Molekulare Typisierung CF
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Winterschool Obergurgl Molekulare Typisierung CF-relevanter Erreger Barbara C. Kahl Institut für Medizinische Mikrobiologie Universitätsklinikum Münster Warum Typisierung? • Individueller Patient – Persistierende Infektion – Neuinfektion • Epidemiologie – Ausbruch – verschiedene Klone - Ursprung • Populationsstruktur – Weltweite Vergleiche von Isolaten Methoden • Pulsfeldgel-Elektorphorese Dendrogram Indviduelle Klone 7 9 8 Pat. 1 2 3 3 3 4 4 4 5 5 6 7 8 8 M Prävalenter Klon B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 6 3 4 1 5 2 Kahl et al, J Clin Microbiol 2003 Marker clone C clone G clone A clone D clone E clone B Marker Die 6 weit verbreiteten S. aureus Klone B A E D G C Klon A B C D E G Patienten 12 9 7 4 3 3 38 Sequenzbasierte Typisierungs-Methoden • Vorteil – Hohe Diskriminierung – Sehr gute Reproduzierbarkeit – Daten transportierbar, gute Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Laboratorien • Epidemiologische und populationsbiologische Studien möglich – High-through-put Analyse • Nachteil – Besonderes Equipment – Pflege offener Datenbanken – Kosten Sequenzbasierte Typisierungsmethoden • Single-locus sequencing Methoden – spa-Typisierung von S. aureus (VNTR) • Multi-locus sequence typing (MLST) – S. aureus, P. aeruginosa • Whole-genome Sequencing – P. aeruginosa spa-Typsierung: VNTR Region von Protein A von S. aureus Protein A Signal IgG binding VNTR LPXTG • Region von Protein A mit einer unterschiedlichen Anzahl variabler tandem repeats (21 to 27 bp) „variable number of tandem repeats“ • Als Typisierungsmethode fürS. aureus Methode: • Primer der flankierenden konservierten Region, um die repeat Region zu amplifizieren • Amplicons werden sequenziert • Software Programm zur Analyse – www.spaServer/ridom.de; (Ridom StaphType ) spa-repeats und -Typen •spa Typen, abhängig von der Zusammensetzung und der Anzahl der repeats Repeat Code Sequence Repeat SpaType Repeat Succession r01 GAGGAAGACAACAACAAGCCTAGC t001 r26r30r17r34r17r20r17r12r17r16 r02 AAAGAAGACAACAAAAAACCTGGC t002 r26r23r17r34r17r20r17r12r17r16 r03 GAGGAAGACAATAACAAACCTGGT t003 r26r17r20r17r12r17r17r16 r04 GAGGAAGACAATAACAAGCCTGGT t004 r09r02r16r13r13r17r34r16r34 r05 AAAGAAGACAACAAAAAGCCTGGC t005 r26r23r13r23r31r05r17r25r17r25r16r28 r06 AAAGAAGACGGCAAAAAACCTGGC t006 r26r23r13r23r31r05r17r17r25r16r28 r07 GAGGAAGACAACAACAAACCTGGT t007 r15r12r16r16r16r16r02r25r17 r08 GAGGAAGACAACAACAAGCCTGGT t008 r11r19r12r21r17r34r24r34r22r25 Sequenzierung von spa • Typisierung von MRSA und MSSA • Shopsin et al. JCM 1999, introduction of spa-typing – Tang et al. JCM 2000, comparison of PFGE and spa-typing – Oliveira et al. JCM 2001, comparison of PFGE, other molecular typing techniques and spa-typing • Als Marker für Micro - und Macrovariation • Koreen et al. JCM 2004 verglichen zur DNA Array Analyse CF Isolate • 155 konsekutive S. aureus Isolate von 10 Patienten • Isogene Isolate eines jeden Patienten (6-25 Isolate) • mediane S. aureus Persistenz: 56 Monate (Streuung 41 bis 75 Monate) • PFGE Charakteristiken: -Isolate von 4 Patienten identisch -Isolate von 6 Patienten mit leichten Unterschieden im Bandenmuster Kahl B et al, J Clin Microbiol 2003 Identische PFGE Bandenmuster Patient 3 11/11/98 05/22/98 11/20/97 10/01/97 06/04/97 04/19/97 12/20/95 10/31/95 06/14/95 Spa types repeats t072 t071 t072 t072 t071 t071 t071 t002 t071 r26r23r23r17r12r17r16 . r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 r26r23r23r17r12r17r16 r34r17r20r17 an Pos 5 Del r26r23r23r17r12r17r16 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 r26r23r17r34r17r20r17r12r17r16 r23 an Pos 3 Del r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 t071 r26r23r23r17r34r17r20r17r12r17r16 Die Isolate von 2 von 4 Patienten mit identischen PFGE Bandenmustern wiesen unterschiedliche spa Typen auf Kahl B et al, J Clin Microbiol 2003 Unterschiedliche PFGE Bandenmuster Patient 9 Date of isolation 01/15/99 01/15/99 01/15/99 01/15/99 08/05/98 07/28/98 08/21/97 02/27/97 06/19/96 01/18/95 Spa types repeats t009 t009 t009 t009 t009 t009 t009 t009 t009 t009 r11r12r21r17r34r24r34r22r24r34r22r33r25 Die Isolate von 2 von 6 Patienten mit unterschiedlichen PFGE Bandenmustern hatten denselben spa Typen Kahl B et al, J Clin Microbiol 2003 Ergebnisse der spa Typisierung • 142 Isolate von 10 Patienten: – 16 unterschiedliche spa Typen • Isolate von 5 Patienten identische spa Typen • Isolate von 5 Patienten variierende spa Typen – Deletionen (9 Isolate von 4 Patienten) – Duplikationen (2 Isolate von 2 Patienten) – Punktmutationen (4 Isolate von 2 Patienten) ⇒ zum ersten Mal überzeugender Nachweis von Evolution der VNTR während Langzeitpersistenz ⇒ wichtige Bedeutung für spa Typisierung Multi-locus sequence typing (MLST) ¾ 7 Haushaltsgene ¾ Länge der Amplikons ca. 400-600bp ¾ jedes neue Allel erhält eine neue Nummer ¾ die Kombination der verschiedenen Allele ergibt den Sequenztypen (ST) ¾ Jeder neue Sequenztyp erhält eine neue Nummer Curran et al J Clin Microbiol 2004 MLST Ergebnisse – Pseudomonas aeruginosa • 143 Isolate, klinische und Umwelt-Isolate • 139 verschiedene Sequenztypen • 10 Linien oder „clonal complexes“ – Identische STs, oder STs, die an einem (single-, SLV) oder zwei (double-locus variants, DLV) loci variierten • Zu jedem CC gibt es ein „founder“ Isolat (Ursprungs.) • Umweltisolate nicht verwandt, ordnen sich zu den Gruppen der klinischen Isolate Curran et al J Clin Microbiol 2004 Clonal complexes - 61 Isolate ernster ambulant erworbener S. aureus Infektionen - 179 Isolate gesunder nasaler Träger - 94 Isolate nosokomialer Isolate - Oxford und Umgebung, 1997 - 1998 Day et al, Science 2001 MLST Analyse • eBURST – Algorythmus, der große MLST Datensets in nichtüberlappende oder verwandte STs und CC unterteilt – Diversifizierung von Klonen – Entstehung epidemischer Klone ⇒P. aeruginosa hat keine Populationsstruktur klonale epidemiologische Populationsstruktur ⇒ Auswirkungen für die Auswahl der besten Typisierungsmethode ⇒ Bedeutung für Vakzinierungsstrategien Streptococcus pneumoniae (1638 Isolate) MLST Ergebnisse von P. aeruginosa Isolaten Curran et al J Clin Microbiol 2004 Whole genome sequencing Whole genome sequencing von CF-Isolaten • P. aeruginosa, frühes Isolat • P. aeruginosa, isogenes Isolat 7,5 Jahre später – shot gun sequencing, 97 % des Genoms sequenziert viele „loss-of function“ Mutationen Smith EE et al., PNAS 2006 Mutationen im Spät-Isolat Funktionen Anzahl mutierter Gene ¾Virulenzfaktoren, Virulenzregulatoren 13 ¾Transporter, Resistenzfaktoren 12 ¾Eisenaufnahme 5 ¾DNA-Replikation, Zellteilung, Transkription ¾Translation 5 ¾Quorum sensing 3 ¾Fettstoffwechsel 3 ¾DNA-mismatch Reparatursysteme 1 ¾Anaerober Metabolismus 1 Smith et al., PNAS 2006 Mutationen in weiteren CF-Isolaten • • • • 29 weitere Paare von CF-Patienten untersucht Mindestens 2 isogene Isolate Mindestens 5 Jahre Zeitunterschied 24 Gene, die im ersten Patienten mutiert waren, sequenziert – Die meisten Gene sind nicht mutiert – Jedoch finden sich einige der Mutationen bei vielen SpätIsolaten Häufige Mutationen – Positive Selektion überwiegt: • Nicht-synonyme Mutationen (n=103) überwiegen die synonymen Mutationen (n=5) – Häufigste Mutationen betreffen „multi-drug-efflux“ Pumpen – Mutationen von Virulenzregulatoren, insbes. lasR • Vfr, ein Regulator, der lasR reguliert • exsA, TypIII-Sekretionssystem Ergebnisse ¾Konzept der Virulenz ¾Virulenzgene für akute und chronische Infektion ¾Invasive Faktoren und Faktoren, die für die Persistenz bedeutend sind ¾„immune evasion“ oder „immune escape“ ÖVirulenzgene der chronischen Infektion als zukünftige Targets der Behandlung chronischer Infektionen
