Gruppe 5 - Ihre Homepage bei Arcor

Wahlpflichtpraktikum
Genetik II
Protokoll Versuch 1
Präparation genomischer DNA
07.01.-25.01.08
Gruppe 5
Alexander Lang
Dejan Music
Ingo Eisele
I. Einleitung
Ziel des Versuches war die Isolierung chromosomaler DNA verschiedener
Organismen. Dazu wurde die Technik der isopyknischen Ultrazentrifugation
verwendet, wodurch Moleküle ähnlicher Größe über ihre unterschiedliche Dichte
aufgetrennt werden können. Im Vergleich zu anderen Isolierungsmethoden liefert
die Ultrazentrifugation große Mengen genomischer DNA, die durch anschließende
Reinigungsschritte wie Dialyse und Phenolextraktion lange haltbar gemacht werden
können.
Die Weiterverwendung der hergestellten DNA hätte z.B. in Versuch 3 zur
Auffindung eines Peptidsynthetasegens in verschiedenen Organismen erfolgen
können, wobei auf Grund des Zeitplans hier bereits vorhandene genomische DNA
verwendet wurde.
II. Theorie und Durchführung
Um die genomische DNA mittels Ultrazentrifugation zu isolieren, muss diese zuerst
aus den Zellen freigesetzt werden. Dazu wurde das Zellpellet mit Lysozym
behandelt, welches die Zellwand auflöst. Die Membran wurde dann mittels eines
nichtionischen Detergenz aufgelöst. Hierbei wurde N-Laurylsarcosinat verwendet,
da SDS in den Salzkonzentrationen einer Ultrazentrifugation mit Caesiumchlorid
(CsCl) ausfallen würde.
Die Einstellung des Dichtegradienten erfolgt bis zu einer maximalen Dichte von
1,75mg/mL CsCl. Dadurch bildet RNA mit einer Dichte von 1,8mg/mL später ein
Pellet, während Proteine und Lipide mit einer Dichte von <1,4 oben auf
schwimmen. Die DNA schwebt mit einer Dichte von 1,69-1,73mg/mL im Gradient.
Ethidiumbromid(EtBr), welches zum Anfärben der DNA und zur Identifikation unter
UV-Licht dient, senkt die Dichte der DNA durch Interkalation zusätzlich noch etwas.
Hierbei wird die Dichte von genomischer, linearer DNA im Vergleich zu circulärer
DNA stärker gesenkt, da in ccc-DNA mehr Etidiumbromid eingelagert werden kann.
Dies ermöglicht eine Trennung von genomischer DNA und Plasmid-DNA.
Die Zentrifugation erfolgte für 48 Stunden bei 35000 RPM unter Verwendung eines
Festwinkelrotors. Dieser erreicht im Vergleich zu einem Vertikalrotor ebenfalls eine
kurze Zentrifugationsstrecke, jedoch wird das Problem von Verwirbelungen bei der
Umorientierung des Gradienten während des Abstoppens der Zentrifugation
vermieden.
Nach der Zentrifugation konnte die DNA unter UV-Licht betrachtet und mit Hilfe
einer Spritze abgezogen werden. Um eine lange Haltbarkeit zu ermöglichen, ist
eine Aufreinigung der DNA essentiell. Dazu ist es notwendig die DNA von
Proteinen wie z.B. Nucleasen sowie vom in der Ultrazentrifugation verwendeten
Ethidiumbromid zu reinigen, was durch eine Phenolextraktion geschieht. Zwei
Dialyseschritte trennen zum einen das bei der zur Herstellung des Dichtegradienten
verwendete CsCl, zum anderen das Phenol ab. Verunreinigungen mit Nucleasen
können die DNA degradieren, während Phenol zum einen ebenfalls die DNA durch
Oxidation beschädigen kann, zum anderen jedoch auch Probleme bei der weiteren
Verwendung der DNA bereiten kann, da es verwendete Enzyme wie z.B.
Restriktionsendonucleasen inaktiviert.
Um die Reinigungsschritte zu kontrollieren, wurde die Absorption der DNA bei
260nm und 280nm bestimmt werden. DNA hat ein Absorptionsmaximum bei
260nm, was die Bestimmung der Konzentration ermöglicht. Desweiteren entspricht
ein Absorptionsverhältnis von A260/280=1,8 einer gut aufgereinigten DNA. Mit der
Aufnahme eines Absorptionsspektrum von 220nm bis 320nm können
Verunreinigungen mit Phenol sowie Proteinen untersucht werden. Diese haben ein
Absorptionsmaximum bei 270nm bzw. 280nm.
Um die genomische DNA auf Fragmentierung bzw. Verunreinigung mit RNA zu
kontrollieren, wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt.
Die genaue Durchführung der einzelnen Schritte erfolgte entsprechend dem Skript
(Ultrazentrifugation S.21-22, Agarosegelelektrophorese S.32-33).
III. Ergebnisse
In Gruppe 5 wurde der Stamm Streptomyces lividans LG16.3 verwendet.
Die DNA-Konzentrationsbestimmung über die Absorption bei 260nm bzw. 280nm
sowie die Aufnahme des Spektrums von 220-320nm erfolgte in einem neuen
Photometer im IIG. Es wurden dazu 5µl DNA eingesetzt. Der Ausdruck ist dem
Protokoll beigelegt.
Reinheit der DNA:
A260=0,148 ; A280= 0,077
Verhältnis A260/280 = 1,92
Konzentration der DNA:
Vom Photometer wurde eine Konzentration von c[DNA] = 7,4 µg/mL ausgegeben.
Es muss jedoch eine virtuelle Verdünnung um den Faktor 10 berücksichtigt werden,
weshalb sich eine tatsächliche Konzentration von 74 µg/mL ergibt.
Ergebnis der Agarosegelelektrophorese:
Abbildung 1: Gelbild der Agarosegelelektrophorese:
Spur 1 enthält 7µl der 1kb-ladder.
Der rot umrandete Bereich beinhaltet die Proben von Gruppe 5. In Spur 10 wurden
10µl DNA (= 740ng) aufgetragen, in Spur 11 hingegen 200ng.
Die Berechnung des Volumens von 200ng DNA erfolgt exemplarisch für die
Konzentration von S.lividans LG 16.3 (Gruppe 5):
c[DNA]=74µg/mL
V(200ng)
= 0,2µg/74µg/mL*1000µL/mL
= 2,7µL
Zusätzlich wurde noch 1/5 des Volumens an 5x Auftragspuffer zugefügt,
mindestens jedoch 1µL.
IV. Diskussion
Die bestimmte Konzentration der isolierten genomischen DNA liegt 74µg /mL.
Eine Abschätzung der zu erwartenden DNA-Menge war leider nicht möglich, da
hierfür die OD der Ausgangskultur benötigt worden wäre. S.lividans LG 16.3 wächst
aber als Mycel, weshalb für diesen Stamm keine OD angegeben werden konnte.
Der Reinheitsgrad A260/280 liegt 1,92. Die optimale Reinheit würde einen Wert von
1,8 ergeben. Hier könnte sich also noch etwas RNA in der Lösung zu befinden.
Dies kann durch Ungenauigkeiten beim Absaugen der DNA nach der Zentrifugation
entstanden sein.
Im angehefteten Spektrum ist allerdings kein peak für RNA zu sehen. Die
Aufreinigung per Dialyse war ebenfalls erfolgreich: Es sind keine Peaks für Phenol
oder Proteine zu sehen.
Das Agarosegelbild zeigt, dass alle Ansätze hochmolekulare DNA beinhalten. Auch
die Unterschiede in der eingesetzten DNA-Menge zwischen Spur 10 (10µl = 740ng)
und Spur 11 (200ng) sind gut erkennbar.
Es sind auch keine niedermolekularen Banden sichtbar. Folglich konnte eine
Fragmentierung der DNA durch Scherkräfte erfolgreich vermieden werden.
Auch eine RNA-Bande ist in Spur 10 und 11 nicht sichtbar.
Die Vermutung, dass sich noch RNA in der Lösung befinden könnte hat sich also
nicht bestätigt.