Aufreinigung von GFP aus einem E.-coli

Aufreinigung von GFP aus einem E.-coli-Lysat durch Säulenchromatographie
1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie
(30`)
2.2
2.3
Aufgabe 1: Prüfen Sie Ihr Tube mit dem E.-coliLysat im UV-Feld auf Fluoreszenz.
Notieren Sie Ihre Beobachtung!
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
Zentrifugieren Sie das Bakterienlysat 10 min.
bei 13000 rpm (Umdrehungen pro Minute).
Schütteln Sie die verschlossene
Chromatographiesäule (30 sek.)
um das Säulenmaterial zu
durchmischen.
Warten Sie etwa 2 min. bis sich
das Säulenmaterial abgesetzt hat.
Öffnen Sie die Chromatographiesäule zunächst oben dann unten.
Lassen Sie die Flüssigkeit aus
der Säule vollständig heraustropfen.
Pipettieren Sie 2 ml Ausgleichspuffer (AP) an der Wand
entlang in die Säule.
Lassen Sie den Ausgleichspuffer
bis zur 1 ml Markierung durch
die Säule laufen.
Verschließen Sie die Säule unten
und oben.
Entnehmen Sie Ihr Tube aus der Zentrifuge.
Aufgabe 2: Prüfen Sie Ihr Tube mit dem zentrifugierten E.-coli-Lysat im UV-Feld auf
Fluoreszenz, ohne das
Pellet aufzuwirbeln!
Notieren Sie Ihre
Beobachtung!
1.10 Pipettieren Sie in Ihr gelbes
Tube, das 250 µl Bindepuffer (BP) enthält,
250 µl Überstand des zentrifugierten
Bakterienlysats.
2. Durchführung der Säulenchromato- (30`)
graphie
2.1
Nummerieren Sie Ihre Sammelröhrchen.
2.4
2.5
Öffnen Sie die Chromatographiesäule und
lassen Sie die Säule leer laufen.
Stecken Sie die Säule auf das Sammelröhrchen 1.
Ab jetzt sollte die stationäre Phase der
Chromatographiesäule nicht mehr
aufgeschwemmt/-geschüttelt werden.
Pipettieren Sie 250 µl des verdünnten Bakterienlysats aus dem gelbes Tube BP an der
Wand entlang in die Säule.
Lassen Sie die Säule leer laufen.
Aufgabe 3: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule im UV-Feld auf GFP.
Notieren Sie Ihre Beobachtung!
2.6
2.7
Stecken Sie die Chromatographiesäule um auf das
Sammelröhrchen 2.
Pipettieren Sie 250 µl
Waschpuffer (WP) an der
Wand entlang in die Säule.
Aufgabe 4: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule im UV-Feld
auf GFP.
Notieren Sie Ihre Beobachtung!
2.8
2.9
Stecken Sie die Chromatographiesäule um auf das
Sammelröhrchen 3.
Pipettieren Sie 750 µl Elutionspuffer (EL)
in die Säule.
Aufgabe 5: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule während der Elution im UV-Feld auf
GFP.
Notieren Sie Ihre Beobachtung!
Hinweis: Um ein besonders reines GFP zu erhalten, kann die Säule im Zeitraum der
Elution von GFP auf ein leeres Tube umgesteckt werden.
Das Eluat in Sammelröhrchen 3 wird in ein entsprechend beschriftetes Tube umgefüllt und bis
zur Reinheitsprüfung mittels PolyacrylamidGelelektrophorese bei –18°C aufbewahrt.