Single Chromatin Streching Reveals Physically Distrinct

Single Chromatin Stretching
Reveals Physically
Distinct Population of
Disassembly Events
L. H. Pope, M. L. Bennink, K. A. van
Leijenhorst-Groener, D. Nikova, J.
Greve, und J. F. Marko
wird präsentiert von Anil Demirata
Gliederung
 Hintergrundwissen und Einführung
 Material und Methoden
 Ergebnisse und Diskussion
 Zusammenfassung und Ausblick
Grundkenntisse




DNA + Proteine  Chromatin
Kompaktierung: 104 – 105
Grundeinheit: Nukleosom
Es besteht aus:
 NCP: nucleosome core
particle
 Linkerhistonen
 Linker DNA
 Höher geordnete Chromatin
Strukturen
http://micro.magnet.fsu.edu/cells/nucleus/images/chromatinstructurefigure1.jpg
Nukleosom
 NCP: ist ein Oktamer
 1x (H3-H4)2 Tetramer
 2x (H2A-H2B) Dimere
 DNA: ~146 bp
 um 1,65 mal
 Linkerhiston: bindet
ein/ausgehende DNA
(~160 bp)
 Linker DNA: Abstandhalter:
(~200 bp)
 Chromatin Breite: 11 nm
http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/Stryer/Stryer_F37-08.jpg
http://www.bio.miami.edu/dana/104/nucleosome.jpg
Höher geordnete Chromatin Strukturen
 Auch 30 nm-Fiber genannt
 Zwei Modelle
 Reguläre Spirale
 Irregulärer Zick Zack
 Aktive Form
 Dynamisch für
 Rekombination
 Transkription
 Reparationsmaschinerie
http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/seitz-stefanie-2004-10-20/HTML/seitz_html_21996ee1.png
wird erreicht durch...
 Posttranslationale
Modifikationen
an den Ausläufern
von Histonen:
 acetyliert (A)
 phosphoryliert (P)
 Ändert NCP-NCP
Wechselwirkung (WW)
  der Grad der
Kompaktierung ist
regulierbar durch Schlüsselenzyme
http://chemistry.gsu.edu/faculty/Zheng/nucleosome.jpg
wird erreicht durch (2)...
 Änderungen in
Ionenkonzentrationen
 Linkerhistone
 die Abschirmung der
negativen Ladung
des DNA-Rückgrats
 auch durch basische
nicht-Histon Proteine:
HMGs
 Polyamine in Chromatin
http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/molecular%20biology/dsDNA.jpg
Einführung
 Vorteil der Forschung mit einzelnen Molekülen
 Untersucht werden




Struktur,
Dynamik,
Kinetik und
Mechanik
 von DNA-Protein WW
 in Zusammenhang mit DNA-Kompaktierung
 mit den Methoden: AFM, Optical Tweezer und
flow generated forces
drei wichtige Studien
 Extrahierte individuelle
 Rekonstruierte
Chromatinfäden
Chromatinfäden
 Native
 präzis und
Chromatinfäden
reproduzierbar
 Untersucht wird
mechanische
 Strukturelle
Eigenschaften
Informationen
 Bei verschiedenen
 Stretching
Salzkonzentrationen
 Zerreißen von
 Weniger kompaktes
Chromatin in
einzelnen
niedrigeren
Nukleosomen
Salzkonzentrationen
Individuelle DNA Moleküle
Definierte kurze Nukleosomenarray
Keine Linkerhistone
Nukleosomen werden schrittweise gespaltet
Ziel dieser Arbeit
 Bestehende Frage: “Wie wird der genetische
Code organisiert und zugegriffen?”
 Erwartungen: Die Stretching-Bedingungen
beeinflussen Zerreißkraft
 Hier: bestimmt wird
 Zerreißkraft (F) und
 Längenunterschied (ΔL)
 jeweils pro mechanisches Zerreißen von
Chromatinfaden (Event)


Zerreißkraft  Energiebarrieren
Längenunterschied  Typ des Nukleosomsunterbrechen
Ziel dieser Arbeit (2)
 Bestehende Frage: “Wie wird der
genetische Code organisiert und
zugegriffen?”
 Überlegung: DNA-Protein WW müssen
irgendwie geändert und/oder unterbrochen
werden
 Durch Kraftgenerierende Motoren:
Polymerasen
Material
 12 bp Überhänge von λ-DNA werden ergänzt
 in der PCR mit bio-11-dUTP und bio-14-dATP
 Streptavidin bekleidete Polystyrene beads
(Ø=2,6μm)
Methode
 1 DNA Molekül zwischen 2 Beads
 + Xenopus Oozytenextrakt
 Kompaktion von DNA von 16,4 μm zu 2 μm
Optical
trapping
 1064 nm
Infrarotlaser
O 
Micropipette:
erlaubt das
Bewegen von
nicht
“getrappten”
bead
 piezzo-Streckung
Optical trapping
 Quadrant Detektor:
notiert Ablenkung des
transmittierten
Laserlichts
 Kraft ist Direkt
proportional zu Δx
Ergebnisse
Fig2
 Genereller Verlauf:
 1.& 2. Streckung von
rekonstutierter
Chromatinfaden
 Vergrößerung:
 Einzelne Events
(DNA-Protein WW)
 ΔL  Indiz: welche WW
ist unterbrochen
 Kraft / Extensions-Kurve
(später)
 Plateau bei 65pN
 Hier: Dabei steigt die
(wie bei nackten DNA)
Kraft F steigt stetig an
und dann fällt plötzlich
ab
Statistik
 Kraft-Extensions-Kurven
 mit verschiedenen Chromatinfasern
 Mit verscheidenen PiezoStreckgeschwindigkeiten
 Zerreißkraft (F) und Längenunterschied (ΔL)
Analyse
 ΔL pro Event
 Histogramme
 Multi Gauss Fitting 
 3 peaks bei 30, 59, und 117 nm
 30nm  Abwickeln halbes Nukleosoms
 59nm und 117nm  1-2 Nukleosom Abwickeln
Fig 3
Applied Dynamic Force Spectroscopy Theory
 Betrachtungen:
 Für jedes Zerreißen: dF/dt aus
 dF/dx und Streckgeschwindigkeit v
 Chromatin: Kette von N in Serie
geschalteten Ereignissen
 folgende Strecken:
weniger Ereignisse mit höherer Kraft
sichtbar
 3 Energiebarrieren
Fig 4
Alle
Weitere
Strecken
Erstes
Strecken
Korrelationen
 Um eine Korrelation zwischen Energiebarrieren
und Typ von Zerreißen der Nukleosome zu
bestimmen
 Daten (F) werden sortiert
 Für korrespondierende Energiebarrieren
 Graphen F vs ΔL
 Eine kleine Korrelation sichtbar
Fig5
28 kBT
25 kBT
Diskussion
 Chromatin DNA + Xenopus Oozytenextrakt
 Hier: statt somatischem Linkerhiston H1 
embryonisches Linkerhiston B4
 Weniger basisch im C-Terminus
 geöffnete aktive Form
 in vitro : physiologisch angeordnete
Nuckleosomen (mit 62 nm Abstand)
 Längenunterschied korreliert nur mit
Abwicklung der Nukleosomen
Warum zwei verteilte Kräfte?
Warum verschwindet eine nach der ersten Strecken?
 schrittweise
 1. B4  sehr mobile, schwach gebundene Proteine
 2. H2A-H2B Dimere
 3. (H3-H4)2 Tetramer
 Höhere Kraft
 im ersten Strecken: alle Linkerhistone
 eine Energiebarriere (28kBT)
 Niedrige Kräfte
 2 Energiebarrieren (25kBT & 20kBT)
 gleiche Anzahl von Events für hohe und niedrige Kraft
 in Natur 28kBT und 25kBT Barrieren möglich
 Differenz: 3kBT: Energiebeitrag von B4
Abwicklung von DNA
 ändert die Konturlänge
 zwei diskräte ΔL: bei 30nm und 60nm
 60 nm:
ganzes
Nukleosom
 30 nm:
partielle
Abwicklung
 3 Modelle
neues Modell
 zuerst: Linkerhistone und (H2A-H2B) Dimer
 dann: übriges Hexamer
K.K.Klenin,
Klenin,T.T.Wocjan,
Wocjan,J.J.Langowski
Langowski(2006)
(2006)
zweites Modell
 zuerst: Linkerhiston und schwachgebunde
Teile der NCP
 dann: übrige Oktamere
zusätzlich
 Zuerst Chromatinfaden vollständig strecken
(bis auf nackte DNA-Länge)
 dann Relaxation, Chromatinfaden zieht sich auf
intermediäre Konturlänge zusammen
  NCP-Teile nicht vollständing abgelöst
 keine Korrelation in der Abfolge der 30nm und
60 nm-Schritte
Zusammenfassung
 Abwicklung von Nukleosomen verläuft in
Schritten
 30 nm “Halbschritte” in rekonstutiertem
Chromatinfaden (hier) und kurzen
Nukleosomenarrays (Brower-Toland et al.)
 3 Energiebarrieren
 Für folgende Streckzyklen: Events zu 28kBT
 Energiebeitrag des B4 Linkerhistons: 3kBT
Zusammenfassung 2
 diese Barrieren  Hindernis beim Zugriff
auf den genetischen Code
 kraftausübende Motoren (Polymerasen)
 Torsionkräfte auf DNA durch Polymerasen
können zum Öffnen des Chromatins
beitragen
 Nukleosomen können abgewickelt und dann
wieder hergestellt werden.
 Traskription ist bei (H3-H4)2 nicht gestört
Ausblick
 Ersetzen oder Ausnehmen von Faktoren im
Extrakt
 B4 gegen H1 tauschen oder “abschalten”
 Rekombinante Histone
  Effekte von (A) & (P) vortäuschen
 Histone ohne Ausläufer(tails)
 Effekt von HMGs?
 Studien mit einzelnen Molekülen: erweitert den
Einblick
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
 Fragen??
 Anregungen??
 Beschwerden??