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Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Diplomarbeit Sören Werner Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. Bley Prof. Dr.-Ing. D. Eibl Dr. rer. nat. D. Grimmecke Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 1 Einleitung Dresden 16.05.2016 • Escherichia coli Wildstamm mit weitestgehend unbekannter Physiologie Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • Bisher identifizierte Eigenschaften liefern Anhaltspunkte für eine mögliche probiotische Nutzung zur Prävention und Akutbehandlung entzündlicher Darmerkrankungen • Gestiegene Anzahl antibiotikaresistenter Krankheitserreger stärkt das Marktpotential probiotischer Pharmakons in Human- und Veterinärmedizin • Zusätzlich sind Nebenwirkungen von Antibiotika unerwünscht Ziel → Kultivierung des Stammes mit einer hohen Zelldichte und einer Anpassung an das Milieu „Verdauungstrakt“ Sören Werner Folie 2 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 2 Theoretischer Überblick Dresden 16.05.2016 Escherischia coli Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit Sören Werner Folie 3 • Fakultativ anaerobes, gramnegatives, stäbchenförmiges, nichtsporenbildendes und peritrisch begeißeltes Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae • Medizinische Mikrobiologie unterscheidet kommensale, nichtpathogene und pathogene Stämme • Diagnostische Differenzierung beruht auf der serologischen Einteilung von Kauffmann nach O-, H- und K-Antigen Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 2 Theoretischer Überblick Dresden 16.05.2016 Wachstum von E. coli Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • Heterotrophe Mikroorganismen → Energie aus Oxidation energiereicher organischer Verbindungen • Bei E. coli Kohlenhydrate, organische Säuren oder Aminosäuren als Energie- und Kohlenstoffquelle • Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren als Stickstoffquelle • Makroelemente wie Magnesium, Kalium, Eisen und Phosphor essentiell • Mikroelemente wie Bor, Mangan, Kupfer, Cobalt, Molybdän in spezifischen Funktionen Sören Werner Folie 4 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 2 Theoretischer Überblick Dresden 16.05.2016 Stressantwort von E. coli • Allgemeine Stressantwort geregelt durch alternativen s-Faktor S → veränderte RNA-Synthese Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit Sören Werner Folie 5 • Säurestressantwort durch Bildung biogener Amine aus korrespondierenden Aminosäuren → dadurch Verbrauch eines Wasserstoffions • Aminosäure/Amin-Paare: Glutaminsäure/g-Aminobuttersäure (GABA), Arginin/Agmatin/Putrescin, Ornithin/Putrescin und Lysin/Cadaverin Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 3 Material und Methoden Dresden 16.05.2016 Kultivierungen Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • Komplexes Nährmedium (Pepton) anaerob in Schüttelkultur (37 °C, 150 rpm, pH-ungeregelt) • Komplexes Nährmedium (Pepton, LB) aerob im 15L Bioreaktor von Braun (37 °C, 400-800 rpm, 1-2 vvm, pH 6,8) • Wachstum, Substratverbrauch und Produktbildung aufgezeichnet • Bildung biogener Amine als Zeichen der Stressadaption durch HPLCAnalyse ermittelt → Physiologie in Bezug auf Stressantwort und Wachstum • Nach Medienoptimierung Validierung des Mineralmediums durch Versuche in Analogie zu Komplexmedium Sören Werner Folie 6 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 3 Material und Methoden Dresden 16.05.2016 Medienoptimierung Einleitung Theorie • Ableitung chemisch definiertes Mineralmedium aus Erkenntnissen von Wachstumsversuchen und Literaturangaben Material und Methoden • Optimierung in einem Mikrotiterplattenphotometer (Thermo Electron) Ergebnisse • Mineralmedium aus Glucose, Ammoniumchlorid, Phosphatpuffer, Magnesiumsulfat und Spurenelementen Fazit Sören Werner Folie 7 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 3 Material und Methoden Dresden 16.05.2016 Analysen Einleitung Theorie • Zellzahl und Biotrockenmassekonzentration über Korrelation zur optischen Dichte ermittelt Material und Methoden • Medienbestandteile mit Bioprofile 300 (Nova Biomedical) untersucht Ergebnisse • Konzentration biogener Amine und korrespondierender Aminosäuren mittels HPLC (Dionex) bestimmt Fazit Sören Werner Folie 8 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 4 Ergebnisse Dresden 16.05.2016 Komplexmedium anaerob Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • Wachstum bis zu einer Zelldichte von 0,35 g·L-1 • pH-Wert sinkt auf 4,0 • Glucoseverbrauch von insgesamt 2,5 g·L-1 (teils auch nach Wachstumsstop) → Metabolismusaktivität • Acetat- und Ethanolausschüttung (1,3 g·L-1 bzw. 0,35 g·L-1) auch nach Wachstumsstop • Aminausschüttung equimolar und zeitgleich zu Aufnahme von Aminosäuren als Zeichen der Säurestressantwort Sören Werner Folie 9 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 4 Ergebnisse Dresden 16.05.2016 Komplexmedium aerob Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • Wachstum bis zu einer Zelldichte von 2,5 g·L-1 • pH-Wert geregelt (pH 6,8) • Hohe Acetatausschüttung (1,3 g·L-1) trotz ausreichender Sauerstoffsättigung aufgrund hoher Glucosekonzentration (36 g·L-1) • Ausschüttung von Cadaverin und Putrescin trotz physiologischem pH-Wert • Keine Bildung von g-Aminobuttersäure und Agmatin Sören Werner Folie 10 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 4 Ergebnisse Medienentwicklung und -optimierung Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • pH-Wert ungeregelt • optimales Wachstum bei Glucosekonzentration von 7,2 g·L-1 • Ammoniumchlorid als bevorzugte Stickstoffquelle • Aminosäuren mit teils negativen Auswirkungen • Zugabe von Vitaminen nahezu ohne Einfluss auf Wachstum Sören Werner Folie 11 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Dresden 16.05.2016 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 4 Ergebnisse Mineralmedium anaerob Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit Sören Werner Folie 12 • Wachstum bis zu einer Zelldichte von ca. 0,15 g·L-1 • pH-Wert sinkt auf 4,0 • Keine Stressantwort in Form von biogenen Aminen nachweisbar → unbekannte Cofaktoren müssen analysiert werden Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Dresden 16.05.2016 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik 4 Ergebnisse Dresden 16.05.2016 Mineralmedium aerob Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • Wachstum bis zu einer Zelldichte von 5 g·L-1 • pH-Wert geregelt (pH 6,8) • Kaum Acetatausschüttung • Vollständiger Verbrauch von Glucose (7,2 g·L-1) • Parameter: µmax=0,79 h-1 , YX/Gluc=0,76 g·g-1, KGluc=0,003 g·L-1, YX/NH4+=0,13 g·mmol-1 Sören Werner Folie 13 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Dresden 4 Ergebnisse 16.05.2016 Aerobe fed-batch-Strategie Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • Wachstum bis zu einer Zelldichte von 60 g·L-1 • pH-Wert geregelt (pH 6,8) • Acetatausschüttung bei Limitierung durch Sulfatmangel (Stunde 18) • Ausschüttung von Cadaverin, Putrescin und g-Aminobuttersäure trotz physiologischem pH-Wert → teilweise konstitutive Bildung • Weitere Parameter: YX/PO Sören Werner Folie 14 4 3+=3,55 g·mmol-1, YX/SO 4 2+=14 g·mmol-1 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Dresden 5 Fazit 16.05.2016 Zusammenfassung • Ausgeprägte Stressantwort durch Biosynthese biogener Amine im Komplexmedium unter anaeroben, nicht pH-geregelten Bedingungen Einleitung Theorie Material und Methoden Ergebnisse Fazit • Aufnahme von Aminosäure und Export der korrespondierenden Amine nahezu equimolar und zeitgleich • Unter aeroben, pH-konstanten Bedingungen keine Beziehung • Medienoptimierung im Mikrotiterplattenphotometer ist ressourcenschonend • Optimale Glucosekonzentration 7,2 g·L-1 • Mineralmedium mit gutem aerobem Wachstum • Säurestressantwort auch bei Zugabe der benötigten Precursoren kaum vorhanden • Bei höheren Zelldichten (fed-batch bis 60 g·L-1) unter pH-konstanten Bedingungen Bildung von Aminen → teils konstitutiver Charakter Sören Werner Folie 15 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Dresden 5 Fazit 16.05.2016 Ausblick • Säurestressantwort im Mineralmedium Einleitung • Assay zur Bestimmung der allgemeinen Stressantwort (ss) Theorie • Vitalitätsbestimmung Material und Methoden • Verbesserte Prozessführung mit online-Messung Ergebnisse Fazit Sören Werner Folie 16 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Dresden 16.05.2016 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Einleitung Theorie Danke für Ihre Aufmerksamkeit Material und Methoden Ergebnisse Fazit Offene Fragen? Sören Werner Folie 17 Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000
