Kurstag D

Kurs 2
Themen:
Streptokokken
Staphylokokken
Pneumokokken
Neisserien
Listerien
1
Aufgaben:
1. Kulturplatte des Fingerabdruckes betrachten.
2. Kulturplatte des Rachenabstriches betrachten.
3. Isolierung vom 3-Ösen-Ausstrich (Bakt.- Gemisch aus Kurs 1 )
4. Keime wurden auf Blutagar ausgestrichen und 24 Std. lang im Brutschrank bei 37°C bebrütet.
Beschreiben Sie im Protokollblatt:
- Farbe , Form der Kolonie
- Hämolyse ( - ,- ,-Hämolyse )
5. Koagulase testen.( Staph. aureus, Staph. epidermidis )
6. DNAase Test für Staphylococcus aureus und S. epidermidis auswerten. ( pro Reihe ausgeteilt )
7. Katalase testen. (Staphylokokken, Streptokokken )
8. Überprüfung der Optochinempfindlichkeit.
9. Werten Sie den pro Bank ausgeteilten Äskulin – Test aus und tragen das Ergebnis in Ihr
Protokollblatt ein.
10. Cytochromoxydase testen ( apathogene Neisserien ).
11. Zur Ansicht steht auf der ersten Bank eine CTA Reihe.
12. Mikroskopieren Sie die pro Team ausgeteilten Präparate:
- Staphylokokken-Eiter
- Streptokokken-Eiter
- Pneumokokken-Eiter
- Meningokokken-Liquor
- Gonokokken-Eiter
- Erythrozyten + Leukozyten
2
Arbeitsanleitungen zu Kurs 2
Isolierung vom 3-Ösen-Ausstrich:
Auf Ihrem Arbeitsplatz liegt eine Blutagarplatte und eine MacConkeyplatte. Bitte kennzeichnen Sie
mit dem roten Fettstift den Boden Ihrer Platte mit Ihrer Platznummer und teilen Sie die Platte mit
einem Strich.
Betrachten Sie den 3-Ösen-Ausstrich aus der ersten Kurswoche.
Mit der ausgeglühten Isolierungsöse sollen Sie jetzt eine weisse Kolonie antippen und auf die eine
Hälfte der von Ihnen beschriftete Blutplatte und MacConkeyplatte überimpfen. Danach überimpfen Sie
eine gelbe Kolonie mit der erneut ausgeglühten Öse auf die andere Hälfte der Blut- und MacConkeyagarplatte.
Legen Sie beide Platten bitte auf die Ablage. Die Kursassistenten sammeln diese dann ein.
Die Platten werden 24 Stunden bei 37° Celsius bebrütet.
Beurteilung der Hämolyse:
Alpha-Hämolyse: -hämolysierende Bakterienkolonien sind auf Frischblutagar von grünen
Höfen umgeben. Bei partiell intakten Erythrozytenmembranen ist es zur Umwandlung von Hämoglobin
in Met- und Sulfhämoglobin gekommen.
Beta-Hämolyse: -hämolysierende Bakterienkolonien sind auf Frischblutagar von vollständig
entfärbten, durchsichtigen Höfen umgeben. Die roten Blutkörperchen wurden vollständig aufgelöst
und das Hämoglobin wurde zu farblosen Substanzen abgebaut.
Gamma-Hämolyse: Dieser Begriff (-Hämolyse) steht für keine makroskopisch sichtbare Veränderung
des Frischblutagars im Kolonienbereich.
3
Koagulase :
Durch dieses Enzym wird das Fibrinogen im Citratplasma von Menschen und Kaninchen in Fibrin
überführt. Suspendiert man Staphylococcus aureus in einen auf einem Objektträger befindlichen
Citratplasma-Tropfen, so kommt es zur Ausfällung von Fibrin, in dessen Netzwerk die Staphylokokken
eingebettet sind. Makroskopisch erkennt man die Bildung kleiner Klümpchen in klarer Flüssigkeit
(positives Ergebnis), die an eine Agglutination denken lassen. Im Gegensatz zu anderen
Staphylokokken besitzen fast alle Staphylococcus aureus-Stämme diesen "Clumping factor" an ihrer
Zelloberfläche.
Durchführung:
Führen Sie den Test mit Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis durch.
Nehmen Sie eine zu prüfende Kolonie und verreiben Sie diese auf einem Objektträger zwischen 1
Tropfen Kochsalzlösung und daneben 1 Tropfen Plasma. Vermischen Sie anschließend den Keim mit
dem Kochsalztropfen und dann mit dem Plasmatropfen. Achten Sie darauf, dass die beiden Tropfen
nicht miteinander vermischt werden.
DNase (Desoxyribonuklease) – Test:
DNase, ein von verschiedenen Bakterienarten produziertes, extrazelluläres Enzym, hydrolysiert DNA
zu kleineren aus Nukleotiden bestehenden Einheiten. Im Gegensatz zur DNA sind Nukleotide im sauren
Milieu löslich. Wird ein DNA-haltiger Nährboden nach Ausbildung von Wachstum mit Säure geflutet,
zeigen sich um DNase positive Kolonien klare Zonen, während der übrige Nähboden durch Ausfällung
der DNA getrübt ist.
Staphylokokken Stämme wurden strichförmig auf die DNA Platte aufgeimpft; nach 24stündiger
Bebrütung bei 36°C mit 1M Salzsäure vorsichtig überflutet.
Betrachten Sie die Platte und tragen das Ergebnis in den Protokollbogen ein:
Positiv: Klare Zone um den Wachstumsbereich.
Negativ: Keine Veränderung der Kolonieumgebung
Katalase – Test:
Katalase-positive Bakterien (z. B. Staphylokokken) spalten das Wasserstoffperoxid einer
3 %igen H2O2-Verdünnung, wobei der freiwerdende Sauerstoff zur Bläschenbildung führt.
Durchführung: Verreiben Sie mit einer Öse 2 - 3 Kolonien von den Staphylokokken, bzw.
Streptokokken auf einen Objektträger. Tropfen Sie Katalasereagenz (H2O2) auf diesen Bereich. Eine
positive Reaktion erkennt man an der Bläschenbildung.
Positiv: Rasche Entwicklung von Gasblasen in der Flüssigkeit
Negativ: Keine Gasentwicklung
4
Darstellung und Überprüfung der Optochinresistenz zur Differenzierung von S. pneumoniae
Streptococcus pneumoniae („Pneumokokken“) bildet auf Blutagar kleine, vergrünende Kolonien, die
denen von Viridansstreptokokken ähneln. Wegen des sehr unterschiedlichen Virulenzpotentials ist die
Differenzierung der Gruppen von wesentlicher Bedeutung; etwa im Mund-/Rachenraum oder in
bronchoskopisch gewonnenem Material können beide Spezies vorkommen, Viridansstreptokokken als
Bestandteil der normalen Flora, Pneumokokken als nicht ungewöhnlicher Erreger von Pneumonien.
Obwohl die Kolonieform und eine Färbung nach Gram dem Geübten gute Hinweise liefern, sollte zur
sicheren Differenzierung die Testung auf Optochinresistenz durchgeführt werden.
Optochin (Ethyl-Hydrocuprein) aktiviert in S. pneumoniae, nicht jedoch anderen Streptokokken, eine
Muraminidase, deren Aktivität zur Autolyse der Bakterien führt; entsprechend können die Bakterien in
Gegenwart von Optochin nicht wachsen.
Praktisch ist diese Empfindlichkeit in einem
Agardiffusionstest einfach nachweisbar (mehr zur Resistenztestung von Bakterien im Kursteil E):
Suspensionen der zu testenden Bakterienstämme oder -isolate werden auf einer Agarplatte
ausgestrichen. Anschließend werden kleine Testblättchen, die das Antibiotikum (hier Optochin)
enthalten, aufgelegt, und die Platte wird über Nacht im Bakterieninkubator inkubiert. Während dieser
Zeit diffundiert das Antibiotikum in den Agar ein, und es entsteht ein Konzentrationsgradient der
Chemikalie (am höchsten am Plättchen, nach außen abfallend). Am nächsten Tag erfolgt die
Auswertung: Das zu bewertende Kriterium ist die Hemmhofgröße, d.h. mittelbar die Konzentration,
die das Bakterienwachstum inhibiert (für diese Bewertung gibt es nationale und internationale
Referenzwerte, die je nach Testverfahren herangezogen werden).
Tragen Sie das Ergebnis für Pneumokokken in den Protokollbogen.
Äskulin Nachweis:
Die hydrolytische Spaltung von Äskulin durch gewisse Bakterien setzt Glukose und Äskulin frei, dessen
Phenolanteil mit Eisensalzen reagiert (Schwarzfärbung).
Durchführung:Die Aesculin-Bouillon wurde mit den zu testenden Keimen beimpft und übernacht bei
36°C bebrütet.
Positiv: Schwarzfärbung der Bouillon (Enterokokken, Listerien)
Negativ: Keine Veränderung der Bouillon, Wachstum positiv
5
Cytochromoxidase-Reaktion:
Dieses letzte Enzym der Atmungskette wird nachgewiesen. Positiv reagieren z. B. Neisseria,
Aeromonas und Pseudomonas aeruginosa.
Durchführung: Mit dem Oxidase-Teststreifen ( pro Team verteilt) eine Kolonie der apathogenen
Neisserien antippen. Bei positivem Testausfall verfärbt sich der Streifen innerhalb von 20 Sekunden
tiefblau.
CTA (Cystin Trypticase Agar ) Reihe:
Bunte Reihe zur Kohlenhydratspaltungsprüfung ( Dextrose, Fruktose, Maltose, Saccarose, Lactose )
von Neisserien.
Durchführung: Der zu testende Keim wird nur auf die Oberfläche des Mediums aufgeimpft.
Da entstehende Säure im halbfesten Medium nicht in die übrigen Bereiche des Nährbodens diffundiert,
lässt sich die Kohlenhydratspaltung im Bereich des Bakterienwachstums erkennen,
Positiv: Gelbfärbung(in der oberen Substratschicht)
Negativ:Kein Farbumschlag
Differenzierung grampositiver Kokken
Katalase
-
+
Enterococcus
Staphylococcus
Koagulase
a -Hämolyse
vergrünende
Streptokokken
+
S.aureus
(ß-Hämolyse)
S. epidermidis
S. saprophyticus
6
Streptococcus
ß-Hämolyse
Streptokokken der
serologischen
Gruppen A,B
-Hämolyse
Enterococcus
Protokollblatt
Staph. aureus
Staph.
Pneumoepidermidis kokken
Vergr.
Streptokokken
Enterokokken
Form der
Kolonie
Farbe der
Kolonie
Hämolyse
Katalase
Koagulase
Äskulin
DNase
Oxidase
Optochin
Mikroskop.
Bild
7
StrepNeisseria
Neisseria
Listerien
tokokken
meningitidis gonorrhoeae
z. B.
Gruppe A,B
Für Ihre Notizen:
8