in-vitro Testung der Influx-Transporterfunktion von stabil
Werbung
Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen Zellen bilden gewünschtes Transfektion Infektion Selektion undoder Isolation Protein (z.B. mit ein dem Zielzelle der erfolgreich Transporterprotein) Gen of interestZellen (GI) transfizierten GI GI GI Endosom Endosom GOLGI GOLGI Lysosom Lysosom GOLGI ERGIC ERGIC Zellkern Zellkern Lysosom GOLGI GOLGI ERGIC Zellkern endoplasmatisches endoplasmatisches Retikulum Retikulum Endosom Endosom Endosom Lysosom Lysosom endoplasmatisches Retikulum GOLGI ERGIC ERGIC Zellkern Zellkern Lysosom Zielzellen in Kulturschale GOLGI GOLGI Lysosom Lysosom ERGIC ERGIC ERGIC Zellkern Zellkern Zellkern endoplasmatisches endoplasmatisches Retikulum Retikulum Endosom Endosom Endosom endoplasmatisches Retikulum endoplasmatisches endoplasmatisches Retikulum Retikulum in-vitro Testung der Influx-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen Konzentrationsbestimmung Lyse dervon Zellen des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht Zugabe transfizierte Abwaschen des Zellen Substrat nicht nehmen aufgenommenen Substrat auf, Substrates wenn Substrat radioaktiv markierten ist, Substraten oder β-counter radioaktiv markierten Proben. transporterspezifisch Kontrollzellen nicht oderbei deutlich Nach Gesamtproteinbestimmung zwischen stabil transfizierten und nicht weniger, da der Transporter fehlt Vergleich oder nur gering exprimiert transfizierten Zellen. wird Endosom Endosom GOLGI Lysosom GOLGI Lysosom Zellkern Zellkern endoplasmatisches Retikulum GOLGI ERGIC ERGIC Lysosom Stabil transfizierte Zellen GOLGI Lysosom ERGIC ERGIC Zellkern Zellkern endoplasmatisches Retikulum Endosom Endosom endoplasmatisches Retikulum endoplasmatisches Retikulum Nicht transfizierte Kontrollzellen in-vitro Testung der Transporterinhibition von endogen exprimierenden oder stabil transfizierten Zellen Konzentrationsbestimmung Inhibitor Zugabe Kontrollzellen Abwaschen Lyse dervon Zellen zu des lagert den Substrat nehmen sich überschüssigen denan zuSubstrat Transporter untersuchenden des auf, Substrates Inhibitors Substrates an wennTransporter Substrat mittels LC-MS/MS transporterspezifisch exprimierenden oder Elisa Zellen bei ist.nicht Die geben, Kontrollzellen inhibierten radioaktiv markierten Zellen nehmen ohne Substraten weniger Inhibitor oder oder β-counter kein Substrat bei radioaktiv auf, da der markierten Transporter Proben. blockiert Nach Gesamtproteinbestimmung ist Vergleich zwischen inhibierten Zellen und Kontrollzellen. Endosom GOLGI Lysosom Endosom GOLGI ERGIC Zellkern Lysosom GOLGI ERGIC Zellkern endoplasmatisches Retikulum Endosom Lysosom GOLGI ERGIC Zellkern endoplasmatisches Retikulum Endosom Lysosom ERGIC Zellkern endoplasmatisches Retikulum Kontrollzellen endoplasmatisches Retikulum in-vitro Testung der Efflux-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen Zellen Membranen ggfs. Zugabe Abwaschendes Homogenisieren apikale lysieren von isolieren Substrat bilden und nicht der balolaterale inside-out-Vesikel, Vesikel aufgenommenen Membranen d.h. Substrates die Membranbestandteile Substrat Konzentrationsbestimmung gelangt über Efflux-Transporter des Substrates in trennen mittels dasinneren Innere LC-MS/MS der Vesikel oder über Elisa bei nicht liegen außen undtransfizierten umgekehrt Membranen radioaktiv markierten der Substraten Zellen, oderwenn β-counter Substrat bei transporterspezifisch radioaktiv markiertenist, Proben. die Nach Vesikel Gesamtproteinbestimmung der Membranen der Kontrollzellen Vergleich zwischen nehmenstabil kein transfizierten Substrat oderund nur nicht wenig transfizierten auf, da Zellen. der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird Endosom GOLGI Lysosom Endosom GOLGI ERGIC Zellkern Lysosom GOLGI ERGIC Zellkern endoplasmatisches Retikulum Endosom Lysosom Stabil transfizierte Zellen GOLGI ERGIC Zellkern endoplasmatisches Retikulum Endosom Lysosom ERGIC Zellkern endoplasmatisches Retikulum endoplasmatisches Retikulum Nicht transfizierte Kontrollzellen
