Praktikumsbericht Genspirale 1 vom 9
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Vera Traber, 4Ma, 2010 Praktikumsbericht Genspirale 1 vom 9. November 2009 Im Praktikum, welches wir am 9. November 2009 durchführten ging es darum, die wichtigsten Methoden und Handgriffe des gentechnischen Arbeitens kennen zu lernen. Genauso lernten wir, um was es sich genau handelt, wenn man von E. coli spricht. Als erster Schritt der Genspirale haben wir in diesem Praktikum fremde DNA in einen Organismus eingeschleust. Bei diesen Arbeiten, in welchen wir uns mit Bakterien befassen, ist es sehr wichtig, dass man Wert auf eine saubere Arbeitsweise legt. Das sogenannte sterile Arbeiten lernten wir auch in diesem Praktikum. 1. Einführung ins sterile Arbeiten Material 70% Ethanol Mikroliterpipetten Methoden Wir haben ein Zellstofftuch mit 70% Ethanol getränkt und damit die Mikroliterpipette desinfiziert. Genauso haben wir die Arbeitsplatte und unsere Hände mit 70% Ethanol desinfiziert. Da Nährmedien genauso gute Nährböden für unerwünschte Bakterien oder Pilze sind, war diese Vorgehweise notwendig. Aufgaben 70% Ethanol führt zur Denaturierung von Eiweissen zum Beispiel in der Zellwand von Bakterien. Der hohe osmotische Druck der Lösung hilft bei der Zerstörung von Kontaminanten (=unerwünschte Stoffe, die nicht absichtlich hinzugefügt worden sind, sondern durch Verunreinigung). Eine zu niedrige Konzentration von Alkohol ist weniger effektiv und eine zu hohe Konzentration führt zur Aushärtung der Zellwand eines Bakteriums und somit zum Überleben des Organismus. Verwendete Verbrauchsmaterialien müssen vor dem Arbeiten absolut steril sein, sonst geht der Versuch schief. Den Vorgang diese zu sterilisieren (falls sie nicht schon steril erworben worden sind) nennt man Autoklavieren. Man erhitzt dazu die Vera Traber, 4Ma, 2010 Verbrauchsmaterialien in einem Dampftopf für eine gewisse Zeit auf Temperaturen bis zu 120 Grad Celsius. 2. Giessen von Platten mit Nähmedium Material leere Petrischale steriles LB-AGAR-Medium Methoden Nachdem wir den Arbeitsplatz sterilisiert haben, haben wir den Bunsenbrenner entzündet. Um Verunreinigungen zu vermeiden haben wir vom LB-Medium möglichst schnell in die Petrischale gegossen. Jedoch ging das bei unserer Gruppe aufgrund von Unstimmigkeiten etwas zu lange. Da das LB-Medium in der Mikrowelle verflüssigt worden ist, haben wir den Deckel der Petrischale ein klein wenig offen gelassen, um das Abkühlen zu beschleunigen und der Bildung von Kondenswasser entgegen zu wirken. Aufgaben E. coli ernährt sich vor allem von Zucker, bestimmten Aminosäuren und Nukleinsäuren. Das LB-Meidum setzt sich vor allem aus Hefeextrakt (5g/l), Trypton (10g/l) und Natriumchlorid (0.5-10g/l). Für Plattenkulturen wird Agar (15g/l) zugegeben. Diese Angaben unterscheiden sich in den Salzkonzentrationen, die den Bedingungen der Bakterien und den Kulturbedingungen angepasst werden. 3. Pipettieren mit den Mikroliterpipetten Das Einzige was mir persönlich beim Pipieren mit den Mikroliterpipetten Schwierigkeiten bereitete, war die Einstellung zum Volumen. 0.5-10µm und 2-20µm 1 2 5 20-200 µm 1 12.5 µm 2 5 100-1000 µm 1 125 µm 0 0 1 µm Vera Traber, 4Ma, 2010 4. Herstellung eines Ausplatierrechens Um einen Film von Bakterien dünn auf der Oberfläche des Nährmediums zu verteilen benötigt man einen Ausplatierrechen. Den haben wir selbst hergestellt. Material Pasteurpipette Bunsenbrenner Methoden Mit dem Bunsenbrenner haben wir einen kleinen Knick kurz hinter der dünnen Spitze in die Pasteurpipette geschmolzen. Den zweiten knick haben wir kurz hinter der Verjüngung der Pipette im Winkel von 90% geschmolzen. 5. Übertragung von genetischem Material in einem Empfängerorganismus Material (Werkzeug) Mikropipette Eppendorfröhrchen (weiss, grün und gelb) Eis Heizblock 6 Platten mit Nährmedium Glaspetrischale Ausplatierrechen Parafilm Wärmeschrank Material (Stoffe) 1 µm Plasmid-DNS 3 µm pGlo-DNS 3 Mal 35 µm kompetente Bakterien 1ml LB-Medium 70% Ethanol Vera Traber, 4Ma, 2010 Methoden Aufgrund von Zeitdruck haben wir das Eppendorfröhrchen bei Schritt 5 nur 8 Minuten anstatt 10 Minuten im Heizblock gelassen. Sonst kam es zu keiner Abweichung der vorgegebenen Anleitung. Beobachtungen LB-Amp+DNS LB+DNS LB-Amp-DNS LB-DNS LB-Amp+PGlo LB-Amp-Ara+PGlo Auswertung Beim LB+DNS und LB-DNS konnten vereinzelte Bakterien wachsen, da wir keine Zusätze dazu gegeben haben, die das Wachstum der Bakterien gehemmt hätten. Das LB-Medium mit Ampicilin ohne DNS konnten keine Bakterien wachsen, weil Ampicilin sehr bakterienwachstumshemmend wirkt (siehe Anwort zu Frage 3). Beim LB-Nährmedium mit Ampicilin und DNA konnten Bakterien wachsen, da die Bakterien wegen der Zugabe von DNA resistent gegenüber dem Ampicilin geworden sind. Im Vergleich zu den anderen Nährmedien sind hier aber eher weniger Bakterien gewachsen. Vera Traber, 4Ma, 2010 Beim LB-Amp-Ara+pGlo wuchsen auch Bakterien heran. Diese Nährplatte haben wir unter UV-Licht gehalten und dann haben die Bakterien grün geleuchtet. Das ist, weil ein Gen für GFP (grün fluoreszierende Protein) in das pGlo-Plasmid injiziert wurde. Aufgaben Was ist ein Plasmid? In Bakterien vorkommende kleine ringförmige DNA-Moleküle. Sie werden unter natürlichen Bedingungen zwischen verschiedenen Zellen ausgetauscht. Was ist ein Vektor? Hilfsmittel der Gentechnik, um fremdes Erbmaterial in Zellen einzuschleusen. Vektoren werden deshalb auch Genfähren genannt. Meist dienen Plasmide in Bakterien oder Viren als Vektoren. Zunächst werden das gewünschte Gen (Zielgen) und das Markergen in den Vektor eingebaut und dann in das Pflanzen- oder Bakteriengenom übertragen. Welche Wirkung hat Ampicilin auf Bakterien? Zu welcher Stoffklasse gehört es? Ampicilin blockiert ein Enzym, welches zur Bildung einer neuen Zellwand des Bakteriums zuständig ist. Dies verhindert die Neusynthese der Zellwand, die Zellen sind somit teilungsunfähig, leben aber weiter. Die Teilung menschlicher Zellen wird nicht behindert, da menschliche Zellen nur eine Zellmembran aber keine Zellwand besitzen. Ampicilin gehört zur Stoffklasse Sulfonamide. Was ist Arabinose und welche Bedeutung hat es beim oben durchgeführten Versuch? Arabinose ist ein natürlich vorkommender Einfachzucker (Monosaccharid), der aus fünf Kohlenstoff-Atomen besteht. Ein Arabinose-Operon ist jedoch Abschnitt auf der Vera Traber, 4Ma, 2010 DNA von Escherichia coli, der eine Gruppe benachbarter Gene des ArabinoseStoffwechsels sowie die zugehörigen Kontrollelemente umfasst. Auf welchen Platten erwartest du wachsende Bakterien? Auf den Platten LB+DNS und LB-DNS erwarte ich, dass wahnsinnig viele Bakterien wachsen, weil wir bei denen ja keinen Wachstumshemmer hinzugegeben haben. Bei den anderen ist Ampicilin hemmend. Warum eignen sich Bakterien gut, wenn ein gesamter Organismus genetisch verändert werden soll? Weil Bakterien erstens eine sehr schnelle Verdopplungszeit von 20 Minuten haben. Weil sie zweitens ein gutes Verhältnis von Volumen und Oberfläche haben, welches dazu führt, dass es zu einer guten Stoffwechselrate kommt. Und drittens sind sie einzellige Lebewesen, was den ganzen Prozess sehr vereinfacht. Warum sind Bakterien geeignete Organismen für gentechnische Veränderungen, wenn man Auswirkungen auch in späteren Generationen untersuchen möchte? Weil die nachfolgenden Generationen identisch sind. +: - Welche Besonderen Eigenschaften soll ein Labor-Organismus haben? schneller Wachstum - genug lange Lebenszeit - gut zu lagern (keine Ansprüche) - preiswert - leicht kultivierbar - genetisch einfach manipulierbar - hohe Expressionsrate
