um Pippettierfehler zu korrigieren, wird für den Master-Mix
eine Reaktion mehr als eigentlich benötigt angesetzt
Der Master-Mix wird gut gemischt (vortexen) die einer Einzelreaktion
entsprechende Menge wir jeweils auf informativ beschriftete 0,5 ml-Eppis
verteilt, 1,5 µl der DNA-Lösung (bzw. ddH2O für die Negativkontrolle) werden
zugegeben und die PCR wird gestartet
PCR-Programm:
95 °C
5 min
95 °C
58 °C
72 °C
72 °C
30 sec
30 sec
45 sec
10 min
35x
b) Restriktionsverdau der PCR-Fragmente

Ein Reaktionsansatz enthält:
- 15 µl PCR-Produkt
- 1fach konzentrierter Reaktionspuffer G, Stammlösung ist 10x konzentriert
- 0,5 µl MunI
- Gesamtvolumen: 20 µl (mit ddH2O auffüllen)

Nach Zugabe des Enzyms und nochmals nach Zugabe des PCR-Produkts
Reaktionsansatz gut mischen (vortexen)
Ähnlich wie bei der PCR kann auch hier ein Master-Mix, der alle
Reaktionskomponenten mit Ausnahme des PCR-Produkts enthält, angesetzt
werden
Inkubation der Reaktion für 2 h bei 37 °C
Zugabe von 5 µl Ladepuffer zur Gesamtreaktion
20 µl dieses Gemisches auf 2,5 % (w/v) Agarose-Gel auftragen




7


Außerdem pro Gel in separaten Slots auftragen (Proben werden bereitgestellt):
 Zur Größenabschätzung: 6 µl DNA-Marker
Erwartung: Bandengröße für
 WT-Allel:
177 bp
 mutantes Allel: 208 bp
7. Gießen eines Agarose-Gels
Die Konzentration von Agarose-Gelen wird in „weight per volume“ (w/v) angegeben, das
heißt, für ein 1 %iges Gel müssen 1 g Agarose in 100 ml Laufpuffer resuspendiert werden.
Durchführung:
- Agarose Gel abwiegen, in eine Schott-Flasche geben
- Laufpuffer zugeben, mischen
- Gemisch in Mikrowelle aufkochen, dabei Flaschendeckel leicht öffnen. Vorsicht:
Siedeverzug
- Heiße Agaroselösung kurz (5 min) abkühlen lassen, dann in Gelschlitten gießen
- Für ein großes Gel 6 µl Ethidiumbromid-Lösung, für ein kleines Gel 2 µl
Ethidiumbromid-Lösung zugeben und mit Pipettenspitze in der Lösung verteilen.
- Ethidiumbromid ist mutagen, immer blaue Handschuhe tragen, Hautkontakt
vermeiden; Gele, die Ethidiumbromid enthalten, nur mit blauen Handschuhen
anfassen
- Kämme einsetzen
- Gel auspolymerisieren lassen (ca. 20- 30 min)
8. cDNA Synthese
Die Abkürzung cDNA steht für “complementary” DNA und ist eine zur RNA komplementäre,
einzelsträngige DNA. Der Prozess der Umwandlung von RNA in cDNA, die Reverse
Transkription, geschieht mittels Enzymen, den Reversen Transkriptasen.
Durchführung:
2 µg RNA
1 µl (= 0,5 µg) oligo(dT)18 primer
Mit DEPC-Wasser auf 12,5 µl auffüllen
 65°C 5 Minuten, auf Eis, kurz an zentrifugieren, wieder auf Eis
4 µl 5x Reaktionspuffer
0,5 µl Ribolock RNase Inhibitor
2 µl dNTP Mix (10 µM)
1 µl Revert Aid H Minus Reverse Transkriptase
 Mischen, kurz zentrifugieren, 60 Minuten bei 42°C inkubieren
 Reaktion bei 70°C für 10 Minuten abstoppen
8
9. semiquantitative Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)
Die RT-PCR dient der Abschätzung des Expressionslevels eines Gens in einem bestimmten
Gewebe. Dafür wir RNA aus dem entsprechenden Gewebe isoliert und in cDNA
umgeschrieben. Ausgehend von diesem ‚cDNA-Pool‘ können dann PCR-Analysen mit
verschiedenen, genspezifischen Primern durchgeführt werden. Die Menge des erhaltenen
Fragments ist – nach Abgleich mit einer internen Kontrolle – mit der Menge an RNATranskript korreliert.
Durchführung:
- jede Gruppe verwendet, wie im Arbeitsplan beschrieben, ein cDNA-Pool
- für diesen Pool werden PCRs durchgeführt, um AP3, PI und APT1 zu amplifizieren;
Negativkontrollen für jedes Primerpaar nicht vergessen
 also 6 PCRs pro Gruppe
- Primerpaare für die RT-PCR:
(1) AP3fwd RT-PCR; AP3rev RT-PCR
(2) PIfwd RT-PCR; PIrev RT-RCR
(3) APT1fwd RT-PCR; APT1rev RT-PCR
Reaktionspuffer
dNTPs
forward Primer
Konzentration bzw. Menge
im Reaktionsansatz
1fach
0,2 mM
1 µM
Ausgangskonzentration
10fach
2 mM
5 µM
reverse Primer
1 µM
5 µM
taq-Polymerase
cDNA-Lösung
Gesamtvolumen (mit ddH2O
auffüllen)
0,75 units
1 µl
25 µl
1 unit/µl
---
-
-
PCR-Programm:
95 °C
95 °C
58 °C
72 °C
72 °C
5 min
30 sec
45 sec
45 sec
10 min
25x
Nach der PCR werden die Reaktionen mit je 6 µl Ladepuffer versetzt, 15 µl
dieser Lösung werden auf ein 1%iges Agarose-Gel aufgetragen.
pro Gel 6 µl Marker zur Größenabschätzung mit auftragen
9