Contest - Proteomanalyse von 10.000 Zellen

12. Arbeitstagung
Contest
Proteomanalyse von 10.000 Zellen
12. Arbeitstagung Martinsried 18.-20. Juli 2005
12. Arbeitstagung
Analyse eines Zellpellets aus
10.000 Zellen
• Menschliche Zellinie aus
embryonalen Nierengewebe
• HEK 293 Zellen wurden
unter Standardbedingungen
kultiviert.
• Zellen wurden bei 4°C
geerntet und 3 mal mit PBSPuffer gewaschen
• Zellen wurden gezählt und mit PBS-Puffer auf eine
Konzentration von 10.000 Zellen pro 10 µl eingestellt.
• Zellen wurden aliquotiert und in der SpeedVac eingeengt.
12. Arbeitstagung
Reproduzierbarkeit der Aliquotierung
der Pellets von 10.000 Zellen
• Reproduzierbarkeit der
Erzeugung der Zellpellets
wurde mittels SDS-PAGE
überprüft
1 2 3 4 5 6 7
1
Marker
2-7 Pellets von 10.000 Zellen
Optimierung der Verdaubedingungen
Bedingungen:
A
B C D E
-+ -+ -+ -+ -+
12. Arbeitstagung
• Für die Optimierung des
Verdaus wurden verschiedene
Bedingungen getestet
• Ansätze wurden mittels SDSPAGE verglichen
Marker
A Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall/Benzonase -/+ Trypsin
B Phosphat-Puffer/CHAPS/Ultraschall -/+Trypsin
C Phosphat-Puffer /CHAPS/95°C/Benzonase -/+ Trypsin
D Phosphat-Puffer/CHAPS/ 95° -/+Trypsin
E 1 M Harnstoff-Puffer/CHAPS -/+ Trypsin
12. Arbeitstagung
Herstellung des Verdaus von
10.000 Zellen
• Ausgangsmaterial: Zellpellet aus 2 Millionen Zellen
• In 20 µl Lysis-Puffer (TrisHCl 30 mM; Thioharnstoff 2M;
Harnstoff 7 M; CHAPS 4 %) aufgenommen
• 6 x 10 Sekunden Ultraschall lysiert
• 1:10 verdünnt mit 10 mM NH4HCO3-Puffer
• 100 µl Trypsinlösung (0,06 µg/µl) zugegeben
• Inkubation über Nacht
• Volumen auf 2 ml gebracht (Wasser)
• In 10 µl Aliquots aufgeteilt; entsprechend 10.000 Zellen
• Aliquots in der SpeedVac eingeengt
Reproduzierbarkeit der einzelnen
Contest-Aliquots
RT: 0.00 - 65.04
100
95
90
90
85
85
80
80
75
61.06
989.6
75
70
70
65
65
Relative Abundance
Relative Abundance
95
60
63.16
989.6
55
50
45
40
43.73
41.42 640.7 45.34
914.5 50.13
688.5
831.6
33.78
816.5
35
30
60
55
45
15
26.00
22.58 981.5
16.77 19.51 901.7
1003.6
594.6
10
5
1.69
7.25
1015.6 1577.5
0
0
5
10
15
20
25
31.81
816.5
40
49.30
912.6
30
25
20
31.25
1168.4
15
22.78
17.82 981.6
3.87 7.89 15.53 901.6
819.4 615.4 1003.6
10
5
30
35
Time (min)
40
45
50
39.85 43.40
715.6 914.4
35
39.70
844.5
20
48.22
831.6
50
55.10
1180.6
25
55
0
60
0
5
10
15
20
29.06
26.17 1168.5
712.5
25
58.16
1314.5
37.76
844.5
30
35
Time (min)
40
45
50
55
60
65
RT: 0.00 - 65.07
NL:
60.28
7.07E7
953.6
Base Peak
60.40 MS
953.6 LCQ11139
100
95
90
95
NL:
6.65E7
Base Peak
MS
LCQ11140
90
85
80
85
75
80
48.11
831.6
70
75
65
70
65
60
49.94
831.6
55
50
45
33.56
816.5
40
35
62.92
989.6
Relative Abundance
LCQ classic
Säule: C18; Ø 75 µm x 25 cm
Gradient Ameisensäure, 90 min
58.33
953.6
100
RT: 0.00 - 65.07
Relative Abundance
12. Arbeitstagung
100
BasepeakChromatogramme von
vier Contest-Verdau
Proben
NL:
7.23E7
Base Peak
MS
LCQ11137
60.60
953.6
NL:
6.52E7
Base Peak
MS
LCQ11138
58.50
953.6
RT: 0.00 - 64.99
41.39
42.00
715.6
850.4
55
50
31.69
816.5
45
54.76
977.9
35
43.70
664.0
30
50.91
1161.4
30
40.90
688.6
25
25
15
10
15.35 19.24
831.6 1003.5
3.34 7.47
860.1 615.4
5
0
0
5
10
15
28.92
1168.5
25.87
712.5
20
30.80
1168.4
20
15
25.79
22.18 981.5
901.6
10
17.02 17.80
13.26 943.6 901.7
594.5
0.83
948.7
5
0
20
25
30
35
Time (min)
40
45
50
55
54.88
978.1
43.33
39.32 914.4
688.5
40
56.85
977.8
41.03
688.5
60
65
61.03
989.6
60
0
5
10
15
20
32.17
1134.4
22.51
981.4
25
30
35
Time (min)
40
45
50
55
60
65
12. Arbeitstagung
2D-PAGE von 10.000 Zellen, 2 µg Protein, Cy3-markiert
(40 cm x 30 cm) 3.100 Proteinspots
Contest-Teilnehmer
Verdau
12. Arbeitstagung
Methode
Pellet
Methode
Agilent
Technologies
3 Läufe 1D-LC-MS/MS
(HPLC-Chip/MS XCT
Ultra)
Applied
Biosystems
2 Läufe LC MALDI –
MS/MS
(4800 TOF/TOF
Analyzer)
1 Lauf LC-MS/MS
(MIDAS;
4000QTRAP)
Bruker
Daltonics
1 Lauf LC-ESI-IT MS
(HCT)
1 Lauf LC-MALDIMS/MS
(Ultraflex)
GE Healthcare
3 Läufe 1D-LC-MS/MS
(LTQ)
3 Läufe 2D-LCMS/MS
(LTQ)
Protana Inc.
3 Läufe LC-MS/MS
( LTQ, "Proteome
Reactor“)
Thermo
Electron
3 Läufe LC-MS/MS
(LTQ)
Methode
2 Läufe LCMALDI-MS/MS
(Ultraflex)
3 Läufe LCMS/MS
( LTQ,
"Proteome
Reactor“)
Suchmaschine
Datenbank
Spectrum
Mill
(A03.01.03
7a)
IPI.human.v
306
MASCOT
CDS
MASCOT
(v2.1.0)
Swissprot
(21.06.2005)
Sequest
NCBI
MASCOT
(v2.1.0)
NCBI
(June 2005)
Turbo-Sequest v27
(rev.13)
NCBI
(Mai 2005)
12. Arbeitstagung
Übereinstimmung (Homologiecluster)
der identifizierten Proteine
zwischen den Contest-Teilnehmer
Insgesamt 1757
nicht-homologe
Sequenzen
52
+64
+110
6fach
3%
5fach
4%
4fach
6%
+171
3fach
10%
+251
1109
1fach
63%
2fach
14%
Nature Methods Vol. 2,9, Sept. 2005, 647-48
12. Arbeitstagung
How to deal with data & results performing
high-throughput proteomics
 Experiments – irrespective of their size and effort and of the amount of
the acquired data - have to be repeated independently several times to
demonstrate their reproducibilty to get significant results
 This will remove most of the „1hit wonders“
 One-time experiments can not elucidate quantitative differences in two
different proteomes, therefore, they should not be named quantitative!
 We have to go back to scientifically sound experimental work &
strategies to create value(s) for ourself and for the society who gives us
the money and deserves that we do our best.
12. Arbeitstagung
Danksagung
Anja Tatzel - Biochemiestudentin
Christian Stephan - Bioinformatik
Christian Scheer –Protagen, Bioinformatik
Christian Bunse – LC-MS/MS
Oliver von End – Nierenzellen
Kai Stühler