Kapillarelektrophorese DNA-Sequenzierung Kapillarelektrophorese

Kapillarelektrophorese DNA-Sequenzierung
Kapillarelektrophorese DNA-Sequenzierung
DNA Kettenanalyse oder DNA-Sequenzierung wird bei der Anordnung der Primärstruktur
und Bestimmung der Nukleotid-Basensequenz verwendet. Die Analyse basiert auf der
Hybridisierung
der
Nukleinsäure-Ketten.
Während
dieser
Hybridisierung
werden
Markierungen mit radioaktiven oder nicht radioaktiven Substanzen gemacht. Oft wird dieses
Verfahren bei der Erkennung von Gen Mutationen (Deletionen, Insertionen usw.) oder bei
der Behandlung von rekombinanten DNA verwendet. Darüber hinaus können auch die GenSteuerungsregionen bei der genetische Regulation, die Konsensus-Sequenzen, epistatische
Gene und deren Wirkung festgestellt werden. Präimplantationsdiagnostik wird häufig bei der
Erkennung von Erbkrankheiten verwendet. Die DNA von IVF-Embryonen bei Paaren mit
Erbkrankheiten werden analysiert und die die genetische Krankheit tragende Embryonen
eliminiert. Danach werden auch Nabelschnurblut und Knochenmark der gesunde Embryonen
bei der Behandlung von erkrankten Geschwistern verwendet. Für diese Studien wird in der
Türkei eine automatisierte Ablauf-Analysemethoden verwendet. Für die automatische
Sequenzanalyse werden die PCR-Produkte unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden
gereinigt. Das am häufigsten verwendete Reinigungsverfahren ist die Siliciumdioxid
basierende Methode. Kommerziell hergestellte Kits werden genutzt. Am häufigsten wird ABI
Prism Big DyeTM Terminator Reaktion Kit verwendet. Dieser PCR Kit beinhaltet alle PCR
Chemikalien, mit Leuchtstoff gefärbtes ddNTP und Taq DNA Polymerase Enzym in einer
Mischung. Diese Mischung wird als "Big Dye Ready Reaction Mix" bezeichnet. Es werden
nur gereinigte Template-DNA und Primer zu dieser Mischung hinzugefügt und PCR wird
gestartet. Die DNA Sequenzierung Methode von Sanger wird weiterentwickelt und die in
jeder Reaktion verwendeten ddNTP werden mit verschieden Farben gefärbt. Mit dieser
Technologie können tausende von Nukleotid DNA-Sequenzen in einigen Stunden analysiert
werden. So können sehr große DNA-Sequenzierung Projekte entwickelt werden. Das in der
Sanger Verfahren verwendete ddNTP wird mit Fluoreszenzmolekülen verbunden. Die Teile,
endend mit ddNTP, haben ihre eigene Farbe. Alle 4 markierten ddNTP werden in einem
Rohr hinzugegeben. Die gefärbten DNA-Fragmente werden durch elektrophoretisches Gel in
dem Kapillarrohr nach deren Größe aufgetrennt.
Materialien für die DNA-Sequenzierung
Kapillarelektrophorese DNA-Sequenzierung
DANN-Templat
-Mix
Wasser
Vorwärtsprimer
Rückwärtsprimer
PCR-Mischung
-Polymerase
-SAP Purifikation Enzym
Purifikation Kolonne
Dye-Terminator-Mix
Sephadex
Laufpuffer
Polymersequenz
Sequenzen Platte
Methode der DNA-Sequenzierung
A. Vorbereitung des Genomischen DNA-Templats
a. Genomische DNA wird nach Standard-Protokolle zur Isolierung hochmolekulare DNA
hergestellt.
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b. Genomische DNA-Konzentration wird nach spektrophotometrische Verfahren bestimmt.
c. Genomische DNA wird nach der gemessenen Konzentration mit sterilem, deionisiertem
Wasser oder 10 mM Tris, pH 8,0 verdünnt.
i. Für Humanes Gen soll die DNA bis zwischen 30-60 ng / ul verdünnt.
d. Verdünnte DNA portioniert und bei -15 ° C bis -25 ° C aufbewahrt.
1. Vermeiden Sie mehrfachtes Enteisen und Einfrieren.
e. DNA-Qualität wird durch Berechnung des Verhältnisses A260/A280 bestimmt.
1. Anmerkung: Bei der hochwertigen DNA wird das Verhältnis A260/A280 dazwischen 1,71,9 sein.
B. PCR Amplifikation
a. Vorbereitung der PCR-Reaktion:
i. Das Reaktionsgemisch wird vorbereitet.
ii. Wenn die zu erarbeitende Anzahl der Proben zur Herstellung der Reaktionsmischung hoch
ist, können die gemeinsamen Chemikalien als Master-Mischung –wie PCR-Master-Mix G / C
Enhancer- vorbereitet werden. Die benötigte Menge den Master-Mix wird nach der Anzahl
der Proben berechnet und in den PCR Rohre gleichmäßig verteilt.
b. Reaktionsmischung
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a. PCR Master Mix ............................... 12,5 µl
1. In PCR-Mastermix sind für die PCR Reaktion benötigte MgCl2, dNTPs, Taq-Polymerase,
und der Puffer-Lösung zu finden.
b. Forward (Vorwärts) Primer ..................... 2,5 µl
1. In dieser Studie wird speziell für genomische DNA-Bereiche konzipierter vorwärts
(forward) Primer verwendet.
c. Rückwärts (Reverse) Primäre ...................... 2,5 µl
1. In dieser Studie wird speziell für genomische DNA-Bereiche konzipierter Rückwärts
(Reverse) Primer verwendet.
d. G / C Enhancer ................................... 5 µl
1. Die Verbindung der Primer zur Genomische DNA-Sequenz wird erleichtert.
e. Genomische DNA (30-60 ml) ................ 2,5 µl
a. Nachdem Eingeben aller Chemikalien werden die PCR-Röhrchen kurz verwirbelt.
Das Gesamtvolumen nach der Zugabe aller Chemikalien sollte 25 µl betragen.
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f. Die PCR Röhrchen werden im PCR Thermikzyklus- Gerät platziert.
g. Die Ergebnisse der Aktivierung, Amplifikation und Dehnung sowie Zeiteinstellungen
werden je nach Experiment gespeichert. Beispielseinträge sind wie folgt:
Aktivierung: 1 Schleife
95°C ..................... 10‘
95°C..................... 40‘'
Verstärkung: 40 Zyklen
62°C....................... 1 '
72°C....................... 50''
Dehnung: 1 Zyklus
72°C ....................... 7 '
Lagerung
4°C...........................∞
C. Bestimmung der Menge der DNA
a. Nach der PCR-Reaktion wird das 5µl PCR-Produkt - um die Menge der DNA zu
bestimmen - von der DNA entfernt, mit Ladepuffer vermischt und in bereits vorbereitetes
2%iges
Agarosegel
gegeben.
DNA-Marker
wird
in
die
leer
Vertiefungen/Brunnen gefüllt.
Die Reaktion wird mittels Illumination UV Bildgebungsvorrichtung betrachtet.
gelassenen.
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b. Reinigung von PCR-Produkten
Nach der PCR Reaktion werden die PCR-Gefäße kurz zentrifugiert.
I. 5 µl wird in ein anderes PCR-Röhrchen als das, in dem das PCR-Produkts enthalten ist,
gegeben.
II. Um die PCR-Reaktion-Rückstände zu entfernen werden 2 µl Transaktion-spezifisches
Enzym zugegeben.
III. Gesamtvolumen soll 7 µl betragen.
IV. Die vorbereiteten Röhrchen werden in dem Thermikzyklus- Gerät platziert und je nach
verwendetem Enzym die notwendigen Voraussetzungen geschaffen, um das Gerät starten
zu können. Repräsentative Voraussetzungen sind wie folgt:
Enzyme Inkubation:
37 ° C ..................... 30
Enzymdeaktivierung:
80 ° C..................... 15 '
Lagerung:
4 ° C ..................... ∞
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D. Vorbereitung der Sequenzreaktion
a. Die nach der PCR-Reaktion gereinigten Produkte werden für die Sequenz-Reaktion
vorbereitet. Die benötigte Materialien für die Sequenz-Reaktion sind wie folgt:
 Farbe Terminator Mischung (Dye Terminator Miks )......................... 2 µL
 Sequenzpuffer
......................... 2 µL
 Forward (F) / Rückwärts-Primer (R)
......................... 2 µL
 PCR-Produkt
......................... 2 µL
 destilliertes Wasser
......................... 2 µL
b. Das Gesamtvolumen wird 10 µL betragen. Die vorbereiteten Röhrchen werden kurz
verwirbelt , zentrifugiert und in dem Thermikzyklus- Gerät platziert.
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Beispiel: Thermikzyklus Bedingungen sind wie folgt:
Aktivierung:
96 ° C ..................... 1 '
Cycle: 25 Wiederholung
96 ° C
..................... 10''
50 ° C
....................., 5''
60 ° C
..................... 4 '
Lagerung:
4 ° C ..................... ∞
E. Purifikation der Extensor-Produkte
a. Die Produkte werden unter Verwendung von Sephadex-Spalten/ Säulen purifiziert.
Vorbereitung der Spalten:
a. Es werden zu Sephadex-Spalten/ Säulen 750 µL ultrareinem Wasser gegeben.
b. Sie Spalten/Säulen werden bis sich das Sephadex Pulver auflöst verwirbelt.
c. Nachdem die Spalten 30 Minuten bei Raumtemperatur geruht haben, werden sie 2
Minuten bei 4600 prm zentrifugiert. In dem Spalte entsteht eine zylindrischen geformte Matix.
d. Es wird sicherstellt dass das gesammelte Wasser in der Spalte vollständig abgelassen
wurde.
e. Alle Sequenzprodukte werden sorgfältig auf der Mitte der Sephadex Matrix der Sequenz
mit einer Pipette platziert.
f. Die Spalte/Säule wird erneut 2 Minuten bei 4600 rpm zentrifugiert.
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F. Installation des Purifizierten Produkts zum Kapillarelektrophorese Serie Analyzer
a. Alle in dem Spalte-Container gesammelten Produkte werden auf einer Platte mit 96
Vertiefungen/Brunnen übertragen.
b. Die Platte wird mit Septa verschlossen.
c. Die Platte wird im Plattenhalter platziert
d. Die mittels Kapillarelektrophorese erhalten Daten werden ausgewertet.