Fortgeschrittenen Kurs Genetik und Molekularbiologie, WS 2005/2006

Fortgeschrittenen Kurs Gentechnik und Molekularbiologie, WS 2006/2007
Die Technik der Phagenpräsentation
1. Woche: Mo- Do: Phage Display
2. Woche: Mo: Phagen SDS Gel; Di: Sequenzierung; Do: Proteinstruktur; Fr: Sequenzauswertung
Leitung: Kristian Müller, Institut für Biologie III; Schänzlestr. 1, 79104 Freiburg
Tel. 203-2748; e-mail [email protected]
Technische Assistentin: Susanne Knall, Karin Schmidtkunz
Kursassistenz: Janina Speck, Dinah Mattay, Christina Räuber
Skriptversion 1.1/07
Ziel des Kurses
In dem Kurs soll die Technik der Phagenpräsentation (Phage Display) anhand eines
anwendungsorientierten Beispiels erlernt werden. Der Trick des Phage Display besteht darin, daß
ein Protein und das dazugehörige kodierende Gen durch den Phagen in einer sehr gut handhabbaren
Form, d.h. dem Phagen, zusammengehalten werden. Erzeugt man beispielsweise durch verzufallte
Gensynthese hundert Millionen bis eine Milliarde verschiedene Gene, lassen sich mit Hilfe des
Phage Display hundert Millionen bis eine Milliarde verschiedener Phagen erzeugen, in denen
jeweils das präsentierte Peptid mit dem Gen verbunden ist. Aus diesem hoch komplexen Gemisch
lassen sich dann Phagen anreichern, die beispielsweise ein bestimmtes Protein binden.
In dem Kurs wird mit einer vorgefertigten Phagenbibliothek (New England Biolabs Ph.D-7 Phage
Display Peptide Library Kit) gearbeitet, aus der Streptavidin bindende Peptide gewonnen werden
sollen. Hierzu werden insgesamt drei Anreicherungsrunden (Panning-Runden) durchgeführt, zwei
davon im Praktikum. Hierbei wird die Technik des “Panning” erlernt. Die Phagen werden hierfür
amplifiziert und durch Fällung gereinigt. Die Anreicherung bindender Phagen soll durch TiterBestimmung mit Plaques, photometrische Phagenbestimmung und Phagen-ELISA verfolgt werden.
In einem Nebenexperiment werden besonders reine Phagen durch eine Ultrazentrifugation im CsClGradienten gewonnen. Am Ende wird durch DNA-Sequenzierung die Aminosäure Sequenz eines
binden Peptids abgeleitet, das von jeder Gruppe im Praktikum gefunden werden soll.
Ergänzt werden die experimentellen Arbeiten durch Computer-gestützte Auswertungen. An einem
halben Tag sollen vorhandene Strukturdaten eines Peptids im Komplex mit Streptavidin am
Rechner dargestellt werden. An einem weiteren Tag wird eine Rechner-gestützte Klonierung
durchgeführt, wobei der Phagen Vektor mit Bibliothek am Rechner zusammengesetzt wird. Die am
Computer erzeugte Sequenz dient dann dazu, die Sequenzierung des gefundenen Klons
auszuwerten.
Streptavidin bindende Peptide, die über Phage Display gewonnen wurden, werden in der Praxis für
die Proteinreinigung und -detektion genutzt.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
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Hinweis zum Ablauf
Das Praktikum besteht aus einem einzigen Versuch mit mehreren Teilen, der so wie im richtigen
Labor durchgeführt wird. Auch Profis benötigen vom Start bis zur DNA Sequenz ca. sieben Tage.
Um diesen Versuch in einem einwöchigen Praktikum durchzuführen, wurde die erste von drei
Panning-Runden bereits durchgeführt. Das Praktikum beginnt also mit Panning-Runde zwei (P2).
Während des Praktikums muß jeder Teilnehmer ein “Labor-Buch” führen. Hierzu wird ein Heft
ausgegeben, in dem jeder Versuch und das Ergebnis mit Datum und Uhrzeit einzutragen ist. Das
Heft wird während des Kurses von den Assistenten eingesehen, und die Hefte einer Gruppe müssen
mit dem Protokoll abgegeben werden.
Hinweis zur Einteilung
Das Praktikum wird aus didaktischen und finanziellen Gründen in zweier Gruppen absolviert.
Damit jedoch jeder Teilnehmer ausreichend experimentelle Erfahrung sammelt, werden Teile der
Versuche von jedem Teilnehmer durchgeführt. D.h. jeder führt zwei “Panning-Runden” durch,
gerätetechnisch oder finanziell limitierte Schritte wie die Phagenbestimmung auf Platten, die
Ultrazentrifugation oder die Sequenzierung werden jedoch nur mit einer Probe pro Gruppe
durchgeführt. Um den Fortschritt der Phagenpräsentation von Runde zu Runde zu beobachten,
sollte sich jede Gruppe von Anfang an auf eine Probe als die “Hauptprobe” festlegen.
Übersicht Methode
Phagenselektion
Immunoröhrchen
belegen
Phagen
binden
Phagenproduktion
Zellen in
Flüssigkultur
Phagen
waschen
Phagen
eluieren
Titerbestimmung
Plaques / infizierte Zellen
auf Agar-Platte
PEG/NaCl-Fällung
Abb. 1 Übersicht Phagenpräsentation
Zellen
infizieren
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
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Übersicht Versuch
Phage Display Versuch
Mo
Zusätzliche Arbeiten
Bindung der ausgegebenen Phagen an
ausgegebene Röhrchen, d.h. Panning Runde P2
das Neutralisationstest; Belegen eines
Immunoröhrchens und der ELISA
Platten; X-Gal-Platten gießen
Elution der Phagen
(pro Gruppe)
Amplifikation der Phagen mit ausgegebener Kultur
Fällung der amplifizierten Phagen
Über-Nacht Kultur von ER2738 Zellen (pro Gruppe)
Di
Aufarbeitung der Phagenfällung P2
Panning Runde P3 mit selbst belegtem Röhrchen
Blocken der
und Platten
Immunoröhrchen
Titerbestimmung durch Plattieren (pro Gruppe) und
Absorptionsmessung von Eluat P2, Amplifikation P2
und Eluat P3
Phagenamplifikation P3 mit eigener Kultur
Phagenfällung P3
Mi
Aufarbeitung der Phagenfällung P3
Phagenkultur eines Klons von der Platte der
Titerbestimmung P3
Präparation einzelsträngiger DNA
Do
Phagen ELISA
Phagenreinigung
mit
Gradient (pro Gruppe)
Fr
Doktorandenvorträge
Mo
SDS Gel mit Phagen
Di
Sequenzierreaktion (pro Gruppe)
Do
Fr
CsCl
Proteinstruktur am Computer
Sequenzauswertung des Klons (pro Gruppe)
Computer gestütztes Klonieren
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
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Einführung
Selektion und die Kopplung von Genotyp und Phänotyp
Abb. 2 Übersicht über mögliche Kopplungen von Genotyp und Phänotyp auf molekularer Ebene. A) Fusion an das
Phagenprotein VIII, B) Fusion an das Phagenprotein III im Phagensystem, C) Fusion an das Phagenprotein III im
Phagmidsystem, D) Fusion an ein Zelloberflächenprotein, E) Kopplung des Proteins mit der mRNA. Erklärungen zum
Phagendisplay siehe Text.
Die Entstehung der M13 Phagenvektoren
Bakteriophagen, auch bakterielle Viren oder kurz Phagen genannt, infizieren, wie der Name besagt,
Bakterien. Phagen wurden unabhängig voneinander 1915 von Frederick W. Twort und 1917 von
Félix d'Hérelle beschrieben. d'Hérelle prägte dem damaligen Verständnis folgend den Begriff
“Bakteriophage” (Bakterienesser). Für die Phagenpräsentation werden filamentöse, nicht lytische
Bakteriophagen als Vehikel verwendet. Filamentöse Phagen sind zum Verpacken manipulierter
DNA besonders geeignet, da die Phagenlänge automatisch der Genomgröße angepaßt wird. Diese
Phagen wurden ursprünglich aufgrund ihrer auf “männliche” E. coli-Stämme beschränkten
Infektiösität isoliert. Diese Bakteriophagen werden wie folgt klassifiziert: Viren; ssDNA Viren;
Inoviridae; Inovirus. Es gibt drei sehr nah verwandte filamentöse Phage “f1“, “M13“ und “fd” deren
Genome zu etwa 98 % identisch ist. Der Phage M13 (für München 13) wurde 1963 das erste Mal
beschrieben (Hofschneider, 1963). Das Genom dieses wild-Typ Phagen umfaßt 6407 Nukleotide.
Um diesen Phagen als Klonierungsvektor zur Produktion einzelsträngiger DNA, die ursprünglich
zur Sanger Sequenzierung und später für die Mutagenese benötigt wurde, einsetzen zu können,
wurde ein 789 Bp großes Fragment in das Genom eingesetzt, das das lac Operon und die ersten 146
Aminosäuren der ß-Galactosidase enthielt. Dies führte zu dem Klon M13mp1, dem ersten Klon der
sehr erfolgreichen Serie der M13mp Phagenvektoren (mp für Max-Planck-Institut) (Messing et al.
1977). Durch chemische Mutagenese mit Nitrosomethylharnstoff und Selektion und später durch
Klonierungen wurden zusätzliche Restriktionsschnittstellen vor allem als multiple Klonierungsstelle
in das Phagengenom eingeführt. Aus diesen Phagenvektoren leitet sich die ebenfalls sehr weit
verbreitete pUC-Phagmidserie ab (Vieira & Messing 1982).
Das in den M13 Phagen kodierte ß-Galactosidase Fragment, das historisch bedingt auch α-Fragment
genannt wird, ermöglicht die sogenannte α-Komplementation im Zusammenspiel mit einem E. coliStamm, der eine Galactosidase ohne die N-terminalen Aminosäuren (auch ω-Akzeptor genannt)
exprimiert (Ullmann et al. 1967). In der Praxis wird häufig die lacZΔM15 Deletion verwendet, bei
der die Aminosäuren 11-41 der Galactosidase fehlen. Die α-Komplementation läßt sich durch die
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
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Zugabe des Farbstoffs X-Gal sichtbar machen, wodurch die sogenannte blau-weiß Selektion
ermöglicht wird.
Literatur:
Hofschneider HP, 1963, “Untersuchung über kleine E. coli K-12 Bacteriophagen M12, M13 und
M20“ Z. Naturforsch. 18, 203-205.
Messing J, Gronenborn B, Müller-Hill B, Hofschneider PH, 1977, “Filamentous coliphage M13 as a
cloning vehicle: Insertion of a HindII fragment of the lac regulatory region in M13 replicative
form in vitro”, PNAS 74, 3642-6.
Vieira J, Messing J, 1982, “The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion
mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers”, Gene, 19, 259-68.
Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing J., 1985, “Improved M13 phage cloning vectors and host
strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors”, Gene, 33, 103-19.
Ullmann A, Jacob F, Monod J., 1967, “Characterization by in vitro complementation of a peptide
corresponding to an operator-proximal segment of the beta-galactosidase structural gene of
Escherichia coli”, J Mol Biol., 24(2):339-43.
Die Erfindung der Phagenpräsentation
Georg Smith publizierte die Idee der Phagenpräsentation 1985 in einer wegweisenden Publikation
mit dem Titel: “Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on
the virion surface.” Science 1985 228(4705):1315-7. In seiner Zusammenfassung beschreibt er
diese Entwicklung wie folgt: “Foreign DNA fragments can be inserted into filamentous phage gene
III to create a fusion protein with the foreign sequence in the middle. The fusion protein is
incorporated into the virion, which retains infectivity and displays the foreign amino acids in
immunologically accessible form. These "fusion phage" can be enriched more than 1000-fold over
ordinary phage by affinity for antibody directed against the foreign sequence. Fusion phage may
provide a simple way of cloning a gene when an antibody against the product of that gene is
available.” Diese Technik findet seit Anfang der 90er Jahre weite Verbreitung vor allem seit man
merkte, daß sich so sehr einfach aus verzufallten Sequenzbibliotheken Peptide aber auch Proteine
mit bestimmten Bindungseigenschaften isolieren lassen. Hierin begründet sich auch die große
kommerzielle Bedeutung, da sich so einfach Antikörperfragment-Bibliotheken auf spezifische
Bindung oder Peptide auf Bindung oder Inhibition selektionieren lassen. Die Idee der
Phagenpräsentation legte auch den Grundstein für zahlreiche weitere Präsentationstechniken, wie
zelluläre Präsentation, Viren-Präsentation und Ribosomen-Präsentation.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
-6-
Abb. 3 Vermehrung eines M13 Phagen. 1) Infektion; 2) Herstellung der doppelsträngigen Form = relikative Form (RF)
der DNA und Vermehrung zu ca. 100 Kopien; 3) Herstellung der einzelsträngigen Form; 4) Herstellung der
Phagenproteine; 5) nicht lytische Ausschleusung von ca. 200 Phagenpartikeln.
Prinzip und Varianten der Phagenpräsentation
Abstrakt betrachtet ermöglicht die Phagenpräsentation die Kopplung eines Phänotyps mit einem
stabil verpackten Genotyp, da die Proteine, die den Phagen bilden, in seinem Genom kodiert
werden. Bei einer Transformation mit einem Phagemid oder einem Phagengenom oder bei einer
Phageninfektion gelangt in der Regel jeweils nur ein Genom in die Zelle und es werden in dieser
Zelle nur zusammengehörige Protein-Genom Einheiten verpackt. Das zu selektionierende Protein
kann zur Präsentation mit verschiedenen Hüllproteinen des Phagen fusioniert werden. Das GenIII
Protein bietet sich hierzu besonders an, da es nur in 3 bis 5 Kopien an der Spitze des Phagen
vorkommt und gut zugänglich ist. Das GenIII-Protein gliedert sich in drei Domänen, wobei die zwei
N-terminalen Domänen nach außen weisen und für die Bindung des Phagen an Zellen und somit für
die Infektiösität des Phagen wichtig sind. Die C-terminale Domäne verankert das Protein in der
Phagenhülle. Kurze Peptide bis zu 20 Aminosäuren interferieren nur wenig mit der Zellbindung und
können genetisch direkt an das 5'-Ende des genIII fusioniert werden. Durch die mehrfache
Präsentation solcher Fusionen an der Oberfläche erhält man einen Aviditätseffekt, d.h. die
beobachtete Affinität eines Phagenpartikels ist deutlich höher als die intrinsische Affinität eines
einzelnen Peptids. Diese Art der Phagenpräsentation wird im Praktikum angewendet.
Ist kein Aviditätseffekt erwünscht oder sollen Proteine präsentiert werden, die aufgrund ihrer Größe
mit der Infektiösität interferieren, greift man auf ein sogenanntes Phagmid (engl. Phagemid) zurück.
Phagmide sind Plasmide, die einen Plasmid Replikationsursprung enthalten und daher wie Plasmide
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
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propagiert werden können. Zudem enthalten sie einen Phagen Replikationsursprung, der in
Gegenwart entsprechender Proteine die Verpackung einzelsträngiger DNA in Phagen ermöglicht.
Um die Verpackung einzelsträngiger DNA zu ermöglichen superinfiziert man Phagmid tragende
Zellen mit einem Helfer-Phagen. Dieser Helfer-Phage enthält alle Gene, die benötigt werden, um
Phagenpartikel zu produzieren. In seinem Genom ist jedoch eine Mutation, die dazu führt, daß sein
eigenes Genom nur sehr schlecht verpackt wird. Daher wird nach einer Superinfektion mit HelferPhagen fast ausschließlich das Phagmid in Phagenpartikel verpackt. Phagmide für die genIII
Phagenpräsentation enthalten eine genetische Fusion mit dem vollständigen genIII oder nur mit dem
für die C-terminal kodierenden Bereich. Die Expression dieser Fusion erfolgt durch einen
schwachen Promotor, so daß weniger Fusionsproteine gebildet werden als vollständiges GenIIIProteine durch den Helfer-Phagen. Im Mittel werden daher nur ein Fusionsprotein und zwei bis vier
Wild-Typ GenIII-Proteine auf dem Phagen präsentiert, der so seine Infektiösität erhält.
Ist ein besonders hoher Aviditätseffekt erwünscht, kann auch das GenVIII-Protein, das in mehreren
tausend Kopien die Phagenhülle bildet, als Fusionspartner verwendet werden. Hierbei kann
wiederum auf Phagen oder Phagemid zurückgegriffen werden. Da Fusionen mit dem genVIII den
Phagenaufbau beeinflussen können, sind Phagen mit mutiertem genVIII entwickelt worden. Weitere
Hüllproteine des Phagen sind für Fusionen getestet worden, diese Konstrukte finden jedoch keine
weite Verbreitung.
Der Praktikumsversuch
Für das Praktikum wird eine kommerziell erhältliche Phagenbibliothek eingesetzt, bei der sieben
vollständig verzufallte Kodone (nnk) zwischen die Signalsequenz und das GenIII-Protein fusioniert
wurden. Um dies zu erreichen wurde zuerst aus dem Phagen M13mp18 eine Kpn I Schnittstelle
durch eine Deletion aus der multiplen Klonierungstelle entfernt und dann die Bibliothek über KpnI
und EagI kloniert. Hieraus resultiert die unten ausschnittsweise gezeigte Genstruktur. Im Praktikum
sollen aus dieser Phagenbibliothek, die ca. 1,2×109 verschiedene Phagen enthält, Sequenzen
gefischt werden, die Streptavidin binden. Hierzu werden insgesamt 3 Panning-Runden benötigt.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
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Genstruktur der Bibliothek
|-> genIIIp Signal Sequenz
ATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAA
1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1600
TAAGTGGAGCTTTCGTTCGACTATTTGGCTATGTTAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAAACCTCTAAAAGTTGCACTTTTTTAATAATAAGCGTT
a
V K K L L F A I |->reifes genIIIp
KpnI/Acc65I
|-> Bibliothek
<-|
EagI
|
|
|
TTCCTTTAGTGGTACCtttctattctcactctnnknnknnknnknnknnknnkggtggaggttCGGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCA
1601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1700
AAGGAAATCACCATGGaaagataagagtgagannmnnmnnmnnmnnmnnmnnmccacctccaaGCCGGCTTTGACAACTTTCAACAAATCGTTTTAGGGT
a
P L V V P F Y S H S ? ? ? ? ? ? ? G G G S A E T V E S C L A K S H -
TACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTT
1701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800
ATGTCTTTTAAGTAAATGATTGCAGACCTTTCTGCTGTTTTGAAATCTAGCAATGCGATTGATACTCCCAACAGACACCTTACGATGTCCGCAACATCAA
|- -96 primer ------|
Abb. 4 Elektronenmikroskopische Aufnahme eines
filamentösen Phagen. Diese Phagen messen 6-8 nm im
Durchmesser und können zwischen 760 und 1900 nm
lang sein.
Abb. 5 Schema der Phagenbindung undpräsentation
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
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Technische Information
Phagengenom in der Datenbank
Die Phagengenome sind beispielsweise in der EMBL Gendatenbank abgelegt und können mit den
Identifikationsnummer V00604 für M13 (6407 Bp) und X02513 für M13mp18 (7249 Bp) abgerufen
werden.
Der Genetische Code mit JCBN / IUBMB Abkürzungen
Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). The JCBN is jointly responsible to the
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) and the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB).
Symbol Bedeutung
Begründung der Namensgebung
G
G
Guanine
A
A
Adenine
T
T
Thymine
C
C
Cytosine
R
G or A
puRine
Y
T or C
pYrimidine
M
A or C
aMino
K
G or T
Keto
S
G or C
Strong interaction (3 H bonds)
W
A or T
Weak interaction (2 H bonds)
H
A or C or T
not-G, H follows G in the alphabet
B
G or T or C
not-A, B follows A
V
G or C or A
not-T (not-U), V follows U
D
G or A or T
not-C, D follows C
N
G or A or T or C
aNy
Definition der komplementären Symbole
Symbol
A B
Complement
T
C
D G H K
V G H C
M S
D M K
* In certain cases the symbol and its complement are identical.
S*
T
V W
A B
W*
N
N*
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 10 -
Der bakterielle Übersetzungsschlüssel:
AAs
Starts
Base1
Base2
Base3
=
=
=
=
=
FFLLSSSSYY**CC*WLLLLPPPPHHQQRRRRIIIMTTTTNNKKSSRRVVVVAAAADDEEGGGG
---M---------------M------------MMMM---------------M-----------TTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGGGGGGGGGGG
TTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGGTTTTCCCCAAAAGGGG
TCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAG
Der Einbuchstabenschlüssel für Aminosäuren:
(http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/AA1n2.html)
Trivial name
Symbols Systematic name
Alanine
Arginine
Ala A 2-Aminopropanoic acid
CH3-CH(NH2)-COOH
Arg R 2-Amino-5-guanidinopentanoic acid H2N-C(=NH)-NH-[CH2]3-CH(NH2)COOH
Asnd N d 2-Amino-3-carbamoylpropanoic acid H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH
Aspd D d 2-Aminobutanedioic acid
HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH
Cys C 2-Amino-3-mercaptopropanoic acid HS-CH2-CH(NH2)-COOH
Glnd Qd 2-Amino-4-carbamoylbutanoic acid H2N-CO-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
Glud E d 2-Aminopentanedioic acid
HOOC-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
Gly G Aminoethanoic acid
CH2(NH2)-COOH
His H 2-Amino-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoic acid
Asparagine
Aspartic acid
Cysteine
Glutamine
Glutamic acid
Glycine
Histidine
Isoleucine
Leucine
Lysine
Methionine
Phenylalanine
Proline
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
I
L
K
M
F
P
2-Amino-3-methylpentanoic acide
2-Amino-4-methylpentanoic acid
2,6-Diaminohexanoic acid
2-Amino-4-(methylthio)butanoic acid
2-Amino-3-phenylpropanoic acid
Pyrrolidine-2-carboxylic acid
Serine
Threonine
Tryptophan
Ser S 2-Amino-3-hydroxypropanoic acid
Thr T 2-Amino-3-hydroxybutanoic acid e
Trp W 2-Amino-3-(lH-indol-3-yl)propanoic acid
Tyrosine
Tyr Y 2-Amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid
Valine
Val V 2-Amino-3-methylbutanoic acid
Unspecified
amino
acid
Xaa Xf
Formula
C2H5-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH
(CH3)2CH-CH2-CH(NH2)-COOH
H2N-[CH2]4-CH(NH2)-COOH
CH3-S-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
C6H5-CH2-CH(NH2)-COOH
HO-CH2-CH(NH2)-COOH
CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH
(CH3)2CH-CH(NH2)-COOH
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 11 -
Montag
Das Praktikum beginnt aus Zeitgründen mit der zweiten Runde (P2)
Materialien
 Phagen Stock amplifiziert nach der ersten Runde (P1-Ampl)
 2 Immunoröhrchen belegt mit Streptavidin
 2 neue Immunoröhrchen
 2 96-well Flachboden ELISA Platten
 ca. 6.5 ml Streptavidin 30 μg/ml in 0.1 M NaHCO3-Puffer pH 9.0
 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween 20, pH 7,5 (TBST Puffer)
 Abgeschnitte Spitzen für Tween
 0.2 M Glycin/HCl Puffer pH 2,2
 Rollentaumelmischer / Radmischer
 Zentrifuge für 50 ml Gefäße
 Photometer bei 600 nm
 Über-Nacht Kultur von ER2738 Zellen ( F́ proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15 zzf:: Tn(TetR)/ fhuA2
glnV Δ(lac-proAB) thi-1Δ(hsdS-mcrB)5 )
 1 l Kolben
 LB Medium
 Tetrazyklin Stammlösung 20 mg/ml
 BSA Stammlösung 100 mg/ml
 1 M Tris-Stammlösung pH 9.1
 Stift, Klebeetiketten, Klebepunkte, Heft
 1.5 % Agar 150 ml
 IPTG/ X-gal 150 μl (50 mg/ml Isopropyl-β-D-thiogalactosid, 40 mg/ml 5-Bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-galactosid in Dimethylformamid)
 pH Stäbchen
 20% PEG 6000 / 2.5 M NaCl Lösung
 Feuerzeug
 50 ml Plastikgefäße
 Plastikküvetten
 P20, P200, P1000, Eppiständer, Spitzenboxen, Eiskübel (aus Praktikumsbestand)
 Eis, Eispott
Kultur für die Phagenamplifikation
Nach der Selektion auf Bindung müssen die bindenden Phagen wieder vermehrt werden.
 Die optische Dichte bei 600 nm der Über-Nacht-Kultur (OD 600) wird mit einem Photometer
gegen das reine Medium als Referenz bestimmt.
 Von der Über-Nacht-Kultur wird eine 100 ml Hauptkultur angesetzt. Hierzu wird mit einem 50
ml PP Gefäß das Volumen an LB Medium abgemessen, in ein 1 l Kolben gegeben, mit Tet (20
μg/ml final) versetzt und Start OD von 0,1 angesetzt und bei 37 °C geschüttelt. Da sich der
Schüttler im 4. Stock befindet, bitte die Probe auf den bereitgestellten Wagen stellen.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 12 -

Im weiteren Verlauf werden Zellen bei einer OD von ca. 0.5 für die Phageninfektion benötigt.
Das Hochwachsen der Zellen dauert in Abhängigkeit der Vitalität der Zellen 1 bis 3 Stunden.
Die optische Dichte der Zellen wird daher mindestens stündlich kontrolliert.
 Sollten die Zellen zu schnell wachsen, können sie bis zur weiteren Anwendung bei 4°C gelagert
werden.
Anmerkung: Phagen infizieren über Pili, die sich am besten in der frühen log-Phase und unter
günstigen Wachstumsbedingungen (ausreichend Sauerstoffzufuhr, reiches Medium) ausbilden; zu
heftiges Schütteln von Schikanekolben sollte vermieden werden. Die für die Bildung der Pili
erforderliche Information befindet sich auf dem F Episom, das eine Tet Resistenz trägt.
Selektion bindender Phagen
Dieser Schritt ist das Kernstück der Phagenpräsentation.
 200 ml TBST-Puffer mit TBS (Tris Buffered Saline) und 0,1% (v/v) Tween 20 in einer kleinen
Flasche ansetzen.
 Zum Waschen Immunoröhrchen 2 mal mit TBST füllen und in Abfallgefäß entleeren.
 Immunoröhrchen mit 1 ml TBST füllen, BSA Stammlösung auf final 1 mg/ml zusetzen und 30
μl Phagen Stock von einer ersten Panning-Runde “P1” zugeben.
 Röhrchen 1 h auf einem Rollentaumelmischer inkubieren.
 Anmerkung: Häufig wird zum Blockieren unspezifischer Bindung fettarmes Trockenmilchpulver
verwendet, dieses ist billiger als BSA und blockiert in der Regel besser. Milch enthält jedoch
Spuren von Biotin, das das Streptavidin blockieren würde.
Mikro-Titration der Neutralisation
Die Bindung der Peptide an Streptavidin wird durch Absenkung des pH-Wertes gebrochen. Da die
Phagen bei niedrigem pH schneller denaturieren, wird nach der Elution neutralisiert und diese
Neutralisation wird vorab einmal pro Gruppe getestet.
 1 ml Gly/HCl pH 2,2 mit 100 μl 1M Tris pH >= 9 versetzen und 10 μl auf ein pH Stäbchen
geben. Wenn der pH Wert unter 7 liegt, nochmals 50 μl zugeben und nochmals auf einem neuen
pH-Stäbchen testen. Wenn sich der pH in etwa einstellt, in 10 μl Schritten weiterarbeiten.
Abschließend wird empfohlen, das getestete Volumen nochmals mit 1 ml der Gly/HCl-Lsg zu
testen.
Anmerkung: Diese Art der Mikrotitration soll hier exemplarisch gezeigt werden, sie eignet sich zur
schnellen Bestimmung sehr kleiner Probenvolumen, auch mit 5 μl Tropfen kann der pH Wert in
vielen Fällen noch genau genug bestimmt werden.
Gegen Ende der Phagen-Inkubation sollte die optische Dichte der Zellen kontrolliert werden.
Phagen Waschen, Elution und Neutralisation
 Nach der Inkubation wird die Phagenlösung in den biologischen Abfall gegeben.
 Das Röhrchen wird 6 mal mit TBST bis zum Rand gefüllt und ausgeleert und ausgeklopft.
 Zur Elution wird 1 ml Glycin/HCl pH 2.2 mit final 1mg/ml BSA versetzt und in das Röhrchen
gegeben und 10 min auf dem Taumelrollenmischer gedreht.
 Ein 1,5 ml Eppi wird mit einem kleinen Haftetikett markiert. Hierauf wird der Name, das Datum
und der einzufüllende Inhalt festgehalten (Phagen Eluat 2. Panning Runde anti Streptavidin, z.B.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation

- 13 -
kurz P2EL Strept). Zusätzlich kommt ein Aufkleber auf den Deckel, der nur die Abkürzung
trägt. Mit einem rundherum geklebten Tesafilm wird das Etikett geschützt.
Die Phagenelution wird in das beschriftete 1,5 ml Eppi überführt und mit der in der
Mikrotitration bestimmten Menge an Tris-Puffer (ca. 150 μl) neutralisiert.
Phagen Amplifikation
1 ml des Phageneluats wird zu 40 ml ER 2738 Zellen in der frühen log Phase bei einer OD600 von
ca. 0,5 gegeben. 20 ml der 100 ml Kultur werden verworfen und zum Autoklavieren gegeben.
Nach der Zugabe der Phagen die Kultur schwenken und 10 min auf dem Tisch stehen lassen, dann 4
(- 5 h) bei 37 °C schütteln.
Belegen eines Immunoröhrchens und einer Mikrotiterplatte
Für eine weitere Panning-Runde müssen ein Immunoröhrchen und für den Test der Phagenbindung
eine Mikrotiterplatte mit Streptavidin belegt werden (siehe Schema vom Donnerstag).
 Jeweils 1,5 ml der bereits angesetzten Beleglösung (30 μg/ml Streptavidin in NaHCO3-Puffer) in
ein Immunoröhrchen geben.
 Auf zwei Mikrotiterplatten in der Mitte ein Raster von 3 × 5 markieren und jeweils 75 μl der
Beleglösung hineinpipettieren.
 Zwei Vertiefungen werden zusätzlich mit 75 μl als Referenz befüllt und der Rest auf die zwei
bereits befüllten Immunoröhrchen verteilen.
 Die Röhrchen und Platten werden im Kühlraum über Nacht bei 4 °C gedreht bzw. geschüttelt.
Mittagspause
Herstellung von Platten für die Phagentiter Bestimmung
 150 ml 1.5 % Agar in LB werden im Wasserbad flüssig gehalten.
 Eine 1:1000 Verdünnung der IPTG / X-Gal Stammlösung zugeben.
 10 dünne Platten gießen, bei denen der Boden gerade eben bedeckt ist. Während des Gießens die
Platte bewegen, so daß sich die Flüssigkeit trotz der Oberflächenspannung verteilt. Nach dem
Abkühlen werden die Platten lichtgeschützt (z.B. in Aluminiumfolie eingeschlagen) und bei 4 °C
gelagert.
Phagen Fällung
Die Phagen werden durch Zentrifugation und anschließende Fällung aus dem Kulturmedium
gereinigt und angereichert.
 40 ml Zellsuspension werden in ein 50 ml Schraubdeckel Plastikgefäß gegeben; bei 5000 × g, 4
°C, 10 min werden die Zellen in der Heraeus Variofuge abzentrifugiert.
Achtung: Die gewünschten Phagen befinden sich im Überstand.
 Anmerkung: Zum Abzentrifugieren von Zellen wäre eine höhere g-Zahl besser, die Variofuge
leistet jedoch nicht mehr und die Rotoren anderer Zentrifugen fassen nicht genug Proben für den
gesamten Kurs. Im Labor verwenden wir 9000 × g.
 Der Überstand wird in ein neues Gefäß überführt und es wird 1/6 Volumen der
Phagensuspension an PEG/NaCl-Lösung zugegeben.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation


- 14 -
Die Phagen fallen bei einer Inkubation bei 4°C aus; diese erfolgt über Nacht. Hierzu werden die
Proben in den Kühlraum gebracht. (Anmerkung: wenn man es eilig hat und eine schlechtere
Fällung in Kauf nimmt reichen zwei Stunden.)
Die Phagen werden am nächsten Tag aufgearbeitet.
Dienstag
Materialien
 siehe auch erster Kurstag
 Zellen, Phagen, Platten und Immunoröhrchen aus erstem Kurstag
 Photometer, das Spektren aufzeichnen kann
 Einwegküvetten, Quarzküvette
 Wasserbad 45 °C
 Reagenzgläser, Ständer
 Brutschrank
 Kultur für Phagenamplifikation
 Kultur für Phagentiter
 Wischtücher
 Spritzflasche
Kultur für die Phagenamplifikation
Wie am ersten Kurstag. Die Zellen werden während der 2. Phagenfällung ausgegeben.
Immunoröhrchen und Platten blocken
 Die Streptavidin-Lösung in den belegten Immunoröhrchen und in den Platten wird verworfen.
 Die belegten Immunoröhrchen (ca. 4 ml) und Mikrotiterplatten Vertiefungen (ca. 400 μl) werden
randvoll mit 5 mg/ml BSA in NaHCO3-Puffer gefüllt. Das benötigte Volumen abschätzen und
ausreichend Blocklösung mit der BSA Stammlösung und dem NaHCO3 Puffer in einem 50 ml
Plastikschraubgefäß ansetzen.
 Mindestens 1 h durch Schwenken bzw. Rollen bei Raumtemperatur die Oberflächen blockieren.
 Die Blocklösung durch Ausgießen bzw. Abschlagen verwerfen und die Platten bzw. Röhrechen
bei 4 °C verschlossen bzw. abgedeckt lagern.
 Die Oberflächen vor Gebrauch 3 mal mit TBST-Puffer waschen.
Phagenfällung aufarbeiten
 Gefällte Phagensuspension 15 min bei 5000 × g, 4 °C zentrifugieren.
 Achtung: die gewünschten Phagen befinden sich im Zentrifugat (=Pellet).
 Überstand vorsichtig dekantieren und verwerfen, restliche Flüssigkeit vorsichtig mir einer
Pipette abnehmen. (Anmerkung: man kann das Plastikgefäß zum Auslaufen auch auf einem
Papier auf den Kopf stellen, dies kann jedoch eher zu Kontaminationen führen)
 Zentrifugat in 1 ml TBS aufnehmen und in ein 1.5 ml Eppi überführen.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 15 -

5 min bei 13000 ×g zentrifugieren
 Überstand mit den gelösten Phagen in eine neues Eppi geben.
 Für eine zweite Fällung 1/6 Volumen PEG/NaCl zugeben (ca. 167 μl).
 20 min - 60 min auf Eis inkubieren. (Anmerkung: Eine längere Lagerung der zweiten PEG/NaCl
Fällung verbessert die Ausbeute; 20 min passen jedoch besser zum Praktikum). In der Wartezeit
werden die Zellen ausgegeben.
 8 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.
 Überstand vorsichtig mit einer Pipette abnehmen und verwerfen.
 Zentrifugat in 300 μl TBS aufnehmen.
 1 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.
 Überstand in ein neues Eppi geben.
 Die durch PEG-Fällung gereinigten Phagen auf Eis lagern.
Anmerkung: Für eine längere Lagerung der gereinigten Phagen können diese aufgrund ihrer
geringen Größe noch sterilfiltriert werden.
Panning Runde P3
wie am ersten Kurstag
Titerbestimmung Amplifikation P2 durch Absorptionsmessung
Filamentöse Phagen besitzen bezogen auf die Masse ca. sechsmal mehr Protein als DNA. Das
Absorptionsspektrum der Phagen ist daher durch ein breites Plateau von 260 - 280 nm
gekennzeichnet mit einem flachen Maximum bei 269 nm. (Andere Phagen wie λ oder T4 besitzen
etwa gleiche Massen an Protein und DNA). Nach Day und Wiseman kann die Phagenkonzentration
aus der Differenz der Absorption bei 269 und 320 nm berechnet werden.
( A269  A320 )  6 1016
Phagen / ml 
Verdünnungsfaktor
Anzahl _ der _ Basen _ Phagengenom
Gemessen wird gegen eine Referenz mit reinem TBS Puffer. Der Abzug der Absorption bei 320
nm, einer Wellenlänge bei der Proteine und DNA fast nicht absorbieren, dient der Korrektur des
Streulichtes durch Phagenpartikel und partikuläre Verunreinigungen. Noch genauer kann das
Streulicht durch eine lineare Extrapolation der Absorption zwischen 350 und 320 nm auf 269 nm
approximiert werden. Der verwendete Phage M13kelib besitzt 7265 Basen. Zur Messung wird ein
Spektrum von 350 bis 220 nm aufgenommen. Um das eingesetzte Volumen klein zu halten, wird in
einer geschwärzten und gesockelten Quarzmikroküvette gemessen. Hierzu werden 10 μl der
Phagenamplifikation in 290 μl TBS aufgenommen.
Sollte bei der Titerbestimmung ein ungewöhnlich niedriger Wert bestimt werden, sollte der Ansatz
zur Panning Runde P3 nachgebessert werden.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 16 -
Phagenamplifikation P3
wie am ersten Kurstag (eine frische Kultur zur Infektion wird ausgegeben).
Mittagspause
Titerbestimmung Eluat P2, Amplifikation P2 und Eluat P3 durch Plattieren
 9 LB X-gal/IPTG Platten im Brutschrank auf 37 °C aufwärmen.
 9 sterile Reagenzgläser in einem Wasserbad auf 45 °C vorwärmen.
 Top-Agar (LB + 0,7% Agar) in der Mikrowelle im 4. Stock aufkochen, jeweils 3 ml in die
erwärmten Reagenzgläser geben und weiterhin bei 45 °C flüssig halten.
 Durch serielles Verdünnen eine 1:102, 1:103 und eine 1:104 Verdünnung des Phageneluats der
Runde P2 und P3 herstellen (z.B. 10 μl zu 990 μl LB Medium ergibt eine 1:102 Verdünnung,
hiervon 100 μl zu 900 μl LB Medium ergibt eine 1:103 Verdünnung usw., die Pipettenspitze
dabei mehrmals füllen und leeren, für jede Verdünnung eine neue Pipettenspitze verwenden,
nach jeder Verdünnung gut mischen).
 Durch serielles Verdünnen eine 1:108, 1:109 und 1:1010 Verdünnung des Phagenamplifikats der
Runde P2 herstellen (z.B. 10 μl zu 990 μl ergibt eine 1:102 Verdünnung, hiervon 10 μl zu 990 μl
eine 1:104 Verdünnung, usw. ergibt 1:106 und 1:108, hiervon 100 μl zu 900 μl eine 1:109
Verdünnung. Bei seriellen Verdünnung ergeben sich größere Pipettierfehler und die Adsorption
der Phagen an die Gefäßwände kann sich bemerkbar machen. Wieviel Liter würde man
benötigen, wenn man 10 μl direkt 1:1010 verdünnen wollte?).
 Für jede Verdünnung 190 μl der Zellen der Infektionskultur bei OD 0,5 in ein Eppi geben.
 10 μl der jeweiligen Phagenverdünnung zu den vorbereiteten Zellen geben, mischen und 5 min
für die Infektion bei Raumtemperatur stehen lassen.
 Top-Agar aus dem Wasserbad nehmen, kurz auf ca. 42 °C abkühlen lassen, die infizierten Zellen
zugeben, durch mehrmaliges Schwenken gut durchmischen, auf die warmen LB-Platten gießen
und durch Schwenken und Kippen gleichmäßig verteilen.
 Nach dem Härten die Platten über Nacht im Dunkeln bei 37 °C bebrüten.
 Anmerkung: vor dem Bebrüten können die Platten einige Zeit im Dunkeln bei Raumtemperatur
gelagert werden. ( Die Platten können auch ohne Lichtschutz gehandhabt werden, die
Farbintensität nimmt jedoch im Laufe der Zeit erheblich ab. Um den Luftzutritt zu den Platten zu
erhalten, dürfen die Platten nicht eingewickelt, sondern nur abgedeckt werden)
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 17 -
Mittwoch
Materialien
 Zahnstocher
 DNAprep-Säulchen
 Heizblock 50°C
Aufarbeitung der Phagenfällung
wie bereits beschrieben
Titerbestimmung Amplifikation P3
wie bereits beschrieben durch Absortionsmessung
Präparation Einzelsträngiger DNA (wird zuert angesetzt)
 Jeder Kursteilnehmer pickt mit Hilfe eines Zahnstochers einen Klon der Titerbestimmung seiner
3. panning Runde und infiziert eine 4 ml Kultur von ER2738 in der frühen log-Phase. Danach
wachsen die Zellen ca. 4 h bei 37 °C. Die DNA Präparation erfolgt mit Hilfe einer
Silicamembran-Chromatographie. Im Folgenden ist die Anleitung des Herstellers für die
Verwendung dieses “Kits” wiedergegeben. Während des Zellwachstums werden die anderen
Versuche des Tages angesetzt.
QIAprep Spin M13 Protocol, QIAprep M13 Handbook 02/99
This protocol is designed for preparation of single-stranded M13 DNA from 1– 3 ml E. coli culture
grown in 2x YT or LB medium, using spin columns in a microcentrifuge. Up to 3 μg of ssDNA can
be expected per 1 ml phage supernatant depending on the particular phage clone. E. coli strains used
for infection must contain the F’episome that drives pilus biosynthesis (e.g., JM101, JM109, TG1).
 1. Grow an infected M13 culture.
Cultivation of M13 infected cultures should be performed at 37°C with constant agitation. Do
not grow cultures infected with recombinant M13 bacteriophages for longer than 5–6 hours.
Longer growth results in selection of deletion mutants and contamination of cultures with M13
RF, chromosomal DNA, and nucleases from lysed cells. For general information about M13
propagation, refer to the Appendix on page 28 or to molecular biology manuals such as “Current
Protocols in Molecular Biology”, Ausubel, F.M. et al., eds (1991), Chapter 1.14.
Mittagspause



2. Spin down bacterial cells at 5000 rpm for 15 min at room temperature.
3. Transfer supernatant containing M13 bacteriophage to a fresh reaction tube. Be careful not to
disturb the bacterial pellet. Any carryover of bacterial cells will result in contamination of the
M13 precipitation with bacterial chromosomal DNA or double-stranded bacteriophage RF DNA.
4. Optional: Repeat the centrifugation step. A second centrifugation step may be necessary to
ensure a clean supernatant fraction, and no bacterial cell carryover.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation









- 18 -
5. Add 1/100 volume of Buffer MP for M13 precipitation. (i.e., 10 μl per 1 ml of phage
supernatant.) Mix by vortexing and incubate at room temperature for at least 2 min. During this
step, bacteriophage particles are precipitated from the culture medium.
6. Place a QIAprep spin column in a 2-ml microcentrifuge tube and apply 0.7 ml of the sample to
the QIAprep spin column. The bacteriophage supernatant must be loaded in successive 0.7 ml
fractions due to the capacity of the QIAprep spin column.
7. Centrifuge for 15 sec at 8000 rpm and discard flow-through from collection tube. During this
step intact bacteriophage are retained on the QIAprep silica-gel membrane.
8. Repeat the loading and centrifugation (steps 6 and 7) until all of the sample has been loaded
onto the QIAprep spin column.
9. Add 0.7 ml Buffer MLB, for M13 lysis and binding, to the QIAprep spin column and
centrifuge for 15 sec at 8000 rpm. This step creates appropriate conditions for binding of the
M13 DNA to the QIAprep silica-gel membrane. Bacteriophage lysis begins.
10. Add another 0.7 ml Buffer MLB to the QIAprep spin column, and incubate for 1 min at room
temperature to lyse bacteriophages completely. Centrifuge for 15 sec at 8000 rpm. M13 singlestranded DNA is released from bacteriophage particles and adsorbed to the QIAprep silica-gel
membrane.
11. Add 0.7 ml Wash Buffer PE and centrifuge for 15 sec at 8000 rpm. Residual salt is removed
in this step.
12. Discard Wash Buffer PE from collection tube. Centrifuge QIAprep spin column for 15 sec at
8000 rpm to remove residual Buffer PE. It is important to dry the QIAprep membrane with a
quick microcentrifugation step. This prevents residual ethanol from being carried over into
subsequent reactions.
13. Place QIAprep spin column in a clean 1.5-ml microcentrifuge tube. To elute DNA add 100 μl
of Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) to the center of the column membrane, incubate for 10
min, and centrifuge for 30 sec at 8000 rpm. Incubation of elution buffer in the QIAprep spin
column significantly increases the recovery of single-stranded M13 DNA molecules, which
adsorb tightly to the silica membrane. If yields are low or variable, recovery may be enhanced by
preheating the elution buffer to 50°C. The DNA can also be eluted with H2O. When using water
for elution, make sure that the pH is in the range 7.0–8.5. Elution efficiency is dependent on pH
and the maximum elution efficiency is achieved within this range.
Konzentrationsbestimmung der DNA
20 μl der DNA-Lösung werden mit 280 μl EB-Puffer gemischt und das Absorptionsspektrum von
340 bis 220 nm aufgenommen. Als Referenz wird das Spektrum von reinem EB-Puffer verwendet
bzw. abgezogen. Die DNA Konzentration wird aus der Absorption bei 260 nm abzüglich des
Streulichtes bei 320 nm berechnet.
Kursteil 2: gerichtete Evolution
(siehe Skript)
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 19 -
Donnerstag
Materialien
 Ultrazentrifuge, Schweißgerät, Waage, Pinzette, Bechergläser
 CsCl Lsg 0,4 g/ml
 Quickseal Röhrchen, Kanülen, 5ml Spritzen
 Stativ, Hintergrund, Taschenlampe
 Photometer
 Aliquotiertes ABTS
 ELISA Reader
Phagenreinigung in einem Cäsium Chlorid Gradienten und Ultrazentrifugation
 Etwa 80% des Volumens der PEG-Fällung der 3. Runde (Achtung: es werden noch Phagen für
den Phagen ELISA benötigt) werden zu 5 ml einer CsCl/TBS-Lösung gegeben, die 2 g CsCl
enthält. Durch mehrmaliges Umdrehen des Plastikgefäßes wird gemischt.
 Mit Hilfe einer Spritze und Kanüle werden 5 ml in ein beschriftetes 13 × 38 mm Polyallomer
Quick-Seal Zentrifugenröhrchen geben.
 Nach dem Einfüllen durch Absaugen sicherstellen, daß der Hals des Röhrchens trocken ist. An
einer elektronischen Waage werden die Röhrchen mit Hilfe der Platzhalter und Deckel paarweise
auf 10 mg genau tariert. Mit einem speziellen Schweißgerät werden die Röhrchen verschlossen
und durch Drücken auf Dichtigkeit geprüft.
 Die Zentrifugation erfolgt in einer Ultrazentrifuge bei 60 000 rpm (ca. 400 000 × g) für 4 h in
einem Beckman VTi 65.2 Rotor, die Beschleunigung wird “schnell” und die Bremse auf
“langsam” eingestellt.
Anmerkung: Die Zentrifuge darf nur nach Einweisung bedient werden. Bei dem Rotor handelt es
sich um einen Vertikalrotor bei dem sich die Schichten im Gleichgewicht vertikal ausbilden.
Während des langsamen Abbremsens (15 bis 20 min) lagern sich die Schichten in eine
horizontale Lage um. Ein Vertikalrotor wird verwendet, da sich bei diesem aufgrund der kurzen
Strecke der Dichtegradient schnell ausbildet. Nach Beendigung der Zentrifugation die Röhrchen
sehr vorsichtig herausnehmen um eine Durchmischung der Schichten zu vermeiden.
 Gewinnung der Phagen:
Das Zentrifugenröhrchen wird mit einer Stativklemme an einem Stativ befestigt und vor einem
schwarzen Hintergrund von oben mit einer ebenfalls am Stativ befestigten Taschenlampe
durchleuchtet. Aufgrund des Streulichts erscheint die Phagenbande milchig weiß. Zur Belüftung
des Röhrchens eine Kanüle an der Spitze des Röhrchens einstechen. Eine zweite Kanüle
unterhalb der Phagenbande einstechen und nach schräg oben führen bis die Öffnung an der
Phagenbande anliegt. Bei der Verwendung der Kanülen nicht auf die eigene Hand zielen!! Die
Phagenbande von etwa 400 bis 500 μl vorsichtig absaugen.
 Anmerkung: Üblicherweise wird das CsCl durch Verdünnung (z.B. 2,5 ml TBS) und nochmalige
pelletierende Zentrifugation (z.B. 50 000 rpm / 135 000 × g) oder Dialyse entfernt.
 Von den gereinigten Phagen wird ein Spektrum gegen CsCl/TBS-Puffer aufgenommen.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 20 -
Phagen ELISA
 Die belegte und geblockte Mikrotiter-Platte wird 5 x mit TBST gewaschen.
 Für den Phagen ELISA werden die Phagenamplifikate eingesetzt. Für jede Panning-Runde
werden drei serielle Verdünnungen angesetzt, wobei die erste und zweite Verdünnung als
Doppelbestimmung durchgeführt werden. Die Vertiefungen werden mit jeweils 75 μl gefüllt. Die
Phagenkonzentration sollte dabei anhand der Absorptionsspektren so gut wie möglich bestimmt
werden. Bei der geringsten Verdünnung, also der höchsten Phagenkonzentration, sollen 5×1012
Phagen in jede Vertiefung pipettiert werden. Hierzu werden die Phagen mit TBST / 3 mg/ml
BSA verdünnt. Bei sehr geringen Ausbeuten werden die Phagen unverdünnt eingesetzt. Die
Phagen der Runde P0 werden mit Konzentrationsangabe ausgegeben. Das folgende
Pipettierschema sollte angewendet werden:







Zeile
Spalte
3
P0
4
P2
5
P3
6
B
P0 5*10^12
P2 5*10^12
P3 5*10^12
2. Ak
C
P0 5*10^12
P2 5*10^12
P3 5*10^12
1.+ 2. Ak
D
P0 5*10^11
P2 5*10^11
P3 5*10^11
nur ABTS
E
P0 5*10^11
P2 5*10^11
P3 5*10^11
F
P0 5*10^10
P2 5*10^10
P3 5*10^10
Die Phagen werden 45 - 60 min bei RT auf einer Plattform geschüttelt.
Die Platten werden abgeschlagen und 5 mal mit TBST gewaschen. Der Flüssigabfall wird in ein
Becherglas gegeben.
Jeweils 75 μl eines murinen monoklonalen anti-M13genVIII Antikörpers, der mit Peroxidase
gekoppelt ist, werden in einer Verdünnung von etwa 1:3000 zugesetzt.
Anmerkung: Häufig verwendet man einen primären monoklonalen Antikörper und einen
generell einsetzbaren sekundären Antikörper der mit einem Enzym gekoppelt ist. Dies ist in der
Regel sensitiver und billiger, erfordert jedoch einen weiteren Arbeitsschritt und das Signal ist
weniger linear zur Antigendichte.
45 - 60 min schütteln.
5 mal waschen.
Jeweils 75 μl einer ABTS Substratlösung zusetzen, die aliquotiert ausgegeben wird (1 g/l ABTS,
3.25 mM Na-Perborat, 40 mM Zitronensäure, 60 mM Di-Na-Hydrogenphosphat, pH 4,5).
Nach ca. 20 min Farbveränderung beobachten und qualitativ festhalten. Die Platten werden
genauer mit einem Mikrotiterplattenlesegerät bei 405 nm ausgewertet (im Labor 4. OG Ost).
Freitag
Kursteil 2
Vorträge Doktoranden
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 21 -
Montag (zweite Woche)
Materialien
 Glasplatte (80x100 mm), weiße Porzellanplatte mit
Ohren (80x100 mm)
 Zwei
Abstandshalter, Kamm (Dicke muss
zusammenpassen)
 Klebeband, Klammern zum Abdichten
 10 ml Spritze mit Kanüle (zum Ausspülen der
Taschen)
 Vertikal Gelelektrophorese Apparaturen
 Stromnetzgeräte, Anschlusskabel
 Heizblock 95°C; Eis
 70% EtOH, 20% Isopropanol
 2 Bechergläser zum Pipettieren
 Glaspipetten, Pipettierhilfe
 Handschuhe, Schutzbrille
Je zwei Gruppen stellen zusammen ein SDS Gel her und lassen es gemeinsam laufen. Jeder
Teilnehmer trägt seine Phagenprobe (Gereinigtes Amplifikat P2 oder P3) auf wertet diese aus.
SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS PAGE), Gel gießen
 Glasplatte, Porzellanplatte, Abstandshalter und Kamm mit 70% Ethanol reinigen und zum
Trockenen auf eine saubere Unterlage legen.
 Gelkammer zusammenstapeln: Glasplatte unten, im Querformat links und rechts Abstandshalter
an der Kante anlegen, Porzellanplatte auflegen.
 Gelkammer abkleben: vorsichtig an der Tischkante der mit der Unterseite (ohne Ohren)
überstehen lassen und mit sanftem Druck zusammenhalten, Klebebeand mittig auf den Rand
setzen und an beiden Seiten straff umfalzen und faltenfrei auf die Platten kleben, an den Enden
Klebeband knapp überstehen lassen und zusammenkleben; Gelkammer an Tischkante drehen
und an den beiden Seiten ebenso verfahren, jedoch die Oberseite frei lassen.
 Gelkammer mit je 2 Klammern an den geklebten Seiten zusammenhalten.
 Trenngellösung im Becherglas zusammenpipettieren:
Lösung
Trenngel
Sammelgel
H2O
4,8 ml
6,8 ml
Acrylamid/Bisacrylamid
6,3 ml
1,7 ml
1,5 M Tris/HCl pH 8,8
3,5 ml
1 M Tris/HCl pH 6,8
1,3 ml
20% (w/v) SDS
75 µl
50 µl
(Sodium dodecyl sulfate)
10% (w/v) APS
150 µl
100 µl
(Ammonium Peroxydisulfate)
TEMED
10 µl
10 µl
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation










- 22 -
Mit Pipettenspitze durch Rühren blasenfrei mischen.
Kammer mit der Aussparung nach oben leicht schräg halten und Trenngellösung mit dem
Becherglas Blasenfrei hineingießen bis zu einer Höhe von ca. 5 cm. Trenngellösung vorsichtig
mit 500 µl Wasser gesättigtem Isopropanol überschichten. Auf Papiertuch abstellen und
waagrecht justieren. (Wenn das Gel ausläuft, Prozedur von vorne wiederholen)
20 - 30 min polymerisieren lassen.
Isopropanol durch Strürzen auf Papiertuch entfernen.
Sammelgellösung pipettieren (siehe oben) und auf das Trenngel gießen.
Über einem Papiertuch Handschuhe tragend Kamm zwischen die Glasplatten in das Trenngel
schieben.
Gel 20 – 30 min polymerisieren lassen.
Klebeband entfernen.
Kamm langsam nach oben abziehen und Taschen mit Laufpuffer mit Hilfe von Spritze und
Kanüle vorsichtig ausspülen.
Gel in Gelkammer mit Klammern einspannen und Laufpuffer in obere und untere Kammer
füllen, so dass der Puffer über den Taschen steht.
Probe vorbereiten und Elektrophorese starten
11
 2×10 Phagen mit dem 5-fachen Volumen an Protein-Auftragspuffer (Ladepuffer) 250 mM
Tris/HCl pH 8,0, 500 mM DTT, 50% (v/v) Glycerin, 10% SDS (w/v) 0.5% (w/v)
Bromphenolblau Na-Salz, mischen.
 10 min bei 95°C erhitzen und dann 1 min bei max Geschwindigkeit abzentrifugieren.
 Mit 20 µl Pipette ca. je 15 µl Proben und Molekulargewichtsmaerker vorsichtig in Tasche
auftragen. Proben am besten links und rechts des Markers assymetrisch auftragen, z.B. ein und
zwei Taschen entfernt.
 Apperatur mit richtiger Polung an Stromversorgung anschließen (SDS ist negativ geladen und
läuft zum Plus-Pol/Anode) und Gel spannungskontrolliert bei 120 V laufen lassen.
 Der Lauf ist beendet, wenn der Farbmarker den unteren Rand des Gels erreicht.
Gel Färben und Auswerten
 Stromversorgung abklemmen und Gel aus der Kammer nehmen.
 Platten mit Hilfe der Abstandshalter langsam und vorsichtig trennen, so dass das Gel auf einer
Platte liegt.
 Gel vorsichtig in eine Dose fallen lassen und mit 0,05% Coomassie R-250 Lösung ca. 30 min
unter Schwenken auf dem Schüttler färben.
 Färbelösung in Sammelgefäß geben und Gel mit 20% Essigsäure unter Schwenken entfärben, bis
Banden gut zu erkennen sind. Ggf. Entfärbelösung 1- 2 mal ersetzen.
 Laufstecke der Banden mit Lineal ausmessen und auf eine Eichgerade des Markers in eine x,y
Grafik
mit
logarithmischer
Molekulargewichtsachse
eintragen.
Aufgrund
der
Molekulargewichtsbestimmung sollen die Banden den bekannten Phagenproteinen zugeordnet
werden.
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 23 -
Dienstag (zweite Woche)
Materialien
 Sequenzier Pre-Mix
 PCR-Maschine
 Sequenziergerät / Sequenzierservice
Sequenzierreaktion
Protokoll für Applied Biosystems Gerät
 Reaktionsansatz: Für die Sequenzierreaktion werden die folgenden Reagenzien in ein
dünnwandiges 500 μl PCR Gefäß pipettiert.
Premix+Primer 2.0 μl (wird im Eppi ausgegeben)
ssDNA-Template ca. 0.1 μg (typisch 2-3 μl, die DNA-Konzentration wurde durch
Absorptionsmessung bestimmt)
H2O auf 10 μl
Anmerkungen: Das “Premix” enthält Taq Polymerase, Puffer, dNTP und fluoreszenzmarkierte
ddNTP in jeweils 4 unterschiedlichen Fluoreszenzfarben. Es werden 10 pmol Primer mit dem
“Premix” ausgegeben. Größere DNA Mengen liefern in der Regel stärkere Signale.

Thermocycler Protokoll ( Eppendorf Mastercycler PCR Maschine): Bei diesem Schritt erfolgt
die eigentliche Sequenzierreaktion.
Gerätegrundeinstellung:
Standardgeschwindigkeit 3 °C/s (gilt, wenn nicht im Programm anders definiert)
500 μl Gefäß (wird vor dem Start des Programms abgefragt)
10 μl Füllvolumen (wird vor dem Start des Programms abgefragt)
105 °C geheizter Deckel
Auto-Abkühlung des Deckels nach Ende des Programs
Programm:
Schritt 1) 96 °C bis Eingabe (dient dem Aufheizen der Maschine und des Deckels; hier
erfolgt die Zugabe der vorbereiteten Probengefäße und Bestätigung der Fortführung des
Programms)
Schritt 2) 96 °C für 30 s (dient der Denaturierung der DNA)
Schritt 3) 50 °C für 15 s (diese Temperatur soll knapp unterhalb der Schmelztemperatur des
Primers liegen)
Schritt 4) 60 °C für 4 min (bei diesem Schritt werden die Primer verlängert bis zu einem
Abbruch mit ddNTP)
Schritt 5) Wiederholung ab einschließlich Schritt 2) 14 mal
Schritt 5) 4 °C halten, bis Eingabe
Schritt 6) Ende
Nach Beendigung des Programms kurz zentrifugieren, um die Probe am Gefäßboden zu
sammeln. Hierzu wird das kleine Gefäß in ein 1.5 ml Eppdorfgefäß gestellt.

Probenreinigung: Die Sequenzierreaktion enthält nicht inkorporierte fluoreszenzmarkierte
ddNTP, die mit dem Auslesen von bis zu 40 Basenpaaren interferieren würden. Diese müssen
Gentechnik Kurs: Phagen Präsentation
- 24 -
daher durch z.B. Größenausschlußchromatographie abgetrennt werden. Hierzu werden
Zentrifugiersäulchen gepackt und eingesetzt. Das Säulenmaterial darf während der einzelnen
Arbeitsschritte
nicht
austrocknen.
Das
Sephadex
G50
Material
für
die
Größenausschlußchromatographie ist mindestens 30 min vorgequollen und wird gebrauchsfertig
ausgegeben, eventuell überschüssiges Wasser vor Gebrauch dekantieren.
o
Die Vorratsflasche wird durch zweimaliges Schwenken durchmischt. Mit einer
abgeschnittenen 1 ml Spitze werden 700 μl auf eine Spin-Säule mit Fritte geben und diese
in ein 2 ml Zentrifugiergefäß geben.
o
2 × 2 min bei 1000 ×g zentrifugieren (es bleibt genau so viel H2O zurück wie das
Säulenmaterial aufnehmen kann), das Zentrifugat verwerfen, Zentrifugiergefäß aufheben.
Bei der Zentrifugation auf die Orientierung des Eppi achten.
o
Den Sequenzieransatz mit H2O auf 20 μl auffüllen.
o
Säule in ein beschriftetes 1.5 ml Reaktionsgefäß geben und den 20 μl Reaktionsansatz
mittig auf das schräg liegende Säulenmaterial geben
o
2 min bei 1000 × g zentrifugieren (falls weniger als 12 μl eluieren, nochmals
zentrifugieren)
o
Das Eluat in ein 200 μl Eppi überführen und auf Eis aufbewahren.
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Probenauftrag: Die Proben werden gesammelt und von der Arbeitsgruppe Igloi in die
Sequenziermaschiene geladen. Die Sequenzprofile werden am nächsten Tag verteilt.
Bei der Abgabe der Proben wird das Sequenziergerät vorgestellt.
Mittwoch (2. Woche)
nur 2. Kurteil
Donnerstag (2. Woche)
Material
CIP pool, 10 Computer mit Internetanschluß, Internet browser, swiss pdb viewer, acrobat reader,
Grafikprogramm, LCD Projektor, Leinwand, Internetanschluss für Laptop
Proteinstruktur Darstellung und Manipulation am Computer, DNA und Proteindatenbanken
Freitag (2. Woche)
Sequenzierauswertung, Klonierung am Computer