Agarosegelelektrophorese
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Agarosegelelektrophorese Eine sehr wichtige Analysentechnik für Nukleinsäuren Sie lernen ... • das Prinzip, Nukleinsäuren zu analysieren • DNA anzufärben • DNA zu quantifizieren Problem Die Länge eines DNA-Moleküls kann in weiten Grenzen schwanken: • Chromosom: 2 x 108 bp • chromosomale DNA aus einem Bakterium oder Virus: 4 x 106 bp • Plasmid-Moleküle: 1 x 104 bp • Fragmente eines Restriktionsverdaus: 3 x 103 bp • PCR-Produkte: 1 x 103 bp • Primer/Oligos: 20 nt Lösung • Elektrisches Feld • Setzt geladene Moleküle voraus • DNA ist wegen der Phosphatgruppen negativ geladen (Anion) • DNA wandert also zur Anode (Plus-Pol) • „Poren“ in der Trennmatrix sieben die Moleküle nach ihrer Größe Und noch ein Problem • • • • DNA ist farblos Wie kann die DNA „sichtbar“ gemacht werden? Durch Färbung: z.B. mit Ethidiumbromid Achtung: der Farbstoff muss die DNA erkennen. Weil der Farbstoff mit der DNA eine Wechselwirkung eingehen muss, kann er für unser Genom „gefährlich“ sein. 1. Schritt • Lösen Sie 0,8 g Agarose in 98 ml demin. Wasser und 2 ml 50-fache TAE- Stammlösung • Kochen Sie die Suspension auf, bis sie aufklart. Hinweise: • Die Agarose-Menge bestimmt die Porosität der Trennmatrix. Je höher die Agarosemenge, desto kleiner die Poren, desto kleinere DNA-Fragmente können getrennt werden. • Achten Sie auf einen möglichen Siederverzug beim Aufkochen der Agarose. 2. Schritt • Gießen Sie die etwa 60°C heiße Agarose in die waagerecht liegende Gelkammer. • Setzen Sie den Kamm in die Gelkammer. • Lassen Sie die Agarose erkalten. Hinweise: • Die Agarose wird fest, wenn sie abkühlt. Dabei trübt sich das Gel ein. • Die Agarose kann im Trockenschrank bei 60°C wochenlang flüssig gehalten werden. • Achten Sie auf eine waagerecht liegende Gelkammer, damit das Gel gleichmäßig dick wird. Ungleichmäßige Gele liefern ungleichmäßige Trennungen. 3. Schritt • Überschichten Sie das Gel etwa 3 mm mit Trenngelpuffer (1x-TAE) • Ziehen Sie den Kamm aus den Probetaschen. • Achten Sie darauf, dass die Probetaschen gleichmäßig mit Puffer voll laufen. 4. Schritt • Mischen Sie Ihre DNA-Proben mit Auftragepuffer, z.B. 5 µl Plasmidlösung mit 1 µl 6x Probenauftragepuffer. • Bringen Sie Ihre DNA-Proben in die Probentaschen. • Tragen Sie in der 1. und in der letzten Spur einen geeigneten DNA-Längenstandard auf. Hinweise: siehe nachfolgende Folie Hinweise zum Probenauftrag • Mischen Sie die Proben auf einem Stück Parafilm. Auf dessen hydrophober Oberfläche bleiben die Lösungen als leicht mischbare Tropfen stehen. • Der Auftragepuffer enthält einen oder zwei Farbstoffe: Bromphenolblau und eventuell Xylencyanol. Bromphenolblau zeigt die Front der wandernden Anionen. • Der Auftragepuffer erhöht die Dichte Ihrer Probelösung. Damit wird ein Aufschwimmen der Probe in der Probentasche verhindert. • Notieren Sie unbedingt die Reihenfolge Ihrer Proben und deren Probevolumen. Probenauftrag Probentasche für Gewichts-Standard 1 2 3 Probentasche für Gewichts-Standard 4 5 - + • Tragen Sie in die flankierenden Probetaschen den DNALängestandard auf. • Sie können die Länge der DNA in ihren Proben daran referenzieren. 5. Schritt • Schließen Sie die Spannungsquelle an die Gelkammer an. • Legen Sie eine Spannung von bis zu 7 Vcm-1 Elektrodenabstand an. • Das elektrische Feld wird erst abgestellt, wenn die Bromphenolblaufront das Gelende erreicht hat. Hinweise: • Bei 15 cm Elektrodenabstand werden maximal 120 V angelegt. • Bromphenolblau wandert in einem 0,8%-igen Gel wie etwa 400 bp lange DNA. 6. Schritt • Entnehme Sie mit einem Spatel das Agarosegel aus der Gelkammer. • Färben Sie das Gel mit einem Farbstoff Ihrer Wahl in einer Färbekammer. Hinweis: Farbstoffe, die DNA anfärben, können gesundheitsschädlich sein. Beachten Sie die Sicherheitshinweise zu dem von Ihnen eingesetzten Farbstoff. Färbung mit Ethidiumbromid • Mischen Sie 1 µl einer 1%-igen Ethidiumbromidstammlösung mit 100 ml 1x-TAE Puffer. • Inkubieren Sie das Gel für 5-10 min in diesem Färbebad. • Legen Sie es auf einen Transilluminator (302 oder 312 nm) Hinweise: siehe nachfolgende Folie! Hinweise zur EtBr-Nutzung • Tragen Sie unbedingt Handschuhe (Latex oder Nitril)! • Das Färbebad sollte an einer gesicherten Stelle stehen. Es darf nur unter Lehreraufsicht benutzt werden. • Das EtBr-Färbebad kann wochenlang lichtgeschützt bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. • Sie können das Gel bei Bedarf nachfärben. 7. Schritt • Dokumentieren Sie das Ergebnis Ihrer Analyse mit einer digitalen Kamera. • Beschriften Sie in einem Bildbearbeitungsprogramm die Banden des verwendeten Längenstandards.
