Molecular techniques for diagnosing and monitoring
Werbung
> Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter Klinische Mikrobiologie AKH Wien Kennen Sie dieses Szenario? Fiebernder, vortherapierter ICU-Patient Infektion? Sepsis = SIRS durch Infektion Wenn ja, welche? Gefragt wäre rasch ein relevanter Befund Erreger, Empfindlichkeitsprofil Warum ist Sepsisdiagnostik wichtig? Haupttodesursache auf nichtkardiologischen ICU Direkte Behandlungskosten in D: 1,1 bis 2,45 Milliarden Euro/Jahr Therapie oft empirisch 11% - 46% ICU Patienten initial falsch therapiert 1, 2, 3 Zeitfaktor essentiell für Outcome Letalität hoch (40%) 1 Kollef M, Chest, 1999 2 Garnacho-Montero J, CCM, 2003 3 Byl B, CID, 1999 Von welchen Infektionen geht eine Sepsis am häufigsten aus? Lunge Harnwege Bauchorgane Wunden und Weichteile Katheter ZNS Herzklappen Andere (z.B. Sinus) 44.0% 9.1% 8.6% 6.6% 2.2% 0.8% 0.6% 10.8% Bakterien im Blut (positive Blutkultur) 17.3% (Angus DC, Crit Care Med 2001; 29:1303-1310) Anteil positiver Blutkulturen AKH Wien 2005 12% n=15.636 88% Butkulturen ohne Wachstum Positive Blutkulturen Krankenhaushygiene, AKH Wien Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik Blutkultur (BK) Diagnostik - Neu PNA-FISH aus BK Light Cycler®SeptiFAST aus EDTA-Blut rDNA-Sequenzanalyse Diagnostik - In Entwicklung Chip-Techniken Alt, aber gut: die BK Blutmenge ist DER entscheidende Faktor! Bakteriämie: Erwachsene <1-10 Kinder 10->100 KBE/ml KBE/ml Gesamtvolumen: 15-20 ml (Kinder 1-5 ml) Standard: 1 aer. + 1anaer. Fl. od. 2 aer. Flaschen Wann BK abnehmen? Möglichst früh bei Symptomen, die auf eine Sepsis hinweisen Vor Behandlungsbeginn, ansonsten am Ende eines Antibiotika – DI 2-3 Kulturen in rascher Folge Bei negativem Ergebnis nach 24h WH! Keine „Überwachungs-BK“ Keine „follow-up“ BK nach Diagnosestellung Diagnostischer Zeitrahmen BK Empirische AB-Therapie Anpassen – De-Eskalieren Tag Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7 28 PILZE Blutkultur Gram ID + AB Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik Blutkultur (BK) Neu PNA-FISH aus BK Light Cycler® SeptiFAST aus EDTA-Blut rDNA-Sequenzanalyse In Entwicklung Chip-Techniken PNA-FISH Peptide Nucleic Acid Fluorescence In Situ Hybridization Fluoreszierende PNA Sonde hybridisiert mit ribosomaler RNA Blut-Kultur Identifikation in 2.5 h Für in vitro Diagnostik Diagnostischer Zeitrahmen PNA-FISH vs. BK: - 1d Empirische AB-Therapie Anpassen – De-Eskalieren Tag Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7 28 -> PILZE ! Blutkultur Gram ID + AB PNA-FISH: Target rRNA Hoch konserviert 103-105 Kopien/Zelle (natürliche Amplifikation) rRNA Sequenzen = taxonomische Referenz Schnell-ID positiver BK S. aureus PNA FISH Gram Fbg. Yeast C. albicans PNA FISH E. faecalis PNA FISH Multiplex Real-time PCR am Light Cycler 2.0 (Roche) Diagnostics Light Cycler® SeptiFAST aus EDTA-Blut PCR Kultur freie DNA lebende Bakterien/Pilze lebende Bakterien/Pilze tote Bakterien/Pilze phagozytierte Bakterien/Pilze lebende, phagozytierte Bakterien/Pilze (?) human DNA Diagnostics The LightCycler SeptiFast Test Hypothesis: DNA in human blood? Target Region – Internal Transcribed Spacer Multiple specific HybProbe probes Spacer Region (ITS*) Ribosomal Genes • Multiple copies • Well investigated • Especially suited for Group testing • Multiple copies • Well investigated • Especially suited for Species testing Single Copy Genes • No enhancement • Less investigated * ITS = internal transcribed spacer Diagnostics The LightCycler SeptiFast Test Das HybProbe Prinzip 2 Sonden = benachbart hybridisierendes Oligopaar Signal (FRET) nur wenn beide nebeneinander binden Sequenz-spezifische Detektion + Mutationsanalyse in der Hybprobe-Targetsequenz durch Schmelzkurvenanalyse möglich! - MagNA Lyser Instrument - Sample Preparation Sample or Negative Control Lysis Internal Control Extraction LightCycler Instrument Purified NA 50 µl The LightCycler SeptiFast Kit Gram (-) eluate each Gram (+) Fungi Diagnostics The LightCycler SeptiFast Test Negative Control / Internal Control Channel Diagnostics The LightCycler SeptiFast Test Channel distribution Gram (+) S. spp. from SML (610) 610 S.spp Channel 640 Channel 670 Channel 705 CoNS from SML Staphylococcus aureus CoNS S.aureus S. spp from SML (670) Streptococcus pneumoniae S.spp S.pneu Internal Control Enterococcus faecium Enterococcus faecalis IC E.fum E.fis t [°C] SeptiFast Master List Gram (-) Gram (+) Fungi •Escherichia coli •Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) •Serratia marcescens •Enterobacter (cloacae / aerog.) •Proteus mirabilis •Pseudomonas aeruginosa •Acinetobacter baumannii 3 •Stenotrophomonas maltophilia •Staphylococcus aureus •CoNS 1 •Strep. pneumoniae •Streptococcus spp. 2 •Enterococcus faecium •Enterococcus faecalis •Candida albicans •Candida tropicalis •Candida parapsilosis •Candida glabrata •Candida krusei •Aspergillus fumigatus 1 Coagulase Negative Staphylococci (Species which represent the group are listed in the PI). 2 Species which represent the group Streptococcus spp. are 3 Species referred as A. calcoaceticus- A.baumannii are not listed in the PI. detected. • Each bullet point represents a specific melting point, species in brackets are not differentiated Keimspektrum AKH Wien 2005 % 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Sepi 25% Sau 12% 46 E. coli 9% Klebsiella 5% Enterobacter 3% 21 6 6 4 5 2 Krankenhaushygiene, AKH Wien Empirische ABTherapie Anpassen – De-Eskalieren Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 ! Blutkultur 6h SeptiFAST Gram ID + AB Tag Tag 5 Tag 6 Tag 7 28 -> PILZE rDNA-Sequenzanalyse Real-time PCR + Sequenzierung rDNA-Sequenzanalyse 16S rDNA für Bakterien 18S, 28S rDNA & ITS1 & 2 Region für Pilze Direkt von Patientenprobe Amplifikation mit universellen Primern Sequenzieren der Amplicons Alignment mit Datenbank perimentelle Schritte in der Identifizierung einer bakteriellen on: Zielgene Real-time PCR-Amplifikation 16S rDNA Universelle Primer 16S tRNA tRNA 23S rDNA Operon 341f 16S rDNA = universelles bakterielles Gen Konservierte Regionen … Primertarget 907r Hypervariable Regionen518r (zB V3) … Phylogenetische Analyse 5S Überblick Sequenzreaktion Sequenzreaktion & Aufreinigung MicroSeq Komponenten dRhodamine dye Terminatoren, cycle sequencing A G dR110 C dTAMRA dR6G T dROX Analyse der Daten Editieren der Sequenz Technik Anfordern: Besuchen Sie uns! http://www.meduniwien.ac.at/akh/ klinischemikrobiologie Worum es heute geht Konventionelle Diagnostik Blutkultur (BK) Neu PNA-FISH aus BK SeptiFAST aus EDTA-Blut rDNA-Sequenzanalyse In Entwicklung Chip-Techniken Microarrays Detektion hunderter Mikroorganismen simultan (100.000e Gene) Detektion wichtiger Resistenzgene Bestimmung von verschiedenen Genotypen, Mutationen Quantifikation möglich Oligo-shotgun-Chip Austrian Research Center Seibersdorf genomic 16S rRNA gene- fragments Patterns of green spots identify species + resistence present in sample Cloning of interesting genes in E.coli ( plasmids) Amplicons(oligos) of all gene fragments spotted onto chip = probes Hybridization DNA* extraction from specimen (*incl. unknown bacterial DNA) -> PCR (whole bacterial DNA tagged with Cy3) Diagnostischer Peptidchip Anwendung in Körperflüssigkeiten Simultane Detektion verschiedener Erreger & Resistenzen: Protein/Epitop am Chip detektiert spezifische Immunantwort Funded by: Co-Operate Vienna Wiener Wirtschaftförderungsfond Peptidchip - Strategie Prediction of Bacterial Antigens in silico Whole genome B cell epitopes Collection of Sera Sera from patients (with bacterial infections) Sera from healthy persons Bacterial Epitope Identification Peptide Synthesis Peptide ELISA with Sera Validation of Antigens Peptide ELISA Peptide Chip Take home message: Besuchen Sie uns! http://www.meduniwien.ac.at/akh/ klinischemikrobiologie
