CD8+ Lymphozyten mediierter Angriff auf Neuronen des ZNS

CD8+ Lymphozyten mediierter Angriff auf
Neuronen des ZNS: Relevanz von Granzym B
und Perforin für akute elektrophysiologische
Veränderungen
Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen
Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität
Würzburg
vorgelegt von
Alexander Michael Herrmann
aus Oberharmersbach
Münster 2014
http://d-nb.info/1068608005
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1.1
Erläuterung der Rolle von CD8+T-Zellen in verschiedenen entzündlichen
und neuro-degenerativen Erkrankungen des ZNS
1.2
7
CD8+ T-Zell-Reaktivierung, klonale Expansion und Migration in das ZNS-
Parenchym
1.4
1
Mechanismen der Antigen-Präsentation, klonalen Expansion und CD8+T-
Zell-Migration
1.3
1
10
Kontrolle der Immunzellen durch das ZNS-Parenchym mittels Regulation
von MHC-I-Molekülen und der Regulation von T-Zell-inhibierenden Molekülen
auf den Zielzellen
1.5
CD8+ T-Zell-Einwanderung in das ZNS und die Suche nach antigen-
präsentierenden Zielzellen
1.6
14
Ausbildung der immunologischen Synapse zwischen CD8+T-Zellen und
ihren Zielzellen
2
12
16
1.7
Mechanismen der unspezifischen Zell-Schädigung durch CD8+ T-Zellen 19
1.8
Unterschiedliche Angriffspunkte von CD8+ T-Zellen auf Neuronen des
ZNS und mögliche Folgen
21
1.9
23
Ziel der Arbeit
Material und Methoden
2.1
Material
26
26
2.1.1
Geräte
26
2.1.2
Verbrauchsmaterialien
27
2.1.3
Chemikalien
27
2.1.4
Puffer und Lösungen
28
2.1.5
Biochemikalien, Medien und Supplemente
29
2.2
Tierexperimentelle Methoden
30
2.3
OT-I Maus-System
30
2.4
Aktivierung und Stimulation von T-Lymphozyten
31
Inhaltsverzeichnis
2.5
Präparation embryonaler Hippocampus-Neuronen
32
2.6
Immunhistochemie von neuronalen Zellkulturen
33
2.7
Charakterisierung neuronaler Zellkulturen mit Propidium-Iodid
35
2.8
Immunhistochemische Charakterisierung von T-Lymphozyten
36
2.9
Elektrophysiologie..
36
2.10
Pafcft-C/amp-Ableitungen in primären Neuronen-kulturen
39
2.11
Kalzium-Imaging mittels 2-Photonen-Mikroskopie
42
2.12
Charakterisierung der OT-I T-Lymphozyten sowie der Granzym B- und
Perforin-defizienten OT-I T-Lymphozyten mit Hilfe der Durchflusszytometrie....43
2.13
INF-Y ELISA
44
2.14
3H
44
2.15
Elektrophysiologische
Thymidin-Inkorporationsassay
Ableitung
extrazellulärer
Neuronennetzwerk mittels eines Multi-Elektroden-Arrays
3
Ergebnisse
3.1
Potentiale
im
45
47
Charakterisierung der Vitalität von murinen primären Hippocampus-
Neuronen
47
3.2
Expression von MHC-I auf murinen Neuronen nach IFN-y Stimulation....48
3.3
Antigen-abhängiger Effekt von OT-I T-Lymphozyten gegenüber murinen
Hippocampus-Neuronen
3.4
Morphologischer Einfluss durch IFN-y Stimulation und MHC-I Beladung
mit OVA auf primären murine Hippocampus-Neuronen
3.5
49
52
Änderung passiver elektrophysiologischer Parameter in Neuronen nach
Zell-Zellkontakt mit OT-I Lymphozyten
55
3.6
Charakterisierung der OT-I Lymphozyten
58
3.7
Änderung passiver elektrophysiologischer Parameter in Neuronen nach
direktem Zell-Zellkontakt mit Perforin-defizienten und Granzym B-defizienten
OT-I Zellen
59
v
Inhaltsverzeichnis
3.8
Neuronale Apoptose und Membranwiderstands Effekte nach Interaktion
von OT-I FasL mit neuronalem Fas Rezeptor
3.9
Antigen- und Perforin-abhängiger Kalziumeinstrom in Neurone nach
direktem OT-I-Zellkontakt
3.10
66
Auswirkungen der antigen-abhängige Interaktion von Neuronen und
zytotoxischen T-Zellen auf die neuronale Netzwerkaktivität
4
63
Einfluss auf die Neuronen Apoptose durch die Reduktion des
Membranwiderstandes mittels porenformende Agenzien
3.11
61
Diskussion
68
71
4.1
Methodenkritische Aspekte
4.2
Morphologische und funktionelle Charakterisierung der verwendeten
Zellmodelle
4.3
Zusammenfassung
5.1
6
vi
81
Vergleich der Membranleitfähigkeit nach direktem OT-I-Kontakt mit einem
theoretischen Modell der Leitfähigkeit von Perforin-haltigen Poren
5
80
Antigen-abhängiger ZTL-Effekt und die Rolle von Perforin auf den
intrazellulären Kalziumhaushalt primärer Neurone
4.9
78
Antigen-abhängiger Einfluss von OT-I Zellen auf elektrische Parameter in
einem neuronalen Netzwerk
4.8
76
Die Rolle von Perforin und Granzym B bei der Antigen-abhängigen
Änderung von passiven elektrischen Parametern von Neuronen
4.7
75
Elektrophysiologische Charakterisierung von murinen Neuronen während
des direkten Kontakts mit zytotoxischen CD8+ T-Zellen
4.6
74
Beteiligung Perforin- und Granzym B beinhaltender zytotoxischer Granula
an der OT-l-vermittelten neuronalen Apoptose
4.5
72
Zytotoxische Effekte von TZR transgenen CD8+ OT-I T-Zellen auf primäre
murine Hippocampus-Neurone
4.4
71
Abstract
Literatur
82
84
86
88
Inhaltsverzeichnis
7
Abkürzungsverzeichnis
100
8
Danksagung
102
9
Lebenslauf
103
9.1
Eigene Publikationen
105
9.2
Konferenz Beiträge
108
vii