C 3.2.2. Die Ninhydrin-Probe
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Wolfgang Proske Wolfgang Proske Schulchemiezentrum Dipl. Ing (FH) Wolfgang Proske Bahnhofstr. 18, 06895 Zahna - Elster Tel: 034924 / 20648, Fax: 034924 / 20011 www. schulchemiezentrum. de, wolfgang_proske@ web.de wolfgang.proske@ schulchemiezentrum.de Reagenzglasversuche zur Chemie der Aminosäuren und Proteine Was ist in der Schule machbar? Fachwissenschaftliche Kontexte und didaktische Umsetzung A 1. B 2. Einleitung Fachliche Grundlagen B 2.1. Aminosäuren und Proteinen, eine allgemeine Einführung C 3. Aminosäuren, allgemeine Grundlagen C 3.1. Die einzelnen, essenziellen Aminosäuren, eine Übersicht C 3.2. Experimente zum Thema Aminosäuren C 3.2.1. Komplexbildung Darstellung von Kupferglycinat C 3.2.2. Die Ninhydrin-Probe C 3.2.3. Reaktion von Glycin mit Formaldehyd C 3.2.4. Reaktion von Glycin mit salpetriger Säure (Desaminierung) C 3.2.5. pH- abhängige Löslichkeit von Tyrosin C 3.2.6. Isoelektrischer Punkt von 4- Aminobenzoesäure C 3.2.7. Die Xanthoprotein-Probe C 3.2.8. Die Millon-Probe auf Tyrosin C 3.2.9. Die Cole- Hopkin-Probe auf Tryptophan C 3.2.10. Die Probe nach Sakkagucchi auf Arginin C 3.2.11. Die Probe nach Pauly auf Histidin C 3.2.12. Die Farbreaktion auf Aminosäuren mit Naphthochinon C 3.2.13. Die Reaktionen von Cystein mit Eisen(III)chlorid, Kupfersulfat und Nitroprussid-Natrium D 4. Proteine D 4.1. Allgemeine Grundlagen D 4.2. Experimente D 4.2.1. Herstellung einer Eiweiß-Lösung D 4.2.2. D 4.2.3. D 4.2.4. D 4.2.5. D 4.2.6. D 4.2.7. D 4.2.8. D 4.2.9. D 4.2.10. D 4.2.11. D 4.2.12. D 4.2.13. D 4.2. 14. D 4.2.15. D 4.2.16. Nachweis von Schwefel und Stickstoff im Eiweiß Fällungsreaktionen der Proteine Die Ninhydrin-Probe Darstellung von Biuret / Die Biuret-Probe Die Xanthoprotein-Reaktion Albumin-Globulin- Trennung Modellexperiment zum isoelekrischen Punkt Bestimmung des Isoelektrischen Punktes von Casein (N2-Proj) Die Pufferwirkung der Eiweißkörper Die Eiweißverdauung Der Indikatorfehler, ein weiterer Proteinen-Nachweis Die Protein-Bestimmung nach Lowry Die Protein-Bestimmung nach Bradford Die Protein-Bestimmung mit dem BCA-Reagenz Die Empfindlichkeit verschiedener heute üblicher Bestimmungsmethoden für Proteine, ein Vergleich Herstellungsvorschrift für die Reagenzien Literaturverzeichnis Geräte und Chemikalien: x Durchführung: x Beobachtung: x Auswertung: x A 1. Einleitung Experimente zum Thema Aminosäuren und Proteine sind im Chemie- und Biologieunterricht etabliert. Vergleicht man allerdings die Schulbücher der verschiedenen Verlage, findet man nur eine ganz geringe Anzahl,. die sich immer wieder gleichen. Vor über dreißig Jahren habe ich ein Skript für ein Biochemiepraktikum geschrieben und war auch an der Uni an Studentenpraktika beteiligt. Aus diesem Fundus ist das vorliegende Material entstanden. Es enthält eine Reihe von Experimentieranleitungen, welche in dieser Form in der didaktischen Literatur bisher nicht beschrieben worden sind. Der Vollständigkeit halber befinden sich auch einige Versuchsbeschreibungen mit Stoffen darin, welche heute im Allgemeinen in der Schule nicht mehr vorhanden sind. Die entstandene Sammlung soll dazu dienen, Anregungen für neue experimentelle Konzepte zu geben. B 2. Fachliche Grundlagen x B 2.1. Aminosäuren und Proteinen, eine allgemeine Einführung Eiweißkörper sind Bestandteile jeder lebenden Zelle. Die kleinsten Bausteine der Eiweißkörper sind die Aminosäuren. Da ohne Eiweißkörper kein Leben möglich ist, werden sie auch als stoffliche Grundlage des Lebens bezeichnet. Eiweißkörper bestehen aus Aminosäuren, die durch Peptid-Bindungen verbunden sind. Sie stellen mengenmäßig den größten Anteil an organischen Substanzen im Organismus dar. Von Mulder stammt die Bezeichnung „Proteine“, das heißt wie das erste. C 3. Aminosäuren, allgemeine Grundlagen Die Aminosäuren besitzen zwei funktionelle Gruppen: die Aminogruppe (- NH2) und die Carboxylgruppe (- COOH). Die allgemeine Formel für eine α- Aminosäure lautet: R – CH – COOH. I NH2 Die Aminosäuren unterscheiden sich durch ihre Reste. Eine α – Aminosäure trägt die Aminogruppe am esren Kohlenstoffatom nach der Carboxylgruppe, eine ß – Aminosäure am zweiten Kohlenstoffatom. Bei den Aminosäuren tritt eine optische Isomerie auf. Man unterscheidet die D – und die L – Form. Wenn in der gegebenen allgemeinen Form R nicht H sondern eine Kohlenstoffkette ist, so ist das Kohlenstoffatom in der α – Stellung von vier verschiedenen Substituenten umgeben. Es muss eine optische Isomerie auftreten (Drehung des polarisierten Lichtes nach rechts oder links), weil das Modell nicht durch Spiegelbild zur Deckung gebracht werden kann. L – Aminosäure: COOH I H2 N – C – H I R COOH I D – Aminosäure: H – C – NH2 I R Bei einer L – Aminosäure steht die Aminogruppe links, die Carboxylgruppe rechts, bei einer D – Aminosäure seht die Aminogruppe und die Carboxylgruppr rechts. Die Drehrichtung kann man nur mittels Polarimeter ermitteln, sie ist nicht identisch mit der Struktur. Die für den Organismus bedeutsamen Aminosäuren gehören der L- Form an. C 3.1. Die einzelnen, essenziellen Aminosäuren, eine Übersicht Zwanzig verschiedene Aminosäuren kommen regelmäßig in Proteinen vor. Aufgrund des unterschiedlichen Restes lassen sie sich in folgende vier Gruppen einteilen: I Aminosäuren mit apolaren Rest II saure Aminosäuren III basische Aminosäuren IV Aminosäuren mit nicht ionisiertem polaren Rest C 3.2. Experimente zum Thema Aminosäuren In der folgenden Übersicht sind Experimente, welche mit geringen zeitlichen und materiellen Aufwand realisierbar sind. Der Vollständigkeit halber wurden auch problematische Experimente (z. B. Millon-Probe und Fällung mit Pikrinsäure) aufgenommen worden. C 3.2.1. Komplexbildung Darstellung von Kupferglycinat Geräte und Chemikalien: Spatel, Reagenzgläser, Glasstab, Brenner, Trichter, Filter Uhrglasschale, Abdampfschale Glycin, Kupfersulfat-Lösung (Fehling I), Natronlauge 1 mol/l, Natriumcarbonat-Lösung (100 g Na2CO3 x 10 H2O /l), Universalindikator-Papier, Kupfercarbonat Durchführung: Variante A: Ein Spatel Glycin werden in 5 ml Wasser gelöst. 5 ml Fehling I werden in ein weiteres Reagenzglas gegeben. Von beiden Lösungen wird der pH-Wert mittels Indikatorpapier bestimmt. Beide Lösungen werden gemischt, und es wird erneut der pH-Wert gemessen. Danach werden einige Tropfen Natronlauge dazu gegeben. Variante B: Eine reichlicher Spatel Glycin wird in wenig Wasser gelöst, mit einer reichliches Spatelspitze (erbsengroße Menge) Kupfercarbonat versetzt. Danach wird die Lösung zum Sieden erhitzt und in eine Abdampfschale oder ein Uhrglas filtriert. Variante C: 2 ml Kupfersulfat –Lösung werden mit einigen Tropfen Natriumcarbonat-Lösung versetzt, so dass ein Niederschlag ausfällt. Ein Spatel Glycin wird zugegeben, zum Sieden erhitzt und danach heiß in eine Abdampfschale oder Uhrglasschale filtriert. Beobachtung: Variante A: Der pH- Wert der Kupfersulfat-Lösung beträgt etwa 5, der pH – Wert der Glycin-Lösung etwa 7- der pH – Wert des Gemisches beträgt etwa 2. Die Lösung färbt sich dunkler. Nach Zugabe von Natronlauge ist keine Veränderung feststellbar. Variante B und C: Das Kupfercarbonat löst sich in der Glycin-Lösung, beim Abkühlen scheidet sich Kupferglycinat als blauer Feststoff in Form feiner Nadeln ab. Auswertung: Aus Kupfer- Ionen und Glycin bildet sich das blaue Komplexsalz Kupferglycinat. Zwischen dem Sauerstoff der Carboxylgruppe und dem Kupfer tritt Ionenbeziehung ein. Eine koordinative Bindung tritt zwischen dem Cu ++ - Ion und der Aminogruppe ein. Die deutliche Absenkung des pH – Wertes erklärt sich aus der Abspaltung von Hydronium-Ionen. Die Chelatbildung (Komplexbildung) ist an der Farbvertiefung erkennbar. Komplexverbindungen zeigen ein anderes chemisches Verhalten, beispielsweise, das KupferIonen nicht mehr mit Natronlauge auszufällen sind. Diese Tatsache ist auch in der klinischen Chemie von Bedeutung. Die im klinischen Labor verwendetet Benedict- RL zum Nachweis von Glucose im Harn enthält ebenfalls einen Komplexbildner, der verhindert, das KupferIonen in alkalischer Lösung ausgefällt werden. C 3.2.2. Die Ninhydrin-Probe X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Brenner, Glycin, Ninhydrin-Lösung 1 % in Alkohol, Kupfernitrat-Lösung oder Kupfersulfat-Lösung (Fehling I) Hinweis: Ninhydrin hinterlässt auf der Haut nach einiger Zeit violette Flecke, die schwer entfernbar sind (Bimsstein oder ähnliche Scheuermittel). Deshalb unbedingt mit Schutthandschuhe tragen Durchführung: Eine mohnkorngroße Menge Glycin wird in 2 ml Wasser gelöst, mit 10 Tropfen NinhydrinLösung versetzt, gut gemischt und zum Sieden erhitzt. Wenn der Farbumschlag eingetreten ist, werden einige Tropfen Kupfernitrat – oder Kupfersulfat-Lösung zugegeben. Beobachtung: Die Lösung färbt sich blauviolett, nach Zusatz von Kupfersalz- Lösung tritt ein Farbumschlag nach rotviolett ein. Auswertung: Eine viel verwendete Nachweisreaktion für Aminosäuren und Proteine ist die NinhydrinProbe. Diese Reaktion ist sehr empfindlich, aber nicht spezifisch. Man setzt die Reaktion auch zum Nachweis von Fingerspuren in der Kriminalistik ein. Sie wird auch zum Nachweis von Aminosäuren bei der Dünnschichtchromatographie eingesetzt. Da die Flecken nicht haltbar sind , kann man sie mit Kupfernitrat-Lösung stabilisieren. Die Ninhydrin-Reaktion besteht aus zwei Teilschritten: A1. Spaltung der Aminosäuren (Decarboxylierung und oxidative Desaminierung), sowie Reduktion des Ninhydrin zum Hydrindantin B 2: Kondensation von Hydrindantin, Ninhydrins und Ammoniak zum Farbstoff. O O O OH 2 + R OH O CH COO- + RCHO + CO2 + 2 H2O + H3O+ N NH3+ O -O violettes Anion C 3.2.3. Reaktion von Glycin mit Formaldehyd X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Tropfpipetten, Glycin, Formaldehyd-Lösung, Natronlauge 1 mol/l, Phenolphthalein- oder Cresolphthalein-Lösung Durchführung: Herstellung von neutralisierter Formaldehyd-Lösung: Formaldehyd-Lösung oxidiert zu Ameisensäure. Dies kann man verhindern, indem man festes Calciumcarbonat in die Vorratsflasche gibt. Auch scheidet sich in der Kälte Paraformaldehyd als weißer Niederschlag ab, welches durch Filtration entfernbar ist. Es ist auch möglich, Formaldehyd-Lösung mit Phenolphthalein – oder Cresolphthalein-Lösung zu versetzen und tropfenweise bis zur schwachen Färbung Natriumcarbonat-Lösung dazu zugeben. Eine Spatelspitze Glycin wird in 5 ml Wasser gelöst und mit je einem Tropfen Indikator Lösung und Natronlauge versetzt. Die entstehende rote Lösung wird mit einigen Tropfen neutralisierter Formaldehyd-Lösung versetzt. Nun gibt man weiter tropfenweise Natronlauge dazu. Beobachtung: Nach Zugabe von Natronlauge erfolgt ein Farbumschlag nach rotviolett. Durch Zusatz von Formaldehyd-Lösung entfärbt sich die rote Lösung. Nach erneuter Zugabe von Natronlauge tritt die rotviolette Färbung der Lösung wieder auf. Auswertung: Aminosäuren sind Verbindungen mit amphoterem Charakter. Sie lassen sich durch einfache Titration nicht bestimmen. Setzt man Formaldehyd-Lösung zu, wird der Einfluss der Aminogruppe durch Kondensation ausgeschaltet. Formaldehyd reagiert mit Aminosäuren, es entstehen die entsprechenden Hydroxymethyl- oder Methylol-Verbindungen. Die Dissoziation an der α – Aminogruppe wird verändert. Aus der amphoteren Aminosäure entsteht durch Blockierung eine echte Säure. Nun ist die Carboxylgruppe direkt titrierbar. O // 2 H – C + H – C – NH3 \ I H COO - H I + + → H + H – C –---I COO - Formaldehyd CH2OH / N \ CH2OH N - Hydroxymethylglycin C 3.2.4. Reaktion von Glycin mit salpetriger Säure (Desaminierung) X Geräte und Chemikalien: 50 ml Erlenmeyerkolben, Holzspan Glycin, Natriumnitrit, Eisessig Durchführung: Eine Spatelspitze Glycin wird in 5 ml Wasser gelöst und ein Spatel Natriumnitrit wird zugegeben und bis zur Lösung geschüttelt. Nachdem sich die Stoffe gelöst haben, wird schnell wenig Eisessig zugegeben und sobald die Gasentwicklung eingesetzt hat, wird ein brennender Holzspan an die Mündung des Kolbens gehalten Beobachtung: Es setzt eine starke Gasentwicklung ein, der brennende Holzspan erlischt. Auswertung: α – Aminosäuren enthalten im Molekül eine primäre Aminogruppe. Deshalb lassen sich diese mit salpetriger Säure desaminieren. NaNO2 + CH3COOH → CH3COONa + HO - N = O H2N – CH2 – COOH + HNO2 → HO – CH2- COOH + H2O + N2 Diese Reaktion ist die Grundlage für die gasvolumetrische Stickstoffbestimmung nach van Slyke. Im Organismus werden Aminosäuren durch verschiedene in der Leber lokalisierte Enzyme (Transaminasen) desaminiert. Bei verschiedenen Lebererkrankungen sind erhöhte Aktivitäten der Enzyme nachweisbar, deshalb besitzen Bestimmungen der Aktivität von Enzymen hohen diagnostischen Wert. C 3.2.5. pH- abhängige Löslichkeit von Tyrosin X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Tyrosin, Salzsäure 1 mol/l, Natronlauge 1 mol/l Durchführung: Eine kleine Spatelspitze Tyrosin wird in 5 ml Wasser aufgeschwemmt. Diese Suspension ist auf 2 Reagenzgläser aufzuteilen. In das erste Reagenzglas wird tropfenweise unter Umschütteln Salzsäure in das zweite Reagenzglas Natronlauge zugegeben. Beobachtung: In beiden Reagenzgläsern tritt sofortige Auflösung ein. Auswertung: Liegt eine Aminosäure als Zwitter-Ion vor, ist diese schwer wasserlöslich. R – CH – COOI NH3+ Aminosäure als Zwitter- Ion. R – CH – COOH I NH3+ Aminosäure als Kation R – CH – COO I NH2 Aminosäure als Anion Tyrosin besitzt einen lipophilen Phenylrest, aber auch die hyrophilen Amino – und Carboxylgruppe. Diese kommen kaum zu Geltung, da die Phenylgruppe die Wirkung aufhebt. Durch Zusatz von Säure entsteht die kationische Form, nach Zusatz von Lauge die anionische Form. Es entstehen auf diese Weise Ionen mit positiver oder negativer Ladung. Dadurch wird die Wirkung der hydrophilen Gruppen verstärkt. Die Löslichkeit in Wasser hängt ab von: Verhältnis von hydrophilen und lipophilen Gruppen Ladungszustand bzw. Ausmaß der Überschussladung C 3.2.6. Isoelektrischer Punkt von 4- Aminobenzoesäure X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Glasstab, 4- Aminobenzoesäure, Methylorange-Lösung, Natronlauge 1 mol/l, Salzsäure 1 mol/l Durchführung: Eine Spatelspitze 4-Aminobenzoesäure wird in 1 – 2 ml Natronlauge gelöst. Nach Zusatz von einem Tropfen Methylorange entsteht eine zitronengelbe Lösung. Diese wird tropfenweise unter Umschütteln mit Salzsäure bis zum Farbumschlag nach orange-braun (zwiebel-farben) versetzt. Sollte sich die Lösung nicht trüben, wird mit einem Glasstab an der inneren Wandung des Reagenzglases gerieben. Anschließend wird weiter Salzsäure zugegeben. Beobachtung: Der Ansatz wird trüb, ein Feststoff scheidet sich ab. Nach weiterer Zugabe von Salzsäure tritt ein Farbumschlag nach rot ein und die Lösung wird klar. Auswertung: In basischer Lösung liegt die 4-Aminobenzoesäure als Natriumsalz (Anion) vor. Durch tropfenweise Zugabe von Salzsäure wird der pH- Wert stufenweise gesenkt. Methylorange schlägt von gelb (pH – Wert > 5) über orangebraun (pH – Wert 4,5) nach rot (pH – Wert < 4) um. Durch die Salzsäure wird das 4 – Aminobenzoat- Anion stufenweise protoniert, bis schließlich die Zwitter-Ionen-Struktur entsteht. An diesem Punkt hat die Substanz die geringste Löslichkeit in Wasser. Durch weiteren Zusatz von Salzsäure wird die Zwitter – Ionen –Struktur aufgehoben, es entsteht das Kation. C 3.2.7. Die Xanthoprotein-Probe X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Phenol, besser verflüssigter Phenol (Phenolum liquefactum), Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Salpetersäure 65 %, Ammoniak-Lösung 25 % Durchführung: Hinweise zum Arbeitsschutz: Konzentrierte Salpetersäure und Ammoniak-Lösung sind stark ätzend, deshalb unbedingt Schutzbrille tragen Manchmal wird empfohlen, statt der 65 %igen Salpetersäure 25 % ige Säure zu verwenden, das wäre auch möglich, allerdings sind die zu beobachtenden Effekte weniger deutlich erkennbar, in diesem Falle sollte der Ansatz erhitzt werden. Aus meiner Erfahrung halte ich diese Variante nicht unbedingt für empfehlenswert. Je eine Spatelspitze Phenol (besser 2 Tropfen verflüssigtes Phenol), Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin werden mit 2 ml Wasser gelöst oder aufgeschwemmt und mit 10 Tropfen Salpetersäure versetzt und gut gemischt. Nach einigen Minuten, wen die Gelbfärbung eingetreten ist werden einige Tropfen Ammoniak-Lösung zugegeben. Beobachtung: Die Ansätze färben sich nach einigen Minuten mehr oder weniger intensiv gelb, nach Zusatz von Ammoniak-Lösung Farbumschlag nach orangerot. Auswertung: Phenol reagiert mit Salpetersäure, es entsteht gelb gefärbtes Nitrophenol. Nach Zusatz von Ammoniak-Lösung entstehen die entsprechenden Nitrophenolat-Anionen, welche eine intensivere Färbung besitzen. Das gleiche Verhalten zeigen aromatische Aminosäuren. Diese Reaktion hatte früher zur Diagnostik von Nierenerkrankungen eine Rolle gespielt (Xanthoprotein- Probe nach Becher) C 3.2.8. Die Millon-Probe auf Tyrosin x Geräte und Chemikalien: Phenol, besser verflüssigtes Phenol (Phenolum liquefactum), Tyrosin, Millon-Reagenz Durchführung: Hinweise zum Arbeitsschutz: Millons Reagenz ist eine Quecksilbernitrat-Lösung in Salpetersäure. Dieses Reagenz ist sehr giftig und stark ätzend. Dieses Experiment darf niemals von Schülern durchgeführt werden!!! Versuchsreste müssen als quecksilberhaltiger Sondermüll entsorgt werden!!! Je eine Spatelspitze Phenol (besser 2 Tropfen verflüssigtes Phenol), Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin werden mit 2 ml Wasser gelöst oder aufgeschwemmt und mit 10 Tropfen Millons - Reagenz versetzt, gut gemischt und zum Sieden erhitzt. Beobachtung: Es tritt ein Farbumschlag nach rotviolett ein Auswertung: Phenol, Tyrosin und andere aromatische Aminosäuren werden durch die im Reagenz enthaltene Salpetersäure nitriert, die entsprechenden Nitrophenole bilden mit dem Quecksilber rotviolette Komplexe. Diese Reaktion geben auch Proteine, welche aromatische Aminosäuren enthalten. Diese Reaktion hatte früher in der Labormedizin eine gewisse Bedeutung (Leberfunktionstest mit Oxyphenylbrenztraubensäure). C 3.2.9. Die Cole- Hopkins-Probe auf Tryptophan X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Tryptophan, Glyoxylsäure-Lösung konzentrierte Schwefelsäure Durchführung: Hinweise zum Arbeitsschutz: Konzentrierte Schwefelsäure ist stark ätzend, beim Umgang unbedingt Schutzbrille tragen Zum Unterschichten Tropfpipette mit fein ausgezogener Kapillare verwenden Eine Spatelspitze Tryptophan wird mit Wenig Wasser versetzt, und es werden 20 Tropfen Glyoxylsäure-Lösung zugegeben. Anschließend wird vorsichtig mit konzentrierter Schwefelsäure unterschichtet. Beobachtung: Es entsteht ein rotvioletter Farbkomplex. Auswertung: Ringförmige Verbindungen, speziell Tryptophan kondensiert in Gegenwart von konzentrierter Schwefelsäure, es entstehen Farbkomplexe, die Ähnlichkeit mit der Struktur der Triphenylmethan-Farbstoffe haben. C 3.2.10. Die Probe nach Sakkagucchi auf Arginin X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Arginin, Molisch-Reagenz, Natriumhypobromit-Lösung Durchführung: Eine Spatelspitze Arginin wird in Wasser gelöst und es werden 3 Trofen Molisch Reagenz zugegeben und gut gemischt. Anschließend werden 5 Tropfen Natriumhypobromit – Lösung zugegeben. Beobachtung: Es entsteht eine rote Färbung Auswertung: Arginin ist ein Derivat des Guanidins. Guanidin reagiert mit Natriumhypobromid unter Abspaltung von Stickstoff. Das entsprechende Zwischenprodukt reagiert mit 1- Naphthol unter Bildung eines roten Farbkomplexes. C 3.2.11. Die Probe nach Pauly auf Histidin und Tyrosin X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Tyrosin, Histidin, Diazo I (Sulfanilsäure-Lösung), Diazo II (NatriumnitrtLösung), Ammoniak-Lösung 10 % Durchführung: Herstellunt der Diazo-Lösung: 10 ml Diazo I werden mit 0,3 ml (6 Tropfen Diazo II gemischt. Diese Mischung muss frisch bereitet werden Es werden jeweils eine Spatelspitze Histidin bzw. Tyrosin in Wasser gelöst bzw. suspendiert. Es werden 5 ml Diazo-Lösung zugegeben, gut gemischt und danach Ammoniak-Lösung Beobachtung: Nach Zusatz von Ammoniak-Lösung bildet sich eine rote Färbung bei Tyrosin und.bei Histidin eine gelbe Färbung. Auswertung: Sulfanilsäure reagiert mit salpetriger Säure, es entsteht Diazobenzolsulfonsäure, diese kuppelt mit aromatischen Verbindungen, es entstehen Azofarbstoffe. Die „Diazo-Probe nach Ehrlich“ im Harn diente früher zur Diagnostik von Scharlach und anderen Infektionskrankheiten. C 3.2.12. Die Farbreaktion auf Aminosäuren mit Naphthochinon X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Glycin Natriumcarbonat-Lösung , Naphthochinon-Lösung, Universalindikator-Papier Durchführung: Eine Spatelspitze Glycin wird in 2 ml Wasser gelöst und mit Natriumcarbonat-Lösung alkalisch gemacht, Kontrolle mit Indikatorpapier. Nun wird tropfenweise unter Umschütteln Naphthochinon-Lösung zugegebenBeobachtung: Die Lösung färbt sich rot bis rotbraun Auswertung: Je ein Mol ß – Naphthochinon und Aminosäure kondensieren miteinander. Ein weiteres Mol ß – Naphthochinon dient als Wasserstoff-Akzeptor, aus einem Chinon entsteht eine Dihydroxi-Verbindung. Mit dieser Methode kann die Summe aller freien α – Aminogruppen bestimmt werden. Im Serum ist diese Konzentration ein Maß für sie vorhandenen freien Aminosäuren. Bestimmt man die Konzentration von Gesamt-Stickstoff nach Kjeldahl und den α- Amino-Stickstoff kann man daraus den Hydrolysegrad abschätzen. C 3.2.13. Die Reaktionen von Cystein mit Eisen(III)chlorid, Kupfersulfat und Nitroprussid-Natrium x Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Cytein - Hydrochlorid, Eisen(III)chlorid-Lösung, Kupfersulfat-Lösung (Fehling I), Dinatriumpentacyanonitrosylferrat-RM nach AB 2 –DDR (DL) Durchführung: Eine Spatelspitze Cystein-Hydrochlorid wird in 5 ml Wasser gelöst und diese Lösung wird auf 3 Reagenzgläder aufgetelt In die Reagenzgläser kommen folgende Reagenzien: Reagenzglas Zugabe 1 3 Tropfen Eisen(III)chlorid-Lösung 2 3 Tropfen Kupfersulfat-Lösung 3 eine Spatelspitze Dinatriumpentacyanonitrosylferrat-RM Beobachtung: beim ersten Reagenzglas tritt ein Farbumschlag nach blau, beim zweiten Reagenzglas nach violett und beim dritten Reagenzglas nach blauviolett ein. Die entstandenen Färbungen verblassen nach kurzer Zeit. Auswertung: Die Farbkomplexe des Cysteins mit Eisen und Kupfer sind nicht beständig, Verschließt man die Reagenzgläser mit einem Stopfen und schüttelt diese nach der Entfärbung, tritt die Färbung wieder ein (Analogie zum „Trick mit der blauen Flasche“). Dieser Vorgang ist mehrmals wiederholbar, allerdings scheidet sich das gebildete Cystin aufgrund seiner geringen Löslichkeit in Wasser ab. Natrium- Nitroprussid (Dinatriumpentacyanonitrosylferrat) reagiert mit Sulfid-Ionen und Thiol-Verbindungen, es entsteht ein sofort ein blauvioletter Farbkomplex. [Fe(CN)5NO] 2- + S 2 - → [Fe(CN)5NOS] 4Dieser Komplex ist in stark alkalischer Lösung nicht beständig, bzw. werden durch die Hydroxid- Ionen verhindert, da hier ein beständigeres Natriumpentacyanonitritoferrat (II) gebildet wird. [Fe(CN)5NO ] 2- + 2 OH - → [Fe(CN)5NO2] 4- + H2O Natriumnitroprussid ist giftig und die wässrige Lösung nur beschränkt haltbar. Aus dem Band Diagnostische Laboratoriumsmethoden des 2. Arzneibuches der DDR stammt die Rezeptur. Dieses Reagenz war zum Nachweis von Aceton im Urin seinerzeit vorgeschrieben. Das Reagenz ist gut verschlossen unbegrenzt haltbar. Wir erprobten es für diesen Nachweis, es wäre eine Alternative zum Nitroprussid-Natrium. Aufgrund der geringen Konzentration an Natrium-Nitroprussid ist es nicht mehr als giftig eingestuft. D 4. Proteine x D 4.1. Allgemeine Grundlagen Die Peptid-Bindung ist die Bindung, die Aminosäuren eingehen, um Eiweißkörper aufzubauen. Zwei Aminosäuren reagieren unter Abspaltung von Wasser, es entsteht ein Dipeptid. R O H OH I // I / H2N - C – C + H2N – C - C → I \ I \\ H OH H O R H H OH I I I / H2N – C – C – N -- C -- C I II I \\ H O R O O II Es entsteht die charakteristischen Gruppe: – C – N – , die Peptid-GruppeI H Die Bindung ist sehr fest. Es ist ein großer Aufwand erforderlich, um die Rückreaktion (hydrolytische Spaltung) herbeizuführen. Dieses erfordert beispielsweise ein stundenlanges Kochen mit Säuren unter Luftabschluss. Man unterscheidet zwischen den Eiweißkörpern Peptide und Proteine. Nach der Anzahl der Aminosäuren, wobei sich keine scharfe Grenze ziehen lässt. Man nimmt etwa ein Molekulargewicht von 1000 an. Eiweißkörper üben im Organismus verschiedene Funktionen aus: • Enzyme sind Eiweißkörper (Biokatalysatoren) • Eiweißkörper sind zum Aufbau von Zellstrukturen erforderlich. • Eiweißkörper haben Transportfunktion ( 1g Protein bindet 16 g Wasser) • gelöste Eiweißkörper liefern einen bestimmten Beitrag zur Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Druckes • Eiweißkörper wirken auch als Hormone • aber auch als Abwehrstoffe gegen Krankheitserreger • unlösliche Eiweißkörper haben Schutz – und Stützfunktion Einteilung der Proteine ↓ Einfache Eiweißkörper ↓ zusammengesetzte Eiweißkörper (Proteide) Globuläre (wasserlöslich) Protein u. prosthetische (keine Proteinstruktur) Gruppe ↓ Albumin fibrilläre unlöslich ↓ Globulin Lipoproteide, Glucoproteide, Chromoproteide, Nucleoproteide, M;etalloproteide Molekulargewicht : 15-16000 MG > 1 Mill. Struktur der Eiweißkörper Proteine bestehen aus Aminosäuren, die durch Peptid-Bindung miteinander verknüpft sind. Eine Kette von hunderten an Aminosäuren kann in verschiedener Art und Weise im Raum angeordnet sein, z. B. als gestreckte Kette als Knäuel oder auch als Schraube. Die Anordnung von Ketten nennt man Kettenkonformation. Proteinmoleküle sind Makromoleküle. Man unterscheidet die Primär -, die Sekundär -, die Tertiär -, und die Quartär - Struktur. Sie werden auch als höhere Proteinstrukturen bezeichnet. Struktur Primärstruktur Charakteristisches Merkmal Aminosäure-Sequenz (Reihenfolge der AS genetisch festgelegt Sekundärstruktur räumliche Anordnung der Peptid-Kette (Art und Weise der Kettenfaltung) Tertiär - Struktur nochmalige räumliche Anordnung der Peptid-Kette Quartär - Struktur Zusammenlagerung mehrerer tertiär strukturierten Bausteine zu einem funktionsfähigen Molekül Die globulären (löslichen) und die fibrillären (unlöslichen) Eiweißkörper haben unterschiedliche Strukturen. Struktur Globuläre Proteine Sphäroproteine Primärstruktur Aminosäure-Sequenz genetisch festgelegt Sekundärstruktur α – Struktur (Helix) α – Struktur (Helix). ß -- Struktur (Faltblatt) Tertiär- - Struktur Verknäuelungen zu kugligen Gebilde Verzwirnung Quartär – Struktur Fibrilläre Proteine Skleroproteine Zusammenlagerung zu funktionsfähigen -Gebilden Diese Strukturen werden durch verschiedene Bindungen ermöglicht: • Peptid-Bindung • Disulfid-Bindung • Wasserstoff- Brücken-Bindung • Ionenbeziehung • van der Waals – Dispersionskräfte Disulfid – Bindung: Sie entsteht durch Abspaltung von Wasserstoff. Aus zwei Molekülen Cystein entsteht ein Mol Cystin, es ist eine feste Bindung. COOH COOH COOH COOH I I I I H – C – NH2 + H – C – NH2 = H – C – NH2 H – C – NH2 + 2 H I I I I CH2 CH2 CH2 CH2 I I I I S S S ----------------S I I H H Wasserstoff – Brücken-Bindung: Zwischen der >C=O- Gruppe und dem Wasserstoffatom einer NH – oder – OH – Gruppe kommt es zu einer Wechselwirkung, wenn sich die Gruppen auf einen Abstand von 2,8 A nähern. Beide Gruppen sind polarisiert und üben aufeinander elektrostatische Wirkung (Anziehung) aus. Es entstehen zwischenmolekulare Bindungen mit relativ kleiner Bindungsenergie. Ionenbeziehung: Eine Reihe funktioneller Gruppen des Proteins z. B. Carboxyl – und Aminogruppe liegen im physiologischen Bereich in ionisierter Form vor. Van der Waals – Dispersionskräfte: Sie kommen durch das Auftreten vorüber gehender asymmetrischer Ladungsschwerpunkte zustande. Bindungen bei höheren Protein-Strukturen: Primärstruktur Peptid – Bindung Sekundärstruktur Wasserstoff – Brücken-Bindung Tertiär- Struktur Wasserstoff – Brücken – Bindung, van der Waals – Kräfte Quartär – Struktur van der Waals Kräfte, Disulfid-Bindung D 4.2. Experimente x D 4.2.1. Herstellung einer Eiweiß-Lösung X Geräte und Chemikalien: Erlenmeyerkolben 200 ml mit NS 29 und Plastik-Stopfen, Messzylinder, ein Eiklar, Natriumchlorid – Lösung 0,154 mol/l Durchführung: In den Erlenmeyerkolben werden 150 ml Natriumchlorid- Lösung gegeben und dazu ein Eiklar. Danach wird vorsichtig gemischt, nicht geschüttelt. Beobachtung: Es entsteht eine leicht getrübte EiweißlösungHinweis: Die Eiweißlösung sollte immer möglichst frisch bereitet werden. Im Kühlschrank ist die Lösung maximal eine Woche haltbar. Auswertung: Die Eiweißlösung ist ein Gemisch aus Albuminen und Globulinen. Albumine sind in Wasser leicht löslich, während sich Globuline nur in verdünnter Salzlösung lösen. Die leichte Trübung rührt vom kolloidalen Charakter der Eiweißkörper (Teilchengröße > 1000µm) her. D 4.2.2 Nachweis von Schwefel und Stickstoff im Eiweiß X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, gekochtes Hühnereiweiß, Natronlauge 1 mol/l, Universal-Indikator-Papier, Bleiacetat, Nylander Reagenz, Salpetersäure 1 mol/l, Silbernitrat-Lösung 1 %, Kaliumnitrat, Salzsäure 10 %, Bariumchlorid – Lösung 0,05 mol/l, Phenolphthalein-Lösung 0,05 % oder Cresolphthalen-Lösung 0,1 % Durchführung: Nachweis von Stickstoff als Ammoniak: In ein Reagenzglas wird 1 cm hoch Natronlauge eingefüllt und ein erbsengroßes Stück gekochtes Hühnereiweiß dazugegeben. Es wird einige Minuten erhitzt, an die Mündung des Reagenzglases hält man ein kleines Stück angefeuchtetes Indikatorpapier. Nachweis des Schwefels als Silbersulfid: Zum Inhalt des Reagenzglases vom Stickstoff-Nachweis als Ammoniak wird ein Tropfen Phenolphthalein oder Cresolphthalein gegeben. Nun wird unter Umschütteln tropfenweise Salpetersäure bis zur Entfärbung, sowie 1 Tropfen im Überschuss zugegeben. Nun gibt man einige Tropfen Silbernitrat-Lösung dazu. Nachweis des Schwefels als Bismutsulfid: In ein Reagenzglas wird 1 cm hoch Nylander Reagenz eingefüllt. Man gibt eine erbsengroße Menge gekochtes Hühnereiweiß dazu und hält die Mischung einige Minuten im Sieden Nachweis des Schwefels als Bleisulfid, nicht empfehlenswert: Eine Mikrospatelspitze Bleiacetat wird in wenigen Tropfen Wasser gelöst. Es wird tropfenweise Natronlauge zugegeben, bis sich der Niederschlag wieder gelöst hat. Nun gibt man eine erbsengro0e Menge gekochtes Hühnereiweiß dazu und hält einige Minuten im Sieden Nachweis des Schwefels als Bariumsulfat (oxidativer Aufschluss mit Kaliumnitrat): In ein Reagenzglas wird 2 cm hoch gepulvertes Kaliumnitrat eingefüllt und dieses wird geschmolzen Ist dieses gerade geschmolzen, wirft man eine erbsengroße Menge gekochtes Hühnereiweiß hinein. Nachdem die Reaktion abgeklungen ist, wird solange erhitzt, bis der Reagenzglasinhalt hell ist, d. h. die organische Substanz zerstört ist. Man lässt abkühlen gibt etwas Wasser dazu und erwärmt zur leichteren Auflösung des Salzes. Die Lösung wird filtriert. Das Filtrat wird angesäuert mit Salzsäure und mit Bariumchlorid-Lösung versetzt. Beobachtung: Nachweis von Stickstoff als Ammoniak: Das Eiweiß löst sich in der Natronlauge, es tritt ein stechender Geruch nach Ammoniak auf und das Indikatorpapier färbt sich blau Nachweis des Schwefels als Silbersulfid: Nach Zugabe von Silbernitrat-Lösung entsteht ein schwarzer Niederschlag. Nachweis des Schwefels als Bismutsulfid: Die Lösung färbt sich während des Erhitzens schwarz. Nachweis des Schwefels als Bleisulfid, nicht empfehlenswert: Die Lösung färbt sich während des Erhitzens schwarz. Nachweis des Schwefels als Bariumsulfat (oxidativer Aufschluss mit Kaliumnitrat): Nach Zugabe des Hühnereiweißes glüht die Schmelze auf. Nach Zugabe von BariumchloridLösung zum Filtrat bildet sich ein weißer Niederschlag. Auswertung: x Nachweis von Stickstoff als Ammoniak: In vielen Anleitungen wird das Erhitzen mit konzentrierter Natronlauge beschrieben. Die Verwendung von 1 mol/l Natronlauge ist ein Beitrag, das Gefährdungspotenzial zu senken. Trotzdem besteht die Gefahr eines Siedeverzuges und aus diesem Grunde sollte dieses Experiment im Abzug erfolgen. Nachweis des Schwefels als Silbersulfid: Es ist eine mögliche Alternative, um auf Bleisalze verzichten zu können. Wichtig hierbei ist, dass die Lauge neutralisiert wird und Säure im Überschuss vorliegt. Silbersulfid fällt auch in saurer Lösung. In alkalischer Lösung fällt Silberhydroxid aus, welches gleichfalls scharz gefärbt ist. Nachweis des Schwefels als Bismutsulfid: In der Nylander-Reagenzlösung liegt Bismut in alkalischer Lösung vor. Bismutsulfid ist auch schwarzbraun gefärbt. Diese Durchführung ist am ähnlichsten der früher üblichen Probe mit Bleiacetat. Nachweis des Schwefels als Bleisulfid, nicht empfehlenswert: Früher wurde Bleiacetat mit Natronlauge zum Plumbit umgesetzt, welches beim Erhitzen schwarzes Bleisulfid bildet. Der Nachweis ist nur aus historischen Gründen aufgenommen! Nachweis des Schwefels als Bariumsulfat (oxidativer Aufschluss mit Kaliumnitrat): Ein weiterer Nachweis ist der oxidative Aufschluss. Dieses Experiment ist nur als Lehrerdemonstrationsexperiment vorgesehen, er verlangt experimentelle Erfahrung- D 4.2.3. Fällungsreaktionen der Proteine X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Eiklar-Lösung, Trichloressigsäure - Lösung 3%, Sulfosalicylsäure-Lösung 20 %, Eisen(III)chlorid-Lösung 0,1 mol/l, Aluminiumchlorid-Lösung 0,1 mol/l Durchführung: In Reagenzgläser wird etwa 5 ml Eiweißlösung eingefüllt und es werden die angegebenen Lösungen zugegeben. Beobachtung: Es entstehen Niederschläge in jedem Reagenzglas Auswertung: Viele Chemikalien besitzen die Eigenschaft, Eiweißkörper zu denaturieren. Darunter versteht man die Zerstörung der Quartär – und Tertiär- Struktur und damit auch den Verlust der biologischen Aktivität. Oftmals ist dieser Vorgang mit einer Ausfällung verbunden. Diese Vorgänge haben auch praktische Bedeutung. In der klinisch-chemischen Analytik vor allem bei manuellen Verfahren stören Eiweiße bei verschiedenen photometrischen Verfahren. Aus diesem Grunde musste Blut und Serum enteiweißt werden. Ein vielfach angewendetes Mittel für diesen Zweck ist (war) Trichloressigsäure. Heute erfolgt die klinisch- chemische Analytik mit enzymatischen Verfahren in Analysenautomaten. Dort spielt die Störung durch Eiweiße nicht mehr diese Rolle. Zum Nachweis von Eiweiß im Harn wurde früher Sulfisalicylsäure eingesetzt, man konnte damit geringe Spuren Eiweiß nachweisen. Viele Schwermetalle fällen Eiweiß aus, damit erklärt sich auch ihre toxische Wirkung. So war es in der ersten Hilfe üblich, nach oralen Vergiftungen mit Schwermetallen viel Milch zu trinken. Das Prinzip bestand darin, die Schwermetalle zu binden, bevor sie im Organismus weiteren Schaden anrichten konnten. Auch die zur Blutstillung heute noch verwendeten Alaunstifte und die Eisen(III)chlorid-Watte beruhen auf diesem Prinzip. D 4.2.4. Die Ninhydrin-Probe X Geräte und Chemikalien: siehe auch 3.2.2., zusätzlich Eiweißlösung und Milch Durchführung: siehe auch 3.2.2 zusätzlich Wiederholung mit Milch und Eiweißlösung Beobachtung: Siehe 3.2.2. Auswertung: Siehe 3.2.2. D4.2.5. Darstellung von Biuret / Die Biuret-Probe Reagenzgläser, Brenner Harnstoff, Biuret, Milch, Eiweißlösung, Kupfersulfat-Lösung (Fehling I, Natronlauge 1 mol/l Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Brenner Harnstoff, Biuret, Milch, Eiweißlösung, Kupfersulfat-Lösung (Fehling I, Natronlauge 1 mol/l Durchführung: Darstellung von Biuret: In einem Reagenzglas wird 1 cm hoch Harnstoff eingefüllt, dann vorsichtig geschmolzen und weiter erhitzt, bis Ammoniak entweicht, erkennbar am stechenden Geruch. Man lässt abkühlen und löst den Feststoff in 5 ml Wasser Die Biuret-Reaktion: In je einem Reagenzglas werden 5 ml Eiweißlösung, Milch, die hergestellte Biuret-Lösung und wenn vorhanden 1 Spatelspitze Biuret-Substanz in 5 ml Wasser gelöst mit 2 ml Natronlauge versetzt, gut gemischt und mit 3 Tropfen Kupfersulfat-Lösung vermischt. Beobachtung: Die Biuret-Lösung färbt sich rotviolett, die Milch und Eiweißlösung blauviolett. Auswertung: Aus Harnstoff kann man Biuret erhalten, indem dieser stark erhitzt wird. NH2 / C=O \ NH2 → NH2 / C=O \ NH / / C=O \ NH2 NH3 NH2 / C=O \ NH2 Harnstoff (Kohlensäurediamid) O II 2 NH2 - C – HN2 Harnstoff (Kohlensäurediamid) Biuret → NH3 O O II II + NH2 – C – NH – C – NH2 Biuret Biuret gibt mit Kupfer-Ionen einen rotvioletten Komplex mit folgender Struktur Die Biuret- Probe wird auch heute noch zur Bestimmung der Gesamteiweißkonzentration im Serum eingesetzt (Methode nach Weichselbaum) D 4.2.6. Die Xanthoprotein-Reaktion X Geräte und Chemikalien: siehe 3.2.7 zusätzlich Milch und Eiweißlösung Durchführung: Siehe 3.2.7. zusätzlich noch mit Milch und Eiweißlösung durchführen Beobachtung: Siehe 3.2.7. Auswertung: Siehe 3.2.7. D 4.2.7. X Albumin-Globulin- Trennung Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Trichter, Filter Eiweißlösung, Ammoniumsulfat Durchführung: Herstellung gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung: In einem Reagenzglas stellt man sich eine gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung her, indem man zu 5 ml Wasser solange festes Ammoniumsulfat zugibt, bis sich trotz Schütteln nichts mehr löst. Zu 2 ml Eiweißlösung gibt man die gleiche Menge gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung mischt fut und filtriert den gebildeten Niederschlag ab. Zum klaren Filtrat gibt man festes Ammoniumsulfat.. Beobachtung: Nach dem Zusatz der Ammoniumsulfat-Lösung zur Eiweißlösung fällt ein Niederschlag aus, welcher abfiltrierbar ist. Wenn zum klaren Filtrat festes Ammoniumsulfat gegeben wird fällt erneut ein Niederschlag aus. Auswertung: Zu den wasserlöslichen Eiweißkörpern gehören die Albumine und die Globuline. Globuline sind in Wasser schwerer, in Salzlösungen dagegen leichter löslich. Albumine sind in reinem Wasser leicht löslich. Um Albumine und Globuline trennen zu können, nutzt man deren unterschiedliches Lösevermögen in starken Salzlösungen aus. Globuline werden bereits bei Halbsättigung gefällt, das heißt gleiche Volumina Proteinlösung und gesättigte Salzlösung. Albumine fallen dagegen erst bei Vollsättigung aus, das heiße, die Proteinlösung enthält die maximale Menge an gelöstem Salz. Die Proteine fallen unbeschädigt an, im Gegensatz zur Denaturierung. Die Ursache der unterschiedlichen Löslichkeit ist im Aufbau der Albumine bzw. Globuline begründet. Proteine haben als Kolloid in wässriger Lösung eine Hydrathülle. Gibt man Salze dazu, treten diese in Konkurrenz mit der Hydrathülle des Proteins um Ausbildung einer eigenen Hydrathülle. Ist die Konzentration an Salz sehr hoch, verliert das Protein die Hydrathülle und fällt aus. Globuline besitzen eine geringere Hydrathülle, deshalb werden sie schon bei geringeren Salzkonzentrationen ausgefällt. Experimentelle Alternative: Aussalzen: Unverdünntes Eiklar wird solange tropfenweise mit Wasser gemischt, bis gerade eine Trübung eintritt. Es wird festes Natriumchlorid zugegeben, die Trübung löst sich. Chemisch reines Natriumchlorid einsetzen, handelsübliches Kochsalz enthält Calciumcarbonat, um die Rieselfähigkeit zu erhalten, die wässrige Lösung ist trüb!! D 4.2.8. Modellexperiment zum isoelekrischen Punkt X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Eiklar, Essigsäure 1 mol/l, Ammoniak-Lösung 1 %, Universalindikator-Papier Durchführung: 5 ml Eiklar wird mit Essigsäure tropfenweise bis zur Trübung versetzt. Der pH – Wert wird mit Indikatorpapier ermittelt, Nun wird der Ansatz auf zwei Reagenzgläser aufgeteilt. Zu einem Teil gibt man tropfenweise weiter Essigsäure, zum anderen Teil tropfenweise Ammoniak-Lösung. Beobachtung: Die weitere Zugabe von Essigsäure bzw. Ammoniak-Lösung bewirkt die Auflösung der Trübung. Auswertung: Proteine bestehen aus einer Vielzahl von Aminosäuren, welche durch Peptid-Bindung miteinander verbunden sind. Sie zeigen daher ein chemisch gleiches Verhalten wie die Aminosäuren. Sie sind Ampholyte, d. h. Stoffe mit mindestens zwei funktionellen Gruppen, der Carboxylgruppe und der Aminogruppe. Der Ampholyt -Charakter ist mit der BROENSTEDT’schen Säure – Base- Theorie erklärbar. Nach BROENSTEDT sind: Säuren: Stoffe, welche Protonen abgeben können (Protonendonatoren) Basen: Stoffe, welche Protonen aufnehmen können (Protonenakzeptoren) S→H++B B→H+ +S Die Carboxylgruppe kann in wässriger Lösung Protonen abgeben, sie wirkt als Säure R – COOH → R – COO - + H + Die Aminogruppe wirkt als Base, sie nimmt Protonen auf. R – NH2 + H + → R – NH3+ Wenn die Carboxylgruppe und die Aminogruppe gleichzeitig dissoziiert, erhält man die Zwitterionenform. Auch bei den Eiweißkörpern besteht ein Zustand mit gleicher Anzahl dissoziierter Carboxylgruppen und ionisierten Aminogruppen. Man nennt ihn den Isoelektrischen Punkt. COO I H3N + – C - H I R Isoelektrischer Punkt An diesem Punkt hat der Eiweißkörper die geringste Hydrathülle, daraus erklärt sich die minimale Löslichkeit. Diesen Zustand erhält man nach Zusatz der verdünnten Essigsäure bis zur Trübung. Nach Zusatz von weiterer Essigsäure bzw. Ammoniak-Lösung tritt eine Auflösung der Trübung wieder ein. Ursache: Der Zusatz von Säuren bewirkt die Besetzung der negativ geladenen Carboxylgruppe. Sie wird darum ungeladen. Die Verbleibenden NH3 + - Kationen bedingen die Löslichkeit. COOCOOH I I H3N + – C – H +H+ → H3N+ -- C – H--H I I R R Nach dem Zusatz von Basen dissoziieren die an der Aminogruppe angelagerten WasserstoffIonen ab und verbinden sich mit den Hydroxid-Ionen zu Wasser. COO COOI I H3N + -- C - H + OH - → H2N – C - H I I R R Der Nachweis von Eiweiß im Harn beruhte auf diesem Prinzip. Doie Probe wurde mit einem Acetat-Puffer entsprechend dem IEP des Serumalbumins versetzt und zum Sieden erhitzt. War Protein nachweisbar, kam es zu einer Trübung. Auch die Gewinnung von Quark aus Milch beruht auf diesem Prinzip. Durch bakterielle Umsetzungen entsteht Milchsäure, dies führt zur Ausfällung von Milcheiweiß. D 4.2.9. Bestimmung des Isoelektrischen Punktes von Casein (N2-Proj) X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Reibschale mit Pistill, Trichter, Filter, 10 ml Messzylinder mit Glas-Fuß, Messpipetten 1 und 10 ml, Maßkolben 100 ml, evtl. Zentrifuge, Filzschreiber schwarz, Quark, 1 mol/l Natronlauge, 0,1 %ige alkoholische Phenolphthalein-Lösung Salzsäure 1 mol/l Essigsäure 0,2 mol/l, Natriumacetatlösung 0,2 mol/l Durchführung: X Vorbereitende Arbeiten Herstellung der Casein-Lösung: 5 g Quark werden in einer Reibschale mit Pistill mit 10 ml Natronlauge 5 -10 min verrieben. Nach Zugabe von 3 - 4 Tropfen Phenolphthalein-Lösung wird Salzsäure zugetropft, bis die Mischung nur noch ganz leicht rötlich gefärbt ist. Evtl. noch ungelöste Bestandteile durch Zentrifugieren abtrennen, und das Zentrifugat auf 100 ml mit Wasser auffüllen. Herstellen der Pufferlösungen pH - Wert 4,0 ml Natriumacetat 1,8 ml Essigsäure 8,2 4,4 3,7 6,3 4,8 5,9 4,1 5,2 7,9 2,1 5,6 9,1 0,9 Versuchsdurchführung In 5 Reagenzgläsern jeweils 10 ml Acetatpuffer vorlegen, mit 1 ml Casein-Lösung versetzen und gut durchmischen. Nun wird abgeschätzt, in welchem Reagenzglas, d.h. bei welchem pH - Wert, die Trübung durch ausgefallenes Zwitter-Ion maximal ist (isoelektrischer Punkt). Dies kann folgendermaßen recht genau geschehen: Auf weißes Papier wird mit Filzschreiber ein kleines schwarzes Kreuz gezeichnet. Darauf wird ein 10 ml Messzylinder mit Glas-Fuß gestellt und solange mit einer Tropfpipette Reaktionsmischung eingefüllt, bis das Kreuz durch diese hindurch nicht mehr sichtbar ist. Die Füllhöhe des Messzylinders ist umgekehrt proportional zur Trübung der Mischung. Beobachtung: Die Trübungen in den Reagenzgläsern sind unterschiedlich Auswertung: x D4.2.10. Die Pufferwirkung der Eiweißkörper X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Tropfpipetten, Messpipetten Eiweißlösung, Natriumacetat-Lösung 1 mol/l, Essigsäure 1 mol/l, Natronlauge 1 mol/l, Salzsäure 1 mol/l, Phenolrot-Lösung pH 6,6 – 8,4 gelb-rot, Methylorange_Lösung pH 3,8 – 4,4 rot - gelb Durchführung: X In Reagenzgläsern werden folgende Lösungen vorbereitet Glas – Nr. 1 Wasser 10 ml Essigsäure Natriumacetat Eiweißlösung Indikator 2 Tropfen 2 10 ml 2 Tropfen 3 5 ml 5 ml 2 Tropfen 4 5 ml 5 ml 2 Tropfen 5 10 ml 2 Tropfen 6 10 ml 2 Tropfen In die Reagenzgläser 1, 3, 5 tropfenweise Salzsäure geben, bis sich die Farbe verändert, Tropfen bis zum Farbumschlag zählen In die Reagenzgläser 2, 4,6 tropfenweise Natronlauge geben, bis sich die Farbe ändert, Tropfen bis zum Farbumschlag zählen Beobachtung: Bei reinem Wasser erfolgte der Farbumschlag des Indikators bereits nach einem Tropfen Säure oder Lauge, während bei der Natriumacetat-Essigsäure-Mischung größere Mengen erforderlich sind. Ein ähnliches Verhalten zeigt auch die Eiweißlösung, jedoch sind die Mengen an Säure bzw. Lauge bis zum Farbumschlag wesentlich geringer. Auswertung: Puffer sind Mischungen von schwachen Säuren und Basen sowie deren Salzen. Sie haben die Eigenschaft ihren pH – Wert nach geringem Säuren – und Basen-Zusatz nicht oder nur unwesentlich zu ändern. Die Menge an Säure oder Base, die ein Puffer aufnehmen kann, ohne den pH – Wert w3esentlich zu verändern, nennt man Pufferkapazität. Beispiel Acetatpuffer: [CH3COO - ] x [H +] K = ----------------------------------- = 1,8 x 10 -5 [CH3COOH] Essigsäure ist eine schwache Säure, denn sie dissoziiert nur geringfügig. Beim Zusatz von Natriumacetat, welches vollständig dissoziiert, wird die Konzentration an Acetat-Ionen erhöht. Das geschieht, indem die Wasserstoff-Ionen mit den Acetat-Ionen undissoziierte Essigsäure bilden. Diesen Vorgang nennt man „Abstumpfen“, d. h. durch gleichionigen Zusatz wird die Dissoziation eines Elektrolyten geringer. Eiweiße enthalten im Molekül eine Carboxylgruppe und eine Aminogruppe. Sie haben Ampholyt-Charakter (Säure und Base zugleich). Beim Zusatz von Säuren wird die Dissoziation der Carboxylgruppe zurückgedrängt, die Aminogruppe ionisiert. Beim Zusatz von Lauge wird die Ionisation der Aminogruppe zurückgedrängt, die Dissoziation der Carboxylgruppe gefördert. Eiweißkörper besitzen zwei Pufferbereiche, den der Aminogruppe und den der Carboxylgruppe. Eiweißkörper, die in der Regel aus verschiedenen Aminosäuren bestehen, überdecken die Pufferbereiche von pH – Bereich von pH 2 bis pH 13. D 4.2.11. Die Eiweißverdauung X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Brutschrank oder alternatives Wasserbad (Hinweis 2), Messpipetten Pepsin-Lösung 0,5 % in Wasser, Salzsäure 0,1 mol/l. gekochtes Hühnereiklar, evtl mit Indigocarmin angefärbt und in Würfel geschnitten 3 x 3mm), Durchführung: Es werden fünf Reagenzgläser mit A, B, C. D, E. beschriftet Reagenzglas einfüllen A 2 ml Salzsäure und 2 ml Pepsin – Lösung B 2 ml Salzsäure C 2 ml Pepsin – Lösung D 2 ml aufgekochte Pepsin-Lösung und 2 ml Salzsäure E 2 ml alkalibehandeltes Pepsin in alle Reagenzgläser gibt man ein Stück Hühnereiweiß und stellt diese für eine Stunde in den Brutschrank oder in das Wasserbad Beobachtung: Im Röhrchen A ist das Eiweiß aufgelöst, bei Verwendung von angefärbten Eiweiß ist die überstehende Flüssigkeit ist blau gefärbt Auswertung: Auswertung: Pepsin ist ein Enzym, welches nur im stark sauren Medium Proteine zu Peptiden mit einhundert Aminosäuren abbaut. Dieses Enzym liegt in den Fundusdrüsen des Magens als inaktives Pepsinogen vor, die Salzsäure wird in den Belegzellen gebildet nach Stimulation. Durch Erhitzen und Einwirkung von Basen wird es denaturiert und damit wirkungslos. Hinweis 1 Wasserbad: Das Wasserbad kann improvisiert werden, indem in eine Styropor Verpackung, in der 500 ml Chemikalienflaschen aus Glas geliefert werden, ein 400 ml Becherglas stellt. Dieses wird zur Hälfte mit Wasser (T = 40 – 42 °C) gefüllt. Die vorbereiteten Reagenzgläser werden in das Wasserbad gestellt und mit dem dazugehörigen Deckel verschlossen Hinweis 2 alkalibehandeltes Pepsin: Eine Spatelspitze Pepsin in 1 ml Wasser aufschwemmen, 1 Tropfen 30 %ige Natronlauge zugeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Anschließend 1 mol/l Salzsäure tropfenweise zugeben, bis ein pH – Wert von 2 erreicht wird (Kontrolle mit UniversalIndikatorpapier. D 4.2.12 . Der Indikatorfehler, ein weiterer Proteinen-Nachweis X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Eiweißlösung, Puffer-Lösung pH 3, Bromphenolblau - Lösung Durchführung: Zu 5 ml Wasser in einem Reagenzglas werden 1 ml Puffer-Lösung pH 3 und 3 Trofen Bromphenolblau – Lösung gegeben. Die entstandene gelbe Lösung wird auf zwei Reagenzgläser verteilt. In ein Reagenzglas wird Eiweißlösung dazugegeben. Beobachtung: Es erfolgt ein Farbumschlag von gelb nach grün bis blau Auswertung: Der pH-Indikator Bromphenolblau schlägt von pH 3,0 – 4,6 um. Er liegt bei pH 3,0 und darunter als gelbes nicht dissoziiertes Anion (Säure) und bei einem pH-Wert von 4,6 und darüber als blaues dissoziiertes Anion (Salz) vor. Zwischen pH 3,1 – 4,5 liegt eine grüne Mischfarbe vor. Der Teststreifen enthält Bromphenolblau und einen Puffer von pH 3,0. Bei einem pH- Wert von 3,0 liegen Albumine in protonisierter Form vor. Diese reagieren mit dem Anion des Bromphenolblaus, es entstehen Salze. Die Intensität der grünen Mischfarbe ist von der Proteinkonzentration abhängig. Als Protein – Lösung wird mit Kochsalzlösung verdünntes Eiklar eingesetzt. Anders formuliert: Der pH-Indikator Bromphenolblau liegt bei einem pH-Wert bis 3,0 als gelbe nicht dissoziierte Säure vor. Bei einem pH-Wert über 4,6 liegt das blaue dissoziierte Anion vor. Im Harn wird das Eiweiß als Albumin ausgeschieden. Die zu untersuchende Probe wird zunächst mit einer Pufferlösung von pH 3 versetzt. Bei diesem pH-Wert liegt das Albumin protonisiert vor, das heißt an die Aminogruppe ist das Hydroniumion gebunden. Bromphenolblau H-Ind pH < 3,0 gelb. R – NH3 + + Ind- → → H+ + Ind pH > 4,6 blau Blaugrünes Salz D 4.2.13. Die Protein-Bestimmung nach Lowry X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Biuret-Reagenz nach Lowry, Phenolreagenz nach Folin-Ciocalteu Durchführung: In einem Reagenzglas werden 5 ml Wasser und un einem Reagenzglas 5 ml Eiweißlösung vorgelegt. In beide Reagenzgläser gibt man 1 ml Biuret-Reagenz nach Lowry und 2 Tropfen Phenolreagenz nach Folin- Ciocalteu und lässt 10 min stehen. Beobachtung: Bei der Eiweißlösung findet ein Farbumschlag von farblos nach dunkelblau statt. Auswertung: Bestimmte Aminosäuren wirken reduzierend auf Kupfer - Ionen. Zweiwertiges Kupfer wird zu einwertigen reduziert. Die Aminosäuren Cystein Tyrosin und Tryptophan wirken reduzierend. Zunächst findet die Biuret – Reaktion statt. Die gebildeten Kupfer (I) – Ionen reagieren mit dem Phenol – Reagenz, dieses enthält Wolframatophosphorsäure und Molybdatophosphorsäure zu einem blauen Farbstoff (Gemisch aus Wolframblau und Molybdänblau). Diese Methode gestattet die Bestimmung von kleinen Protein Konzentrationen D 4.2. 14. Die Protein-Bestimmung nach Bradford X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Eiweißlösung, Bradford Reagenz Durchführung: Zu Eiweißlösung wird Bradford-Reagenz gegeben Beobachtung: Es findet ein Farbumschlag von braun - rot nach blau statt. Auswertung: Der Farbstoff Coomasiebrillantblau G 250 bildet in saurer Lösung Komplexverbindungen mit unpolaren Seitenketten der Proteine. Er liegt in saurer Lösung in kationischer Form vor, er ist brau – rot gefärbt. Die anionische Form ist blau gefärbt. Es ist eine ähnliche Reaktion (Farbstoffbindung) wie beim Indikatorfehler. D 4.2.15. Die Protein-Bestimmung mit dem BCA-Reagenz X Geräte und Chemikalien: Reagenzgläser, Eiweißlösung, BCA – Reagenz I (alkalische Tartrat – Lösung mit BCA) und BCA II (Kupfersulfat) Durchführung: Herstellung der BCA – Lösung: 10 ml BCA I und 0,2 ml BCA II werden gemischt. Die Lösung ist apfelgrün gefärbt und nur einen Tag haltbar. Zu BCA – Lösung wird Eiweißlösung gegeben Beobachtung: Es findet ein Farbumschlag von apfelgrün nach rotviolett statt. Auswertung: Bestimmte Aminosäuren wirken reduzierend auf Kupfer - Ionen. Zweiwertiges Kupfer wird zu einwertigen reduziert. Die Aminosäuren Cystein Tyrosin und Tryptophan wirken reduzierend. Die gebildeten Kupfer(I) – Ionen reagieren mit Bichinchonincarbonsäure, es entsteht ein rotvioletter Farbkomplex. Der Kupfer(II)komplex der Bichinchonincarbonsäure ist apfelgrün gefärbt. D 4.2.16. Die Empfindlichkeit verschiedener heute üblicher Bestimmungsmethoden für Proteine, ein Vergleich X Geräte und Chemikalien: 6 Vollpipetten 10 ml, Messpipetten 2, 5, 10 ml. 7 Maßkolben 100 ml Becherglas 100 ml Glasstab, Pipetten 0,1 ml, Albumin aus Hühnerei (Albumen ovi) Biuret - Reagenz nach Weichselbaum, BCA - Reagenz, Biuret – Reagenz nach Lowry, Sulfosaliclysäure Lösung 20 %, Bradford - Reagenz, Natriumacetat Puffer I nach AB 2 DDR – DL, Durchführung: Herstellung der Verdünnungsreihe: 10 g Albumin werden abgewogen. In ein 100 ml Becherglas werden etwa 75 ml Wasser eingefüllt. Das Albumin ist unter Rühren mit einem Glasstab portionsweise einzurühren, wobei unbedingt darauf geachtet werden muss, das keine Klumpen entstehen. Ist das gesamte Albumin eingetragen, wird der Inhalt des Becherglases quantitativ in einen Maßkolben überführt. Man lässt diesen dann noch eine Stunde bei Raumtemperatur stehen und füllt diesen dann mit Wasser zur Marke auf. Die Eiweiß-Stammlösung ist leicht trüb! Von dieser Stammlösung werden mit einer Vollpipette 10 ml entnommen, in einen 100 ml Maßkolben überführte, gut gemischt, aber nicht geschüttelt, nur leicht geschwenkt wegen der Schaumbildung). Dieses wiederholt man noch viermal Protein-Nachweise: Biuret nach Weichselbaum (Ph Eur): 5,0 ml Biuret – Reagenz nach Weichselbaum 0,1 ml Eiweißlösung Bradfort – Test: 5,0 ml Bradford – Reagenz 0,1 ml Eiweißlösung BCA – Test: 2,0 ml BCA – Reagenz 0,1 ml Eiweißlösung Lowry – Test: 1 ml Biuret Reagenz nach Lowry 0, 1 ml Eiweißlösung 0,1 ml Folin Ciocalteu - Reagenz (1 Volumenteil Reagenz und 9 Volumenteile Wasser Sulfosalicylsäure – Test (SSS): 5,0 ml Eiweißlösung 0,5 ml (10 Tropfen) Sulfosalicylsäure – Lösung Fällung am Isoelektrischen Punkt: 5,0 ml Eiweißlösung 0,5 ml (10 Tropfen) Natriumacetat-Puffer I für 5 min in ein siedendes Wasser stellen oder auf offener Flamme 2 Minuten kochen Beobachtung: X Konz. Biuret Bradford BCA 100 g/l + + + 10 g/l (+) + + 1 g/l 0 (+) 0 100 mg/l 0 0 0 10 mg/l 0 0 0 1 mg/l 0 0 0 + = positiv, (+) schwach positiv, 0 = negativ Lowry + + + 0 0 0 SSS. + + + (+) 0 0 Na-acetat + + + (+) 0 0 Auswertung: Das Ziel dieses Experiment ist es, die heute in der biochemischen Forschung üblichen Methoden vorzustellen und auch deren unterschiedliche Empfindlichkeit. Herstellungsvorschrift für die Reagenzien Aluminiumchlorid-Lösung 0,1 mol/l: 24,1 g Aluminiumchlorid-Hexahydrat werden in Wasser gelöst und zu 1000 ml aufgefüllt. Ammoniak-Lösung 10 %: 100 ml Ammoniak – Lösung 25 % werden mit Wasser zu 250 ml aufgefüllt. Ammoniak-Lösung 1 %: 10 ml Ammoniak-Lösung 10 % werden mit Wasser zu 100 ml aufgefüllt. Bariumchlorid – Lösung 0,05 mol/l: 12,2 g Bariumchlorid Dihydrat werden in Wasser gelöst und zu 1000 ml aufgefüllt. BCA- Reagenz A: Dieses Reagenz ist im Handel erhältlich. Es enthält 10 g BCA, 20 g NatriumcarbonatMonohydrat, 1,6 g Natriumtartrat, 4 g Natriumhydroxid, 9,5 g Natriumhydrogencarbonat in 1000 ml Wasser gelöst. BCA – Reagenz B: Es handelt sich um eine Kupfersulfat-Lösung, die eine Konzentration von 4 g Kupfersulfat pentahydrat gelöst in 100 ml Wasser hat. Biuret-Reagenz nach Lowry: Lösung A: 20 g Natriumcarbonat (wasserfrei) in 0,1 mol/l Natronluge gelöst Lösung B: 10 g Natriumtatrat und 5 g Kupfersulfat-pentahydrat mit Wasser zu 1000 ml Aufgefüllt Lösung C: 50 ml Lösung A und 1 ml Lösung B immer frisch herstellen Biuret - Reagenz nach Weichselbaum: Gebrauchslösung: In einen 100 ml Maßkolben werden 20 ml Natronlauge 1 mol/l pipettiert. Darin werden 0,9 g Kaliumnatriumtartrat gelöst. Nun werden 50 ml Wasser zugegeben. Danach werden 0,3 g Kupfersulfat-pentahydrat zugegeben und wenn dieses gelöst ist noch 0,5 g Kaliumiodid darin gelöst, Danach wird mit Wasser zu 100 ml aufgefüllt. Diese Lösung ist 14 Tage haltbar. Bradford Reagenz: 10 mg Coomasiebrillantblau werden in 5 ml Ethanol gelöst. Nach Zusatz von 10 ml 85 %iger Phosphorsäure wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Bromphenolblau – Lösung: 100 mg Bromphenolblau werden in Ethanol (Brennspiritus) gelöst und mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt. Bromthymolblau-Lösung: 100 mg Bromthymolblau werden in Ethanol (Brennspiritus) gelöst und mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt. Cresolphthalein-Lösung: 100 mg Cresolphthalein werden in Ethanol (Brennspiritus) gelöst und mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt. Diazo I (Sulfanilsäure-Lösung): 0,5g Sulfanilsäure werden in 50 ml Wasser gelöst, mit 5 ml 25 %iger oder 3,5 ml 37 %iger Salzsäure versetzt und mit Wasser zu 100 ml aufgefüllt. Diazo II (Natriumnitrit-Lösung): 0,5 g Natriumnitrit werden in Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt. Dinatriumpentacyanonitrosylferrat RM nach AB 2 DDR DL: 0,25 g Nitroprussidnatrium (Dinatriumpentacyanonitrosylferrat), 50 g wasserfreies Natriumcarbonat und 50 g Ammoniumsulfat werden sorgfältig in einer Reibschale miteinander verrieben und in einer dichtschließenden Braunglasflasche vor Feuchtigkeit geschützt aufbewahrt. Eisen(III)chlorid-Lösung 0,1 mol/l: 27, 0 g Eisen(III)chlorid – hexaydrat werden inter Zusatz von 10 ml 37 %iger Salzsäure in Wasser gelöst und mit Wasser zu 1000 ml aufgefüllt. Essigsäure 1 mol/l: 60 ml Eisessig werden mit Wasser zu 1000 ml aufgefüllt. Essigsäure 0,2 mol/l: 20 ml Essigsäure 1 mol/l oder 1,2 ml Eisessig werden mit Wasser zu 100 ml aufgefüllt. Glyoxylsäure-Lösung (Hopkin-Cole-Reagenz): 6g Oxalsäure in 50 ml destilliertem Wasser lösen, evtl. erwärmen. 20 ml (!) Magnesiumpulver in einem 200 ml Erlenmeyerkolben mit wenig Wasser anfeuchten, unter Kühlung die Oxalsäure -Lösung zugeben und 1 Stunde stehen lassen. Danach filtrieren, den Filterrückstand mit wenig Wasser waschen, das Filtrat mit Essigsäure ansäuern und auf 150 ml auffüllen. gekochtes Hühnereiklar: Hühnereiklar mit verdünnter Indigocarmin – Lösung mischen und in einem flachen Gefäß, welches sich in einem siedenden Wasserbad befindet stocken lassen (10 min) und nach dem Abkühlen in kleine Würfel schneiden. Kupfersulfat-Lösung (Fehling I): 7 g Kupfersulfat 5 hydrat werden in Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt. Methylorange-Lösung: 100 mg Methylorange werden in Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt. Millon – Reagenz: 10 g Quecksilber (ca 0,8 ml) werden unter dem Abzug in 10 ml konz. Salpetersäure (evtl. erwärmen.) gelöst. Diese Lösung ist mit 20 ml dest. Wasser zu verdünnen. Molisch-Reagenz: 3 g 1-Naphthol werden in 100 ml Ethanol gelöst. Wichtig ist hierbei, dass nur ein hellgefärbtes Präparat geeignet ist. Durch längere Lagerung färbt sich die Substanz dunkel und ist für den Molisch-Test nicht mehr einsetzbar. Naphthochinon-Lösung: 1 g Natriumsalz der ß – Naphthochinonsulfonsäure in Wasser lösen und zu 50 ml auffüllen. Natriumacetat-Lösung 1 mol/l: 13,6 g Natriumacetat-trihydrat werden in Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt. Natriumacetat - Lösung 0,2 mol/l: 20 ml Natriumacetat – Lösung 1 mol/l oder 2,72 Natriumacetat-trihydrat werden in Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt Natriumacetat Puffer I nach AB 2 DDR – DL: 12,5 g Natriumacetat-trihydrat werden in 50 ml Wasser gelöst, mit 6 ml Eisessig versetzt und mit Wasser zu 100 ml aufgefüllt. Natriumcarbonat-Lösung: 100 g Na2CO3 x 10 H2O werden in Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt. Natriumhypobromit-Lösung: 20 ml Bromat-Bromid-Lösung (25 g Natriumbromid und 2,5 g Natriumbromat /l) werden in einem mit Glasstopfen verschließbaren Erlenmeyerkolben mit 5 Tropfen konzentrierter. Schwefelsäure versetzt. Kolben verschließen. Wenn die Entwicklung von Brom abgeschlossen ist (Brom – Dämpfe über der Lösung) wird tropfenweise unter Umschütteln Natronlauge zugegeben, bis die Lösung farblos ist. Diese Lösung ist nicht haltbar und muss daher unbedingt frisch hergestellt werden! 1 mol/l Natronlauge (Reagenz): 10 ml 33 %ige Natronlauge mit Wasser auf 100 ml auffüllen. Ninhydrin- Lösung: 1 g Ninhydrin wird in 100 ml Ethanol gelöst. Nylander-Reagenz: 4 g Kaliumnatriumtartrat und 10 g Natriumhydroxid werden in 90 ml destillierten Wasser gelöst. Nach Zugabe von 2 g Bismutsubnitrat (basisches Bismutnitrat BiONO3)wird dieses unter Schütteln gelöst und danach wird mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Falls die Lösung trübe ist, durch Glaswolle filtrieren. Die Aufbewahrung erfolgt in einer Flasche aus Kunststoff. Phenolphthalein- Lösung: 50 mg Phenolphthalein werden in Ethanol (Brennspiritus) gelöst und mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt. Phenolphthalein sollte, wo es möglich ist, durch Cresolphthalein ersetzt werden. Phenolreagenz nach Folin-Ciocalteu: Dieses Reagenz sollte fertig bezogen werden, da eine Selbstherstellung in der Schulpraxis nicht in Betracht kommt. Der Vollständigkeit halber sei die Rezeptur angegeben. 100 g Natriumwolframat und 25 g Natriummolybdat werden in 700 ml Wasser gelöst und mit 50 ml 85 %iger Phosphorsäure und 100 ml 37 %iger Salzsäure versetzt. Die Mischung wird in einen Rundkolben überführt und 10 Stunden unter Rückfluss gekocht. Danach werden 150 g Lithiumsulfat , 50 ml Wasser und einige Tropfen Brom zugegeben und es wird 15 Minuten ohne Rückflusskühler zur Entfernung des Brom- Überschusses gekocht. Nach dem Abkühlen wird mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt und in eine Braunglasflasche überführt. Das fertige Reagenz ist zitronengelb gefärbt und darf keinen grünlichen Farbton besitzen, da dieser die Bestimmung stört. Phenolrot-Lösung: 100 mg Phenolrot werden in Ethanol (Brennspiritus) gelöst und mit Ethanol zu 100 ml aufgefüllt. Puffer pH 3: 8,47 g Citronensäure - monohydrat, 3,49 g Natriumchlorid, 20,6 ml 1 mol/l Natronlauge mit Wasser zu 100 ml auffüllen Sakaguchi-Reagenz zum Nachweis von Arginin: R 1 = Molisch-Reagenz R 2 = Natriumhypobromit- Lösung (Bromlauge) 100 ml 33 %ige Natronlauge mit 0,8 ml Brom mischen (Abzug!!!) oder alternative Rezeptur Salpetersäure 1 mol/l 7,0 ml 65 %ige Salpetersäure werden mit Wasser zu 100 ml aufgefüllt. Salzsäure 10 %: 25 ml 37 %ige Salzsäure mit Wasser zu 100 ml auffüllen 1 mol/l Salzsäure (Reagenz): 8,2 ml 37 %ige Salzsäure mit Wasser zu 100 ml auffüllen. Silbernitrat-Lösung 1 %,: 1g Silbernitrat wird in destilliertem Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt. Die Lösung ist lichtempfindlich und daher in einer Flasche aus Braunglas aufzubewahren. Sulfosalicylsäure-Lösung 20 %: 20 g Sulfosalicylsäure werden in Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt. Trichloressigsäure - Lösung 3%: 3 g Trichloressigsäure werden in Wasser gelöst und zu 100 ml aufgefüllt. Literaturverzeichnis Aebi, H. Einführung in die praktische Biochemie für Studierende der Medizin, Veterinärmedizin, Pharmazie und Biologie 1965, Basel, New York, S. Karger Verlag Ahrens, G. Die Urinanalyse 1966, Leipzig, Johann Ambrosius Barth Verlag Europäisches Arzneibuch 6. Ausgabe Grundwerk 2008, Stuttgart, Eschborn, Deutscher Apotheker Verlag, Govi-Verlag Hallmann, L. Klinische Chemie und Mikroskopie 1950, Leipzig, Georg Thieme Verlag Hennig, H-G., Jugelt,W. Sauer, G. Praktische Chemie, ein Studienbuch für Mediziner und Naturwissenschaftler 1983, Thun und Frankfurt am Main, Verlag Harri Deutsch Homolka, J. Chemische Diagnostik im Kindesalter 1961, Berlin (Ost), VEB Verlag Volk und Gesundheit Jander / Blasius Lehrbuch der analytischen und präparativen Chemie 1969, Leipzig, S. Hirzel Verlag Lorenz, I, Praktikum der Biochemie für Studierende der Medizin und Stomatologie 1989, Leipzig, Johann Ambrosius Barth Verlag Proske, W. Reagenzglasversuche zur Organischen Chemie und zur Biochemie Jahresarbeit, Fernstudium Medizinisch-technische Laborassistenz 1980, Halle /Saale, Medizinische Fachschule der Martin Luther Universität Rapoport, S.M. Raderecht, H-J. Physiologisch chemisches Praktikum 1989, Berlin (Ost), VEB Verlag Volk und Gesundheit Simon, G. Praktikum der Organischen Chemie 1975, Köln, Aulis Verlag Siegmund, P., Schütte, E., Körber, F. Praktikum der physiologischen Chemie 1968, Berlin (West), Walter de Gruyter Verlag Teichmann, W. Untersuchungen von Harn und Konkrementen 1980, Berlin (Ost), VEB Verlag Volk und Gesundheit Weiwad, M. Persönliche Mitteilung Geräte und Chemikalien: x Durchführung: x Beobachtung: x Auswertung: x
