Synthese von IL-10 und IFN-γ in T-Helferzellen nach Stimulation mit

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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
im St. Josef Hospital
-UniversitätsklinikRuhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger
Synthese von IL-10 und IFN-γ in T-Helferzellen
nach Stimulation mit β-Laktoglobulin
in Abhängigkeit von einer allergischen Sensibilisierung
am Ende des ersten Lebensjahres
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des
Doktorgrades der Medizin
einer Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Andrea Rinke
aus Bochum
2001
Abstract
Rinke, Andrea
Synthese von IL-10 und IFN-γ in T-Helferzellen nach Stimulation mit βLaktoglobulin in Abhängigkeit von einer allergischen Sensibilisierung am Ende des
ersten Lebensjahres
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die kindlichen Immunantworten nach spezifischer
Antigen/Allergen Stimulation zum Zeitpunkt der Geburt, sechs Wochen, sechs Monate und
zwölf Monate postnatal zu untersuchen. Es sollte in erster Linie der Frage nachgegangen
werden, ob Differenzen in den Immunreaktionen zwischen Kindern mit einer atopischen
Erkrankung (mit spezifischem IgE gegen Nahrungs- und Inhalationsallergene im Alter von
einem Jahr) und solchen ohne ein atopisches Beschwerdebild (ohne spezifisches IgE)
bestehen.
Nach 72stündiger Inkubation der mononukleären Zellen mit β-Laktoglobulin wurde die
intrazelluläre IFN-γ und IL-10 Synthese auf Einzelzellniveau mit Hilfe eines
Durchflußzytometers gemessen. Durch Anfärbung von speziellen Oberflächenantigenen
gelang simultan eine Unterteilung in naive (CD4 CD45RA+) und Memory T-Helferzellen
(CD4 CD45R0+). Es zeigte sich, daß Säuglinge mit spezifischem IgE im Alter von zwölf
Monaten bereits im Nabelschnurblut nach β-Laktoglobulin Stimulation signifikant mehr
IL-10 positive Memory T-Zellen aufwiesen als die Kontrollgruppenkinder. Atopische
Kinder lassen sich somit schon bei Geburt anhand ihres Zytokinprofiles (signifikant mehr
IL-10 positive Memory T-Helferzellen) von den nicht-atopischen Kindern unterscheiden.
Das bei den allergisch sensibilisierten Kindern aberrierende Zytokinmuster ist außerdem
bereits vor der Krankheitsmanifestation präsent und daher nicht als Folge der Erkrankung
sondern als deren Ursache anzusehen. Des weiteren weist die Differenzierung der
neonatalen Helferzellen in Memory T-Zellen nach Stimulation mit dem Milcheiweiß βLaktoglobulin darauf hin, daß bereits zum Zeitpunkt der Geburt eine Sensibilisierung
gegen Nahrungsallergene besteht.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte kein direkter Zusammenhang zwischen einer prä- und
postnatalen Tabakrauchexposition oder einem gehobenen sozialen Umfeld und der
Manifestation einer allergischen Sensibilisierung im Alter von einem Jahr aufgezeigt
werden. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, daß sich eine kuhmilchfreie Ernährung
während des ersten Lebensjahres bei Allergierisiko-Kindern atopieprotektiv auswirkt.
2
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
PD Dr. med. U. Schauer
Korreferent:
Tag der Mündlichen Prüfung:
3
Inhaltsverzeichnis
1
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen________________________________ 7
2
Einleitung __________________________________________________________ 8
2.1
Gegenwart und historische Hintergründe ____________________________________ 8
2.2
Die Pathogenese allergischer Erkrankungen__________________________________ 9
2.3
T-regulatorische Zellen und ihre Bedeutung für immunpathologische Prozesse____ 12
2.4
Nahrungsmittelallergien bei Kindern und Milcheiweiß als Allergen _____________ 13
2.5
Die Struktur der verschiedenen Milchproteine und ihre allergene Potenz ________ 15
2.6
Fragestellungen ________________________________________________________ 17
3
Probanden und Methoden ____________________________________________ 18
3.1
Studienkonzept _________________________________________________________ 18
3.2
Probanden_____________________________________________________________ 18
3.3
Festlegung des Atopierisikos ______________________________________________ 22
3.4
Messung des Nabelschnurblut Gesamt IgE-Wertes ___________________________ 22
3.5
Bestimmung der spezifischen IgE-Werte ____________________________________ 22
3.6
Gewinnung und Aufarbeitung des Blutes ___________________________________ 22
3.6.1
3.7
Zytokin-Stimulation mit Laktoglobulin ___________________________________________ 23
Darstellung der Oberflächenantigene und der intrazellulären Zytokine __________ 24
3.7.1
Färbung____________________________________________________________________ 24
3.7.2
Bestimmung der Anzahl der CD4- und CD3-positiven T-Zellen ________________________ 25
3.7.3
Durchflußzytometrische Messung _______________________________________________ 25
3.8
Statistik _______________________________________________________________ 28
3.9
Herstellernachweis ______________________________________________________ 29
4
Ergebnisse _________________________________________________________ 31
4.1
Spezifische IgE-Antikörper im Alter von einem Jahr _________________________ 31
4.2
Anzahl der CD4-positiven T-Zellen ________________________________________ 32
4
4.3
Anzahl der CD3-positiven T-Zellen ________________________________________ 33
4.4
Anteil an CD45RA+ (naiven) Zellen an der Gesamtzahl der CD4+ T-Zellen ______ 34
4.5
Anteil an CD45R0+ (Memory) Zellen an der Gesamtzahl der CD4+ T-Zellen _____ 35
4.6
Messung von naiven und Memory T-Zellen ohne eine Stimulation ______________ 36
4.7
IL-10 Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach Stimulation mit β-Laktoglobulin im
Vergleich zwischen Kindern mit und ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem
Jahr
37
4.8
IFN-γ Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach β-Laktoglobulin-Stimulation im
Vergleich zwischen Kindern mit und ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem
Jahr
38
4.9
Anteil IL-10 produzierender CD45RA-positiver (naiver) T-Zellen nach Stimulation
mit dem spezifischen Antigen β-Laktoglobulin im Vergleich zwischen allergisch
sensibilisierten und nicht sensibilisierten Kindern___________________________________ 39
Anteil IFN-γ synthetisierender CD45RA-positiver T-Zellen nach β-Laktoglobulin-
4.10
Stimulation im Vergleich zwischen allergisch sensibilisierten und nicht sensibilisierten
Kindern _____________________________________________________________________ 40
IL-10 Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach β-Laktoglobulin-Stimulation bei
4.11
Kindern mit und ohne ein Allergierisiko __________________________________________ 41
4.12
Spezifisches IgE gegen inhalative und Nahrungsmittelallergene im Alter von einem
Jahr in Korrelation mit unterschiedlichen Risikofaktoren____________________________ 43
4.13
Stillen und Beginn der Kuhmilchfütterung __________________________________ 45
5
Diskussion _________________________________________________________ 46
6
Zusammenfassung __________________________________________________ 76
7
Dokumentationsbogen über Anamnese und Untersuchungsbefund ___________ 78
7.1
Allgemein _____________________________________________________________ 78
7.2
Anamnese der Mutter ___________________________________________________ 78
7.2.1
Allergieanamnese ____________________________________________________________ 78
7.2.2
Sonstige Erkrankungen________________________________________________________ 81
5
7.2.3
Ernährungsgewohnheiten ______________________________________________________ 81
7.2.4
Rauchgewohnheiten __________________________________________________________ 81
7.2.5
Familienanamnese der Mutter __________________________________________________ 81
7.3
Anamnese des Vaters ____________________________________________________ 81
7.4
Geschwisteranamnese ___________________________________________________ 81
7.5
Wohnung der Familie ___________________________________________________ 82
7.6
Schwangerschaftsanamnese ______________________________________________ 82
7.7
Geburtsanamnese_______________________________________________________ 83
7.8
Vorsorgeuntersuchung des Kindes_________________________________________ 83
7.9
Bestimmung des Symptomscores der Haut für atopische Dermatitis nach SCORAD 85
7.9.1
Ausdehnung (A) _____________________________________________________________ 85
7.9.2
Intensität (B) ________________________________________________________________ 86
7.9.3
Symptomatik (C) ____________________________________________________________ 86
7.9.4
Berechnung des individuellen Schweregrades der atopischen Dermatitis _________________ 86
8
Abbildungsverzeichnis _______________________________________________ 87
9
Tabellenverzeichnis _________________________________________________ 88
10
Literaturverzeichnis _______________________________________________ 89
6
1 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
CD
Cluster of differentiation
DC
Dendritic cells
FACS
Fluorescence activated cell sorter
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FSC
Forward light scatter
G-CSF
Granulocyte colony-stimulating factor
GM-CSF
Granulocyte-makrophage colony-stimulating factor
HBSS
Hanks balanced salts solution
HEPES
Hydroxyethylpiperacinethansulfonsäure
IFN-γ
Interferon-gamma
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
MAS
Multizentrische Atopiestudie
MHC
Major histocompatibility complex
NK-Zellen
Natural-Killer-Zellen
PE
Phycoerythrin
PMT
Photomultiplier
SSC
Sideward light scatter
TGF-β
Transforming growth factor beta
Th-Zelle
T-Helferzelle
TNF-α
Tumor necrosis factor alpha
Tr1-Zellen
T-regulatorische Zellen Subtyp 1
Treg-Zellen
T-regulatorische Zellen
7
2 Einleitung
2.1
Gegenwart und historische Hintergründe
Atopische Erkrankungen, zu denen die endogene Dermatitis, das allergische Asthma
bronchiale, die Rhinitis allergica und die IgE-vermittelte Urtikaria zählen, gehören mit
einer Prävalenz von bis zu 20% zu den häufigen Krankheitsbildern in der heutigen
Gesellschaft.
Sie führen nicht nur zu einer starken Belastung für die Betroffenen selbst -vor allem wenn
es sich um Säuglinge oder Kleinkinder handelt- sondern stellen auch eine große familiäre
Herausforderung und zudem einen nicht unerheblichen sozioökonomischen Kostenfaktor
dar [1]. Allein diese Tatsachen, aber ebenso die zunehmende Häufigkeit der Atopien
rechtfertigen die zahlreichen Studien auf diesem Gebiet.
Das Wort ”Atopie” stammt aus dem Griechischen und bedeutet Ungewöhnlichkeit,
Seltsamkeit. Heute versteht man unter dem Begriff Atopie eine zusammenfassende
Bezeichnung für die klinische Manifestation einer Überempfindlichkeitsreaktion vom
anaphylaktischen Typ (Typ I der Allergie nach Coombs und Gell). Es handelt sich dabei
um eine Sofortreaktion, die durch den Kontakt zwischen einem bestimmten Antigen und
IgE hervorgerufen wird.
Die atopische Dermatitis ist in vielen Fällen die erste klinische Manifestation einer
bestehenden Atopie. Häufig findet sich auch die Vergesellschaftung mit einer
Nahrungsmittelallergie. Retrospektive Studien konnten zeigen, daß Patienten, welche an
allergischer Rhinitis oder allergischem Asthma erkrankt sind, als Kleinkind meist unter
einer Kuhmilchproteinallergie litten.
Rückblickend finden sich erstmals in Aufzeichnungen des Hippokrates von vor mehr als
2360 Jahren Hinweise auf das Vorliegen einer Kuhmilchproteinallergie. Dieser hatte
beobachtet, daß der Genuß von Kuhmilch zu Magenbeschwerden und eigentümlichen
Hauterscheinungen führen kann [2]. 500 Jahre später beschrieb Galen einen Fall von
Milchallergie [3]. Zu Beginn dieses Jahrhunderts erschienen dann auch in der deutschen
Literatur Berichte über Symptome wie Diarrhoe und Gedeihstörungen in Zusammenhang
mit den ”Eiweißkörpern der Milch” [4; 5]. Finkelstein publizierte 1905 den ersten Fall von
anaphylaktischem Schock mit Todesfolge aufgrund einer Kuhmilchingestion [6]. Bis Mitte
8
des Jahrhunderts wurden jedoch nur vereinzelte Fälle von Kuhmilchproteinallergien
beschrieben [7], so daß man annahm, daß es sich um eine eher seltene Erkrankung handele.
In den darauffolgenden Jahren schien die Inzidenz dann aber gerade in den
Industrieländern zuzunehmen [8; 9]. Dies erklärte man sich zum Teil durch einen
Rückgang des Stillens bei gleichzeitiger Zunahme der Säuglingsernährung mit Produkten
auf Kuhmilchbasis.
Bis heute folgten zahlreiche Arbeiten auf diesem Gebiet, die partiell zum Verstehen der
Zusammenhänge beigetragen haben. Viele Sachverhalte bedürfen aber auch zum jetzigen
Zeitpunkt noch einer Klärung, wie z.B. das komplizierte Zusammenspiel der einzelnen
Zytokine in pathologischen Immunantworten oder die Gewichtung der verschiedenen
Umweltfaktoren bei der Entstehung der atopischen Krankheitsbilder.
2.2
Die Pathogenese allergischer Erkrankungen
Das Wort ALLERGIE setzt sich ursprünglich aus den griechischen Wörtern ”allos”
(anders) und ”ergon” (Verrichtung) zusammen. Dies weist darauf hin, daß man bereits vor
hunderten von Jahren erkannt hatte, daß es bei diesem Krankheitsbild zu einer
Abweichung von den regelhaften Reaktionen der körpereigenen Abwehrzellen auf
Fremdstoffe aus der Umwelt kommt.
Es handelt sich bei den allergischen Reaktionen um eine gesteigerte, hypererge Antwort
des erworbenen Immunsystems auf ein Antigen bzw. Allergen, welche nach erneutem
Allergenkontakt mit dem Auftreten bestimmter Krankheitserscheinungen verbunden ist.
Dabei kommt es zu lokalen Entzündungsreaktionen, die durch die Freisetzung von
Mediatoren nach Bindung des Allergens an spezifische Immunglobulin E Antikörper
verursacht werden. Die Mediatoren, welche aus Granula von Mastzellen freigegeben
werden,
sind
vor
allem Histamin,
Heparin,
Eosinophilen-
und
Neutrophilen-
chemotaktische Faktoren und Thrombozyten-aktivierender Faktor. Bei massivem
Auftreten dieser Botenstoffe, wie bei einer Atopie, kommt es zur Bronchokonstriktion und
Vasodilatation.
Beim ersten Kontakt zwischen einem Antigen und den B-Lymphozyten findet die
Aktivierung der B-Zellen statt, die zunächst zur Synthese von IgM führt. Erst bei einer
wiederholten Antigen-Exposition werden Immunglobuline der Subklassen G oder E
produziert. Ob nun die Weichen in Richtung der IgG- oder IgE-Synthese gestellt werden,
9
hängt vom Zytokinmilieu und den zytokinproduzierenden T-Zellen ab.
Es konnte zunächst bei Mäusen nachgewiesen werden, daß Interferon-gamma (IFN-γ) die
Synthese von IgG 2 stimuliert, während es andererseits die Proliferation von B-Zellen
hemmt, welche IgG 1, IgG 3 und IgE sezernieren. Im Gegensatz dazu fördert Interleukin 4
(IL-4) den ”switch” zur Bildung von IgE und IgG 1, während die Produktion von IgG 2,
IgG 3 und IgM unterdrückt wird [10]. IFN-γ besitzt folglich eher allergieprotektive
Wirkungen, wohingegen IL-4 die Entstehung von Allergien bzw. Atopien fördert.
Jedoch sind IFN-γ und IL-4 nicht die einzigen Zytokine, welche die Immunreaktionen
beeinflussen und in bestimmte Bahnen lenken. Ein anderes Zytokin, welches ebenfalls eine
bedeutende Rolle zu spielen scheint, ist das IL-10. Es besitzt z.T. dem IL-4 ähnliche
Wirkungen: unter seinem Einfluß kommt es zu einer Hemmung der Proliferation der Th1Zellen und deren Zytokinfreisetzung.
Die Zytokine, welche die Stärke und Dauer der Immunreaktionen steuern, werden vor
allem von T-Lymphozyten, in geringerem Ausmaß auch von Makrophagen, produziert.
Mosmann und Coffman nahmen 1986 erstmals im murinen System eine Einteilung der THelferzellen in Th1- und Th2-Zellen, basierend auf ihrem unterschiedlichen Zytokinprofil,
vor:
Th1-Zellen produzieren vor allem IFN-γ und IL-2, Th2-Zellen hingegen IL-4, IL-5 und IL6 [11-14]. Beide Subklassen sind in der Lage, sich gegenseitig zu hemmen. So unterdrückt
IFN-γ die Ausdifferenzierung der T-Zellen zu Th2-Zellen, fördert jedoch die Reifung zu
Th1-Zellen [15]. Umgekehrt ist IL-4 notwendig für die Entwicklung von Th2-Zellen,
während es die Th1-Zelldifferenzierung hemmt [16-18]. Auch in ihren Funktionen und
Eigenschaften verhalten sich beide Untergruppen gegensätzlich: die Th1-Zellen bewirken
eine Makrophagenaktivierung, eine Sensibilisierung vom verzögerten Typ und die
Synthese von IgG 2a, die Th2-Zellen hingegen führen zu einer vermehrten IgG 1 und IgE
Synthese durch B-Zellen [19]. Studien an Mäusen zeigten außerdem, daß es noch eine
weitere T-Zellsubpopulation gibt, welche ein intermediäres Zytokinmuster mit Th1- und
Th2-typischen Zytokinen zu produzieren vermag: die Th0-Zellen. Diese Helferzellen
herrschen in der frühen Phase nach Antigen-Kontakt vor. Dauert die Antigen-Exposition
im weiteren an, stellt sich die Proliferation der Th1- und Th2-Zellen ein. Dies läßt
vermuten, daß sich die Th1- und Th2-Effektorzellen aus den Th0-Zellen entwickeln [20].
10
Diese Unterteilung der T-Helferzellen in die Th1- und Th2-Subpopulationen ist beim
Menschen nicht so streng und absolut zu sehen wie im Mausmodell, da es keine derart
strikte Trennung der Zytokinproduktion zu geben scheint [21]. Grundsätzlich gilt jedoch
auch für die humanen T-Zellen, daß die Th1-Zellen atopieprotektiv, die Th2-Zellen
atopiefördernd wirken.
Die
T-Helferzellen
können
aufgrund
von
unterschiedlichen
Isoformen
des
Leukozytenoberflächen-Antigens CD45 in naive (CD4+ CD45RA+) und Memory (CD4+
CD45R0+) T-Zellen differenziert werden. Die naiven Helferzellen produzieren nach ihrer
Aktivierung IL-2 und in kleinsten Mengen auch IL-10 [22]. Erst nach ihrer Ausreifung zu
Memory Zellen sollen sie die Fähigkeit besitzen, zusätzlich noch andere Zytokine, wie
z.B. IL-4, IL-5, IFN-γ zu synthetisieren [22-24]. IL-2 wird von den reifen Memory Zellen
nur noch in geringen Mengen produziert.
Bei den menschlichen neonatalen CD4 T-Zellen handelt es sich zunächst fast
ausschließlich um naive Zellen (zu etwa 90%). Diese besitzen funktionell betrachtet auch
noch keine Helferaktivität, sie sind aber in der Lage, CD8 Suppressor-Zellen zu
induzieren. Memory T-Zellen finden sich bei Neugeboreren nur in geringer Anzahl, da sie
erst nach Antigenstimulation heranreifen. Sie nehmen jedoch im Laufe des Lebens stetig
an Zahl zu und ersetzen allmählich die naiven T-Zellen, bis sie während der Pubertät ein
”Plateau” erreichen.
Die Entwicklung von naiven T-Zellen in entweder Th1- oder Th2-Zellen hängt von
verschiedenen Faktoren zum Zeitpunkt der T-Zell-Ausdifferenzierung ab. Eine
vorherrschende Rolle spielt dabei das Zytokinmilieu [25]: IL-4 bewirkt vor allem einen
Anstieg der Th2-spezifischen Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 und führt somit in eine eher
allergiefördernde Richtung. Überwiegt während der Prägung hingegen das Zytokin IL-2,
kommt es zwar auch zu einer Zunahme der Zytokinproduktion, jedoch sowohl bei den
Th1- als auch Th2-typischen Botenstoffen.
In der vorliegenden Arbeit wurde nun als Th1 typisches Zytokin das IFN-γ untersucht. Die
genaue Rolle des IL-10 bei der Regulation von Immunantworten, und damit die Frage, ob
es sich tatsächlich um ein atopiebegünstigendes, Th2 gewichtetes Zytokin handelt, sollte
mit Hilfe dieser Studie erst noch weiter untersucht werden.
11
2.3
T-regulatorische Zellen und ihre Bedeutung für
immunpathologische Prozesse
In den letzten Jahren hat das Interesse an Zellen zugenommen, welche maßgeblich an der
Suppression pathologischer Immunantworten beteiligt sind. Es handelt sich hierbei um
sogenannte T-regulatorische Zellen (Treg-Zellen), zu denen unter anderem CD4+CD25+
T-Zellen, Tr1- und anergische Zellen zählen [26-29]. Man nimmt an, daß diese Zellen die
Fähigkeit besitzen, Immunreaktionen sowohl gegen Allo- als auch Autoantigene zu
unterdrücken [29-31]. Zunächst gelang es in Tiermodellen, die Ausbildung von
Autoimmunkrankheiten durch den Transfer von peripheren CD4+ T-Zellen gesunder
Spendertiere zu inhibieren. Bei Mäusen konnte auf diesem Wege bereits die Manifestation
von autoimmunbedingtem Diabetes mellitus [32] und Colitis [31] verhindert werden.
Ein Merkmal zur Identifikation der T-regulatorischen Zellen unter den übrigen T-Zellen
scheint das CD25-Oberflächenantigen zu sein. Es bleibt jedoch anzumerken, daß nicht alle
CD4+ Treg-Zellen das CD25-Antigen exprimieren [32]. Außerdem kann anhand dieses
Markers nicht zwischen regulatorischen Zellen und aktivierten Effektorzellen differenziert
werden. Die Zuordnung von T-Zellen zum Treg-Zellpool allein anhand einer
phänotypischen Analyse der Zellen erscheint daher nicht sinnvoll. Vielmehr könnten
zusätzliche Zytokinbestimmungen ein weiteres Charakteristikum offerieren, da bekannt ist,
daß beispielsweise Treg-Zellen vom Subtyp 1 (Tr1) große Mengen an IL-10 und
Transforming growth factor-beta (TGF-β) produzieren [30; 33].
Im Mausmodell werden natürlich bzw. permanent vorkommende (CD4+CD25+) von den
induzierten Treg-Zellen (z. B. Tr1) unterschieden, welche erst nach wiederholter
Antigenstimulation in Anwesenheit von IL-10 aus naiven CD4+ Zellen heranreifen [31].
Diese Zellen produzieren nach erneuter Stimulation in großen Mengen IL-10 und sind in
der Lage, Th1- und Th2- Immunantworten zu inhibieren.
Die bisher bekannten Eigenschaften der regulatorischen T-Zellen deuten auf ihre
bedeutende Rolle bei der Kontrolle von Immunantworten hin. Wenn es gelingen sollte,
ihre Wirkungsmechanismen exakter zu analysieren und die Zellen Antigen-spezifisch zu
synthetisieren, könnten diese Zellen in Zukunft vielleicht auch beim Menschen für
zelluläre Therapien immunologischer Erkrankungen genutzt werden.
12
2.4
Nahrungsmittelallergien bei Kindern und Milcheiweiß als Allergen
Die Entstehung von Nahrungsmittelallergien hängt von verschiedenen Faktoren, unter
anderem von der genetischen Disposition und von variablen Umweltbedingungen, ab. Es
existieren mannigfaltige Hypothesen zur Ätiologie der Sensibilisierung gegen diese
Allergene, zu denen bei Kindern vor allem Hühnereiweiß (Ovalbumin) und
Kuhmilcheiweiß (Casein, β-Laktoglobulin) und in den folgenden Jahren auch Nüsse und
Fisch zählen: diskutiert werden unter anderem die Rolle der Darmflora, Zytokine in der
Muttermilch und unterschiedliche Hygieneverhältnisse. Auf der immunzellulären Ebene
scheinen zwei Mechanismen von essentieller Bedeutung zu sein: einerseits die Freisetzung
von Th2-typischen Zytokinen [34], andererseits der Aktivationsgrad der involvierten TZellen [35].
Während der ersten Lebenswochen und –monate werden die Neugeborene ständig mit
einem
großen
Pool
unterschiedlichster
Antigene
konfrontriert.
Hierunter
sind
Kuhmilchproteine in der Regel die ersten oralen Allergene, denen Neugeborene entweder
direkt nach der Geburt oder nach Beendigung des Stillens ausgesetzt sind. Es wird
angenommen, daß gerade dieser erste Kontakt des Immunsystems des Neugeborenen bzw.
Säuglings mit den Allergenen in der Milch (zusammen mit anderen Faktoren)
entscheidend ist für eine mögliche spätere Entwicklung allergischer Erkrankungen bei
atopiegefährdeten Kindern. Von großer Bedeutung sind in diesem Kontext die sowohl
qualitativen als auch quantitativen Differenzen in der Zusammensetzung der Mutter- im
Vergleich zur Kuhmilch. So besitzt die Kuhmilch einen etwa dreifach höheren
Proteingehalt (ca. 33g/l versus ca. 11g/l) und sechsmal mehr Casein (ca. 25g/l versus ca.
4g/l) als die menschliche Milch [36]. Laktoglobulin, eines der Hauptallergene der Milch,
findet sich nur in der Kuhmilch, nicht in der menschlichen Milch. Während der größte
Eiweißanteil der Muttermilch auf die Molkeproteine, hierunter v. a. das Lactalbumin,
entfällt, stellt das Casein in der bovinen Milch den Hauptanteil dar. Obwohl der
Proteingehalt der Muttermilch während der späten Schwangerschaft und kurz nach der
Geburt leicht zunimmt (auf ca. 1,5%), erreicht er nicht die Hälfte des Eiweißgehaltes der
Kuhmilch.
Die jährliche Inzidenzrate der Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelallergene liegt im
ersten Lebensjahr bei etwa 10% und fällt dann bis zum 6. Lebensjahr auf ca. 3% ab [37].
In den ersten zwölf Lebensmonaten herrschen bei den allergischen Kindern
13
gastrointestinale Symptome sowie Hautveränderungen im Sinne einer atopischen
Dermatitis vor. Die Sensibilisierung gegen inhalative Allergene nimmt hingegen erst mit
dem Alter zu (von einer Inzidenz von 1,5% im Alter von einem Jahr auf 8% mit sechs
Jahren), so daß bei Kindern ab einem Alter von etwa vier Jahren das allergische Asthma
unter den Atopien überwiegt.
Bei einer manifesten Milcheiweißallergie entwickeln die betroffenen Säuglinge die
Symptome meist innerhalb des ersten Lebensmonates, oft sogar schon eine Woche nach
Beginn der Kuhmilchfütterung bzw. der Gabe von auf Kuhmilch basierender
Säuglingsfertignahrung. Ein Auftreten der Erkrankung nach dem 12. Lebensmonat gilt als
äußerst selten.
Die Symptome beschränken sich auf drei Organsysteme, wobei in der Mehrheit
mindestens zwei davon betroffen sind: in etwa 50-70% bestehen Symptome an der Haut
(atopische Dermatitis; Urtikaria), in etwa 50-60% gastrointestinale (Erbrechen; Diarrhoe)
und in etwa 20-30% respiratorische Symptome (rezidivierende Rhinitiden; asthmoide
Bronchitiden). Die Anamneseerhebung und Untersuchung der Studienkinder erfolgte daher
unter besonderer Berücksichtigung der oben genannten Beschwerden (s. Anamneseerhebungsbogen im Anhang).
Bisher ging man davon aus, daß das Vorliegen von spezifischem IgE zunächst gegen
Hühnereiweiß, gefolgt von spezifischem IgE gegen Milcheiweiß der früheste verläßliche
serologische Marker ist, welcher auf eine atopische Immunlage in der Kindheit hinweist
[37]. In Kenntnis dieser Tatsache wurde in der vorliegenden Studie am Ende des ersten
Lebensjahres das spezifische IgE gegen Hühner- und Milcheiweiß, Fischeiweiß sowie
unterschiedliche Inhalationsallergene als primären Hinweis auf eine atopische Erkrankung
bestimmt.
Obwohl sich die allergischen Reaktionen auf Milchproteine und Ei häufig (in etwa 80%
der Fälle) innerhalb der ersten drei bis fünf Lebensjahre zurückbilden [38], besitzen sie
trotzdem für die betroffenen Säuglinge eine weitere klinische Relevanz. Wie jüngere
Arbeiten zeigen konnten, besteht bei Kindern mit einer Nahrungsmittelallergie in der
frühen Kindheit ein deutlich erhöhtes Risiko, in den folgenden Jahren an allergischer
Rhinitis, atopischer Dermatitis und/ oder allergischem Asthma zu erkranken [39; 40].
14
2.5
Die Struktur der verschiedenen Milchproteine und ihre allergene
Potenz
Für das Auftreten von Milchallergien lassen sich mehrere Proteine (α-Laktalbumin, βLaktoglobulin, Casein, Lactoferrin etc.) verantwortlich machen. Die unterschiedlichen
Eiweißvarianten sind durch den punktuellen Ersatz von einzelnen Aminosäuren, den
Verlust von Peptidfragmenten und durch posttranslationale Modifizierungen, w. z. B.
Glykosylierungen oder Phosphorylierungen, hervorgerufen. Für die Auslösung der
Allergie kann keine einheitliche, immer wiederkehrende Molekülstruktur verantwortlich
gemacht werden. Vielmehr scheinen einzelne, kurze Peptidabschnitte mit nur 10-14
Aminosäuren einen entscheidenden Part für die Allergenität des Proteins zu spielen [41].
Entlang des Eiweißmoleküls befinden sich nun unterschiedliche Epitope. Diese können in
hydrophoben Bereichen liegen, wo sie für IgE-Antikörper zunächst unerreichbar sind. Zum
Teil kann daher erst nach digestiven Prozessen eine Verbindung zwischen dem Epitop und
dem Antikörper eingegangen werden [41]. Eine Arbeit von Jarvinen et al., welche mit
Patienten mit und ohne eine persistierende Kuhmilchallergie durchgeführt wurde, konnte
zeigen, daß es eine unterschiedliche Anzahl an strukturellen Epitopen für IgE- und IgGAntikörper auf Milchproteinen gibt. Auf α-Laktalbumin konnten vier IgE- und drei IgGBindungsregionen identifiziert werden. Das β-Laktoglobulin wies sieben IgE- und sechs
IgG-spezifische Epitope auf [42]. Es ist anzunehmen, daß eine Verbindung zwischen dem
Erkennen bestimmter Epitope und der Manifestation einer Kuhmilchallergie besteht.
Die mononukleären Zellen des Nabelschnurblutes reagieren nicht auf jedes der
verschiedenen Milchproteine in gleicher Weise. Es konnte gezeigt werden, daß sie eine
höhere Proliferationsrate nach Stimulation mit α-Laktalbumin, β-Laktoglobulin und αCasein entwickeln als nach einer Stimulation mit β-Casein, κ-Casein und bovinem
Serumalbumin [43]. Der Grund hierfür könnte in den unterschiedlichen biochemischen und
strukturellen Eigenschaften dieser Eiweiße begründet sein. Während es sich bei βLaktoglobulin um ein lösliches Molkeprotein mit einer Aminosäuresequenz von 57
handelt, zählt Casein (α-s1-Casein: 51 Aminosäuren, β-Casein: 146 Aminosäuren, λCasein: 53 Aminosäuren) [44-46] zu den nicht löslichen Proteinen.
Außerdem scheint der pH-Wert eine wichtige Rolle für die Gestalt der Eiweiße zu spielen.
Dies soll am Beispiel des β-Laktoglobulin genauer erläutert werden: bei einem pH-Wert
15
von 7 (pH der Milch zwischen 6,5 und 6,9) liegt β-Laktoglobulin als Dimer vor, während
es bei einem pH-Wert von 2, 3 und 9 seine monomere Struktur beibehält [47-49]. Die
Transition des Moleküls vom Dimer zum Monomer ist mit einer Abnahme des Volumens
und gleichzeitig einer Zunahme der Hydratation verbunden [49]. Insgesamt sind allein
beim β-Laktoglobulin sechs verschiedene Strukturzustände bekannt, welche mit dem pHWert wechseln [49]. Es kann angenommen werden, daß diese strukturellen Unterschiede
auch bei den anderen Milchproteinen auftreten. Letztendlich bleibt weiterhin zu klären,
welche morphologischen Charakteristika für die allergische Potenz des jeweiligen
Antigens von Bedeutung sind.
In dieser Arbeit wurde nun stellvertretend für die übrigen Allergene der Milch βLaktoglobulin als Immunstimulans für die kindlichen T-Helferzellen ausgewählt.
16
2.6
Fragestellungen
Daß die Prävalenz atopischer Erkrankungen und damit auch ihre Bedeutung für das
Gesundheitssystem stetig zunimmt, konnten bereits zahlreiche Arbeiten auf diesem Gebiet
zeigen. Leider ist es bisher noch nicht gelungen, das komplizierte Gefüge der
immunregulatorischen Vorgänge vollständig zu analysieren und zu verstehen, so daß nur
eingeschränkt präventive Maßnahmen zur Verfügung stehen. Gelänge es, bereits zu einem
frühen Zeitpunkt, wie zum Beispiel direkt nach der Geburt, Kinder mit einer sich später
manifestierenden Atopie zu identifizieren, so wäre es möglich, diese betroffenen
Neugeborenen frühzeitig einer optimalen Behandlung zuzuführen.
Als sicher gilt zum jetzigen Zeitpunkt, daß gerade die ersten Lebenswochen und -monate
für die Etablierung einer entweder allergiefördernden oder -hemmenden Immunlage von
großer Bedeutung sind. Zunehmend steht auch die Rolle von Zytokinen und den
sogenannten T-regulatorischen Zellen als ”Immunmodulatoren” im wissenschaftlichen
Interesse.
In der vorliegenden Studie sollte daher folgenden Fragestellungen nachgegangen werden:
• Gibt es Unterschiede in der Zytokinproduktion zwischen Kindern mit einer
allergischen Sensibilisierung im Alter von einem Jahr und Kindern ohne eine
Sensibilisierung? Zu welchem Zeitpunkt lassen sich eventuelle Differenzen
verifizieren?
• Findet sich eine unterschiedliche T-Zellausreifung bei Kindern mit einer Atopie
im Vergleich zu Kindern ohne eine derartige Erkrankung?
• Wie reagieren die naiven und die Memory T-Zellen auf eine Stimulation mit
dem Milcheiweiß β-Laktoglobulin?
• Welche Rolle spielen IFN-γ und IL-10 in der Entwicklung von atopischen
Krankheiten?
• Könnte IL-10 ein Marker für T-regulatorische Zellen sein?
• Welche Faktoren haben Einfluß auf die Manifestation einer allergischen
Sensibilisierung im Alter von einem Jahr und damit auf die Entstehung einer
atopischen Erkrankung?
17
3 Probanden und Methoden
3.1
Studienkonzept
Bei der durchgeführten Studie handelt es sich um eine prospektive Untersuchung von der
Geburt bis zur Vollendung des ersten Lebensjahres. Ziel war es, die Zytokinsynthese und
die Entwicklung der T-Helferzellen bei Kindern mit spezifischem IgE mit einem
Lebensjahr und solchen ohne IgE sowie bei Säuglingen mit Atopierisiko und ohne
Atopierisiko über ein Jahr zu vergleichen. Die Zuteilung zur Atopierisikogruppe konnte
bereits kurz nach der Geburt (nach Bestimmung des Nabelschnur IgE-Wertes und
Erhebung der Familienanamnese) erfolgen. Die Zuordnung zur Gruppe mit allergischer
Sensibilisierung und ohne Sensibilisierung wurde nach Vollendung des ersten
Lebensjahres vorgenommen.
3.2
Probanden
Die Nabelschnurblutproben stammen von Neugeborenen, die in einem Zeitraum von fünf
Monaten (von September bis Januar) in der Augusta-Krankenanstalt und im St. ElisabethHospital in Bochum geboren wurden. Weitere Blutentnahmen sowie eine vollständige
körperliche Untersuchung und Anamneseerhebung (s. Anhang) erfolgten sechs Wochen,
sechs Monate und zwölf Monate post partum.
Vor Beginn der Studie wurden zwei Monate lang Voruntersuchungen zur Optimierung der
Meß- und Kulturbedingungen durchgeführt. Die Studie erfolgte dann im weiteren an einem
Kollektiv von 52 Neugeborenen. Als Ausschlußkriterien galten Komplikationen während
der Schwangerschaft und der Geburt, chronische Erkrankungen der Schwangeren sowie
Frühgeburtlichkeit. Es sollten so mögliche Defekte und Transformierungen des kindlichen
Immunsystems weitestgehend ausgeschlossen werden.
Die Eltern der Neugeborenen wurden mündlich und anhand eines Informationsbogens über
die Art der Durchführung und die Zielsetzung der Arbeit aufgeklärt. Erst nach Vorliegen
der schriftlichen Einwilligung der Eltern wurden die Kinder in die Studie aufgenommen.
18
Folgende anamnestische Daten wurden nach der Geburt und während des ersten
Lebensjahres erhoben:
1.
Zum Zeitpunkt der Geburt wurden folgende Daten dokumentiert:
• Schwangerschaftsdauer und -verlauf
• Ernährung
und
Medikamenteneinnahme
der
Mütter
während
der
Schwangerschaft
• Geschlecht des Kindes
• Geburtsgröße und Geburtsgewicht
• Geburtskomplikationen
• Elternanamnese in Bezug auf allergische Symptome und andere Erkrankungen
• Familienanamnese in Bezug auf Allergien (Geschwister des Studienkindes
sowie Großeltern)
• Umgebungsanamnese, Wohnumfeld und sozialer Status der Familie
2.
Bei den Kontrolluntersuchungen der Studienkinder im Alter von sechs Wochen,
sechs Monaten und einem Jahr wurden folgende Daten ermittelt:
• Auftreten und Dauer und ggf. erforderliche Therapie der folgenden Symptome:
Erbrechen, Durchfall, Koliken, Hautrötungen, Ekzeme, Urtikaria, Juckreiz,
Husten,
bronchiale
Obstruktion,
Atemnot,
Schlafstörungen,
Rhinitis,
Niesattacken und Konjunktivitis
• Dauer des ausschließlichen Stillens, Dauer des teilweisen Stillens, Ernährung
der Mutter während des Stillens
• Zeitpunkt der Umstellung auf Fertigmilchen mit ggf. dem Zeitpunkt des
Wechsels von hypoallergener Milch zu normalen Kuhmilchprodukten
• Zeitpunkt der Zufütterung weiterer Nahrungsmittel (Gemüse, Obst, Fleisch,
Getreideprodukte etc.)
• Erfassung der Daten aus dem Vorsorgeheft und der durchgeführten Impfungen
Des weiteren fand bei jedem Untersuchungstermin eine komplette körperliche
Untersuchung der Kinder statt.
19
Die genaue Anamneseerhebung anhand eines Fragebogens sowie das Vorgehen bei der
körperlichen Untersuchung sind im Anhang detailiert nachzulesen. Der verwendete
Fragebogen wurde vor dem Beginn der Untersuchungen von Frau Dr. A. Eckart-Ringel an
einem Probandenkollektiv von 130 Kindern validiert.
Unter den 52 teilnehmenden Säuglingen befanden sich 22 weibliche und 30 männliche,
welche zwischen der vollendeten 37. und 41. Schwangerschaftswoche geboren wurden.
Das Geburtsgewicht lag zwischen 2500 und 4150g, die Größe zwischen 46 und 55cm, der
Kopfumfang zwischen 32 und 36,5cm. Die Mütter waren zwischen 17 und 40 Jahre, die
Väter zwischen 21 und 49 Jahre alt. Sämtliche erhobene Daten wiesen keine signifikanten
Unterschiede zwischen der Kindergruppe mit spezifischem IgE im Alter von einem Jahr
und der Gruppe ohne spezifisches IgE auf (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1: Auflistung von Kopfumfang, Größe und Gewicht der Kinder bei den
Untersuchungen U1 und U2 sowie des Alters der Mutter und des Vaters für die
Kindergruppe mit spezifischem IgE (n=12) und ohne spezifisches IgE (n=40).
Aufgezeigt sind der Median, das Minimum und das Maximum der Werte. Als
Signifikanzniveau wurde p=0,05 gewählt (n. s.= nicht signifikant).
Kinder mit spezif. IgE
Kinder ohne spezif. IgE
p
34 (32,5-36)1
35 (32-36,5)
n. s.
Größe in cm bei U1
51 (47-55)
51 (46-54)
n. s.
Kopfumfang bei U2
34 (32,5-36)
34,75 (32-36,5)
n. s.
Größe in cm bei U2
51 (47-55)
51 (46-54)
n. s.
Gewicht in g bei U1
3470 (2600-4050)
3410 (2500-4150)
n. s.
Gewicht in g bei U2
3225 (2450-4080)
3270 (2450-3820)
n. s.
Gewicht in g bei U3
4415 (3100-5210)
4620 (3480-5670)
n. s.
Alter: Mutter
28 (17-38)
29 (19-40)
n. s.
Alter: Vater
31 (22-49)
30 (21-46)
n. s.
Kopfumfang in cm bei U1
1
Median (Minimum und Maximum)
20
Von allen Elternpaaren (n=52) gaben 39 an, daß entweder ein Elternteil oder sogar beide
unter einer allergischen Erkrankung (allergisches Asthma bronchiale, allergische Rhinitis,
Neurodermitis) leiden oder litten. Signifikante Differenzen zwischen der Kindergruppe mit
spezifischem IgE am Ende des ersten Lebensjahres und ohne IgE waren nicht zu eruieren.
Tabelle 2: Allergische Erkrankungen der Mütter und Väter in der Kindergruppe mit
spezifischem IgE und ohne spezifisches IgE im Alter von einem Jahr
Kinder ohne spezif. IgE
Kinder mit spezif. IgE
(n=40)
(n=12)
Mutter: allerg. Asthma
6
2
n. s.2
Mutter: Neurodermitis
2
1
n. s.
Mutter: allerg. Rhinitis
8
3
n. s.
Vater: allerg. Asthma
3
2
n. s.
Vater: Neurodermitis
7
2
n. s.
Vater: allerg. Rhinitis
12
4
n. s.
2
p
n. s.= nicht signifikant
21
3.3
Festlegung des Atopierisikos
Die Neugeborenen wurden anhand ihres Nabelschnurblut IgE-Wertes sowie ihrer
Familienanamnese entweder einer Atopierisikogruppe (n=39) oder einer NichtRisikogruppe (n=13) zugeordnet. Als Einschlußkriterium in die ”Risikogruppe” galt ein
Nabelschnur IgE-Wert über 0,9 kU/l und/oder ein familienanamnestisch erhöhtes
Atopierisiko (ein oder beide Eltern und/oder ein Geschwisterkind leiden oder litten unter
einer atopischen Erkrankung).
3.4
Messung des Nabelschnurblut Gesamt IgE-Wertes
Zur Bestimmung des Nabelschnurblut Gesamt IgE-Wertes wurden nach erfolgter
Abnabelung 2ml Nabelschnurblut steril aus der Vena umbilicalis der Plazenta entnommen
und in 2ml Reaktionsgefäße gefüllt. Nachdem die Gerinnung beendet war, wurden die
Proben 15 Minuten mit 1850 x g zentrifugiert. Im weiteren wurde aus 100µl des
Serumüberstandes der Gesamt IgE-Wert mit Hilfe eines kommerziellen Immunoassays
gemessen. Die meßtechnischen Vorgänge erfolgten gemäß der Herstellervorschrift.
3.5
Bestimmung der spezifischen IgE-Werte
Im Alter von einem Jahr wurden bei 52 Kindern mit Hilfe des CAP-Testes (Firma
Pharmacia)
im
Serum
die
spezifischen
IgE-Werte
gegen
die
häufigsten
Inhalationsallergene (Sx1) und gegen Nahrungsmittelallergene (Fx5) bestimmt. Zu den
getesteten inhalativen Allergenen gehörten Lieschgras, Roggen, Beifuß, Birke, Katzenund Hundehaare, Cladosporium herbarum und Dermatophagoides pteronyssinus; zu den
Nahrungsmittelallergenen zählten Hühnereiweiß, Milcheiweiß, Weizenmehl, Erdnuß, Soja
und Fisch (Dorsch). Die Messung wurde genau nach Herstellervorschrift vorgenommen.
3.6
Gewinnung und Aufarbeitung des Blutes
In sterile 50ml Falcon tubes wurden jeweils 2ml Heparin-Natrium 100 IE/ml, 0,1ml
HEPES-Buffer (1M), 0,1ml Penicillin/Streptomycin 10000 IE/ml und 0,1ml Amphotericin
250µg/ml gegeben, um dann auf 10ml mit HBSS steril ohne Azid aufzufüllen. Diese
Pufferlösung diente der Keim- und Gerinnungshemmung. Die Vorbereitung fand unter
einer Sterilbank statt.
22
Das Blut der Neugeborenen (ca. 10ml) konnte nun nach der Abnabelung steril von der
Vena umbilicalis in die präparierten Röhrchen gefüllt werden. Weitere 5ml des
Nabelschnurblutes wurden für Serumuntersuchungen gebraucht.
Zwischen der Abnahme des Nabelschnurblutes und der Aufarbeitung im Labor durften
höchstens sechs Stunden liegen. Erfolgte die Stimulation der Zellen nicht sofort, mußte das
Blut bei einer Temperatur von 4°C gekühlt gelagert werden.
Bei den Kontrollterminen nach sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr wurden den
Säuglingen jeweils ca. 3ml Blut zur Serumgewinnung und 1-2ml Heparinblut zur
zellulären Untersuchung venös entnommen.
3.6.1 Zytokin-Stimulation mit Laktoglobulin
In einer 96-Loch-Gewebekulturplatte wurden 10 well (Vertiefungen) mit je 160µl RPMIKulturmedium gefüllt. Das RPMI-Kulturmedium bestand aus folgenden Anteilen:
• zu 86% aus RPMI 1640
• zu 10% aus FCS
• zu 1% aus nicht-essentiellen Aminosäuren (L-Alanin, L-Asparagin x
H2O, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, Glycin, L-Prolin, L-Serin)
• zu 1% aus L-Glutamin 200mM
• zu 1% aus Natrium-Pyruvat 100mM
• und je 0,5% aus Penicillin 10000 IE/ml und Streptomycin 10000µg/ml.
Die nicht-essentiellen Aminosäuren, das L-Glutamin, das Natrium-Pyruvat und das
Penicillin/Streptomycin wurden vorab zu gleichen Teilen gemischt (z.B. je 1ml),
tiefgefroren und bei Bedarf im Wasserbad aufgetaut. Das FCS konnte ebenfalls in
Portionen eingefroren werden.
Zu den 160µl RPMI-Medium wurden nun 40µl des Nabelschnurblutes des jeweiligen
Probanden pipettiert. Die Stimulation erfolgte mit 10µl der Arbeitsverdünnung des ßLaktoglobulin. Das Laktoglobulin wurde zuvor im Verhältnis 2:1 in destilliertem Wasser
aufgelöst und steril filtriert. Diese Verdünnung konnte in kleinen Mengen (z.B. zu je 50µl)
in Eppendorff-Hütchen eingefroren und bei Bedarf bei Zimmertemperatur aufgetaut
werden. Um die endgültige Arbeitsverdünnung zu erhalten, wurde die vorbereitete 2:1 -
23
Lösung nochmals im Verhältnis 1:10 mit RPMI-Medium versetzt (z.B. 15µl
Laktoglobulin-Verdünnung mit 135µl RPMI-Medium). Diese konnte nicht noch einmal
zur weiteren Verwendung eingefroren werden, sondern mußte zu jedem Ansatz neu
hergestellt werden. Die Gewebekulturplatte wurde fest verschlossen 72 Stunden lang in
einem mit 8% CO2 begasten Brutschrank bei 37°C inkubiert. Zusätzlich wurden bei jedem
Ansatz in gleichen Mengen Kontrollen ohne eine Stimulation mit β-Laktoglobulin
angesetzt.
3.7
Darstellung der Oberflächenantigene und der intrazellulären
Zytokine
3.7.1 Färbung
Nach 72 Stunden wurden die mit β-Laktoglobulin stimulierten Zellen in ein 15ml Falcon
Röhrchen geerntet, welches auf 15ml mit HBSS ohne Azid3 aufgefüllt wurde. Der HBSSPuffer diente zur Auswaschung der Proteine, die im Kulturmedium vorhanden waren.
Daraufhin erfolgte eine fünfminütige Zentrifugation bei 300 x g. Nach vorsichtigem
Abgießen des Überstandes verblieben ein Rest Puffer und Pellet von ca. 200µl im
Röhrchen. Zur anschließenden Fixierung wurde die gleiche Menge 4%iges eiskaltes
Paraformaldehyd hinzugegeben und mit der Pipette gründlich resuspendiert. Nach einer
zehnminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Röhrchen wiederum auf 15ml
mit HBSS-Puffer ohne Azid aufgefüllt, gut gemischt und bei 300 x g fünf Minuten lang
zentrifugiert. Falls die Färbung nicht sofort vorgenommen wurde, wurden die Zellen nach
Abschütten des Überstandes in 1ml HBSS-Puffer ohne Azid aufgenommen und im
Kühlschrank gelagert.
Um die Zellen zu permeabilisieren, wurde dem Zellpellet 300µl Saponinpuffer (HBSS mit
0,01 M HEPES und 0,1% Saponin) zugefügt.
Nun wurde die simultane Färbung der Oberflächenantigene und der intrazellulären
Zytokine vorgenommen. Die Differenzierung der mononukleären Zellen erfolgte mit Hilfe
von Antikörpern, welche gegen Leukozytenoberflächenantigene gerichtet und mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Phycoerythrin (= PE) markiert sind. Zur Anwendung kamen hierbei
3
HBSS= Hanks’ Balanced Salts
24
die folgenden Antikörper:
anti-CD45RA-PE zur Markierung der naiven T-Zellen und
anti-CD45R0-PE zur Markierung von Memory T-Zellen.
Der Nachweis der intrazellulären Zytokine IL-10 und IFN-γ geschah mit anti-IL-10
(gekoppelt an Biotin) und anti-IFN-γ (gekoppelt an FITC).
Je 100µl der Zellsuspension wurden nun versetzt mit:
a) 1µl anti-CD45RA-PE und 10µl anti-IL-10-Biotin und anti-IFN-γ - FITC
b) 1µl anti-CD45R0-PE und 10µl anti-IL-10-Biotin und anti-IFN-γ - FITC
c) Kontrolle FITC und Kontrolle PE.
Die so gewonnenen Proben wurden dann für 20 Minuten bei 4 °C in Dunkelheit inkubiert.
Anschließend wurde jeweils 1ml Saponinpuffer zugegeben, und die nicht gebundenen
Antikörper wurden durch eine erneute Zentrifugation ausgewaschen. Da Biotin allein
keine Fluoreszenz zeigt, mußte es mit dem Antikörper Strept-Avidin-Tricolor kombiniert
werden, der den ersten beiden Zellpellets, nicht jedoch der Kontrolle, in einer Menge von
0,5µl zugesetzt wurde. Nach 20minütiger Inkubation bei 4 °C in Dunkelheit erfolgte
wiederum die Auswaschung mit jeweils 1ml Saponinpuffer und die Aufnahme in jeweils
100µl HBSS ohne Azid. Mit den Kontrollansätzen ohne Stimulus wurde ebenso verfahren.
3.7.2 Bestimmung der Anzahl der CD4- und CD3-positiven T-Zellen
Die Bestimmung der CD4+ und CD3+ T-Helferzellen erfolgte parallel zur Messung der
CD45RA+ und CD45R0+ Zellen wie unter 3.7.1 beschrieben, jedoch ohne eine vorherige
Stimulation mit β-Laktoglobulin. Als Antikörper wurden CD3 FITC Anti-Leu-4F zur
Markierung der CD3-positiven Zellen und CD4 PE 100T/ Anti-Leu 3A PE zur Markierung
der CD4-positiven Helferzellen in einer jeweiligen Konzentration von 5µl verwendet.
Die
zur
Umrechnung
Differentialblutbilder
in
der
die
Anzahl
Säuglinge
der
Zellen
stammen
von
pro
Mikroliter
simultan
benötigten
durchgeführten
Untersuchungen.
3.7.3 Durchflußzytometrische Messung
Die Differenzierung der monoklonalen Zellen erfolgte mit Hilfe eines FACScan
Durchflußzytometers anhand von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften. Durch die
25
Messungen mit dem Durchflußzytometer war es möglich, simultan die Oberflächenmarker
und die intrazelluläre Zytokinproduktion zu bestimmen. Zur Messung der intrazellulären
Zytokinsynthese wurde die von T. Jung beschriebene Methode in gering modifizierter
Form angewendet [50].
Dabei liefen die Messungen wie folgt ab: die vorbereiteten Zellsuspensionen wurden durch
Überdruck in die Meßküvette eingebracht. Durch hydrodynamische Fokussierung
durchliefen die Zellen die Meßkammer aneinandergereiht, Zelle für Zelle. Angeregt durch
den Strahl eines 15mW Argon-Ionenlasers kam es dann zur Abgabe von Vorwärts- und
Seitwärtsstreulicht, welches nach der Aufnahme durch Detektoren in entsprechende
Signale umgewandelt wurde (s. Abbildung 1).
Zum Prinzip der Messung:
Die Lichtstreuung kann unterteilt werden in ein Vorwärtsstreulicht (forward light
scatter=FSC) und ein Seitwärtsstreulicht (side light scatter=SSC). Das Vorwärtsstreulicht
ist in erster Linie ein Maß für die Zellgröße, während das Seitwärtsstreulicht hauptsächlich
von der intrazellulären Granularität abhängt.
Fluoreszierende Verbindungen absorbieren Lichtenergie über einen weiten, für sie
charakteristischen Wellenlängenbereich. Mit dieser Energie werden Elektronen in ein
höheres Energieniveau gehoben. Springt das Elektron nun auf das Grundniveau zurück, so
emittiert es ein Photon. Diesen Strahlungsübergang nennt man Fluoreszenz. Der
Lichtbereich, über den eine fluoreszierende Verbindung angeregt werden kann, ist dessen
Absorptionsspektrum. Da beim Absorptionsvorgang mehr Energie aufgenommen wird, als
beim Fluoreszenzübergang später emittiert wird, ist das abgestrahlte Licht langwelliger als
das Anregungslicht und bildet das Emissionsspektrum. Dabei ist die Fluoreszenzintensität
direkt proportional zur Anzahl der gebundenen Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffes.
In
der
Studie
wurden
drei
fluoreszierende
Farbstoffe
eingesetzt
(Dreifarben-
Immunfluoreszenzmessung): Fluorescein-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) und
TRI-Color (Medac; Tandemfarbstoff, welcher R-Phycoerythrin und Cyanin 5 enthält)
mit Fluoreszenzoptima bei 530nm, 585nm und 640nm.
Pro Messung wurden folglich fünf Parameter, nämlich Zellgröße, Zellgranularität und drei
verschiedene Fluoreszenzen, simultan untersucht und nach dem LIST-MODE Prinzip
gespeichert. Je Meßvorgang wurden 10000 Zellen analysiert. Nach Beendigung der
26
Messung konnten die gespeicherten Daten abgerufen und ein ”gating” der Zellen
durchgeführt werden. Unter ”gating” versteht man ein Herausfiltern der gesuchten
Zellpopulation,
indem
durch
Vorgabe
von
Begrenzungswerten
innerhalb
der
verschiedenen Parameter die Zellauswahl eingegrenzt wird. Auf diese Weise ließen sich
aktivierte Lymphozyten beispielsweise von Monozyten und Granulozyten unterscheiden.
Die
erhobenen
Daten
wurden
anschließend
mit
Hilfe
der
korrelierten
Zweiparameterdarstellung abgebildet. Dabei wurden die Oberflächenmarker (CD45RA
und CD45R0) gegen die fluoreszenzmarkierten Zytokine (IL-10 und IFN-γ) in einem
Diagramm aufgetragen. Anhand dieser korrelierten Darstellung war es möglich, den
Prozentsatz Zytokin-produzierender Zellen innerhalb einer definierten LymphozytenSubpopulation (naive gegenüber Memory T-Zellen) zu bestimmen.
27
Abbildung 1: Durchflußzytometer
Schematische Darstellung eines Durchflußzytometers mit Linsen- und Spiegelkombinationen, welche zur
”Aufspaltung” der Signale der gefärbten Zellen genutzt werden. Zum Prinzip der Messung: der Strahl eines
Argonionenlasers trifft auf die gefärbte Zelle, die daraufhin ein FSC und ein SSC entsendet. Bevor das
Vorwärtsstreulicht mit einer Photodiode gemessen wird, wird es durch einen ein- oder zehnprozentigen
Filter geschickt.
Da es sich bei dem Seitwärtssteulicht um ein schwächeres Signal handelt, muß dies mit Hilfe eines
Photomultipliers analysiert werden. Licht, welches den 495nm Spiegel passieren konnte, wird durch 515nm
Filter gelenkt. Ein dichroischer Spiegel, der hinter den Filtern und in 45° zum Lichtstrahl plaziert ist, lenkt
das langwellige Licht auf einen Photomultiplier (PMT) zur Aufnahme des roten Lichtes (Phycoerythrin
PMT). Das kurzwelligere (grüne) Licht geht ungehindert durch den Spiegel hindurch und trifft auf den
Fluorescein PMT [51].
3.8
Statistik
Die Vergleiche zwischen den Probandengruppen erfolgten mit Hilfe des Mann- Whitney
U-Tests. Es wurde ein Signifikanzniveau von 0,05 gewählt. Die Korrelationsberechnungen
erfolgten anhand der Spearman-Rangkorrelation.
Sämtliche Berechnungen einschließlich des relativen Risikos (Odds ratio) sowie des 95%
Konfidenzintervalles (CI) wurden mit Hilfe des Computerprogrammes “PC-Statistik” (Top
Soft, Hannover) vorgenommen.
28
3.9
Herstellernachweis
Aminosäuren, nicht-essentielle Biochrom, Berlin, Best.-Nr. K 0293
Amphotericin B
Biochrom, Berlin, Best.-Nr. A 2612
Anti-CD45RA-PE
Coulter, Krefeld, Best.-Nr. 6603866
Anti-CD45R0-PE
Coulter, Krefeld, Best.-Nr. 347967
Anti-IFN-γ (Klon 45.15-biotin) Freundliche Gabe von Dr. C. Heusser, Ciba Geigy, Basel
Anti-IL-10
Pharmingen, Best.-Nr. 18562 D
Brutschrank
Heraeus
CD3 FITC Anti-Leu-4F
Biosciences, Pharmingen, Best.-Nr. 300757
349201
CD4 PE 100T/ Anti-Leu 3 A
Biosciences, Pharmingen, Best.-Nr. 301117
PE, 347327
Durchflußzytometer
FACScan, Becton Dickinson, Heidelberg
DiaTOP Allergiescreening SX1 Pharmacia & Upjohn Diagnostics, Freiburg
DiaTOP Allergiescreening
Pharmacia & Upjohn Diagnostics, Freiburg
FX5
FCS (mitogengetestet)
Biochrom, Berlin, Best.-Nr. S 0115 (500ml),
S 0113 (100ml)
Hanks balanced salts solution
Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 2045
(HBSS)
Heparin-Natrium (”Vetren
Promonta, Hamburg, Reg.-Nr. V 767
200”)
HEPES-Pufferlösung (1M)
Biochrom, Berlin, Best.-Nr. α-1613
ß-Lactoglobulin A u. B (5g)
Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Best.-Nr. α-0130
L-Glutamin 200 mM
Biochrom, Berlin, Best.-Nr. K 0282 (50ml)
Kopplungskit
Calbiochem, Bad Soden/Ts., Best.-Nr. 343210
29
Lysis II Softwarepaket
Becton Dickinson, Heidelberg
Microtest Gewebekulturplatte Falcon/BD4, Heidelberg, Best.-Nr. 3072
(96 Vertiefungen)
Nabelschnurblut Gesamt-IgE
Pharmacia, Uppsala, Schweden, Best.-Nr. 10-9123-01
Immunoassay
Natrium-Pyruvat
Biochrom, Berlin, Best.-Nr. L 0473 (100mM)
Paraformaldehyd-Pulver
Riedel de Haen, Seelze, Best.-Nr. 16005
Penicillin/Streptomycin
Biochrom, Berlin, Best.-Nr. A 2212 (50ml),
10000 E/ 10000 g/ml
Best.-Nr. A 2213 (100ml)
Polystyren Reagenzgläser
Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr. 2052
(Rundboden)
Reagenzröhrchen 50ml,
Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr. 2070
konisch, mit Verschluß
Reaktionsgefäße (1.5/ 2.0 ml)
Eppendorf, Hamburg, Best.-Nr. 30102002/ 30120094
RPMI 1640 mit 2,0 g/l
Biochrom, Berlin, Best.-Nr. F 1215
NaHCO3
Saponin
Riedel de Haen, Seelze, Best.-Nr. 16109
10ml Serologische Pipette
Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr. 7530
2ml Serologische Pipette
Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr. 7507
Serumröhrchen 15ml,
Falcon/BD, Heidelberg, Best.-Nr. 2097
konisch, mit Verschluß
Strept-Avidin-Tricolor
Caltag Laboratories, Burlington, Code No. SA 1006
(=SATC)
4
BD= Becton Dickinson
30
4 Ergebnisse
4.1
Spezifische IgE-Antikörper im Alter von einem Jahr
Um bei den Studienkindern im Alter von einem Jahr eine allergische Sensibilisierung
nachzuweisen, wurde in den Einjahresseren spezifisches IgE gegen die häufigsten
inhalativen Allergene (Sx1) und gegen Nahrungsmittelallergene (Fx5) bestimmt. Es konnte
so bei 52 Kindern eine Messung des spezifischen IgE-Wertes erfolgen.
Bei 40 Säuglingen (40/52=76,92%) ließ sich kein spezifisches IgE gegen die oben
genannten
Allergene
nachweisen,
während
zwölf
der
teilnehmenden
Kinder
(12/52=23,08%) nach zwölf Monaten spezifisches IgE gebildet hatten.
31
4.2
Anzahl der CD4-positiven T-Zellen
Im Nabelschnurblut, nach sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr wurde die
Messung
der
CD4-positiven
T-Zellen
ohne
vorherige
spezifische
Stimulation
durchgeführt. Hierbei konnten zu keinem der Untersuchungszeitpunkte signifikante
Unterschiede in der Zahl der CD4+ Zellen zwischen Kindern mit einer allergischen
Sensibilisierung (spezifisches IgE+) und den Säuglingen ohne Sensibilisierung
(spezifisches IgE-) gefunden werden. Die Anzahl der CD4+ T-Helferzellen variierte
zwischen 4200 und 2000 Zellen pro µl bei Geburt und am Ende des ersten Lebensjahres.
Zellen pro
Mikroliter
4000
3000
2000
1000
0
IgE+
IgE-
Geburt
IgE+
IgE-
6 Wochen
IgE+
IgE-
6 Monate
IgE+
IgE-
1 Jahr
Abbildung 2: Darstellung der Gesamtzahl der CD4-positiven T-Zellen pro Mikroliter
Aufgetragen sind der Mittelwert und die Standardabweichung der Anzahl der CD4+ Zellen pro µl bei der
Geburt, im Alter von sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr bei Kindern mit bzw. ohne spezifisches
IgE mit zwölf Monaten.
Weißer Balken: Probanden ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr, n=40.
Schwarzer Balken: Probanden mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von einem Jahr, n=12.
32
4.3
Anzahl der CD3-positiven T-Zellen
Ebenso wie die Messung der CD4+ T-Helferzellen erfolgte die Bestimmung der CD3+ TZellen mit Hilfe der Durchflußzytometrie. Zwischen den beiden Untersuchungsgruppen
waren zu keinem der genannten Zeitpunkte signifikante Differenzen bezüglich der Anzahl
der CD3+ Zellen zu verifizieren.
Die Zahl der CD3-positiven T-Zellen lag im ersten Lebensjahr zwischen 6100 (im
Nabelschnurblut der Säuglinge mit allergischer Sensibilisierung) und 3310 Zellen pro
Mikroliter (nach zwölf Monaten in der Gruppe ohne allergische Sensibilisierung).
Zellen pro
Mikroliter
7000
6000
5000
4000
3000
IgE+
IgE-
Geburt
IgE+
IgE-
6 Wochen
IgE+
IgE-
6 Monate
IgE+
IgE-
1 Jahr
Abbildung 3: Darstellung der Gesamtzahl der CD3-positiven T-Zellen pro Mikroliter
Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung der CD3+ Zellen pro µl bei der Geburt, im Alter von
sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr bei Kindern mit bzw. ohne spezifisches IgE in einem Alter
von zwölf Monaten.
Weißer Balken: Probanden ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr, n=40.
Schwarzer Balken: Probanden mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von einem Jahr, n=12.
33
4.4
Anteil an CD45RA+ (naiven) Zellen an der Gesamtzahl der CD4+
T-Zellen
Nach einer dreitägigen Stimulation mit β-Laktoglobulin (Konzentration: 10µg/ml) wurde
mit Hilfe eines Durchflußzytometers die Anzahl der naiven (CD45RA-positiven) Zellen
unter den T-Helferzellen gemessen. Es ließ sich feststellen, daß der Anteil an naiven TZellen in beiden Untersuchungsgruppen bei der Geburt am höchsten war (97,4% in der
Gruppe mit einer allergischen Sensibilisierung gegenüber 96,8% in der Gruppe ohne
Sensibilisierung). Bis zum vollendeten ersten Lebensjahr sank er auf 77% bzw. auf 77,5%
ab. Signifikante Differenzen zwischen den Kindern mit und ohne spezifisches IgE (als
Kriterium
für
eine
Atopiemanifestation)
zeigten
sich
zu
keinem
der
Untersuchungszeitpunkte.
% 100
95
90
85
80
75
IgE+
IgE-
Geburt
IgE+
IgE-
6 Wochen
IgE+
IgE-
6 Monate
IgE+
IgE-
1 Jahr
Abbildung 4: CD45RA-positive Zellen unter den CD4+ T-Zellen in Prozent nach
Stimulation mit β-Laktoglobulin
Aufgezeigt sind der Mittelwert und die Standardabweichung der CD45RA+ Zellen unter den gesamten
CD4+ T-Zellen in Prozent. Die Messung erfolgte nach einer 72stündigen Stimulation mit β-Laktoglobulin
(Konzentration 10µg/ml) zum Zeitpunkt der Geburt, nach 6 Wochen, 6 Monaten und 1 Jahr.
Weißer Balken: Probanden ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr, n=40.
Schwarzer Balken: Probanden mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von einem Jahr, n=12.
34
4.5
Anteil an CD45R0+ (Memory) Zellen an der Gesamtzahl der CD4+
T-Zellen
Zusätzlich zur Bestimmung der CD45RA+ (naiven) T-Zellen erfolgte die Messung des
Anteils an CD45R0+ (Memory) T-Zellen an der Gesamtheit der T-Helferzellen nach einer
72stündigen Kulturzeit unter Zugabe von β-Laktoglobulin. Der durchflußzytometrisch
bestimmte Prozentsatz an Memory T-Zellen war im Nabelschnurblut am geringsten (2,8%
versus 3%) und stieg bis zum Ende des ersten Lebensjahres auf 22% bzw. 22,2% an. Bei
dem Vergleich der Säuglinge mit und ohne spezifisches IgE im Alter von zwölf Monaten
ergaben sich keine signifikanten Unterschiede im Anteil der CD45R0+ T-Zellen.
% 30
25
20
15
10
5
0
IgE+
IgE-
Geburt
IgE+
IgE-
6 Wochen
IgE+
IgE-
6 Monate
IgE+
IgE-
1 Jahr
Abbildung 5: CD45R0-positive Zellen unter den CD4+ Zellen in Prozent nach
Stimulation mit β-Laktoglobulin
Aufgetragen sind der Mittelwert und die Standardabweichung der CD45RA+ Zellen unter den gesamten
CD4+ T-Zellen in Prozent. Die Messung erfolgte nach einer 72stündigen Stimulation mit β-Laktoglobulin
(Konzentration 10µg/ml) zum Zeitpunkt der Geburt, nach 6 Wochen, 6 Monaten und 1 Jahr.
Weißer Balken: Probanden ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr, n=40.
Schwarzer Balken: Probanden mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von einem Jahr, n=12.
35
4.6
Messung von naiven und Memory T-Zellen ohne eine Stimulation
Parallel zu den mit β-Laktoglobulin stimulierten Kulturansätzen wurden zu sämtlichen
Untersuchungszeitpunkten komplettierend Messungen ohne Stimulus durchgeführt. Nach
einer dreitägigen Kulturzeit ohne jegliche Stimulation konnten in den Zellüberständen
weder IL-10 noch IFN-γ positive CD4+CD45RA+ (naive) oder CD4+CD45R0+ (Memory)
T-Zellen nachgewiesen werden.
36
4.7
IL-10 Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach Stimulation mit
β-Laktoglobulin im Vergleich zwischen Kindern mit und ohne
nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr
Im Folgenden wurde die Zytokinsynthese der Kinder, welche im Alter von einem Jahr
nachweisbares spezifisches IgE gegen Inhalations- und Nahrungsmittelallergene gebildet
hatten, verglichen mit der der Kinder ohne nachweisbares spezifisches IgE.
Nach Stimulation mit dem Milcheiweiß β-Laktoglobulin war der Anteil der IL-10
produzierenden CD45R0-positiven Zellen von Kindern mit nachweisbarem spezifischen
IgE im Nabelschnurblut signifikant (p<0,01) höher (Mittelwert der IL-10 positiven
Memory-Zellen: 13,06%) als der Anteil IL-10 positiver Memory-Zellen der Kinder ohne
spezifisches IgE im Alter von einem Jahr (Mittelwert der IL-10 positiven Memory-Zellen:
5,24%). Im Alter von sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr ließen sich keine
signifikanten Unterschiede in der IL-10 Produktion der CD45R0-positiven T-Zellen
% Zytokin
produzierende Zellen
zwischen beiden Kindergruppen nachweisen.
30
p < 0,01
20
10
0
IgE+
IgE-
Geburt
IgE+
IgE-
6 Wochen
IgE+
IgE-
6 Monate
IgE+
IgE-
1 Jahr
Abbildung 6: IL-10 Synthese in CD45R0+ Zellen bei Kindern mit und ohne spez. IgE
im Alter von einem Jahr
Mittelwert und Standardabweichung der IL-10 positiven Zellen unter den CD45R0-positiven Zellen in
Prozent nach 72stündiger Stimulation mit β-Laktoglobulin (10µg/ml) zum Zeitpunkt der Geburt, nach 6
Wochen, 6 Monaten und 1 Jahr.
Weiße Balken: Kinder ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr, n=40.
Schwarze Balken: Kinder mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von einem Jahr, n=12.
Im Nabelschnurblut ließ sich ein signifkanter Unterschied ( p<0,01 ) im Anteil an IL-10 positiven Memory
T-Zellen im Vergleich zwischen den Kindern mit und ohne allergische Sensibilisierung aufzeigen.
37
4.8
IFN-γ Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach β-LaktoglobulinStimulation im Vergleich zwischen Kindern mit und ohne
nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr
Gemessen wurde der prozentuale Anteil der IFN-γ positiven Zellen unter den CD45R0positiven (Memory) T-Zellen nach 72stündiger Stimulation mit β-Laktoglobulin. Bei dem
Vergleich zwischen den Säuglingen mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von
einem Jahr und den Kindern ohne eine Sensibilisierung konnte zu keinem der
Untersuchungszeitpunkte ein signifikanter Unterschied in der intrazellulären IFN-γ
Synthese festgestellt werden.
Der Mittelwert der IFN-γ positiven Memory T-Zellen zeigte ein Maximum zum Zeitpunkt
der Geburt in der IgE-positiven Gruppe und erreichte nach zwölf Monaten in beiden
% Zytokin
produzierende Zellen
Untersuchungsgruppen seinen Minimalwert.
7,5
5
2,5
0
IgE+
IgE-
Geburt
IgE+
IgE-
6 Wochen
IgE+
IgE-
6 Monate
IgE+
IgE-
1 Jahr
Abbildung 7: IFN-γ Synthese in CD45R0+ Zellen bei Säuglingen mit und ohne spez.
IgE im Alter von einem Jahr
Mittelwert und Standardabweichung der IFN-γ positiven Zellen unter den CD45R0-positiven Zellen in
Prozent nach 72stündiger Stimulation mit β-Laktoglobulin (10µg/ml) zum Zeitpunkt der Geburt, nach 6
Wochen, 6 Monaten und 1 Jahr.
Weißer Balken: Kinder ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr, n=40.
Schwarzer Balken: Kinder mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von einem Jahr, n=12.
Es fand sich zu keinem der Untersuchungszeitpunkte ein signifikanter Unterschied bezüglich der IFN-γ
positiven Memory T-Zellen.
38
4.9
Anteil IL-10 produzierender CD45RA-positiver (naiver) T-Zellen
nach Stimulation mit dem spezifischen Antigen β-Laktoglobulin im
Vergleich zwischen allergisch sensibilisierten und nicht
sensibilisierten Kindern
In gleicher Weise wie die Bestimmung der CD45R0-positiven Zellen erfolgte nach einer
72stündigen Inkubationszeit mit β-Laktoglobulin (10µg/ml) die durchflußzytometrische
Messung der IL-10 positiven CD45RA-positiven (naiven) T-Helferzellen. Ein Vergleich
zwischen den untersuchten Kollektiven wies zu keinem der vier Untersuchungszeitpunkte
auf einen signifikanten Unterschied hin. Der Mittelwert an IL-10 synthetisierenden naiven
T-Zellen lag während des gesamten ersten Lebensjahres in beiden Gruppen unter einem
Prozent.
Das Minimum aller Mittelwerte ließ sich im Kollektiv ohne spezifisches IgE nach zwölf
Monaten mit 0,20%, das Maximum in derselben Gruppe sechs Wochen post partum mit
% Zytokin
produzierende Zellen
0,90% der CD45RA-positiven Zellen erheben.
3
2
1
0
IgE+
IgE-
Geburt
IgE+
IgE-
6 Wochen
IgE+
IgE-
6 Monate
IgE+
IgE-
1 Jahr
Abbildung 8: Anteil IL-10 positiver CD45RA+ Zellen bei Kindern mit bzw. ohne eine
allergische Sensibilisierung im Alter von einem Jahr
Mittelwert und Standardabweichung der IL-10 positiven Zellen unter den CD45RA-positiven Zellen in
Prozent nach 72stündiger Stimulation mit β-Laktoglobulin (10µg/ml) zum Zeitpunkt der Geburt, nach 6
Wochen, 6 Monaten und 1 Jahr.
Weißer Balken: Kinder ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr, n=40.
Schwarzer Balken: Kinder mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von einem Jahr, n=12.
Es bestand zu keinem der Untersuchungszeitpunkte ein signifikanter Unterschied im Anteil der IL-10
positiven naiven T-Zellen zwischen den Kindern mit und denjenigen ohne spezifisches IgE mit einem Jahr.
39
4.10 Anteil IFN-γ synthetisierender CD45RA-positiver T-Zellen nach βLaktoglobulin-Stimulation im Vergleich zwischen allergisch
sensibilisierten und nicht sensibilisierten Kindern
Der nach 3tägiger Stimultion mit β-Laktoglobulin mit Hilfe der Durchflußzytometrie
bestimmte Anteil IFN-γ produzierender CD45RA-positiver (naiver) T-Zellen zeigte weder
im Nabelschnurblut noch sechs Wochen, sechs Monate oder ein Jahr nach der Geburt
einen signifikanten Unterschied zwischen Säuglingen mit und solchen ohne spezifisches
IgE.
Die Mittelwerte lagen in dem beobachteten Zeitraum von zwölf Monaten in beiden
% Zytokin
produzierende Zellen
Gruppen zwischen 0,049% und 0,764%.
2
1
0
IgE+
IgE-
Geburt
IgE+
IgE-
6 Wochen
IgE+
IgE-
6 Monate
IgE+
IgE-
1 Jahr
Abbildung 9: Anteil IFN-γ positiver CD45RA+ Zellen bei Kindern mit bzw. ohne eine
allergische Sensibilisierung im Alter von einem Jahr
Mittelwert und Standardabweichung der IFN-γ positiven Zellen unter den CD45RA-positiven Zellen in
Prozent nach 72stündiger Stimulation mit β-Laktoglobulin (10µg/ml) zum Zeitpunkt der Geburt, nach 6
Wochen, 6 Monaten und 1 Jahr.
Weißer Balken: Kinder ohne nachweisbares spezifisches IgE im Alter von einem Jahr, n=40.
Schwarzer Balken: Kinder mit nachweisbarem spezifischen IgE im Alter von einem Jahr, n=12.
Ein signifikanter Unterschied in der IFN-γ Synthese in naiven T-Helferzellen bei Kindern mit und ohne
spezifisches IgE war zu keinem der Untersuchungszeitpunkte nachweisbar.
40
4.11 IL-10 Synthese in CD45R0-positiven Zellen nach β-LaktoglobulinStimulation bei Kindern mit und ohne ein Allergierisiko
Studienkinder, welche entweder einen erhöhten Nabelschnurblut IgE-Wert (IgE > 0,9kU/l)
aufwiesen und/ oder Eltern oder Geschwister mit einer atopischen Erkrankung besaßen,
wurden der Allergierisikogruppe zugeordnet. Traf keines der beiden Kriterien zu, erfolgte
die Zuteilung zur Gruppe ohne Allergierisiko.
Die CD45R0-positiven (Memory) T-Zellen von Neugeborenen mit einem bestehenden
Allergierisiko wiesen im Nabelschnurblut eine signifikant höhere IL-10 Synthese
(p=0.017) nach 72stündiger Stimulation mit β-Laktoglobulin auf als die von
Neugeborenen ohne ein Allergierisiko. Der Mittelwert der IL-10 positiven Memory Zellen
lag bei den Risiko-Kindern bei 5,09% und bei den Nicht-Risiko-Kindern bei 1,45%.
Der Verlauf der Anzahl an IL-10 positiven Memory-Helferzellen war in den ersten sechs
Lebensmonaten in beiden Gruppen umgekehrt proportional: während die Werte der Kinder
mit Allergierisiko kontinuierlich abfielen, stiegen die der Kinder ohne Risiko weiter an. Im
Alter von sechs Monaten produzierten die CD45R0-positiven Zellen der Nicht-RisikoSäuglinge signifikant mehr IL10 als die der ”vorbelasteten” Säuglinge (p=0.044). Diese
Relation kehrte sich im Alter von einem Jahr erneut um, zeigte aber keine Signifikanz.
41
IL-10 positive Zellen (%)
10.0
P=0,017
7.5
P=0,044
5.0
2.5
0.0
Geburt
6 Wochen
6 Monate
1 Jahr
Abbildung 10: IL-10 Synthese in CD45R0+ Zellen im Vergleich zwischen Kindern
mit und ohne ein Allergierisiko
Mittelwert und Standardabweichung der IL-10 positiven Zellen unter den CD45R0-positiven Zellen in
Prozent nach 72stündiger Stimulation mit β-Laktoglobulin (Konzentration 10µg/ml) zum Zeitpunkt der
Geburt, nach 6 Wochen, 6 Monaten und 1 Jahr.
Weiße Balken: Kinder ohne Allergierisiko, n=13.
Schwarze Balken: Kinder mit Allergierisiko, n=39.
Neugeborene mit einem Allergierisiko wiesen bei der Geburt signifikant mehr IL-10 positive Memory TZellen auf als die Kinder ohne ein Allergierisiko (p=0,017). Im Alter von sechs Monaten zeigte sich bei den
risikofreien Kindern ein signifikant höherer Anteil an IL-10 positiven Memory Zellen (p=0,044) als bei den
Risikosäuglingen.
42
4.12 Spezifisches IgE gegen inhalative und Nahrungsmittelallergene im
Alter von einem Jahr in Korrelation mit unterschiedlichen
Risikofaktoren
Bei dem Vergleich der Kinder mit spezifischem IgE im Alter von einem Jahr
(Atopiegruppe) und der Gruppe ohne spezifisches IgE fiel zunächst auf, daß die allergisch
sensibilisierten Kinder auch signifikant (p=0,0025) häufiger allergische Symptome
entwickelten als die diesbezüglich unauffälligen Säuglinge. Bei der Betrachtung der
unterschiedlichen Symptome (Manifestation im Bereich der Haut, Lunge oder des MagenDarm-Traktes) zeigte sich, daß Hautveränderungen im Sinne einer atopischen Dermatitis
signifikant (p=0,0026) häufiger bei den Säuglingen mit spezifischem IgE im Alter von
zwölf Monaten (6/12=50%) auftraten als in der Gruppe ohne allergische Sensibilisierung
(3/40=7,5%). Die Diagnosefestlegung erfolgte unter Zuhilfenahme der Hanifin-Kriterien
für Neurodermitis [130] sowie unter Beobachtung des klinischen Verlaufes.
Als allergisches Symptom wurde außerdem eine Atemwegsobstruktion, die länger als acht
Wochen anhielt, angesehen. Zusätzlich erfolgte die Protokollierung von Beschwerden im
Bereich des Magen-Darm-Traktes, wie z. B. Emesis, Diarrhoe und Flatulenz. Bezüglich
der Atemwegssymptome als auch der Magen-Darm-Trakt-Symptome konnte keine
signifikante positive Korrelation zur Ausbildung einer allergischen Sensibilisierung
festgestellt werden.
Alle übrigen, in der nachstehenden Tabelle dokumentierten sogenannten Risikofaktoren
ließen ebenfalls keine positive Korrelation zum Merkmal ”spezifisches IgE im Alter von
einem Jahr” erkennen.
43
Tabelle 3: Überprüfung des Einflußes unterschiedlicher Risikofaktoren auf den
Nachweis
von
spezifischem
IgE
gegen
Inhalations-
und/
oder
Nahrungsmittelallergene im Alter von einem Jahr mit Hilfe der Odds ratio und des
95% Konfidenzintervalles (CI )
Faktoren
Risiko
spez. IgE
pos. n=12
spez. IgE
neg. n=40
p
Odds ratio
(relativerisk)
CI
95%
Risiko vorhanden
10/12
29/40
0,4578
1,66
0,31-8,92
Mutter Allergie
6/12
15/40
0,4389
1,67
0,45-6,12
Vater Allergie
5/12
13/40
0,5583
0,67
0,18-2,54
Geschlecht männlich
4/12
26/40
0,0510
0,26
0,06-1,05
3/12
4/40
0,1818
0,33
0,06-1,76
Rauchen
6/12
25/ 40
0,8842
1,11
0,27-4,59
Tiere
7/ 12
28/ 40
1,00
1,00
22-4,54
7/12
5/40
0,0025
0,1
0,02-0,45
Hanifin pos.
6/12
3/40
0,0026
0,08
0,02-0,41
Atemwegssympt. vorh.
4/12
15/40
0,7928
1,20
0,31-4,68
MDT-Sympt. vorh.
2/12
3/40
0,3569
0,41
0,06-2,77
Umgebung Gehobener sozialer
Status
Symptome Allerg. Sympt. vorh.
44
4.13 Stillen und Beginn der Kuhmilchfütterung
Während des gesamten ersten Lebensjahres wurde bei allen Studienkindern (n=52) die Art
der Ernährung genau dokumentiert. Es erfolgte die Protokollierung der Stilldauer, der
Dauer des teilweisen Stillens, der Gabe von Fertigmilchprodukten sowie des Zeitpunktes
der Zufütterung anderer Nahrungsmittel.
Von den an der Studie teilnehmenden Kindern wurden 50% (n=26) maximal vier Wochen
oder gar nicht gestillt. Etwa 19% (n=10) wurden bis zu drei Monaten und ca. 30% (n=16)
bis zu sechs Monaten vollgestillt. Bis zum Ende des ersten Lebensjahres waren ca. 15%
(n=8) der Säuglinge teilweise gestillt worden. Eine hypoallergene Nahrung erhielten
38,5% (n=20) der Kinder, 12% (n=6) länger als die ersten sechs Lebensmonate.
Drei von den insgesamt 52 untersuchten Kindern wurden das gesamte erste Lebensjahr
kuhmilchfrei ernährt (5,8%). Es handelte sich bei den drei Säuglingen um
Atopierisikokinder (positive Familienanamnese bzgl. atopischer Erkrankungen und/ oder
erhöhtes IgE im Nabelschnurblut). Nach zwölf Monaten konnte bei keinem dieser
Säuglinge spezifisches IgE gegen Inhalations- und/ oder Nahrungsallergene nachgewiesen
werden.
Bei dem Vergleich der einzelnen Kindergruppen (Kinder mit einem Atopierisiko, Kinder
mit spezifischem IgE) mit dem entsprechenden Kollektiv ohne dieses Merkmal unter
Betrachtung der Ernährungsgewohnheiten ergaben sich weder in Bezug auf die Stilldauer
noch auf den Zeitpunkt des Beginnes mit kuhmilchhaltiger Nahrung signifikante
Differenzen.
45
5 Diskussion
Die Prävalenz von atopischen Erkrankungen im Kindesalter hat in den letzten zwei bis drei
Jahrzehnten in den westlichen Industrienationen stark zugenommen [52-55]. So zeigte
beispielsweise eine Untersuchung in Süd-Wales, die zuerst 1973 und nochmals 1988 unter
gleichen Bedingungen und in der gleichen Altersgruppe durchgeführt worden war, daß die
Prävalenz von Asthma von 6% auf 12%, die Prävalenz des atopischen Ekzems von 5% auf
16% und die von allergischer Rhinitis von 17% auf 22% angestiegen ist [56]. Diese
Tatsache weist darauf hin, welchen Stellenwert Atopien in unserer Gesellschaft
einnehmen. Es folgten in den letzten Jahren zahlreiche Studien auf dem Gebiet der
atopischen
Krankheitsbilder,
welche
dazu
beitragen
sollten,
die
Abläufe
der
Immunantworten besser zu verstehen und somit neue Möglichkeiten des therapeutischen
Eingreifens zu eröffnen.
Immer wieder hat sich gezeigt, daß Zytokine als Immunmodulatoren eine zentrale Rolle
spielen bei der Differenzierung der Lymphozyten in allergiefördernde (Th 2) oder aber
allergiehemmende (Th 1) T-Zellsubpopulationen.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Immunreaktionen bei Neugeborenen und
Säuglingen während des ersten Lebensjahres näher zu untersuchen, insbesondere die in
vitro Zytokinsynthese in T-Helferzellen nach Stimulation mit dem Milcheiweiß βLaktoglobulin. Es stellte sich die Frage, ob es nach dieser spezifischen Stimulation
Unterschiede in der Zytokinproduktion gibt zwischen Kindern mit einer allergischen
Sensibilisierung im Alter von einem Jahr und Kindern ohne eine Sensibilisierung. Des
weiteren galt es zu klären, ob die Kinder mit spezifischem IgE am Ende des ersten
Lebensjahres
bereits
vor
dem
Auftreten
einer
atopischen
Erkrankung
andere
Zytokinmuster aufweisen als Kinder ohne eine Sensibilisierung.
Außerdem sollte zur Klärung der Frage beigetragen werden, inwieweit unterschiedliche
sogenannte
Einfluß-
Atopiedisposition,
ein
oder
Risikofaktoren,
erhöhter
neonataler
wie
beispielsweise
IgE-Wert
und
eine
familiäre
Umwelteinflüsse
(Allergenexposition), die Manifestation einer allergischen Sensibilisierung zu beeinflussen
vermögen.
46
Untersucht wurde die Zytokinproduktion in CD45R0-positiven (Memory) und CD45RApositiven (naiven) T-Helferzellen nach 72stündiger Stimulation mit β-Laktoglobulin zum
Zeitpunkt der Geburt, nach sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr. Außerdem
erfolgte die Bestimmung der Anzahl der CD3- und CD4-positiven Zellen sowie dem
Anteil an CD45RA+ und CD45R0+ Zellen an den CD4+ T-Helferzellen.
Gemessen wurden IFN-γ als Th1-typisches Zytokin und IL-10, dessen Aufgabe und
Wirkungen beim Menschen nicht vollständig bekannt sind.
Bevor die Ergebnisse der vorliegenden Studie diskutiert werden, soll jedoch zunächst kurz
der Stand der derzeitigen Forschung in Bezug auf die Rolle der unterschiedlichen Zytokine
bei der Pathogenese von Immunantworten dargestellt werden.
47
Die Bedeutung der Zytokine für die Differenzierung der humanen naiven
T-Helferzellen in Th1- und Th2-Zellen
Zytokine besitzen eine Schlüsselfunktion bei der Entwicklung von Immunantworten, so
auch in der Regulation der IgE Synthese und bei der Enstehung von allergischen
Erkrankungen. Unter den verschiedenen Zytokinen kommen dem IFN-γ, dem IL-4 und
dem IL-10 eine besondere Rolle zu. IFN-γ induziert die Ausreifung der naiven T-Zellen in
allergieprotektive Th1-Zellen, gleichzeitig hemmt es die Bildung und Proliferation von
allergiefördernden Th2-Zellen [11-15]. Außerdem ist es in der Lage, die Expression der
Histokompatibilitätskomplexe I und II auf der Oberfläche von Makrophagen zu fördern
und damit die Antigenpräsentation und das Antigen Prozessing zu erleichtern [57].
Im Gegensatz zu IFN-γ, das die Entwicklung IgG synthetisierender B-Zellen fördert, führt
IL-4 zu einer Ausdifferenzierung in Th2-Zellen [58] und induziert in B-Zellen den
”switch” zur IgE Synthese [59-64]. Die Proliferation von Th1-Zellen hingegen wird durch
IL-4 gehemmt. IL-10 kann ebenfalls über seinen negativen Effekt auf das IFN-γ eine
Herabsetzung der Th1-Zellproliferation bewirken. Kommt es auf diesen Wegen zum
Überwiegen von einer der beiden T-Helferzellsubpopulationen (Th1 oder Th2), ist die
Umkehr in die gegenteilige Richtung schwierig, da das vorherrschende Zytokinmilieu
(z.B. ein Überschuß von IL-4) selbstverstärkend wirkt und hierdurch zu einer weiteren
Synthese der bereits überwiegenden T-Helferzellgruppe und Zytokine anregt.
Dies zeigt, wie wichtig gerade die ersten Lebenswochen und -monate für die Entwicklung
des kindlichen Immunsystems sind, da in diesem Zeitraum die Prägung in eine der beiden
Richtungen stattzufinden scheint. Langfristig gesehen wäre daher ein Ziel, zu einem frühen
Zeitpunkt die Proliferation von Th1-Zellen zu fördern bzw. die Synthese von Th2-Zellen
zu unterdrücken, um so die Manifestation atopischer Erkrankungen zu verhindern.
Es soll nun zunächst auf die Unterschiede in der Zytokinsynthese (IL-10 versus IFN-γ)
sowohl im Hinblick auf den zeitlichen Verlauf als auch im Vergleich beider
Kindergruppen (allergisch sensibilisierte gegenüber nicht allergisch sensibilisierten
Säuglingen) eingegangen werden. Außerdem wird die Rolle der naiven und der Memory
T-Zellen im Rahmen der allergischen Immunantwort näher erläutert. Im weiteren folgt die
Diskussion des Einflusses genetischer und verschiedener Umweltfaktoren auf die
Manifestation atopischer Krankheitsbilder bei Kindern.
48
Allergen
APC
naiv
NK
+ IL-12
+ IL-4
+ IL-5
+ IFN-γ
– IL-10
Th1
Th2
– IL-2
– IFN-γ
IL-4
IL-5
IL-13
IFN-γ
B
Abbildung 11: Wirkung verschiedener Zytokine auf die T-Zelldifferenzierung
Ausdifferenzierung der frühen, naiven ”Vorläufer”-T-Zellen bei unterschiedlichem Zytokinmilieu in Th1(atopieprotektive) oder Th2- (atopiefördernde) Zellen. IL-4 führt zu einer Ausreifung der naiven T-Zellen in
Th2-Zellen. Findet nun ein Kontakt zwischen der aktivierten Th2-Zelle und einer B-Zelle statt, so kommt es
zur Bindung des T-Zellrezeptors an den MHC II-Komplex auf der Antigen-präsentierenden B-Zelle. Es
entsteht eine Wechselwirkung zwischen beiden Zellen, welche in einer vermehrten IL-4 Synthese und
letztendlich in der Bildung von IgE resultiert.IFN-γ hingegen fördert die Differenzierung in Th1-Zellen und
verhindert die Differenzierung zur Th2-Subpopulation. Außerdem hemmt es die IgE Synthese. Ein weiteres
Zytokin, das maßgeblich an Th1-gerichteten Immunantworten beteiligt ist, ist das IL-12 [65]. Es kann
entweder direkt die Entwicklung von Th1-Zellen fördern oder indirekt über eine Steigerung der IFN-γ
Freisetzung durch ”natural killer” (NK) Zellen zu deren Ausdifferenzierung beitragen.
49
Die CD45R0-positiven Zellen von Kindern mit allergischer Sensibilisierung am Ende
des ersten Lebensjahres weisen bereits im Nabelschnurblut eine signifikant höhere
IL-10 Synthese nach Stimulation mit β-Laktoglobulin auf als Kinder ohne eine
allergische Sensibilisierung
In der vorliegenden Arbeit wurde die IL-10 Synthese sowohl in CD4+ CD45RA+ (naiven)
T-Zellen als auch in CD4+ CD45R0+ (Memory) T-Zellen nach Antigen-Stimulation zu
verschiedenen Zeitpunkten (bei Geburt, im Alter von sechs Wochen, sechs Monaten und
einem Jahr) untersucht. Die an der Studie teilnehmenden Säuglinge (n=52) wurden in zwei
Gruppen unterteilt: Kinder mit spezifischem IgE im Alter von einem Jahr und Kinder ohne
eine allergische Sensibilisierung in diesem Alter. So konnte die Zytokinproduktion der
atopisch erkrankten Säuglinge mit der der Kontrollgruppe verglichen werden. Die
Messung der IL-10 positiven Zellen erfolgte, ebenso wie die Bestimmung der IFN-γ
positiven Zellen, nach intrazellulärer Färbung mit Hilfe eines Durchflußzytometers nach
einer dreitägigen Inkubation unter Stimulation mit β-Laktoglobulin. Eine 72stündige
Inkubationszeit wurde gewählt, da kinetische Untersuchungen gezeigt hatten, daß die IL10 Produktion nach Antigen-Stimulation frühestens nach 24 bis 48 Stunden ihr Maximum
erreicht [21;66].
Der Vergleich beider Kindergruppen weist erstmals auf einen bereits bei Geburt
bestehenden gravierenden Unterschied in der Zytokinsynthese zwischen atopischen und
nicht-atopischen Säuglingen hin. Interessanterweise ließ sich diese signifikante Differenz
nur bei den neonatalen T-Helferzellen und nicht zu den im weiteren folgenden
Untersuchungszeitpunkten aufzeigen. Postnatal kam es dann innerhalb des ersten
Lebensjahres zu einer Angleichung der Anzahl der IL-10 positiven Memory T-Zellen in
beiden Untersuchungsgruppen.
Ähnliche Ergebnisse fanden sich für die Betrachtung der Atopierisiko- versus der NichtAtopierisikokinder. Die Memory T-Zellen der Neugeborenen mit einem Atopierisiko
synthetisierten signifikant mehr IL-10 als ihre Altersgenossen aus der Kontrollgruppe. Im
Alter von sechs Monaten kehrte sich jedoch die Relation der IL-10 Produktion um: die
Säuglinge ohne Risiko zeigten einen höheren Anteil an IL-10 positiven Memory Zellen als
die Kinder mit Atopierisiko. Dieser Unterschied ließ sich bei dem Vergleich der Kinder
mit bzw. ohne eine allergische Sensibilisierung nicht verifizieren. Weitaus wichtiger
50
erscheint jedoch die Tatsache, daß in beiden neonatalen Untersuchungskollektiven
(Neugeborene mit einem erhöhten Risiko und Neugeborene mit einer späteren Atopie) eine
Differenz in der Zytokinsynthese zur jeweiligen Kontrollgruppe bestand.
In Anbetracht dieses Ergebnisses erscheint es möglich, schon zum Zeitpunkt der Geburt
atopiegefährdete Kinder mit Hilfe der intrazellulären IL-10 Bestimmung zu identifizieren.
Es müßte zunächst jedoch anhand von Untersuchungen mit großen Fallzahlen ein
Grenzwert, welcher einen hohen prädiktiven Wert besitzt, festgelegt werden. Sollte dies
gelingen, könnten frühestmögliche präventive oder auch gegebenenfalls therapeutische
Maßnahmen eingeleitet und so eine Atopiemanifestation eventuell verhindert werden.
Als Resümee bleibt festzustellen, daß bei atopisch erkrankten Kindern bereits vor dem
Erkrankungsbeginn ein pathologisches Zytokinmuster, nachgewiesen in Form einer
signifikant erhöhten Anzahl an IL-10 positiven Memory T-Zellen, besteht. Es kann daher
von folgender These ausgegangen werden:
Ein aberrierendes Zytokinmuster ist nicht die Folge einer atopischen Erkrankung
sondern deren Ursache
Es ist bekannt, daß in erster Linie CD4+ T-Zellen über eine gesteigerte IgE Synthese den
Weg zur Manifestation einer atopischen Erkrankung ebnen. Es handelt sich bei den CD4+
Zellen um eine funktionell heterogene Gruppe, welche mit Hilfe monoklonaler Antikörper
unter anderem in CD45RA (naive) und CD45R0 (Memory) Subpopulationen differenziert
werden kann. Einige Publikationen wiesen nun darauf hin, daß dei Atopikern die Zahl an
Memory T-Zellen im peripheren Blut vermindert, die Anzahl der naiven Zellen jedoch
erhöht ist. Während bei gesunden Individuen die naiven Zellen im Laufe der Zeit
zugunsten der Memory Zellen abnehmen, zeigte sich, daß bei Atopikern die naiven
(CD45RA+) Zellen persistierten [67]. Man ging daher von einem Ausreifungsdefekt der TZellen aus. Zu einem ähnlichen Ergebnis kamen 1994 Miles et al., die nachweisen
konnten, daß Atopierisikokinder, welche im weiteren Verlauf allergische Symptome
entwickelten, im Nabelschnurblut signifikant weniger Memory T-Zellen besaßen als
Säuglinge ohne ein Atopierisiko [68]. Als mögliche Ursache für diesen Defekt wurden
zwei verschiedene Theorien diskutiert: es wäre denkbar, daß bei den erkrankten Kindern
pränatal nur eine (durch die Mutter) limitierte Antigenexposition stattfindet, welche nach
der Geburt zu einem Mangel an ”geprimten” T-Zellen und konsekutiv zu einer reduzierten
51
Zahl an Memory Zellen führt. Möglicherweise liegt jedoch auch eine postnatale Unreife
des Immunsystems den verminderten Memory Zellen bei den erkrankten Säuglingen
zugrunde [69].
Die bereits diskutierten Ergebnisse können die zuletzt genannte Hypothese der
Ausreifungsstörung nicht bestätigen. Es fanden sich nämlich nach 72stündiger Inkubation
der mononukleären Nabelschnurblutzellen mit β-Laktoglobulin gerade in der Gruppe der
atopisch erkrankten Kinder signifikant mehr IL-10 positive CD45R0+ T-Zellen als in der
der gesunden Säuglinge. Die Ausdifferenzierung zu Memory T-Zellen wurde folglich in
beiden Gruppen vollzogen, bei den später erkrankten Kindern ließ sich sogar eine
verstärkte Ausreifung in IL-10 produzierende Memory Th2-Zellen nachweisen.
Es muß daher angenommen werden, daß nicht eine Differenzierungsstörung der T-Zellen
zu einer atopischen Erkrankung führt, sondern ein bereits bei der Geburt Th2-gerichtetes
Zytokinmilieu die spätere Manifestation einer Atopie bedingt. Die vorherrschende
Gewichtung beziehungsweise Polarisierung des Zytokinmusters (Th2 versus Th1) ist dabei
nicht als Folge der Erkrankung sondern als deren Ursache anzusehen.
Angesichts der Tatsache, daß sich gerade postnatal ein signifikanter Unterschied in der
IL-10 Synthese zwischen der Atopiegruppe und der Kindergruppe ohne eine derartige
Erkrankung aufzeigen ließ, während in den weiteren zwölf Monaten eine nahezu
vollständige Angleichung der IL-10 Produktion zu verzeichnen war, sind folgende
Hypothesen als wahrscheinlich anzunehmen:
IL-10 scheint eine wichtige Rolle bei der primären Immunprägung zu spielen
IL-10 scheint in den ersten Lebenswochen und -monaten eher Th2-typische
(atopiefördernde) Eigenschaften zu besitzen
Die bereits zuvor erläuterten Ergebnisse deuten darauf hin, daß IL-10 die spätere
Entwicklung einer allergischen Reaktionslage gerade in den ersten Lebenstagen und
-wochen entscheidend mitbeeinflußt. Es scheint eine bedeutendere Rolle bei der Prägung
des kindlichen Immunsystems zu spielen als bisher angenommen wurde. Dies verdeutlicht
vor allem die Tatsache, daß im Alter von einem Jahr atopisch erkrankte Kinder gerade zum
Zeitpunkt ihrer Geburt einen signifikant höheren Anteil an IL-10 positiven Memory
T-Zellen besitzen als ihre gesunden Altersgenossen.
52
Bisher wurde IL-4 als das Th2-charakteristische Zytokin angesehen, welches zu einer
vermehrten IgE Produktion führt und damit auch den Weg zur Manifestation einer
atopischen Erkrankung ebnet. Mit Blick auf die oben erläuterten Ergebnisse ist davon
auszugehen, daß IL-10 ebenso wie das IL-4 eher Th2-typische, allergiefördernde als Th1charakteristische Eigenschaften besitzt. Da ein Zusammenhang mit der Synthese von
spezifischem IgE im Alter von einem Jahr besteht, ist es naheliegend, daß es sich bei dem
Syntheseort des IL-10 in erster Linie um Th2-Zellen handelt, welche zudem noch das für
sie charakteristische IL-4 produzieren.
Fiorentino et al., denen es 1989 bei Mäusen erstmals gelang IL-10 nachzuweisen, stellten
fest, daß im murinen System die IL-10 Produktion lediglich durch Th2-Zellen erfolgt [70].
Im Gegensatz dazu zeigten weiterführende Untersuchungen an humanen Zellen, daß beim
Menschen mononucleäre Phagozyten [66; 71], NK-Zellen [72] und sowohl Th0- als auch
Th1- und Th2-Zellen zur IL-10 Produktion fähig sind [21; 73]. Es stellte sich jedoch
heraus, daß der größte Anteil von den Th0- und Th2-Zellen gebildet wird [21]. Dies steht
im Einklang mit den oben aufgezeigten Ergebnissen, wobei diese am ehesten auf Th2Helferzellen als Syntheseort schließen lassen.
Die Wirkungen des IL-10 gelten als vielfältig, und bisher wurde davon ausgegangen, daß
sie beim Menschen, anders als bei der Maus, sowohl die Th1- als auch die Th2-Zellen
betreffen. Man nahm zunächst an, daß humanes IL-10 die Antigen-induzierte Proliferation
von
Th1-
und
Th2-Zellen
ebenso
reduziert
bzw.
hemmt
wie
auch
deren
Zytokinproduktion, und es somit im Allgemeinen einen eher dämpfenden Effekt auf
Immunantworten besitzt. Aufgrund seines hemmenden Effektes auf die Zytokinsynthese
wurde das IL-10 zunächst auch als CSIF (= cytokine synthesis inhibitory factor)
bezeichnet. De Waal Malefyt et al. konnten 1991 zeigen, daß IL-10 nach Zugabe zu
Monozyten die Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen wie IL-1 α und β, IL-6,
IL-8, TNF-α, G-CSF und GM-CSF zu unterdrücken vermag [74].
Del Prete und Yssel gingen davon aus, daß IL-10 sowohl die IFN-γ Produktion in Th1Zellen und als auch die IL-4 und IL-5 Produktion in Th2-Zellen inhibiert, wobei es jedoch
eine IL-2 induzierte Proliferation von Th1- und Th2- Zellklonen nicht zu hemmen vermag
[73].
53
Die in dieser Arbeit aufgezeigten Ergebnisse deuten auf dem ”murinen Modell” ähnliche,
eher Th2-gerichtete Wirkungen des IL-10 hin. Wobei darauf hinzuweisen ist, daß sich der
Untersuchungszeitraum in der vorliegenden Studie auf das erste Lebensjahr beschränkte.
Ob das IL-10 in den folgenden Jahren bis ins Erwachsenenalter seine TH2-Polarisierung
beibehält, oder, wie von Akdis et al. favorisiert, bei Erwachsenen zu einer Antigentoleranz
der T-Zellen führt [75], bleibt zu klären.
Die Th2-spezifischen Eigenschaften des Interleukin 10 sollen im Folgenden anhand der
Studienergebnisse diskutiert werden:
IL-10 inhibiert die Antigen-induzierte IFN-γ Produktion in Th1-Zellen
Bereits seit längerer Zeit wird angenommen, daß IL-10 die Antigen-induzierte IFN-γ
Produktion in Th1-Zellen hemmt. Der inhibierende Effekt des IL-10 soll darauf beruhen,
daß es die Fähigkeit der Monozyten zur Antigen-Präsentation hemmt, indem es die
Expression des MHC Klasse II auf diesen Zellen vermindert [66; 74]. Folglich greift IL-10
nicht direkt an den Helferzellen an, sondern übt seinen hemmenden Einfluß auf die TZellfunktion über seine Wirkung auf die Antigen-präsentierenden Zellen aus. Es wird
außerdem vermutet, daß es auch costimulierende Faktoren, welche wichtig für die TZellaktivierung sind, beeinflußt.
Um die These der verminderten IFN-γ Synthese zu überprüfen, wurde die intrazelluläre
IFN-γ Produktion der Kinder mit allergischer Sensibilisierung (mit spezifischem IgE) am
Ende des ersten Lebensjahres und signifikant erhöhter intrazellulärer IL-10 Synthese
verglichen mit der IFN-γ Produktion der Kinder ohne eine allergische Sensibilisierung und
konsekutiv niedrigerer IL-10 Produktion.
Die allergisch sensibilisierten Kinder wiesen im Alter von sechs Wochen und sechs
Monaten nach Stimulation mit dem spezifischen Antigen Laktoglobulin auch tatsächlich
weniger IFN-γ positive Memory Zellen auf als die Kinder ohne Sensibilisierung. Zum
Zeitpunkt der Geburt war die intrazelluläre IFN-γ Produktion in den Memory Zellen der
Kinder, welche nach einem Jahr nachweisbar spezifisches IgE gebildet hatten, jedoch
sogar höher als bei den Kindern ohne spezifisches IgE. Letztendlich waren die
Unterschiede in der IFN-γ Produktion jedoch zu keinem der Untersuchungszeitpunkte
signifikant.
54
Eine Erklärung für dieses unerwartete Ergebnis könnte in der Komplexität des
Zusammenspiels der einzelnen Zytokine liegen. So weist bespielsweise eine Arbeit von
Windhagen et al. darauf hin, daß IL-12 zu einer simultanen gesteigerten IL-10 und IFN-γ
Sekretion durch bestimmte T-Zelluntergruppen führt [76]. Bei Mäusen löste die
Behandlung mit IL-12 bis zu 24 Stunden postnatal eine Steigerung der IFN-γ und der IL12 mRNA in der Milz der neonatalen Mäuse aus [77]. IL-4 hingegen bewirkt einen
Anstieg der IL-10 mRNA in Th2-Zellen und auch des sezernierten Zytokins, während IL-2
wiederum die IL-4 mRNA in Th2- und die IFN-γ mRNA in Th1-Zellen erhöht [78]. Die
Ausführungen zeigen, daß es durchaus denkbar ist, daß trotz eines vorherrschenden Th2Zytokinmilieus Th1-typische Zytokine in geringeren Mengen koexprimiert werden.
Außerdem wird deutlich, wie vielfältig und vernetzt die Wirkungen der einzelnen Zytokine
sind. Es kann daher nicht allein anhand der oben aufgeführten Ergebnisse beurteilt werden,
ob IL-10 in vivo tatsächlich eine Reduktion der T-zellulären IFN-γ Synthese zur Folge hat,
da eventuelle Einflüsse anderer Zytokine, wie z.B. von IL-2, IL-12 oder IL-4, nicht
berücksichtigt, bzw. auch nicht ausgeschlossen werden können.
Eine weitere eher Th2-charakteristische Eigenschaft liegt in der Wachstums- und
Differenzierungsförderung
von
B-Zellen
sowie
von
Immunglobulin-assoziierten
Immunantworten, hierunter vor allem von IgE.
IL-10 fördert die Synthese von IgG im Serum und IgA im Speichel
Wie bereits erläutert läßt sich eine Korrelation zwischen der Anzahl der IL-10 positiven TZellen und einer zu einem späteren Zeitpunkt nachgewiesenen IgE-Synthese feststellen.
Ergebnisse, welche an demselben Probandenkollektiv in einer parallel durchgeführten
Studie gewonnen wurden, zeigten jedoch außerdem eine signifikante positive Korrelation
zwischen dem Anteil an IL-10 positiven Memory T-Zellen nach Stimulation mit βLaktoglobulin und Antikörpern gegen Laktoglobulin im Speichel (sIgA) des Kindes zum
Zeitpunkt der Geburt und im Alter von sechs Wochen. Es konnte nachgewiesen werden,
daß je größer der Anteil an IL-10 positiven Memory Zellen war, desto höher auch die im
Speichel gemessenen Antikörperwerte waren. Des weiteren bestand im Alter von sechs
Wochen eine signifikante positive Korrelation zwischen den IL-10 positiven Memory
Zellen und den im Serum gemessenen IgG-Antikörpern gegen Laktoglobulin. Eine
55
Differenzierung der Immunglobuline in IgG1 oder IgG4 Subklassen wurde im Rahmen
dieser Studie nicht vorgenommen.
Bisher gibt es lediglich wenige Studien, welche sich mit möglichen Zusammenhängen
zwischen
allergeninduzierter
antigenspezifischen
Zytokinsynthese
Immunglobulinantworten
und
den
beschäftigen.
daraus
Die
resultierenden
oben
genannten
Ergebnisse stehen jedoch im Einklang mit einer Studie von Moore et al., die 1993 zeigen
konnten, daß humanes IL-10 in B-Zellen die Synthese von IgG und IgA fördert [79]. Zwei
aktuelle Arbeiten aus dem Jahre 1999 erbrachten weitere interessante Details [80; 81]: eine
durch Birkenpollen induzierte Synthese von IL-4 korrelierte positiv mit einer erhöhten
Anzahl von IgE Antikörpern gegen dasselbe Allergen. Ebenso ließen sich gesteigerte
Serum IgG4-Werte in Verbindung bringen mit einer durch Birkenpollen hervorgerufenen
gesteigerten IL-4 und IL-6 Produktion. In der genannten Studie konnte jedoch, im
Gegensatz zu den hier vorliegenden Daten, keine positive Korrelation zwischen einer βLaktoglobulin
getriggerten
Zytokinsynthese
und
Immunglobulinen
gegen
das
Milchallergen verifiziert werden.
Die dargelegten Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, daß eine durch das spezifische
Milchallergen β-Laktoglobulin induzierte IL-10 Synthese zu einer IgG-, IgA- und
letztendlich auch IgE- vermittelten (und damit allergischen) Immunantwort führen kann.
Ob sich diese These auch auf Immunvorgänge bei Erwachsenen übertragen läßt, bleibt
strittig. Eine Arbeit von Akdis et al. weist, wie bereits zuvor erwähnt, in die kontroverse
Richtung [75]: Untersuchungen an Erwachsenen mit einer Allergie gegen Bienengift
zeigten, daß die Induktion und Aufrechterhaltung einer Th1-gerichteten Immunlage mit
einer vermehrten IL-10 Produktion assoziiert zu sein scheint. Mit einem Anstieg der IL-10
Synthese nach spezifischer Immuntherapie kam es zu einer deutlichen Abnahme der durch
Phospholipase A 2 induzierten IgE-Antikörper.
Mit der Ausreifung des Immunsystems über Jahre könnte sich folglich auch eine
Wirkungsänderung des IL-10 von einem frühen Th2- zu einem in späteren Lebensjahren
Th1-gerichteten Zytokin einstellen.
Als Erklärung für die zuvor beschriebene Toleranzinduktion sollte jedoch unbedingt noch
eine andere Hypothese in Betracht gezogen werden: es wäre denkbar, daß IL-10 zur
Proliferation bestimmter T-Zellsubpopulationen führt, die die Fähigkeit besitzen, Antigen-
56
spezifisch Immunantworten zu unterdrücken. Derartige Zellen konnten bereits sowohl bei
Tieren als auch beim Menschen identifiziert werden:
T-regulatorische Zellen und IL-10 als potentieller Marker dieser T-Zellsubpopulation
Das Immunsystem verfügt, wie bereits zuvor erläutert, über unterschiedliche
Möglichkeiten,
regelrechte
Immunreaktionen
zu
fördern
und
pathologische
zu
unterdrücken. Gerade in den letzten beiden Jahren ergaben sich immer wieder Hinweise
darauf, daß sogenannte T-regulatorische (Treg-) Zellen eine wichtige Rolle bei der
Suppression krankhafter Immunantworten spielen [26; 30]. Bei diesen Zellen handelt es
sich um eine heterogene Gruppe von T-Zellen mit einerseits ständig präsenten (z. B.
CD4+CD25+ T-Zellen) und andererseits erst spezifisch induzierten Subpopulationen (z. B.
Tr1 Zellen). Bisher konnten erst einige Untergruppen identifiziert werden. Die exakte
Beziehung der verschiedenen Zellen zueinander bzw. ihre Wechselwirkungen sind
größtenteils noch unbekannt und erfordern weitere Studien.
Für die Differenzierung von naiven T-Zellen in Treg-Zellen scheinen vor allem das
vorherrschende Zytokinmilieu und der Aktivationsgrad der Antigen-präsentierenden
Zellen von großer Bedeutung zu sein. Es hat sich beispielsweise gezeigt, daß die
Stimulation mit unreifen dendritischen Zellen (DC) zur Entwicklung von IL-10
produzierenden T-Zellen mit regulatorischen Fähigkeiten führt [82]. Reife DC induzieren
im Gegensatz hierzu die ausschließliche Proliferation von TH1-Zellen.
Bei der Treg-Zellsubpopulation, die bisher am genauesten examiniert wurde, handelt es
sich um den sogenannten Subtyp 1 (Tr1-Zellen). Bekannt ist, daß diese Zellen zu ihrer
Differenzierung IL-10 und IFN-α benötigen, jedoch im Gegensatz zu den Th3-Zellen kein
TGF-β [29]. Die Tr1-Zellen sind durch ihre einheitliche Zytokinproduktion mit einer
gesteigerten IL-10 und TGF-β Synthese (ohne nachweisliche Produktion von IL-2 oder IL4) charakterisiert [33; 83]. Durch noch nicht vollständig aufgeklärte Zell-zu-ZellInteraktionen ebenso wie durch die genannten Zytokine sollen diese Zellen in der Lage
sein, Antigen-spezifische Immunantworten sowohl von naiven als auch von Th1- und Th2Zellen zu supprimieren [33].
Es wäre durchaus möglich, daß es sich in der vorliegenden Studie bei den IL-10 positiven
Memory T-Zellen nicht um Th2-Zellen, wie zuvor diskutiert, sondern um eine
57
Subpopulation von Treg-Zellen handelt. Daß nun gerade die Kinder mit einer allergischen
Sensibilisierung am Ende des ersten Lebensjahres im Nabelschnurblut einen signifikant
höheren Anteil dieser Zellen aufweisen sollen, erscheint aufgrund der den Treg-Zellen
nachgesagten Toleranzinduktion auf den ersten Blick unklar. Eine Dysfunktion dieser
wichtigen Zellgruppe könnte aber zum Beispiel für die spätere IgE-Bildung verantwortlich
sein. Möglicherweise könnte die fehlende Suppression der allergischen Sensibilisierung
auch in einer fehlerhaften Zell-zu-Zell-Interaktion zwischen den Treg-Zellen und
speziellen Ziel-Zellen begründet sein. Dieser Kontakt ist nämlich zumindest in vitro
notwendig, um eine Toleranzinduktion herbeizuführen [84; 85].
Obwohl einige Arbeiten darauf hinweisen, daß IL-10 einen wichtigen Faktor für die
Toleranzentwicklung gegenüber Alloantigenen darstellt [86; 87], kann letztendlich anhand
der hier genannten Ergebnisse nicht mit Sicherheit festgestellt werden, ob IL-10 einen
Marker für T-regulatorische T-Zellen darstellt. Um diese T-Zellsubpopulation zu
identifizieren und zu charakterisieren, bedarf es weiterer Merkmale, wie zum Beispiel der
TGF-β Synthese und phänotypischer Eigenschaften.
Es stellte sich im weiteren die Frage, ob sich außer den Unterschieden in der
Zytokinsynthese zwischen Atopikern und Nicht-Atopikern ebenso Differenzen in den TZellsubpopulationen (CD45RA+ / CD45R0+) finden.
IL-10 und IFN-γ werden sowohl von naiven als auch von Memory T-Helferzellen
nach Stimulation mit β-Laktoglobulin gebildet
Naive T-Zellen sind daher nicht als immuninkompetent anzusehen
Nach 72-stündiger Inkubation der mononukleären Zellen mit β-Laktoglobulin erfolgte
zunächst die Markierung der Oberflächenmarker CD4 CD45R0 (Merkmal für Memory THelferzellen) und CD4 CD45RA (Merkmal für naive T-Helferzellen), sowie die
intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung der Zytokine IFN-γ und IL-10. Mit Hilfe der
Durchflußzytometrie konnte dann simultan die intrazelluläre Zytokinproduktion auf
Einzelzellniveau nachgewiesen werden.
58
Sowohl die CD4 CD45RA+ (naiven) T-Zellen als auch die CD4 CD45R0+ (Memory) TZellen produzierten nach Stimulation mit β-Laktoglobulin die Zytokine IFN-γ und IL-10,
wobei die Anzahl an IFN-γ und IL-10 positiven Zellen unter den naiven T-Helferzellen
deutlich geringer war als unter den Memory T-Zellen.
Mit Blick auf das von Mosmann entwickelte Modell der T-Zelldifferenzierung überrascht
es zunächst, daß auch unter den naiven Zellen eine andere als die erwartete IL-2
Produktion gemessen werden konnte. Im Mosmannschen Modell wird davon ausgegangen,
daß es sich bei den naiven T-Zellen um sogenannte ”Precursor” (Vorläufer)-Zellen
handelt, die bei ihrem ersten Antigenkontakt lediglich IL-2 produzieren. Diese
Vorläuferzellen differenzieren dann unter kurzfristiger Stimulation weiter in Th0-Zellen
und intermediäre Zellen mit anderen Zytokinmustern, welche noch nicht näher bekannt
sind. Erst bei wiederholter und anhaltender Stimulation entwickeln sich die Th1- und Th2Subpopulationen [17].
In vitro Studien neueren Datums kamen bezüglich der funktionellen Reife neonataler TZellen zu kontroversen Ergebnissen. Einige haben gezeigt, daß CD45RA+ (naive) TZellen nur dürftig auf spezifische Antigene antworteten [88] und auch keine Hilfe bei der
Antikörpersynthese in B-Zellen darstellten, während die CD45R0+ (Memory)T-Zellen im
Gegensatz
hierzu
ausgeprägt
auf
spezifische
Antigene
reagierten
und
die
Antikörpersynthese der B-Lymphozyten unterstützten [20; 89]. Es ließ sich nachweisen,
daß die Anzahl der CD45RA+ Zellen im Nabelschnurblut am höchsten ist und bis ins
Erwachsenenalter abnimmt [90-93].
Einige Untersucher schlossen hieraus, daß die
CD45RA+ Zellen die naiven ”Vorstufen” der CD45R0+ Zellen sind, und somit als
Indikator für die immunologische Naivität gelten können.
In der vorliegenden Arbeit wurden jedoch T-Zellen gefunden, welche IFN-γ und IL-10
produzierten und gleichzeitig das für naive Zellen typische CD45RA Oberflächenantigen
aufwiesen. Dies spricht eher gegen die von Mosmann und auch anderen Autoren
aufgestellte Hypothese, daß naive T-Zellen als immuninkompetent anzusehen sind. Es ist
vielmehr zu anzunehmen, daß die naiven T-Zellen bereits eine Rolle in den frühen Phasen
der Immunantworten spielen.
Auf potentielle quantitative Unterschiede zwischen der IL-10 und IFN-γ Synthese in
naiven gegenüber Memory T-Zellen soll im Folgenden eingegangen werden.
59
Unter den neonatalen Memory T-Helferzellen fanden sich nach spezifischer
Antigenstimulation mit β-Laktoglobulin mehr IL-10 als IFN-γ positive Zellen
Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß die neonatalen CD4 CD45R0+ Zellen nach
Stimulation mit dem Milcheiweiß β-Laktoglobulin sowohl IFN-γ als auch IL-10
synthetisieren. Auffallend war jedoch, daß die Prozentzahl der IL-10 positiven Zellen bei
Geburt mit bis zu 13,06% (in der Gruppe der Kinder mit spezifischem IgE) deutlich höher
lag als die Zahl der IFN-γ positiven Zellen mit einem Median von 3,23% in der gleichen
Gruppe. Diese Differenz in der intrazellulären Zytokinproduktion blieb nahezu über das
gesamte erste Lebensjahr bestehen und näherte sich erst nach einem Jahr einander an: der
Anteil an IL-10 positiven Memory Zellen lag nach zwölf Monaten zwischen 0,8 und 1,5%,
der Anteil an IFN-γ positiven Memory T-Zellen zwischen 0,49 und 0,56%.
Die aufgezeigte verminderte neonatale IFN-γ Synthese steht in Übereinstimmung mit
verschiedenen anderen Studien, die eine signifikant geringere IFN-γ Produktion (z. B.
induziert durch die Mitogene PHA und OKT 3) bei Neugeborenen im Vergleich zu
Erwachsenen feststellten [24; 94-98]. So geht beispielsweise Frenkel davon aus, daß sich
die kindlichen IFN-γ Werte erst in einem Alter von ca. vier Jahren denen der Erwachsenen
angleichen [99]. Andere Autoren fanden in den neonatalen Zellen nicht nur ein
vermindertes IFN-γ sondern auch eine deutlich reduzierte [69; 100] bis zu einer fehlenden
IL-4 Synthese nach Antigenprovokation [101].
Die reduzierte IFN-γ Synthesekapazität der kindlichen mononukleären Zellen fällt nun
genau in einen Zeitraum -nämlich die ersten Lebenswochen und -monate- , in denen sich
sowohl der Gastrointestinal- als auch der Respirationstrakt vermehrt mit Umweltantigenen
auseinandersetzt. Das sich zu diesem wichtigen Zeitpunkt etablierende (vorherrschende)
Zytokinmilieu spielt eine entscheidende Rolle, ob sich später eine allergische Erkrankung
auszubilden vermag. Es werden verschiedene Theorien über die Ursache der verminderten
neonatalen IFN-γ Produktion diskutiert.
Bekannt ist, daß IFN-γ ausschließlich von T-Zellen und natural-killer-(NK-)Zellen
produziert wird, wobei ”ruhende NK-Zellen” eine effizientere Synthese aufweisen [102;
103]. Manetti konnte 1993 zeigen, daß IL-12 für eine optimale IFN-γ Produktion sowohl in
T-Zellen als auch in NK-Zellen notwendig ist. IL-4 und IL-10 unterdrücken wiederum die
Bildung von IL-12 [104], so daß auf diesem Weg die IFN-γ Synthese inhibiert werden
60
kann [105]. Mehrere Arbeiten weisen jedoch darauf hin, daß IL-4 im Neugeborenen- und
Säuglingsalter selbst nach Stimulation mit PHA, PMA, Ionomycin und anti-CD3 nicht
nachweisbar ist [96; 106]. Dies legt die Vermutung nahe, daß IL-10, welches ja bereits in
den neonatalen T-Helferzellen in beträchtlichen Mengen vorlag, zu der Reduktion der
IFN-γ positiven T-Zellen beigetragen haben könnte.
Die Tatsache, daß sowohl die Atopiekinder als auch die Kinder der Kontrollgruppe mehr
IL-10 als IFN-γ positive Memory T-Zellen bei Geburt besitzen, und somit ein
Ungleichgewicht zugungsten allergiefördernder Th2 Zellen besteht, erscheint zunächst
ungewöhnlich. Eine mögliche Erklärung bietet ein von Prescott et al. vorgestelltes Modell,
in dem bei Atopikern und Nicht-Atopikern bereits pränatal ein Überwiegen der Th2
polarisierten Zytokinmuster besteht. In den folgenden Lebenswochen soll es jedoch unter
den gesunden Kindern zu einer Herabsetzung der Th2 Gewichtung, unter den erkrankten
zu einer Verstärkung des allergietriggernden Milieus kommen [107; 108].
Um diese Hypothese genauer zu hinterfragen, soll im Folgenden der Verlauf der IFN-γ
Synthese in naiven sowie in Memory T-Zellen während der ersten zwölf Lebensmonate
betrachtet werden. Besonderes Interesse galt der Frage, ob sich ebenso gravierende
Unterschiede in der Anzahl der IFN-γ positiven Zellen bei dem Vergleich der atopisch
erkrankten gegenüber den diesbezüglich gesunden Kindern nachweisen lassen, wie bereits
für die IL-10 Synthese erläutert.
Während des gesamten ersten Lebensjahres findet sich kein Unterschied in der IFN-γ
Produktion zwischen Kindern mit und solchen ohne eine allergische Sensibilisierung
am Ende des ersten Lebensjahres
IFN-γ stellt, wie bereits erläutert, eines der „Schlüsselzytokine” bei der Ausdifferenzierung
der naiven T-Vorläuferzellen in allergieprotektive Th1-Zellen dar. Bei Erwachsenen mit
atopischer Dermatitis konnte in vitro bereits mehrfach eine reduzierte IFN-γ Sekretion
nachgewiesen werden [109-111]. Da IFN-γ zu einer Hemmung der IgE Synthese führt,
wurde bisher angenommen, daß ein vermindertes IFN-γ über konsekutiv erhöhte IgE
Spiegel entscheidend zu der Manifestation atopischer Krankheitsbilder beiträgt.
Es ergab sich nun die Frage, ob Kinder mit einer Atopie während ihres ersten Lebensjahres
auch tatsächlich eine verminderte IFN-γ Synthese besitzen.
61
Um zur Beantwortung dieser Frage beizutragen, wurde in der vorliegenden Arbeit die IFNγ Synthese von Kindern mit einer allergischen Sensibilisierung am Ende des ersten
Lebensjahres bei Geburt, im Alter von sechs Wochen, sechs Monaten und einem Jahr mit
der von Säuglingen ohne eine Sensibilisierung verglichen.
Es stellte sich heraus, daß zu keinem der Untersuchungszeitpunkte ein signifikanter
Unterschied im Anteil an IFN-γ produzierenden T-Zellen zwischen den Kindern mit einer
allergischen Sensibilisierung im Alter von zwölf Monaten und der Kontrollgruppe ohne
eine Sensibilisierung bestand.
Dieses Ergebnis erscheint in Anbetracht des Mosmannschen Zytokinmodelles und der
oben genannten Studienresultate zunächst überraschend. Aufgrund der bekannten Th1typischen und somit allergieprotektiven Eigenschaften des IFN-γ würde man annehmen,
daß die Kinder ohne eine allergische Sensibilisierung mehr IFN-γ bilden als solche mit
einem atopischen Krankheitsbild. Umgekehrt wäre zu erwarten, daß die erkrankten Kinder
(mit nachweisbarem spezifischen IgE am Ende des ersten Lebensjahres) ein IFN-γ armes,
dafür jedoch ein allergieförderndes Milieu mit Überwiegen der Th2-spezifischen Zytokine
wie IL-4, IL-5 und IL-10 aufweisen.
Verschiedene Studien, die sich ebenfalls mit der IFN-γ Synthese bei Kindern
beschäftigten, erbrachten unterschiedliche Ergebnisse. Rinas fand beispielsweise 1993 eine
signifikant geringere IFN-γ Produktion durch mononukleäre Zellen bei Neugeborenen mit
einer atopischen Familienanamnese. Man schloß daraus, daß bei den sogenannten
Risikokindern wahrscheinlich bereits zum Zeitpunkt der Geburt eine Dysfunktion der TZellen besteht, welche zu abweichenden Immunantworten und konsekutiv zur Ausbildung
eines atopischen Krankheitsbildes führen können [96].
In einer von Jill Warner durchgeführten prospektiven Studie konnten ebenfalls relevante
Unterschiede in der Zytokinbildung aufgezeigt werden [112]: sie stellte bei Kindern,
welche im Laufe des ersten Lebensjahres ein nahrungsmittelbedingtes Ekzem
entwickelten, eine signifikant geringere IFN-γ Synthese nach β-Laktoglobulin Stimulation
zum Zeitpunkt der Geburt fest als bei Kindern ohne Symptome. Ein ähnliches Ergebnis
zeigte sich auch nach der Stimulation mit Ovalbumin. Außerdem war eine signifikant
höhere T-Zellaktivität in Form einer vermehrten Proliferation bei den Neugeborenen,
welche ein nahrungsmittelbedingtes Ekzem entwickelten, zu beobachten im Vergleich zu
62
denen mit einem nahrungsmittelunabhängigen Ekzem. Besonders interessant ist auch die
Tatsache, daß diese Unterschiede nicht nach einer Stimulation der mononukleären Zellen
mit Fel d Ι, einem aus Katzenhaar gewonnenen Allergen, auftraten. Dieses Ergebnis legt
zwei Thesen nahe: einerseits scheint bereits zum Zeitpunkt der Geburt eine allergische
Sensibilisierung gegenüber Nahrungsmittelallergenen, wie bespielsweise Kuhmilchproteinen, vorzuliegen; außerdem scheint bei den Kindern mit einer atopischen Erkrankung
schon bei Geburt ein anderes Zytokinmuster vorzuherrschen als bei gesunden Kindern.
Dies führte zu der Hypothese, daß ein pathologisches Zytokinmilieu nicht als Folge eines
atopischen Krankheitsbildes zu sehen ist, sondern dessen Ursache darstellt. Auf beide
Vermutungen wird im weiteren noch unter Berücksichtigung der IL-10 Synthese der
kindlichen T-Helferzellen genauer eingegangen werden.
Die Tatsache, daß in der vorliegenden Arbeit kein signifikanter Unterschied in der IFN-γ
Produktion der beiden Kindergruppen gefunden wurde, liegt möglicherweise darin
begründet, daß hier intrazelluläres IFN-γ, und nicht wie in der Studie von Warner, IFN-γ in
den Zellüberständen gemessen wurde.
Eine Untersuchung von Tang et al. weist in die gleiche Richtung: Kinder mit atopischer
Dermatitis zeigten nach Stimulation eine signifikant geringere IFN-γ Sekretion im
Vergleich zu den gesunden Kontrollkindern, bei dem prozentualen Anteil an IFN-γ
produzierenden Zellen gab es jedoch keinen Unterschied zwischen beiden Gruppen [113].
Dies läßt die Schlußfolgerung zu, daß das bei atopisch erkrankten Kindern verminderte
IFN-γ nicht in einem Mangel an IFN-γ synthetisierenden Zellen, sondern wohl eher in
einem intrisischen Defekt in der Sekretion begründet ist. Diese Hypothese würde auch
erklären, warum die vorliegenden Ergebnisse keine signifikante Differenz in der Anzahl
von IFN-γ positiven Memory-Zellen zwischen Säuglingen mit und ohne eine allergische
Sensibilisierung aufweisen. Ebenso sollte bedacht werden, daß IFN-γ hauptsächlich von
NK-Zellen produziert wird [100; 101], deren Synthese in der vorliegenden Arbeit nicht
betrachtet wurde. Hinweise auf eine verminderte Anzahl von neonatalen NK-Zellen bei
Atopierisikokindern mit einer konsekutiv reduzierten IFN-γ Produktion liegen bereits vor
[114].
Untersuchungen, die sich einerseits mit der quantitaven Messung der IFN-γ Sekretion nach
Stimulation mit einem spezifischen Allergen und andererseits mit der Zytokinsynthese der
NK-Zellen beschäftigen, müßten zur Bestätigung dieser Annahmen folgen.
63
Es besteht bereits zum Zeitpunkt der Geburt eine Sensibilisierung gegen
Nahrungsallergene
Um der Frage nachzugehen, wie die T-Zellen Neugeborener und Säuglinge auf
Nahrungsallergene reagieren, wurde die Zytokinproduktion in naiven und Memory THelferzellen nach Stimulation mit β-Laktoglobulin -einem der Hauptallergene der Milchuntersucht. Es zeigte sich, daß bereits im Nabelschnurblut eine deutliche Immunantwort
(in Form einer vermehrten IL-10 Synthese) auf das Milcheiweiß nachzuweisen ist. Dabei
sollte zwei Tatsachen besondere Bedeutung beigemessen werden:
1. Die Prozentzahl der IL-10 positiven CD4CD45R0+ (Memory) T-Zellen nach
Antigenstimulation war bei Geburt und in den ersten Lebenswochen und -monaten am
höchsten und nahm im weiteren bis zum Ende des ersten Lebensjahres auf einen Wert von
etwa einem Prozent ab.
2. Es ließen sich bereits im Nabelschnurblut signifikante Unterschiede in der ZytokinProduktion aufzeigen zwischen Säuglingen, welche im Alter von einem Jahr spezifisches
IgE als Zeichen einer späteren Atopie boten, und den Kontrollgruppenkindern.
Daß vor der ersten oralen Milchzufuhr eine β-Laktoglobulin-spezifische Immunreaktion in
den neonatalen T-Zellen ausgelöst werden konnte, deutet auf eine bereits zum Zeitpunkt
der Geburt bestehende Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelallergene hin.
Die Basis des Wiedererkennens eines Antigens liegt in dem selektiven klonalen Wachstum
von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten. Das heißt, eine vermehrte spezifische T-ZellProliferation nach Antigen-Stimulation weist auf einen bereits stattgehabten Kontakt
zwischen dem Antigen und den T-Zellen hin (sog. ”Priming”). Die Klasse der in diesen
Vorgang involvierten T-Helferzellen (Th1 oder Th2) bestimmt dann den Typ der
Immunantwort.
In der vorliegenden Arbeit folgte auf die β-Laktoglobulin Stimulation sowohl eine
Differenzierung in IFN-γ positive (Th1-Zellen) als auch in IL-10 positive (Th2-) Zellen. Es
wäre folglich durchaus möglich, daß vor dem ersten postnatalen bereits ein ”in uteroKontakt” mit dem jeweiligen Peptid bzw. Protein stattgefunden hat. In dieser Studie deuten
sowohl die T-Zellaktivierung in Form der IL-10 Synthese als auch die bereits im
Nabelschnurblut vorhandenen Memory T-Zellen darauf hin. Verschiedene Studien, die
64
eine Proliferation der neonatalen T-Zellen nach Stimulation mit β-Laktoglobulin fanden,
diskutierten ebenfalls einen pränatalen Allergenkontakt als mögliche Ursache [43; 112;
115].
Sollte tatsächlich ein in utero-priming der T-Zellen stattfinden, so stellt sich die Frage, wie
das foetale Immunsystem auf lediglich saisonal präsente Allergene reagiert. Picinni et al.
gingen dieser Frage nach und fanden heraus, daß Lol p 1, ein Allergen des Roggengrases,
nur zu einer geringen und gelegentlichen (nicht persistierenden) Proliferation der
mononukleären Zellen führt. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine starke, konstante
Proliferation nach Stimulation mit Der p 1, dem Hauptallergen der Hausstaubmilbe. Diese
Resultate legen die Vermutung nahe, daß der Antigen- bzw. Allergenkontakt der Mutter
während der Schwangerschaft mitverantwortlich ist für einen möglichen pränatalen
Allergenkontakt des Foeten [116]. Ob letztendlich tatsächlich ein ”in utero-priming” mit
Antigenen bzw. Allergenen stattfindet, und welche Rolle es bei der Entstehung von
atopischen Krankheitsbildern spielt, kann erst durch weitere Untersuchungen mit letzter
Sicherheit geklärt werden.
Auch Szepfalusi et al. gelang es 1997, zwar eine bevorzugte Wiedererkennung bestimmter
Antigene (z.B. von β-Laktoglobulin und α-Casein) durch die Nabelschnurblut T-Zellen
nachzuweisen, es fand sich jedoch kein Unterschied zwischen den atopiegefährdeten
Neugeborenen und der Gruppe ohne ein Atopierisiko.
Im Gegensatz dazu zeigt diese Arbeit nicht nur eine ausgeprägte Reaktion auf den
Stimulus β-Laktoglobulin sondern auch zum ersten Mal nach Stimulation eine signifikant
höhere Prozentzahl an IL-10 positiven Memory T-Zellen bei Kindern, die später im Alter
von zwölf Monaten spezifisches IgE gegen Inhalations- und/oder Nahrungsallergene als
Ausdruck eines atopischen Krankheitsbildes gebildet hatten, im Vergleich zu den Kindern
ohne spezifisches IgE.
Die bereits oben diskutierten Ergebnisse lassen daher folgende Schlußfolgerung zu:
65
Die β-Laktoglobulin induzierte IL-10 Synthese in neonatalen Memory T-Helferzellen
kann als prädiktiver Wert für die spätere Manifestation atopischer Erkrankungen
gelten
Bisher galt die Bestimmung des Nabelschnurblut IgE-Wertes als einziger prädiktiver
Parameter für die mögliche spätere Manifestation einer atopischen Erkrankung, welcher
zum Zeitpunkt der Geburt gemessen werden konnte. Da er zwar über eine hohe Spezifität,
jedoch nur eine geringe Sensitivität verfügt, ist seine Aussagefähigkeit deutlich begrenzt
(s. auch noch folgende Erläuterungen). Es stellte sich daher mehr und mehr die Frage, ob
nicht andere ”Indikatoren” verläßlichere Hinweise auf die Entwicklung allergischer
Krankheiten geben können.
Der Nachweis von spezifischem IgE im Alter von zwölf Monaten wird als positiver
prädiktiver Parameter angesehen für eine später auftretende allergische Sensibilisierung
gegen Allergene, welche zur Entwicklung von atopischen Krankheiten, wie z. B.
allergischem Asthma, führen. Nickel et al. konnten beispielsweise 1997 aufzeigen, daß bei
Kindern das Auftreten von spezifischem IgE gegen Hühnereiweiß im Alter von einem Jahr
zusammen mit einer positiven atopischen Familienanamnese eine hohe Spezifität (99%)
und einen positiven prädiktiven Wert (78%) für die Entwicklung einer Sensibilisierung
gegen inhalative Allergene im Alter von drei Jahren darstellt [117; 118].
Um eine allergische Sensibilisierung der Studienkinder im Alter von einem Jahr
nachzuweisen, wurde zu diesem Zeitpunkt im Serum spezifisches IgE gegen inhalative
Allergene (Roggen, Beifuß, Birke, Dermatophagoides pteronyssinus, Cladosporium
herbarum, Hunde- und Katzenhaare), Nahrungsmittelallergene (Hühner- und Milcheiweiß,
Weizenmehl, Erdnuß, Soja, Fisch) und IgE gegen β-Laktoglobulin bestimmt. Diese
Untersuchung konnte bei 52 Säuglingen durchgeführt werden. Es erfolgte so die Zuteilung
in die Gruppe mit einer Sensibilisierung (n=12) und ohne Sensibilisierung (n=40). Es kann
davon ausgegangen werden, daß die Säuglinge mit spezifischem IgE in den folgenden
Monaten bzw. Jahren eine manifeste Atopie entwickeln werden. Dies belegten auch
Arbeiten jüngeren Datums [39; 40]: Der Nachweis von spezifischem IgE gegen
Nahrungsmittelallergene ist signifikant mit dem Auftreten von atopischer Dermatitis,
Nahrungsmittelallergien und allergischen Atemwegserkrankungen vergesellschaftet. Dabei
scheint die Dauer der Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelantigene von entscheidender
66
Bedeutung zu sein. Kulig et al. fanden heraus, daß Kinder, welche eine langanhaltende
Sensibilisierung (ein Jahr und länger) aufwiesen, ein mehr als dreifach größeres Risiko
besaßen, an allergischer Rhinitis zu erkranken, und ein mehr als fünffach höheres Risiko,
ein allergisches Asthma zu entwickeln, als Kinder mit einer lediglich kurzfristigen
Sensibilisierung [119].
Im Rahmen dieser Studie konnte nun erstmals aufgezeigt werden, daß sich Kinder mit
einer allergischen Sensibilisierung signifikant durch eine höhere Anzahl an IL-10 positiven
Memory T-Zellen im Nabelschnurblut von den nicht sensibilisierten Kindern
unterscheiden. Diese Ergebnisse deuten einerseits darauf hin, daß die β-Laktoglobulin
induzierte IL-10 Produktion in den neonatalen CD4 CD45R0+ Zellen als prädiktiver
Parameter in Bezug auf eine spätere allergische Sensibilisierung und damit auf eine
atopische Erkrankung angesehen werden kann. Nach einer Vereinfachung und
Standardisierung der beschriebenen Meßmethoden könnte so potentiell ein AtopieScreening für Neugeborene entwickelt werden, welches lediglich geringe Mengen
Nabelschnurblutes erfordert.
Andererseits könnte es mit Hilfe der oben beschriebenen Methoden möglich sein, bereits
zum Zeitpunkt der Geburt spezifische Antigene/Allergene zu identifizieren, welche
während der ersten, das Immunsystem prägenden Lebenswochen und -monate vermieden
werden sollten, um die Manifestation einer allergischen Erkrankung zu verhindern. Es
könnten so beispielsweise unterschiedliche Nahrungsbestandteile getrennt bezüglich ihrer
Allergenpotenz getestet werden.
Diese Hypothese steht im Einklang mit einer Untersuchung von Warner et al., die
Unterschiede fanden in der IFN-γ Synthese der mononukleären Nabelschnurblutzellen
ebenfalls nach Stimulation mit β-Laktoglobulin zwischen Kindern, die während des ersten
Lebensjahres ein atopisches Ekzem entwickelten, und Kindern ganz ohne Symptome
[112]. Man schloß aus dieser Beobachtung, daß die Wahrscheinlichkeit des Auftretens
einer Nahrungsmittel induzierten atopischen Dermatitis schon zum Zeitpunkt der Geburt
mittels der β-Laktoglobulin spezifischen Immunantwort ermittelt werden kann.
Weitere Studien mit anderen Allergenprovokationen und auch größeren Fallzahlen sind
jedoch von Nöten, um die aufgestellten Hypothesen zu stützen.
67
Die Familienanamnese bezüglich Atopien und der Nabelschnurblut IgE-Wert können
nur bedingt als prädiktive Faktoren für die spätere Entwicklung einer atopischen
Erkrankung gelten
Vorangegangene Studien älteren Datums gaben Anlaß zu der Annahme, daß ein erhöhtes
Nabelschnurblut IgE auch ein größeres Risiko bedeutet, zu einem späteren Zeitpunkt an
einer Atopie zu erkranken [120-123]. Die Relevanz dieses Parameters als prädiktiver
Faktor für atopische Krankheiten wurde jedoch in der letzten Zeit desöfteren in Frage
gestellt, da er zwar eine hohe Spezifität besitzt (92% bzw. 94%), seine Sensitivität aber
relativ gering ist (8,5% bzw. 26%) [124; 125]. Eine Arbeit von Eiriksson et al. zeigte
sogar, daß der IgE-Wert im Nabelschnurblut mit zunehmendem Gestationsalter ansteigt
und somit nicht allein als Vorhersageparameter für allergische Erkrankungen zu werten ist
[126]. Um eine bessere Sensitivität zu gewährleisten, wird daher in den meisten
Untersuchungen die atopische Familienanamnese als zusätzliches Kriterium für ein
potentielles Atopierisiko herangezogen [127-129].
Es stellte sich nun auch in der vorliegenden Studie die Frage, inwieweit ein erhöhter
Nabelschnurblut IgE-Wert und/oder eine atopische Familienanamnese die Manifestation
einer allergischen Sensibilisierung im Alter von zwölf Monaten (in Form eines
spezifischen IgE gegen Inhalations- und/oder Nahrungsallergene) vorherzusagen vermag.
Um die Studienkinder einer sogenannten Risiko- und einer risikofreien Gruppe zuordnen
zu können, wurde daher zunächst bei den 52 untersuchten Neugeborenen der
Nabelschnurblut IgE-Wert bestimmt. Lag das IgE über 0,9 kU/l und/oder ergab sich eine
positive Familienanamnese, so erfolgte die Zuordnung in die Atopierisikogruppe. Die
Befragung der Eltern wurde nach einem validierten Fragebogen der Multizentrischen
Atopiestudie (=MAS; s. Anhang) vorgenommen. Es erfolgte dann die Korrelation der
Merkmale ”Risiko vorhanden”, ”Mutter Allergie” und ”Vater Allergie” mit der Bildung
von spezifischem IgE im Alter von einem Jahr. Dabei konnten 83% der Kinder, welche mit
zwölf Monaten spezifisches IgE entwickelten, bereits bei Geburt der Atopierisikogruppe
zugeordnet werden, in der Gruppe der Säuglinge ohne spezifisches IgE waren es immerhin
auch noch 72,5%. Größere Differenzen ergaben sich erst bei dem Vergleich der elterlichen
Allergieanamnesen: die Hälfte der Kinder mit allergischer Sensibilisierung hatten eine
Mutter mit einer Allergie, 42% von ihnen einen allergisch erkrankten Vater.
68
Von den nicht sensibilisierten Säuglingen wiesen nur noch ca. 38% eine allergiekranke
Mutter, etwa 33% einen Vater mit einer solchen Erkrankung auf. Trotz dieser
Unterschiede ließ sich jedoch bei keinem der überprüften Parameter eine positive
Korrelation nachweisen.
Des weiteren wurden die oben genannten drei ”Merkmale” mit dem Auftreten von
allergischen Symptomen während des ersten Lebensjahres korreliert. Es zeigte sich, daß
die symptomatischen Kinder signifikant häufiger Mütter mit einer allergischen Erkrankung
besaßen als die symptomlosen Kinder. Auch litten diese Mütter signifikant häufiger unter
atopischer Dermatitis und allergischem Asthma. Unter den Vätern der Kinder mit
Symptomen fanden sich signifikant mehr mit allergischer Rhinitis und allergischem
Asthma.
Die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen in der Gruppe der Kinder mit spezifischem IgE
und der der Säuglinge mit allergischen Symptomen erscheint auf den ersten Blick
überraschend. Eine Erklärung hierfür könnte in der Tatsache liegen, daß die beobachteten
Symptome während des ersten Lebensjahres trotz gründlicher Untersuchung und
Einhaltung strenger Kriterien (Kriterien der Neurodermitis nach Hanifin) noch relativ
unspezifisch sind [130]. Erst längere Untersuchungszeiträume (über mehrere Jahre)
können eine eindeutige Zuordnung der aufgetretenen Beschwerden zu allergisch bedingten
Symptomen sichern. Es ist folglich davon auszugehen, daß Ergebnisse bezüglich der
Korrelation der Einflußfaktoren mit dem Auftreten von spezifischem IgE eher den
Anspruch auf Richtigkeit erheben als die Korrelation mit der fraglichen Manifestation
allergischer Symptome. Im Folgenden werden daher die möglichen Einflußfaktoren im
Hinblick auf die Entwicklung einer allergischen Sensibilisierung mit einem Jahr diskutiert.
Zusammenfassend kann aufgrund der oben dargestellten Ergebnisse davon ausgegangen
werden, daß zwar Kinder mit einer atopischen Erkrankung häufiger einen erhöhten
Nabelschnurblut IgE-Wert und/oder eine positive Familienanamnese aufweisen als
gesunde Kinder; umgekehrt können diese beiden Parameter aber nur bedingt als prädiktive
Faktoren für eine spätere Atopiemanifestation genutzt werden.
69
Bedeutung unterschiedlicher Einflußfaktoren für die Entwicklung einer
allergischen Sensibilisierung im Alter von einem Jahr
Die Genese der allergischen Erkrankungen kann als multifaktoriell bezeichnet werden. Die
Krankheitsmanifestation hängt einerseits von genetischen, andererseits von sogenannten
Umweltfaktoren ab. Zu den äußeren Einflußfaktoren zählen neben klimatischen und
psychologischen
Faktoren
vor
allem
auch
die
Belastung
durch
Luft-
und
Nahrungsallergene. Publikationen über die Gewichtung der unterschiedlichen Faktoren
erbrachten immer wieder kontroverse Ergebnisse.
Die bisherigen Erläuterungen haben noch einmal verdeutlicht, welche prägnante Rolle
gerade die ersten Wochen und Monate im Leben eines Säuglings spielen für die
Entwicklung des kindlichen Immunsystems, da sich in dieser Zeit das noch unreife
Immunsystem vermehrt mit Umweltallergenen auseinandersetzen muß. Es finden sich
sowohl klinische als auch experimentelle Hinweise darauf, daß die äußeren Bedingungen,
unter denen es zum Antigen-/Allergenkontakt kommt, einen Einfluß auf die weiteren
Reaktionen besitzen [131].
Bei gesunden Kindern kommt es zur Proliferation von Memory-Zellen, welche
vornehmlich Th1-typische Zytokine sezernieren und damit das Wachstum von
allergiefördernden Th2-Zellen hemmen. Dieser Weg der Immunantwort wird aber nicht
immer eingeschlagen. Bei etwa 20% der Kinder findet nach dem Allergenkontakt eine
vornehmliche Proliferation von Th2-Zellen statt, und es entwickeln sich allergische
Reaktionen, welche durch die Synthese von IgE gekennzeichnet sind.
Zur Klärung der Frage, welche vermeintlichen Risikofaktoren die Entstehung einer allergischen Sensibilisierung und damit die Manifestation einer Atopie begünstigen, wurden in
der vorliegenden Arbeit vornehmlich das Wohnumfeld der Säuglinge, der soziale Status
der Familie, die Ernährung der Säuglinge während des ersten Lebensjahres und die
Exposition gegenüber Tabakrauch untersucht.
70
Es ließ sich keine positive Korrelation zwischen einer prä- und postnatalen Tabakrauchexposition und einer allergischen Sensibilisierung am Ende des ersten
Lebensjahres aufzeigen
Tabakrauch gehört zu den häufigsten inhalativen Noxen, denen Kinder in vielen Fällen
sogar schon vor ihrer Geburt ausgesetzt sind. Bisher wurde oftmals angenommen, daß
Passivrauchen (in Kombination mit anderen Umweltfaktoren) bei Kindern die Inzidenzrate
von atopischen Erkrankungen, hierunter vor allem von allergischem Asthma, steigere [132;
133]. Da seit ca. 30 bis 40 Jahren die Anzahl der rauchenden Frauen und somit auch die
der rauchenden Mütter kontinuierlich gewachsen ist, wurde dieser Umstand vielfach
angeschuldigt, zumindest in geringem Ausmaß, zu einem Prävalenzanstieg der Atopien
beigetragen zu haben.
Es wurde in der vorliegenden Arbeit sowohl die prä- als auch die postnatale
Rauchexposition untersucht, wobei jedoch keine getrennte Betrachtung der beiden
Einflußvariablen erfolgte. Die so gewonnenen Ergebnisse können die oben genannte
Hypothese nicht unterstützen. Unter den Müttern von Kindern mit allergischen
Symptomen rauchten zwar deutlich mehr als in der Gruppe der Mütter mit diesbezüglich
unauffälligen Kindern, dieser Unterschied stellte sich jedoch nicht als signifikant heraus.
Ein ähnliches Ergebnis fand sich auch bei dem Vergleich der Säuglinge mit und ohne
spezifisches IgE gegen Nahrungs- und Inhalationsallergene im Alter von zwölf Monaten.
Bereits in einer vor mehr als zehn Jahren veröffentlichten Arbeit mit 191 teilnehmenden
Kindern im Alter zwischen zwei und 17 Jahren war die Wirkung des Passivrauchens auf
das Gesamt-IgE wie auch auf die Bildung von spezifischem IgE gegen inhalative
Allergene untersucht worden [134]. Die Ergebnisse zeigten jedoch ebenfalls keinen
Zusammenhang
zwischen
der
Tabakrauchexposition
und
einer
allergischen
Sensibilisierung bei den untersuchten Kindern bzw. Jugendlichen.
Im Gegensatz hierzu weisen verschiedene andere Studien auf eine kausale Verknüpfung
zwischen mütterlichem Rauchen und einem Prävalenzanstieg von Asthma bei deren
Kindern hin [133; 135-137], wobei das Risiko einer Krankheitsmanifestation mit
zunehmender Expositionsdauer ansteigen soll [135; 138-140]. Auch Arshad et al. fanden
heraus, daß elterliches Rauchen einen signifikanten Risikofaktor für die Entwicklung von
Allergien in den ersten zwölf Lebensmonaten eines Kindes darstellt [141].
71
Eine neuere Studie von Kulig [37; 142] untersuchte den Effekt von prä- und postnataler
Tabakrauchexposition auf die Bildung von spezifischem IgE gegen Nahrungs- und
Inhalationsallergene während der ersten drei Lebensjahre. Dabei zeigte sich, daß Kinder,
welche sowohl prä- als auch postnatal dem Rauch ausgesetzt waren, ein signifikant
höheres Risiko hatten, innerhalb der ersten drei Lebensjahre eine allergische
Sensibilisierung gegen Nahrungsmittelallergene zu entwickeln, als die nicht exponierten
Kinder. Für die Sensibilisierung gegenüber inhalativen Allergenen wurde dieser
Unterschied interessanterweise nicht beobachtet.
Die Tatsache, daß sich in der vorliegenden Arbeit keine positive Korrelation zwischen
einer
prä-
und/oder
postnatalen
Tabakrauchbelastung
und
einer
allergischen
Sensibilisierung nachweisen ließ, könnte einerseits darin begründet liegen, daß die Kinder
über einen relativ kurzen Zeitraum -nämlich die ersten zwölf Lebensmonate- untersucht
worden sind, und nicht wie in den oben aufgeführten Arbeiten über mehrere Jahre hinweg.
So bestimmte beispielsweise Kulig das spezifische IgE gegen gängige Allergene nicht nur
am Ende des ersten sondern auch des zweiten und des dritten Lebensjahres [37; 142]. Es
ist daher anzunehmen, daß dies konsekutiv zu einer präziseren Bestimmung der
tatsächlichen Atopieinzidenz führte.
Letztlich stellt sich außerdem die Frage, welche Rolle die pränatale Tabakrauchexposition
bei der Entstehung von atopischen Krankheitsbildern spielt. Magnusson et al. wiesen 1986
beispielsweise höhere Nabelschnurblut IgE-Werte bei Neugeborenen nach, deren Mütter
während der Schwangerschaft geraucht hatten, im Vergleich zu den Kindern von
Nichtraucherinnen [143]. Da erhöhte Nabelschnurblut IgE-Werte jedoch, wie zuvor
erläutert, nicht zwangsläufig mit einer späteren Atopie assoziiert sind, ist die These, daß
eine pränatale Tabakrauchexposition allein zu einer erhöhten Atopieinzidenz führt, als
fragwürdig anzusehen.
Insgesamt betrachtet, scheinen weitere Untersuchungen bezüglich der Auswirkungen
sowohl der prä- als auch der postnatalen Rauchexposition von Nöten zu sein. Sollte sich
die allergiefördernde Wirkung des Passivrauchens bei Kindern bestätigen, wäre dies von
großer Bedeutung für mögliche Präventivmaßnahmen, da der Einflußfaktor ”Tabakrauch”
zu den gut zugänglichen und damit auch leichter vermeidbaren zählt.
72
Es besteht keine positive Korrelation zwischen einem gehobenen sozialen Status der
Familie und der Entwicklung einer atopischen Erkrankung bei dem jeweiligen Kind
Um das direkte Umgebungsumfeld der an dieser Studie teilnehmenden Kinder zu
beurteilen, wurde in der vorliegenden Arbeit bei jeder Familie das Alter der Wohnung, der
Fußbodenbelag (Teppich, Fliesen, Linoleum oder Parkett), eventueller Schimmelbefall der
Wohnung sowie der Schul- und Bildungsweg der Eltern dokumentiert. Außerdem wurde
die Haltung von Haustieren in der Wohnung festgehalten. Als Korrelationsparameter
wurde unter anderem der Sozialstatus der Familie gewählt, welcher sich aus dem
Bildungsstand der Eltern wie auch dem aktuellen Zustand des Wohnumfeldes
zusammensetzte.
Insgesamt lebten sieben der 52 partizipierenden Kinder in einem gehobenen sozialen
Umfeld (13,46%). Drei dieser Kinder gehörten zu der Gruppe mit spezifischem IgE (3/12=
25%), während vier zu der Gruppe ohne spezifisches IgE (4/40=10%) zählten.
Letztendlich konnte keine positive Korrelation zwischen einem gehobenen sozialen Status
und der Entwicklung einer allergischen Sensibilisierung im Alter von einem Jahr
aufgezeigt werden.
Dieses Ergebnis steht in Einklang mit einer Arbeit von Schäfer et al., welche ein Kollektiv
von 1273 Kindern im Alter zwischen fünf und sieben Jahren in verschiedenen deutschen
Städten im Hinblick auf die Manifestation einer atopischen Dermatitis untersuchten. Auch
sie fanden zwar eine höhere Prävalenz in der Kindergruppe, deren Eltern einen höheren
Bildungsstand erreicht hatten; doch auch hier konnte eine Multivarianzanalyse keine
signifikanten Unterschiede in Bezug auf die gesamte Studienpopulation, sondern lediglich
für eine Untergruppe in Duisburg-Süd aufdecken [144].
Interessanterweise hat sich gezeigt, daß die Prävalenz atopischer Erkrankungen in
Entwicklungsländern vom sozioökonomischen Stand der jeweiligen Region beeinflußt
wird. So fanden sich eher niedrige Prävalenzzahlen (z. B. für Asthma) in Ländern, deren
Einwohner ihre ursprüngliche, traditionelle, technisch eher primitive Lebensweise
beibehalten haben. Außerdem lag das Erstmanifestationsalter in den Entwicklungsländern
signifikant höher im Vergleich zu den Industrieländern [145].
73
Eine mögliche Ursache für die Prävalenzunterschiede könnte beispielsweise in den
verschiedenen Stillgewohnheiten liegen. In den sogenannten Entwicklungsländern wird
jeder Säugling sowohl aus ökonomischen als auch aus traditionellen Gründen möglichst
lange gestillt, während das Stillen in den industrialisierten Nationen nicht als Regelfall
angesehen werden kann. Als anderer potentieller Grund werden immer wieder die gerade
in Regionen mit einem niedrigen sozioökonomischen Standard auftretenden, parasitären
Infektionen (wie z. B. Wurminfektionen) diskutiert. Es wird vermutet, daß die durch eine
parasitäre Infektion induzierte IgE-Synthese die Produktion von IgE-Antikörpern gegen
übrige Allergene zu verhindern vermag.
Einige andere Arbeitsgruppen in Industrienationen konnten auch innerhalb ihrer Länder
feststellen, daß ein gehobener sozialer Status das Risiko, an einer Atopie zu erkranken,
erhöht [146; 147]. So fanden beispielsweise Peat et al. bei australischen Jungen aus einer
gehobenen sozialen Schicht eine erhöhte Asthmaprävalenz [146].
Daß die vorliegende Arbeit diese Thesen nicht unterstützt, könnte im Vergleich zu den
anderen Studien einerseits in der deutlich geringeren Fallzahl andererseits auch in dem
kürzeren Untersuchungszeitraum (ein Jahr in der vorliegenden Studie versus bis zu sieben
Jahren in den übrigen Publikationen) begründet sein. Des weiteren liegen unterschiedliche
Definitionen des Begriffes sozialer Status zugrunde. Einige Autoren verwendeten den
Bildungsstand der Eltern, andere das Bruttoeinkommen, die Wohnverhältnisse oder eine
Kombination mehrerer dieser Faktoren als Indikatoren.
Um den tatsächlichen Einfluß des sozialen Status, welcher sich in dieser Untersuchung aus
dem Bildungsstand der Eltern und dem Zustand des Wohnumfeldes zusammensetzt, auf
die Entwicklung einer Atopie bei Kindern beurteilen zu können, sollten prospektive
Untersuchungen über einige Jahre mit entsprechend großen Teilnehmerzahlen und vor
allem
exakt
definierten
Variablen
durchgeführt
werden.
Es
wäre
außerdem
empfehlenswert, die Einflußfaktoren ”Bildungsstand der Eltern” und ”Zustand der
Wohnung/ des Wohnumfeldes” getrennt voneinander zu untersuchen. Gerade auf die
häuslichen Verhältnisse sollte besonderes Augenmerk gelegt werden, da eine Arbeit
neueren Datums an einem Kollektiv von mehr als 1200 Kindern gezeigt hat, daß
wohnliche Mißstände wie Feuchtigkeit und Schimmel mit einer Sensibilisierung gegen
Hausstaubmilben, Katzenhaar und Beifußpollen verknüpft sind [148].
74
Eine kuhmilchfreie Ernährung wirkt sich positiv auf Kinder mit Atopierisiko aus
Seit mehr als achtzig Jahren werden nun schon die Zusammenhänge zwischen
Säuglingsnahrung, Nahrungsmittelallergenen und dem Auftreten von atopischen
Erkrankungen bei Kindern untersucht. Aber auch auf diesem Gebiet konnte bisher noch
kein Konsens herbeigeführt werden. Es sollte daher auch in dieser Arbeit der Frage
nachgegangen werden, ob die Ernährung während des ersten Lebensjahres auf die
Entwicklung allergischer Erkrankungen Einfluß nehmen kann, oder ob sie bei der Genese
eine eher untergeordnete Rolle spielt.
Zunächst fiel einmal auf, daß die Hälfte der Studienkinder (26/52) entweder nur maximal
vier Wochen oder gar nicht gestillt wurden. Etwa 30% der Säuglinge (16/52) wurden bis
zu sechs Monate vollgestillt. Acht Kinder (8/52= 15,38%) wurden bis zum Ende des ersten
Lebensjahres noch teilweise gestillt.
Interessanterweise ließ sich bei Säuglingen mit einem vorbestehenden Atopierisiko,
welche das gesamte erste Lebensjahr ohne Kuhmilchzusätze gefüttert worden waren (n=3),
im Alter von zwölf Monaten kein spezifisches IgE gegen Nahrungsmittel- oder
Inhalationsallergene nachweisen. Obwohl es sich hierbei um eine kleine Fallzahl handelt,
könnte das Ergebnis doch darauf hinweisen, daß eine kuhmilchfreie Ernährung während
der ersten zwölf Lebensmonate die Entwicklung einer ”normalen”, Th1-gerichteten
Immunlage gerade bei Atopierisikokindern begünstigt.
In Übereinstimmung mit den oben präsentierten Ergebnissen konnten zahlreiche Studien
auch anhand von größeren Kindergruppen aufzeigen, daß eine ausschließliche Ernährung
mit Muttermilch für mindestens die ersten drei, vier bzw. sechs Lebensmonate
(unterschiedliche Angaben in den einzelnen Arbeiten) bei Säuglingen mit einem
Erkrankungsrisiko einen atopieprotektiven Effekt besitzt [138; 149-152].
Abschließend ist als Resümee festzustellen, daß letztendlich der Manifestation einer
atopischen Erkrankung eine multifaktorielle Genese (Umweltbedingungen, genetische
Aspekte) zugrunde liegt, und nicht die Vermeidung eines einzelnen vermeintlichen
Risikofaktors die Ausbildung der Krankheit zu verhindern vermag. Um eine exakte
Gewichtung der unterschiedlichen Einflußparameter vorzunehmen, bedarf es, wie zuvor
erläutert, weiterer prospektiver Studien mit großen Fallzahlen und der Beobachtung über
ein längeres Zeitintervall.
75
6 Zusammenfassung
Es liegen bereits zahlreiche Studien vor, welche sich mit der Genese atopischer
Erkrankungen beschäftigen. Die Ergebnisse diesbezüglich verweisen immer wieder auf die
bedeutsame Rolle der ersten Lebensmonate und -jahre bei der Prägung des Immunsystems
in eine entweder atopiehemmende oder aber atopiefördernde Richtung.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die kindlichen Immunantworten nach spezifischer
Antigen/Allergen Stimulation zum Zeitpunkt der Geburt, sechs Wochen, sechs Monate und
zwölf Monate postnatal zu untersuchen. Da die ersten allergischen Symptome in der
Kindheit häufig durch Kuhmilcheiweiß hervorgerufen sind, wurde β-Laktoglobulin als
spezifisches Stimulans verwendet.
Es sollte in erster Linie der Frage nachgegangen werden, ob Differenzen in den
Immunreaktionen zwischen Kindern mit einer späteren atopischen Erkrankung (mit
spezifischem IgE gegen Nahrungsmittel- und Inhalationsallergene im Alter von einem
Jahr) und solchen ohne ein atopisches Beschwerdebild (ohne spezifisches IgE) bestehen.
Nach 72stündiger Inkubation der mononukleären Zellen mit β-Laktoglobulin wurde die
intrazelluläre IFN-γ und IL-10 Synthese auf Einzelzellniveau mit Hilfe eines
Durchflußzytometers gemessen. Die Zellen konnten durch Anfärbung von speziellen
Oberflächenantigenen in naive (CD4 CD45RA-positive) und Memory (CD4 CD45R0positive) T-Helferzellen unterteilt werden.
Die Säuglinge mit spezifischem IgE im Alter von zwölf Monaten wiesen bereits im
Nabelschnurblut nach β-Laktoglobulin Stimulation signifikant mehr IL-10 positive
Memory T-Zellen auf als die Kinder ohne allergische Sensibilisierung. Der Unterschied in
der IL-10 Synthese blieb zwar auch sechs Wochen und sechs Monate postnatal noch
bestehen, zeigte jedoch keine weitere Signifikanz.
Bezüglich der Anzahl der IFN-γ positiven T-Zellen konnten zu keinem der
Untersuchungszeitpunkte relevante Differenzen zwischen den beiden Kindergruppen
verifiziert werden.
Die simultane durchflußzytometrische Messung der intrazellulären Zytokine IFN-γ und IL10 und der Oberflächenantigene CD45RA und CD45R0 ermöglichte es, die
Zytokinsynthese in beiden T-Helfersubpopulationen getrennt voneinander zu betrachten.
Es stellte sich heraus, daß die naiven T-Zellen nach Provokation mit β-Laktoglobulin
ebenso wie die reifen Memory T-Zellen, wenn auch in geringerem Ausmaß, sowohl IFN-γ
als auch IL-10 produzierten. Signifikante Unterschiede in der Zytokinsynthese in den
CD45RA+ (naiven) T-Zellen bei dem Vergleich der Säuglingsgruppen ergaben sich jedoch
76
nicht.
Um den Einfluß von Umweltfaktoren, wie den sozialen Status und das Wohnungsumfeld,
die Ernährung der Kinder während des ersten Lebensjahres und eine eventuelle
Tabakrauchexposition, auf die Entwicklung einer allergischen Sensibilisierung
nachzuvollziehen, wurden die einzelnen potentiellen Risikofaktoren mit der Bildung von
spezifischem IgE im Alter von zwölf Monaten korreliert. Dabei ließ sich zu keinem der
genannten Parameter eine positive Korrelation herstellen. Es zeigte sich jedoch, daß keiner
Säuglinge mit einem Atopierisiko, welche während des gesamten ersten Lebensjahres
kuhmilchfrei ernährt worden waren, mit zwölf Monaten spezifisches IgE gebildet hatte.
Dies legt die Vermutung nahe, daß die Ernährung in den ersten Lebensmonaten gerade bei
Risikokindern von großer Bedeutung für die potentielle Manifestation einer atopischen
Erkrankung in den folgenden Jahren ist.
Resümierend bleibt festzustellen, daß das Milcheiweiß β-Laktoglobulin bei Kindern mit
einer allergischen Sensibiliserung im Alter von einem Jahr zum Zeitpunkt der Geburt zu
einer deutlichen Steigerung der IL-10 Produktion in Memory T-Helferzellen führt. Ob IL10 als Marker für sogenannte T-regulatorische Zellen angesehen werden darf, kann anhand
der vorliegenden Resultate nicht entschieden werden.
Aus den erläuterten Ergebnissen lassen sich folgende Schlußfolgerungen ableiten:
1. An einer Atopie erkrankte Kinder unterscheiden sich bereits bei der Geburt anhand ihres
Zytokinmusters von nicht atopisch erkrankten Kindern.
2. Das bei den allergisch sensibilisierten Säuglingen aberrierende Zytokinprofil ist schon
vor einer Krankheitsmanifestation vorhanden und bildet sich nicht erst konsekutiv nach
dem Erkrankungsbeginn aus. Es ist daher nicht als Folge der Erkrankung sondern als deren
Ursache anzusehen.
3. Eine gesteigerte, durch β-Laktoblobulin induzierte IL-10 Synthese in Memory THelferzellen kann als prädiktiver Parameter für die Manifestation einer allergischen
Sensibilisierung angesehen werden.
4. Es scheint bereits zum Zeitpunkt der Geburt eine Sensibilisierung gegen
Nahrungsallergene (wie z.B. Milcheiweiß) zu bestehen.
77
7 Dokumentationsbogen über Anamnese und Untersuchungsbefund
7.1
Allgemein
Name des Kindes:
Geburtsdatum des Kindes:
Name der Mutter:
Name des Vaters:
Straße:
Stadt:
7.2
Anamnese der Mutter
Alter:
Schulischer und beruflicher Werdegang:
7.2.1 Allergieanamnese
1.
Haben oder hatten Sie ein juckendes Ekzem beim Kontakt der Haut mit bestimmten
Dingen (z.B. mit Schmuck oder Medikamenten) ?
a) Ja
b) Nein
c) Nicht sicher
Falls diese Frage mit Ja beantwortet wurde:
- In welchem Zusammenhang traten die Beschwerden auf ?
- Welche Therapie wurde durchgeführt ?
- Trat eine Besserung nach der Therapie ein ?
78
2.
Leiden oder litten Sie an einer Neurodermitis (auch endogenes Ekzem oder
atopische Dermatitis genannt) ?
a) Ja
b) Nein
c) Nicht sicher
Falls diese Frage mit Ja beantwortet wurde:
- In welchem Zusammenhang traten die Beschwerden auf ?
- Welche Therapie wurde durchgeführt ?
- Trat eine Besserung nach der Therapie ein ?
- Score-Zuteilung:
3.
Hatten Sie wiederholt Nesselsucht (auch Urticaria genannt) mit Quaddeln wie nach
Brennesselkontakt und/ oder Schwellungen von Lippen und Augen ?
a) Ja
b) Nein
c) Nicht sicher
Falls diese Frage mit Ja beantwortet wurde:
- In welchem Zusammenhang traten die Beschwerden auf ?
- Welche Therapie wurde durchgeführt ?
- Trat eine Besserung nach der Therapie ein ?
4.
Leiden oder litten Sie, ohne erkältet zu sein, an einer juckenden, verstopften oder
laufenden Nase (allergische Rhinitis) und / oder an verschwollenen, juckenden
Augen (allergische Konjunktivitis) ?
a) Ja
b) Nein
c) Nicht sicher
Falls diese Frage mit Ja beantwortet wurde:
79
- In welchem Zusammenhang traten die Beschwerden auf ?
- Welche Therapie wurde durchgeführt ?
- Trat eine Besserung nach der Therapie ein ?
5.
Leiden oder litten Sie an allergischem Asthma ?
a) Ja
b) Nein
c) Nicht sicher
Falls diese Frage mit Ja beantwortet wurde:
- In welchem Zusammenhang traten die Beschwerden auf ?
- Welche Therapie wurde durchgeführt ?
- Trat eine Besserung nach der Therapie ein ?
6.
Bestehen oder bestanden bei Ihnen bestimmte Nahrungsmittelunverträglichkeiten ?
a) Ja
b) Nein
c) Nicht sicher
Falls diese Frage mit Ja beantwortet wurde:
- Auf welche Nahrungsmittel haben Sie allergisch reagiert ?
- Welche Beschwerden traten auf ?
7.
Wurde bei Ihnen schon einmal eine Allergietestung durchgeführt ?
Wurde ein Hauttest vorgenommen und/oder spezifisches Immunglobulin E
bestimmt ?
8.
Wurde bei Ihnen schon einmal eine Hyposensibilisierung durchgeführt ?
-Gegen welche Allergene wurden Sie desensibilisiert ?
80
7.2.2 Sonstige Erkrankungen
1.
Leiden oder litten Sie unter anderen ernsthaften Erkrankungen ?
Falls Ja , wie werden bzw. wurden die Erkrankungen therapiert ?
7.2.3 Ernährungsgewohnheiten
1.
Wieviel Milch bzw. Milchprodukte nehmen Sie pro Tag zu sich ?
2.
Wieviele Eier (auch in eierhaltigen Speisen) nehmen Sie pro Tag zu sich ?
3.
Führen Sie regelmäßig besondere Diätmaßnahmen durch ?
7.2.4 Rauchgewohnheiten
1.
Sind Sie Raucherin ?
Falls diese Frage mit Ja beantwortet wurde, wieviele Zigaretten rauchen Sie pro
Tag ?
7.2.5 Familienanamnese der Mutter
1.
Leiden oder litten Ihre Eltern und/ oder Ihre Geschwister unter einer oder mehreren
der folgenden Erkrankungen: Kontaktekzem, atopische Dermatitis, Urticaria,
Rhinitis, Konjunktivitis, allergischem Asthma, Nahrungsmittelallergie ?
7.3
Anamnese des Vaters
Den Vätern der teilnehmenden Kinder wurden dieselben Fragen wie den Müttern gestellt,
lediglich die Fragen zu den Ernährungsgewohnheiten entfielen.
7.4
Geschwisteranamnese
1.
Wieviele Geschwister hat das an der Studie teilnehmende Kind ?
2.
Wie alt sind die Geschwister ?
81
7.5
Wohnung der Familie
1.
Wann wurde die Wohnung erbaut ?
2.
Findet sich Feuchtigkeit und/ oder Schimmel in der Wohnung ?
3.
Welcher
Fußbodenbelag
wurde
hauptsächlich
verlegt
(Teppichboden,
Linoleumbelag, Steinboden oder Parkett) ?
4.
Werden Tiere in der Wohnung gehalten ?
5.
Wird innerhalb der Wohnung geraucht ? Wird in allen Zimmern oder nur in
bestimmten Räumen geraucht ?
6.
Aus welchen Materialien sind die Decke, das Kissen und die Matratze des
Kinderbettes ?
7.6
Schwangerschaftsanamnese
1.
Gab es Besonderheiten während der Schwangerschaft (wie z.B. Blutungen,
vorzeitige Wehen, bakterielle Infektionen) ?
2.
Wurden während der Schwangerschaft Medikamente eingenommen ?
3.
Ist die Ernährung während der Schwangerschaft umgestellt worden ?
Wurde z.B. weniger Fleisch oder mehr Milch zu sich genommen ?
82
7.7
Geburtsanamnese
Geburtsgewicht:
Größe:
Kopfumfang:
Apgar-Index:
1.
In der wievielten Schwangerschaftswoche fand die Geburt statt ?
2.
Gab es Besonderheiten bei der Geburt (mußte z.B. eine Vakuumextraktion oder
eine Sectio durchgeführt werden) ?
7.8
Vorsorgeuntersuchung des Kindes
Die Vorsorgeuntersuchungen wurden im Alter von sechs Wochen, sechs Monaten und
einem Jahr durchgeführt. Zunächst erfolgte eine Anamneseerhebung mit Hilfe des
folgenden Fragebogens:
Angabe von: Gewicht:
1.
Größe:
Kopfumfang:
Welche Nahrung hat der Säugling bisher erhalten?
Bis zu welchem Zeitpunkt wurde er voll bzw. teil gestillt?
Welche Milchsorten wurden gefüttert?
Ab wann wurde zugefüttert? Welche Nahrungsmittel hat der Säugling dann
erhalten
2.
(Gemüse, Fleisch, Getreideprodukte etc.)?
Traten bis zu diesem Zeitpunkt Beschwerden, wie z.B. Durchfall, Erbrechen,
Blähungen und/oder wiederholtes Schreien nach der Nahrungsaufnahme auf?
3.
Hat das Kind eine Rötung der Haut, eine Quaddelbildung und/oder einen
Hautausschlag (Ekzem) entwickelt?
Ist ein vermehrter Juckreiz aufgefallen?
4.
Trat
häufiges
Husten,
eine
pfeifende
Atmung,
Kurzatmigkeit
und/oder
Schlafstörungen auf?
5.
Kam es zu einer Schwellung der Augenlider, Rötung der Augenbindehaut, zu
häufigem Jucken an den Augen und/oder der Nase? Litt das Kind unter häufigen
Niesattacken und/oder einer ”laufenden Nase”?
83
Bei allen oben genannten Symptomen erfolgte außerdem die Dokumentation über
mögliche Zusammenhänge mit dem Auftreten der Beschwerden, die Dauer der
Beschwerdesymptomatik und ggf. durchgeführte Therapien.
Außerdem wurde bei jedem Untersuchungstermin eine körperliche Untersuchung des
Kindes nach folgendem Schema vorgenommen:
• Beurteilung des Verhaltens
• Beurteilung der Haut und ggf. Berechnung der betroffenen Areale nach dem SCORADScore (s. folgende Seite)
• Untersuchung des Hals-Nasen-Ohren Bereiches
• Cardiale und pulmonale Auskultation
• Abdominelle Untersuchung
• Erhebung des neurologischen Status
84
7.9
Bestimmung des Symptomscores der Haut für atopische Dermatitis
nach SCORAD
Eventuell vorhandene Hautveränderungen im Sinne einer Neurodermitis wurden mit Hilfe
des SCORAD-Scores bestimmt und protokolliert [153]:
7.9.1 Ausdehnung (A)
Prozentzahl der betroffenen Hautareale:
A = x / 100
Abbildung 12: Bestimmung der Ausdehnung der neurodermitischen
Hautveränderungen in Prozent
85
7.9.2 Intensität (B)
Tabelle 4: Berechnung der Intensität der neurodermitischen Hautveränderungen
anhand unterschiedlicher Kriterien
Kriterium
Erythem
Ödem/Papulation
Krustenbildung
Exkoriation
Lichenifikation
Intensität
Einteilung der Intensität
0= keine Veränderungen
1= leichte Veränderungen
2= mittelmäßig ausgeprägte Veränderungen
3= schwere Veränderungen
Trockenheit5
B = Summer der Intensitäten / 18
7.9.3 Symptomatik (C)
1.)
Schlaflosigkeit:
Beurteilung auf einer Skala von 1 bis 10
2.)
Juckreiz:
Beurteilung auf einer Skala von 1 bis 10
C =Summe der beiden Punktwerte
7.9.4 Berechnung des individuellen Schweregrades der atopischen Dermatitis
Schweregrad der atopischen Dermatitis = (A / 5) + (7 x B / 2) + C
5
Die Bestimmung der Hauttrockenheit erfolgte an nicht betroffenen Hautstellen.
86
8 Abbildungsverzeichnis
ABBILDUNG 1: DURCHFLUßZYTOMETER .................................................................................................... 28
ABBILDUNG 2: DARSTELLUNG DER GESAMTZAHL DER CD4-POSITIVEN T-ZELLEN PRO MIKROLITER32
ABBILDUNG 3: DARSTELLUNG DER GESAMTZAHL DER CD3-POSITIVEN T-ZELLEN PRO MIKROLITER33
ABBILDUNG 4: CD45RA-POSITIVE ZELLEN UNTER DEN CD4+ T-ZELLEN IN PROZENT NACH
STIMULATION MIT β-LAKTOGLOBULIN............................................................................................. 34
ABBILDUNG 5: CD45R0-POSITIVE ZELLEN UNTER DEN CD4+ ZELLEN IN PROZENT NACH
STIMULATION MIT β-LAKTOGLOBULIN............................................................................................. 35
ABBILDUNG 6: IL-10 SYNTHESE IN CD45R0+ ZELLEN BEI KINDERN MIT UND OHNE SPEZ. IGE IM
ALTER VON EINEM JAHR ..................................................................................................................... 37
ABBILDUNG 7: IFN-γ SYNTHESE IN CD45R0+ ZELLEN BEI SÄUGLINGEN MIT UND OHNE SPEZ. IGE IM
ALTER VON EINEM JAHR ..................................................................................................................... 38
ABBILDUNG 8: ANTEIL IL-10POSITIVER CD45RA+ BEI KINDERN MIT BZW. OHNE EINE ALLERGISCHE
SENSIBILISIERUNG IM ALTER VON EINEM JAHR .............................................................................. 39
ABBILDUNG 9: ANTEIL IFN-γ POSITIVER CD45RA+ ZELLEN BEI KINDERN MIT BZW. OHNE EINE
ALLERGISCHE SENSIBILISIERUNG IM ALTER VON EINEM JAHR ..................................................... 40
ABBILDUNG 10: IL-10 SYNTHESE IN CD45R0+ ZELLEN IM VERGLEICH ZWISCHEN KINDERN MIT UND
OHNE EIN ALLERGIERISIKO ................................................................................................................ 42
ABBILDUNG 11: WIRKUNG VERSCHIEDENER ZYTOKINE AUF DIE T-ZELLDIFFERENZIERUNG ............ 49
ABBILDUNG 12: BESTIMMUNG DER AUSDEHNUNG DER NEURODERMITISCHEN
HAUTVERÄNDERUNGEN IN PROZENT................................................................................................ 85
87
9 Tabellenverzeichnis
TABELLE 1: AUFLISTUNG VON KOPFUMFANG, GRÖßE UND GEWICHT DER KINDER BEI DEN
UNTERSUCHUNGEN U1 UND U2 SOWIE DES ALTERS DER MUTTER UND DES VATERS FÜR DIE
KINDERGRUPPE MIT SPEZIFISCHEM IGE (N=12) UND OHNE SPEZIFISCHES IGE (N=40). .............. 20
TABELLE 2: ALLERGISCHE ERKRANKUNGEN DER MÜTTER UND VÄTER IN DER KINDERGRUPPE MIT
SPEZIFISCHEM IGE UND OHNE SPEZIFISCHES IGE IM ALTER VON EINEM JAHR. ..........................21
TABELLE 3: ÜBERPRÜFUNG DES EINFLUßES UNTERSCHIEDLICHER RISIKOFAKTOREN AUF DEN
NACHWEIS VON SPEZIFISCHEM IGE GEGEN INHALATIONS- UND/ ODER
NAHRUNGSMITTELALLERGENE IM ALTER VON EINEM JAHR......................................................... 44
TABELLE 4: BERECHNUNG DER INTENSITÄT DER NEURODERMITISCHEN HAUTVERÄNDERUNGEN
ANHAND UNTERSCHIEDLICHER KRITERIEN...................................................................................... 86
88
10 Literaturverzeichnis
1. Kemp, A.S.: Atopic eczema: its social and financial costs. J Paediatr Child Health,
1999. 35: 229-231.
2. Chabot, R. Pediatric Allergy, New York: McGraw-Hill, 1951.
3. O`Keefe, E.S.: The history of infant feeding II. Seventeenth and eighteenth centuries.
Arch Dis Child, 1953. 28: 232-240.
4. Hamburger, F.: Biologisches über die Eiweißkörper der Kuhmilch und über
Säuglingsernährung. Wien Klin Wochenschr, 1901. 14: 1202-1204.
5. Schlossmann, A. and Moro, E.: Zur Kenntnis der Arteigenheit der verschiedenen
Eiweißkörper der Milch. Münch Med Wochenschr, 1903. 14: 597-598.
6. Finkelstein, H.: Kuhmilch als Ursache akuter Ernährungsstörungen bei Säuglingen.
Monatsschr Kinderheilk, 1905. 4: 65-72.
7. Vendel, S.: Cow`s milk idiosyncrasy in infants. Acta Paediatr Scand, 1948. 35: 1-37.
8. Savilahti, E.: Cow`s milk allergy. Allergy, 1981. 36: 73-88.
9. Hamburger, R.N.: Introduction: a brief history of food allergy with definitions of
terminology in food intolerance. Hamburger R. N., ed. Food intolerance in infancy. New
York: Raven Press, 1989. Side 1-6.
10. Snapper, C.M., and Paul, W.E.: Interferon-gamma and B cell stimulatory factor-1
reciprocally regulate Ig isotype production. Science, 1987. 236: 944-947.
11. Mosmann,T.R., Cherwinski, H., Bond, M.W., Griedlin, M.A., and Coffman, R.L.: Two
types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine
activities and secreted proteins. J Immunol, 1986. 136: 2348-2357.
12. Mosmann, T.R., and Coffman, R.L.: Th1 and Th2 cells: different patterns of
lymphokine secretion lead to different functional properities. Ann Rev Immunol, 1989. 7:
145-173.
89
13. Wierenga, E.A., Snoek, M.A., de Groot, C., Chretien, I., Bos, J.D., Jansen, H.M., and
Kapsenberg, M.L.: Evidence for compartimentalization of functional subsets of CD4+ T
lymphocytes in atopic patients. J Immunol, 1990. 144: 4651-4656.
14. Parronchi, P., Macchia, D., Piccini, M-P, Biswas, P., Simonelli, C., Maggi, E., Ricci,
M., Ansari, A.A., and Romagnani, S.: Alergen- and bacterial antigen-specific T-cell clones
established from atopic donors show a different profile of cytokine production. Proc Natl
Acad Sci USA, 1991. 88: 4583-4592.
15. Gajewski, T.F., Joyce, J., and Fitch, F.W.: Anti-proliferative effect of IFN-γ in immune
regulation. III. Differential selection of Th1 and Th2 murine helper T lymphocyte clones
using recombinant IL-2 and IFN-γ. J Immunol, 1989. 143:15-22.
16. Peleman, R., Wu, J., Fargeas, C., and Delespesse,G.: Recombinant interleukin 4
suppresses the production of interferon-γ by human mononuclear cells. J Exp Med, 1989.
170: 1751-1756.
17. Mosmann, T.R., Schumacher, J.H., Street, N.F., Budd, R., O´Gara, A., Fong, T.A.T.,
Bond, M.W., Moore, K.W.M., Sher, A., and Fiorentino, D.F.: Diversity of cytokine
synthesis and function of mouse CD4+ T cells. Immunol Rev, 1991. 123: 209-229.
18. Demeure, C.E., Wu, C.Y., Shu, U., Schneider, P.V., Heusser, C., Yssel, H., and
Delespesse, G.: In vitro maturation of human neonatal CD4 T lymphocytes. II. Cytokines
present at priming modulate the development of lymphokine production. J Immunol, 1994.
152: 4775-4782.
19. Mosmann, T.R., and Coffman, R.L: Heterogenity of cytokine secretion patterns and
funtions of helper T cells. Adv Immunol, 1989. 46: 111-147.
20. Beverley, P.C.L.: Functional analysis of human T cell Subsets defined by CD45
isoform expression. Semin Immunol, 1992. 4: 35-41.
21. Yssel, H., de Waal Malefijt, R., Roncarolo, M.G., Abrams, J.S., Lahesmaa, R., Spits,
H., and de Vries, J.E.: IL-10 is produced by subsets of human CD4+ T cell clones and
peripheral blood T cells. J Immunol, 1992. 149: 2378-2384.
22. Ehlers, S., and Smith, K.A.: Differentiation of T cell lymphokine gene expression: the
in vitro acquisition of T cell memory. J Exp Med, 1991. 173: 25-36.
90
23. Lewis, D.B., Prickett, K.S., Larsen, A., Grabstein, K., Weaver, M., and Wilson, C.B.:
Restricted production of interleucin-4 by activated human T cells. Proc Natl Acad Sci
USA, 1988. 85: 9743-9747.
24. Lewis, D.B., Yu, C.C., Meyer, J., English, B.K., Kahn, S.J., and Wilson, C.B.: Cellular
and molecular mechanisms for reduced interleukin 4 and interferon-γ production by
neonates. J Clin Invest, 1991. 87: 194-202.
25. Romagnani, S.: Human Th1 and Th2 subsets: regulation of differentiation and role in
protection and immunopathology. Int Arch Allergy Immunol, 1992. 98: 279-285.
26. Read, S., and Powrie, F.: CD4+ regulatory T cells. Curr Opin Immunol, 2001. 13: 644649.
27. Lombardi, G., Sidhu, S., Batchelor, R., and Lechler, R.: Anergic T cells as suppressor
cells in vitro. Science, 1994. 264: 1587-1589.
28. Chen, Y., Kuchroo, V.K., Inobe, J., Hafler, D.A., and Weiner, H.L.: Regulatory T cell
clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis. Science,
1994. 265: 1237-1240.
29. Levings, M.K., Sangregorio, R., Galbiati, F., Squadrone, S., de Waal Malefyt, R., and
Roncarolo, M.G.: IFN-alpha and IL-10 induce the differentiation of human type 1 T
regulatory cells. J Immunol, 2001. 166: 5530-5539.
30. Cottrez, F., Hurst, S.D., Coffman, R.L., and Groux, H.: T regulatory cells 1 inhibit a
Th2-specific response in vivo. J Immunol, 2000. 165: 4848-4853.
31. Asseman, C., and Powrie, F.: Interleukin 10 is a growth factor for a population of
regulatory T cells. Gut, 1998. 42: 157-158.
32. Stephens, L.A., and Mason, D.: CD25 is a marker for CD4+thymocytes that prevent
autoimmune diabetes in rats, but peripheral T cells with this function are found in both
CD25+ and CD25- subpopulations. J Immunol, 2000. 165: 3105-3110.
33. Roncarolo, M.G., Bacchetta, R., Bordignon, C., Narula, S., and Levings, M.K.: Type 1
regulatory cells. Immunol Rev, 2001. 182: 68-79.
34. Ng, T.W., Holt, P.G., and Prescott, S.L.: Cellular immune responses to ovalbumin and
house dust mite in egg-allergic children. Allergy, 2002. 57: 207-214.
91
35. Schade, R.P., Van Ieperen-Van Dijk, A.G., Versluis, C., Van Reijsen, F.C., Kimpen,
J.L., Bruijnzeel-Koomen, C.A., Knol, E.F., and Van Hoffen, E.: Cell-surface expression of
CD25, CD26, and CD30 by allergen-specific T cells is intrinsically different in cow`s milk
allergy. J Allergy Clin Immunol, 2002. 109: 357-362.
36. Behrman, Kliegman, and Arvin: Nelson, Textbook of Pediatrics. Saunders, 15th
Edition. Side 156-158.
37. Kulig, M., Bergmann, R., Klettke, U., Wahn, V., Tacke, U., and Wahn, U.: Natural
course of sensitization to food and inhalant allergens during the first 6 years of life. J
Allergy Clin Immunol, 1999. 103: 1173-1179.
38. Hourihane, J.O., Smith, P.K., and Strobel, S.: Food allergy in children. Indian J
Pediatr, 2002. 69: 61-67.
39. Tikkanen, S., Kokkonen, J., Juntti, H., and Niinimaki, A.: Status of children with cow`s
milk allergy in infancy by 10 years of age. Acta Paediatr, 2000. 89: 1174-1180.
40. Laan, M.P., Baert, M.R., Bijl, A.M., Vredendaal, A.E., De Waard-van der Spek, F.B.,
Oranje, A.P., Savelkoul, H.F., and Neijens, H.J.: Markers for early sensitization and
inflammation in relation to clinical manifestations of atopic disease up to 2 years of age in
133 high-risk children. Clin Exp Allergy, 2000. 30: 944-953.
41. Wal, J.M.: Structure and function of milk allergens. Allergy, 2001. 67: 35-38.
42. Jarvinen, K.M., Chatchatee, P., Bardina, L., Beyer, K., and Sampson, H.A.: IgE and
IgG binding epitopes on alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin in cow`s milk allergy.
Int Arch Allergy Immunol, 2001. 126: 111-118.
43. Szepfalusi, Z., Nentwich, I., Gerstmayr, M., Jost, E., Todoran, L., Gratzl, R., Herkner,
K., and Urbanek, R.: Prenatal allergen contact with milk proteins. Clin Exp Allergy, 1997.
27: 28-35.
44. Klotz, A., Buchberger, J., Krause, I., and Einspanier, R.: Charakterization of milk
proteins. Entrez, Proteindatenbank. Submitted by Einspanier, Institute of Physiologie,
Technical University Munich, 2001.
45. Chen, R., Wang, B., Zhang, Y., Liu, W., Zhang, J., and Lao, W.: Cloning, mapping,
and sequencing of 3´and ist flanking region of bovine alpha-s1 casein gene. Chin J
Biotechnol, 1992. 8: 235-245.
92
46. Rasmussen, L.K., Hojrup, P., and Petersen, T.E.: The multimetric structure and
disulfide-bonding pattern of bovine kappa-casein. Eur J Biochem, 1992. 207: 215-222.
47. Barteri, M., Gaudiano, M.C., Rotella, S., Benagiano, G., and Pala, A.: Effect of ph on
the structure and aggregation of human glycodelin A. A comparison with betalactoglobulin A. Biochim Biophys Acta, 2000. 1479: 255-264.
48. Sakurai, K., Oobatake, M., and Goto, Y. : Salt-dependent monomer-dimer equilibrium
of bovine beta-lactoglobulin at pH3. Protein, Sci, 2001. 10: 2325-2335.
49. Taulier, N., and Chalikian, T.V.: Charakterization of pH-induced transitions of betalactoglobulin: ultrasonic, densimetric, and spectroscopic studies. J Mol Biol, 2001. 314:
873-889.
50. Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., and Rieger, C.: Detection of
intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods, 1993. 159: 197-207.
51. Hudson, L., and Hay, F.C.: Practical Immunology. Blackwell Verlag. Oxford 1990.
Side 123.
52. Fleming, D.M., and Crombie, D.L.: Prevalence of asthma and hay fever in England
and Wales. Br Med J (Clin Res Ed), 1987. 294: 279-283.
53. Burney, P.G., Chinn, S., and Rona, R.J.: Has the prevalence of asthma increased in
children? Evidence from national study of health and growth 1973-86. BMJ, 1990. 300:
1306-1310.
54. Burckholter, D. and Schiffer, P.: The Epidemiology of Atopic Diseases in Europe. ACI
News, 1995. 7: 113-125.
55. Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., and Ackermann-Liebrich, U.: Prevalence
of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss
Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol, 1995. 106:
149-156.
56. Burr, M.L., Butland, B.K., King, S., and Vaughan-Williams, E.: Changes in asthma
prevalence: two surveys 15 years apart. Arch Dis Child, 1989. 64: 1452-1456.
57. Farrar, M.A., and Schreiber, R.D.: The molecular cell biology of interferon-γ and its
receptor. Annu Rev Immunol, 1993. 11: 571-611.
93
58. Swain, S.L., Weinberg, A.D., English, M., and Huston, G.: IL-4 directs the
development of Th2-like helper effectors. J Immunol, 1990. 145: 3796-3806.
59. Pene, J., Rousset, F., Briere, F., Chretien, I., Paliard, X.; Banchereau, J., Spits, H., and
De Vries, J.E.: IgE production by normal human B cells induced by alloreactive T cell
clones is mediated by IL-4 and suppressed by IFN-gamma. J Immunol, 1988. 141: 12181224.
60. Del Prete, G.F., Maggi, E., Parronchi, P., Chretien, I., Tiri, A., Macchia, D., Ricci, M.,
Banchereau, J., De Vries, J., and Romagnani, S.: IL-4 is an essential co-factor for the IgE
synthesis induced in vitro by human T cell clones and their supernatants. J Immunol, 1988.
140: 4193-4198.
61. Ishizaka, A., Sakiyama, Y., Nakanishi, M., Tomizawa, K., Oshika, E., Kojima, K.,
Taguchi, Y., Kandil, E., and Matsumoto, S. : The inductive effect of interleukin-4 on IgG4
and IgE synthesis in human peripheral blood lymphocytes. Clin Exp Immunol, 1990. 79:
392-396.
62. Chretien, I., Pene, J., Briere, F., Malefyt, R.D.W., Roesset, F., and De Vries, J.E.:
Regulation of IgE synthesis. I. Human IgE synthesis in vitro is determined by reciprocal
antagonistic effects of interleukin-4 and interferon-γ. Eur J Immunol, 1990. 20: 243-251.
63. Vercelli, D., Tabara, H.H., Lauener, R.P., and Geha, R.S.: IL-4 inhibits the synthesis of
IFN-γ and induces the synthesis of IgE in human mixed lymphocyte cultures. J Immunol,
1990. 144: 570-573.
64. Maggi, E., Parronchi, P., Manetti, R., Simonelli, C., Piccini, M.P., Rugiu, F.S., DeCarli, M., Ricci, M., and Romagnani, S.: Reciprocal regulatory effects of IFN-gamma and
IL-4 on the in vitro development of human Th1 and Th2 clones. J Immunol, 1992. 148:
2142-2147.
65. Smits, H.H., van Rietschoten, J.G., Hilkens, C.M., Sayilir, R., Stiekema, F.,
Kapsenberg, M.L., and Wierenga, E.A.: IL-12-induced reversal of human Th2 cells is
accompanied by full restoration of IL-12 responsiveness and loss of GATA-3 expression.
Eur J Immunol, 2001. 31: 1055-1065.
94
66. De Waal Malefyt, R., Abrams, J., Bennett, B., Figdor, C.G., and de Vries, J.E.:
Interleukin 10 (IL-10) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: an autoregulatory
role of IL-10 produced by monocytes. J Exp Med, 1991. 174: 1209-1220.
67. Schauer, U., Jung, T., Heymanns, J., and Rieger, C.H.L.: Imbalance of CD4+CD45+
and CD4+CD29+ T helper cell subsets in patients with atopic diseases. Clin Exp
Immunol, 1991. 83: 25-29.
68. Miles, E.A., Warner, J.A., Lane, A.C., Jones, A.C., Colwell, B.C., and Warner, J.O.:
Altered T lymphocyte phenotype at birth in babies born to atopic parents. Pediatr Allergy
Immunol, 1994. 5: 202-208.
69. Holt, P.G., Clough, J.B., Holt, B.J., Baron-Hay, M.J., Rose, A.H., Robinson, B.W., and
Thomas, W.R.: Genetic risk for atopy is associated with delayed postnatal maturation of T
cell competence. Clin Exp Allergy, 1992. 22: 1093-1099.
70. Fiorentino, D.F., Bond, M.W., and Mosmann T.R.: Two types of mouse T helper cell.
IV. TH2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by TH1 clones. J Exp
Med, 1989. 170: 2081-2095.
71. Fiorentino, D.F., Zlotnik, A., Mosmann, T.R., Howard, M., and O`Garra, A.: IL-10
inhibits cytokine production by activated macrophages. J Immunol, 1991. 147: 3815-3822.
72. Hsu, D.-H., Moore, K.W., and Spits, H.: Differential effects of interleucin-4 and -10 on
interleucin-2 induced interferon-γ synthesis and lymphokine activazed killer activity. Int
Immunol, 1992. 4: 563-569.
73. Del Prete, G., De Carli, M., Almerigogna, F., Giudizi, M.G., Biagotti, R., and
Romagnani, S.: Human IL-10 is produced by both type 1 helper (Th1) and type 2 helper
(Th2) cell clones and inhibits their antigen-specific proliferation and cytokine production.
J Immunol, 1993. 150: 353-360.
74. De Waal Malefyt, R., Haanen, J., Spits, H., Roncarolo, M.G., te Velde, A., Figdor, C.,
Johnson, K., Kastelein, R., Yssel, H., and de Vries, J.E.: Interleukin 10 (IL-10) and viral
IL-10 reduce antigen-specific human T cell proliferation by diminishing the antigenpresenting capacity of monocytes via downregulation of class II major histocompatibility
complex expression. J Exp Med, 1991. 174: 915-924.
95
75. Akdis, C.A., Blesken, T., Akdis, M., Wütherich, B., and Blaser, K.: Role of Interleucin
10 in specific immunotherapie. J Clin Invest, 1998. 102: 98-106.
76. Windhagen, A., Anderson, D.E., Carrizosa, A., Williams, R.E., and Hafler, D.A.: IL-12
induces human T cells secreting IL-10 with IFN-gamma. J Immunol, 1996. 157: 11271131.
77. Arulanandam, B.P., Mittler, J.N., Lee, W.T., O`Toole, M., and Metzger, D.W.:
Neonatal administration of IL-12 enhances the protective efficacy of antiviral vaccines. J
Immunol, 2000. 164: 3698-3704.
78. Schmidt-Weber, C.B., Alexander, S.I., Henault, L.E., James, L., and Lichtman, A.H.:
IL-4 enhances IL-10 gene expression in murine Th2 cells in the absence of TCR
engagement. J Immunol, 1999. 162: 238-244.
79. Moore, K.W., O´Garra, A., de Waal Malefyt, R., Vieira, P., and Mosmann, T.R.:
Interleukin-10. Annu Rev Immunol, 1993. 11:165-190.
80. Jenmalm, M.C., and Björksten, B.: Development of immunoglobulin G subclass
antibodies to ovalbumin, birch and cat during the first eight years of life in atopic and
non-atopic children. Pediatr Allergy Immunol, 1999. 10: 112-121.
81. Jenmalm, M.C., Bjorksten, B., Macaubas, C., Holt, B.J., Smallacombe, T.B., and Holt,
P.G.: Allergen-induced cytokine secretion in relation to atopic symptoms and
immunglobulinE and immunglobulin G subclass antibody responses. Pediatr Allergy
Immunol, 1999. 10: 168-177.
82. Jonuleit, H., Schmitt, E., Schuler, G., Knop, J., and Enk, A.H.: Induction of interleukin
10-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive
stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J Exp Med, 2000. 192: 12131222.
83. Levings, M.K., and Roncarolo, M.G.: T-regulatory 1 cells: a novel subset of CD 4 T
cells with immunoregulatory properities. J Allergy Immunol, 2000. 106: 109-112.
84. Thornton, A.E., and Shevach, E.M.: CD4+CD25+Immunregulatory T cells suppress
polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med,
1998. 188: 287-296.
96
85. Takahashi, T., Kuniyasu, Y., Toda, M., Sakaguchi, N., Itoh, M., Iwata, M., Shimizu, J.,
and Sakaguchi, S.: Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+ naturally
anergic and suppressive T cells: induction of atoimmune disease by breaking their
anergic/ suppressive state. Int Immunol, 1998. 10: 1969-1980.
86. Hara, M., Kingsley, C.I., Niimi, M., Read, S., Turvey, S.E., Bushell, A.R., Morris, P.J.,
Powrie, F., and Wood, K.J.: IL-10 is required for regulatory T cells to mediate tolerance to
alloantigens in vivo. J Immunol, 2001. 166: 3789-3796.
87. Groux, H., Bigler, M., de Vries, J.E., and Roncarolo, M.G.: Interleukin-10 induces a
long-term antigen-specific anergic state in human CD4+ T cells.J Exp Med, 1996. 184: 18.
88. Early, E., and Reen, D.J.: Rapid conversion of naive to effector T cell function
counteracts diminished primary human newborn T cell responses. Clin Exp Immunol,
1999. 116: 527-533.
89. Byrne, J.A., Butler, J.L., and Cooper, M.D.: Differential activation requirements for
virgin and memory T cells. J Immunol, 1988. 141: 3249-3257.
90. Harris, D.T., Schumacher, M.J., Locascio, J., Besencon, F.J., Olson, G.B., De Luca, D.,
Shenker, L., Bard, J., and Boyse, E.A.: Phenotypic and functional immaturity of human
umbilical cord blood T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci, 1992. 89: 10006-10010.
91. Berry, S.M., Fine, N., Bichalski, J.A., Cotton, D.B., Dombrowski, M.P., and Kaplan,
J.: Circulating lymphocytes subsets in second and third-trimester fetuses: Comparison with
newborns and adults. Am J Obstet Gynecol, 1992. 167: 895-900.
92. Hannet, I., Erkeller-Yuksel, F., Lydyard, P., Deneys, V., and DeBruyere, M.:
Developmental and maturational changes in human blood lymphocyte subpopulations.
Immunol Today, 1992. 13: 215-218.
93. Yamada, A., Kaneyuki, T., Hara, A., Rothstein, D.M., and Yokoyama, M.M.: CD45
isoformexpression on human neonatal T cells: expression and turnover of CD45 isoforms
on neonatal versus adult T cells after activation. Cell Immunol, 1992. 142: 114-124.
94. Bryson, Y.J., Winter, H.S., Gard, S.E., Fischer, T.J., and Steim, E.R.: Deficiency of
immune interferon production by leukocytes of normal newborns. Cell Immunol, 1980. 55:
191-200.
97
95. Wakasugi, N. and Verelizier, J.L.: Defective IFN-γ production in the neonate I.
Dysregulation rather than intrinsic abnormality. J Immunol, 1985. 134: 167-171.
96. Rinas, U., Horneff, G., and Wahn, V.: Interferon-γ production by cord-blood
mononuclear cells is reduced in newborns with a family history of atopic disease and is
independent from cord blood IgE-levels. Pediatr Allergy Immunol, 1993. 4: 60-64.
97. Müller, K., Zak, M., Nielsen, S., Pedersen, F.K., de Nully, P., and Bendtzen, K.: In
vitro cytokine production and phenotype expression by blood mononuclear cells from
umbilical cords, children and adults. Pediatr Allergy Immunol, 1996. 7: 117-124.
98. Sautois, B., Fillet, G., and Beguin, Y.: Comparative cytokine production by in vitro
stimulated mononucleated cells from cord blood and adult blood. Exp Hematol, 1997. 25:
103-108.
99. Frenkel, L., and Bryson, Y.B.: Ontogeny of PHA-induced γIFN production of
leucocytes of healthy infants and children: evidence for decreased production for infants
younger than 2 months of age. J Paediatr, 1987. 111: 97-100.
100. Wilson, C.B., Westall, J., Johnston, L., Lewis, D.B., Dower, S.K., and Alpert, A.R.:
Decreased produktion of interferon gamma by human neonatal cells. Intrinsic and
regulatory deficiencies. J Clin Invest, 1986. 77: 860-867.
101. Suomalainen, H., Soppi, E., Laine, S., and Isolauri, E.: Immunologic disturbances in
cow´s milk allergy, 2: Evidence for defective interferon-gamma generation. Pediatr
Allergy Immunol, 1993. 4: 203-207.
102. Trinchieri, G., Matsumoto-Kobayashi, M., Clarck, S.C., Sheera, J., Loudon, L., and
Perussia, B.: Response of resting human peripheral blood natural killer cells to interleukin
2. J Exp Med, 1984. 160: 1147-1169.
103. Kehri, J.H., Dukovich, M., Whalen, G., Katz, P., Fauci, A.S., and Greene, W.C.:
Novel interleukin-2 (IL-2) receptor appears to mediate IL-2-induced activation of natural
killer cells. J Clin Invest, 1988. 81: 200-205.
104. D´Andrea, A., Rengaraju, M., Valiante, N.M., Chehimi, J., Kubin, M., Aste, M.,
Chan, S.H., Kobayashi, M., Young, D., Nickbarg, E., Wolf, S.F., and Trinchieri, G.:
Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood
mononuclear cells. J Exp Med, 1992. 176: 1387-1398.
98
105. Manetti, R., Parronchi, P., Guidizi, M.G., Piccinni, M.P., Maggi, E., Trinchieri, G.,
and Romagnani, S.: Natural killer cell stimulatory factor (Interleukin 12 [IL-12]) induces
T helper type 1 (Th 1)-specific immune responses and inhibits the development of IL-4producing Th cells. J Exp Med, 1993. 177: 1199-1204.
106. Roncarolo, M.G., Bigler, M., Ciuti, E., Martino, S., and Tovo, P.A.: Immune
responses by cord blood cells. Blood cells, 1994. 20: 573-585.
107. Prescott, S.L., Macaubas, C., Smallacombe, T., Holt, B.-J., Sly, P.D., Loh, R., and
Holt, P.G.: Reciprocal age-related patterns of allergen-specific T-cell immunity in normal
vs. atopic infants. Clin Exp Allergy, 1998. Suppl 5:39-44; discussion 50-1.
108. Prescott, S.L., Macaubas, C., Smallacombe, T., Holt, B-J., Sly, P.D., and Holt, P.G.:
Development of allergen-specific T-cell memory in atopic and normal children. Lancet,
1999. 353: 196-200.
109. Coffman, R.L., and Carty, J.: A T-cell activity that enhances polyclonal IgE
production and its inhibition by interferon-gamma. J Immunol, 1985. 136: 949-954.
110. Reinhold, U., Pawelec, G., Whermann, W., Kukel, S., Oehr, P., and Kreysel, H.W.:
Cytokine release from cultured peripheral blood mononuclear cells of patients with severe
atopic dermatitis. Acta Derm Venereol, 1989. 69: 497-502.
111. Jujo, K., Renz, H., Abe, J., Gelfand, E.W., and Leung, D.Y.M.: Deacreased
interferon gamma and increased interleukin-4 production in atopic dermatitis promotes
IgE synthesis. J Allergy Clin Immunol, 1992. 90: 323-330.
112. Warner, J.A., Miles, E.A., Jones, A.C., Quint, D.J., and Warner, J.O.: Is deficiency of
interferon gamma production by allergen triggerd cord blood cells a predictor of atopic
asthma ? Clin Exp Allergy, 1994. 24: 423-430.
113. Tang, M.L., Kemp, A.S., Thorburn, J., and Hill, D.J.: Reduced interferon-gamma
secretion in neonates and subsequent atopy. Lancet, 1994. 344: 983-985.
114. Liao, S.Y., Liao, T.N., Chiang, B.L., Huang, M.S., Chen, C.C., Chou, C.C., and
Hsieh, K.H.: Decreased production of IFNγ and increased production of IL-6 by cord
blood mononuclear cells of newborns with a high risk of allergy. Clin Exp Allergy, 1996.
26: 397-405.
99
115. Piastra, M., Stabile, A., Fioravanti, G., Castagnola, M., Pani, G., and Ria, F.: Cord
blood mononuclear cell responsiveness to beta-lactoglobulin: T-cell activity in ‘atopyprone’ and ‘non-atopy-prone’ newborns. Int Arch Allergy Immunol, 1994. 104: 358-365.
116. Picinni, M.-P., Mecacci, F., and Sampognaro, S.: Aeroallergen sensitization can
occur during foetal life. Int Arch Allergy, 1993. 102: 301-303.
117. Nickel, R., Kulig, M., Forster, J., Bergmann, R., Bauer, C.P., Lau, S., GuggenmoosHolzmann, I., and Wahn, U.: Sensitization to hen´s egg at the age of twelve months is
predictive for allergic senstization to common indoor and outdoor allergens at the age of
three years. J Allergy Clin Immunol, 1997. 99: 613-617.
118. Kulig, M., Bergmann, R., Niggemann, B., Burow, G., and Wahn, U.: Prediction of
sensitization to inhalant allergens in childhood: evaluating family history, atopic
dermatitis and sensitization to food allergens. The MAS Study Group. Multicenter Allergy
Study. Clin Exp Allergy, 1998. 28: 1397-1403.
119. Kulig, M., Bergmann, R., Tacke, U., Wahn, U., and Guggenmoos-Holzmann, I.:
Long-lasting sensitization to food during the first two years precede allergic airway
disease. The MAS Study Group, Germany. Pediatr Allergy Immunol, 1998. 9: 61-67.
120. Michel, F.B., Bousquet, J., Greillier, P., Robinet-Levy, M., and Coulomb, Y.:
Comparison of cord blood immunglobulin E concentrations and maternal allergy for the
prediction of atopic diseases in infancy. J Allergy Clin Immunol, 1980. 65: 422-430.
121. Buscino, L., Marchetti, F., Pellegrini, G., and Perlini, R.: Predictive value of cord
blood IgE levels in ”at-risk” newborn babies and influence of type of feeding. Clin
Allergy, 1983. 13: 503-508.
122. Kjellman, N.-I.M., and Croner, S.: Cord blood IgE determination for allergy
prediction -a follow-up to seven years of age in 1651 children. Ann Allergy, 1984. 53:
167-171.
123. Magnusson, C.G.M.: Cord serum IgE in relation to family history and as a predictor
of atopic disease in early infancy. Allergy, 1988. 43: 241-251.
124. Hide, D.W., Arshad, S.H., Twiselton, R., and Stevens, M.: Cord serum IgE: an
insensitive method for prediction of atopy. Clin Exp Allergy, 1991. 21: 739-743.
100
125. Croner, C.S., Kjellman, N.-I.M., Ericksson, B., and Roth, A.: IgE screening in 1701
newborn infants and the development of atopic disease during infancy. Arch Dis Child,
1982. 57: 364-368.
126. Eiriksson, T.H., Sigurgeirsson, B., Ardal, B., Sigfusson, A., and Valdimarsson, H.:
Cord blood IgE levels are influenced by gestational age but do not predict allergic
manifestations in infants. Pediatr Allergy Immunol, 1994. 5: 5-10.
127. Tariq, S.M., Matthews, S.M., Hakim, E.A., Stevens, M., Arshad, S.H., and Hide,
D.W.: The prevalence of and risk factors for atopy in early childhood: a whole population
cohort study. J Allergy Clin Immunol, 1998. 101: 587-593.
128. Sears, M.R., Holdaway, M.D., Flannery, E.M., Herbison, G.P., and Silva, P.A.:
Parental and neonatal risk factors for atopy, airway hyper-responsiveness, and asthma.
Arch Dis Child, 1996. 75: 392-398.
129. Beyer, K., and Wahn, U.: Is atopic dermatitis predictable ? Pediatr Allergy Immunol,
1999. 10: 7-10.
130. Hanifin, J.M., Rajka, G.: Diagnostic features of atopic dermatitis. Acta Derm
Venereol Suppl (Stockh), 1980. 92: 44-47.
131. Björksten, B., and Gerrard, J.: Environmental and developmental factors in allergic
disease in infancy and early childhood. In: Marsh, D., Blumenthal, M., eds. Genetic and
environmental factors in clinical allergy. Minneapolis, MN: University of Minnesota Press,
1990. Side: 84-96.
132. Couriel, J.M.: Passive smoking and the health of children. Thorax, 1994. 49: 731-734.
133. Soto-Quiros, M., Bustamante, M., Gutierrez, I., Hanson, L.A., Strannegard, I.L., and
Karlberg, J.: The prevalence of childhood asthma in Costa Rica. Clin Exp Allergy, 1994.
24: 1130-1136.
134. Ownby, D.R., and McCullough, J.: Passive exposure to cigarette smoke does not
increase allergic sensitization in children. J Allergy Clin Immunol, 1988. 82: 634-638.
135. Weitzmann, M., Gortmaker, S., Walker, D.K., and Sobol, A.: Maternal smoking and
childhood asthma. Pediatrics, 1990. 85: 505-511.
101
136. Infante-Rivard, C.: Childhood asthma and indoor environmental risk factors. Am J
Epidemiol, 1993. 137: 834-844.
137. Soyseth, V., Kongerud, J., Boe, J.: Postnatal maternal smoking increases the
prevalence of asthma but not of bronchial hyperresponsiveness or atopy in their children.
Chest, 1995. 107: 389-394.
138. Halken, S., Host, A., Husby, S., Hansen, L.G., Osterballe, O., and Nyboe, J.:
Recurrent wheezing in relation to environmental risk factors in infancy. A prospective
study of 276 infants. Allergy, 1991. 46: 507-514.
139. Arshad, S.H., Stevens, M., and Hide, D.W.: The effect of genetic and environmental
factors on the prevalence of allergic disorders at the age of two years. Clin Exp Allergy,
1993. 23: 504-511.
140. Bisgaard, H., Dalgaard, P., and Nyboe, J.: Risk factors for wheezing during infancy. A
study of 5953 infants. Acta Paediatr Scand, 1987. 76: 719-726.
141. Arshad, S.H., Matthews, S., Gant, C., and Hide, D.W.: Effect of allergen avoidance
on development of allergic disorders in infancy. Lancet, 1992. 339: 1493-1497.
142. Kulig, M., Luck, W., Lau, S., Niggemann, B., Bergmann, R., Klettke, U.,
Guggenmoos-Holzmann, I., and Wahn, U.: Effekt of pre- and postnatal tobacco smoke
exposure on specific sensitization to food and inhalant allergens during the first 3 years of
life. Multicenter Allergy Study Group, Germany. Allergy, 1999. 54: 220-228.
143. Magnusson, C.G.M.: Maternal smoking influences cord serum IgE and IgD levels
and increases the risk for subsequent infant allergy. J Allergy Clin Immunol, 1986. 78:
898-904.
144. Schäfer, T., Vieluf, D., Behrendt, H., Krämer, U., and Ring, J.: Atopic eczema and
other manifestations of atopy: results of a study in East and West Germany. Allergy, 1996.
51: 532-539.
145. Massicot, J.G., and Cohen, S.G.: Epidemiologic and socioeconomic aspects of
allergic diseases. J Allergy Clin Immunol, 1986. 78: 954-958.
146. Peat, J.K., Woolcock, A.J., Leeder, S.R., and Blackburn, C.R.: Asthma and bronchitis
in Sydney Schoolchildren. II. The effect of social factors and smoking on prevalence. Am J
Epidemiol, 1980. 111: 728-735.
102
147. Williams, H., Strachan, D.P., and Hay, R.J.: Childhood eczema: disease of the
advantaged? Br J Dermatol, 1994. 308: 1132-1135.
148. Schäfer, T., Krämer, U., Dockery, D., Vieluf, D., Behrendt, H., and Ring, J.: What
makes a child allergic? Analysis of risk factors for allergic sensitization in preschool
children from East and West Germany. Allergy Asthma Pro, 1999. 20: 23-27.
149. Chandra, R.K., Singh, G., and Shridhara, B.: Effect of feeding whey hydrolysate, soy
and conventional cow milk formulas on incidence of atopic disease in high risk infants.
Ann Allergy, 1989. 63: 102-106.
150. Chandra, R.K.: Five-year follow-up of high-risk infants with family history of allergy
who were exclusively breast-fed or fed partial whey hydrolysate, soy, and conventional
cow`s milk formulas. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 1997. 24: 380-388.
151. Lopez, N., de Barros-Mazon, S., Vilela, M.M., Silva, C.M., and Ribeiro, J.D.: Genetic
and environmental influences on atopic immune response in early life. J Investig Allergol
Clin Immunol, 1999. 9: 392-398.
152. Isolauri, E., Tahvanainen, A., Peltola, T., and Arvola, T.: Breast-feeding of allergic
infants. J Pediatr, 1999. 134: 27-32.
153. Severity scoring of atopic dermatitis : the SCORAD index. Consensus Report of the
European Task Force on Atopic Dermatitis. Dermatology, 1993. 186: 23-31.
103
Danksagung
Mein Dank gilt an erster Stelle meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. U. Schauer, der mir die
Durchführung dieser Arbeit ermöglichte. Er stand mir stets mit großer Geduld und
konstruktiver Kritik hilfreich zur Seite.
Unbedingt zu erwähnen ist des weiteren die verständnisvolle und geduldige Unterstützung
durch meine Familie - meinen Mann Holger und meine Eltern Ursula M. T. und Heinrich
R. Rinke. Mein Dank gilt außerdem meiner “Zweitmutter” Evamaria, die mich in meinem
beruflichen Fortkommen immer unterstützt und bestärkt hat.
104
LEBENSLAUF
Persönliche Daten
• geboren am 16.01.1970 in Bochum
• verheiratet
• keine Kinder
Schulbildung
• Besuch der Grundschule von 1976 bis 1980
• Besuch des Gymnasiums am Ostring in Bochum von 1980 bis 1989
(Großes Latinum, Abschluß: Abitur)
Hochschulbildung
• Beginn des Medizinstudiums im Wintersemester 1989/90 an der RuhrUniversität Bochum
• Ärztliche Vorprüfung im August 1992
• Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung im August 1993
• Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung im März 1996
• Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung im April 1997
105
Beruflicher Werdegang
• Tätigkeit als Ärztin im Praktikum in der Chirurgischen Abteilung der AugustaKrankenanstalt in Bochum vom 01.12.1997 bis zum 31.05.1999
• Tätigkeit
als
Assistenzärztin
in
Hämato-Onkologie
in
der
Augusta-
Krankenanstalt in Bochum vom 01.11.1999 bis zum 30.10.2000
• Tätigkeit als Assistenzärztin in der Weiterbildung zur Allgemeinärztin in einer
allgemeinärztlichen Praxis in Plettenberg seit dem 01.12.2000
106
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