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Universitätsklinikum Ulm Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Ärztlicher Direktor Professor Doktor med. Klaus-Michael Debatin Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Richard David Sebastian Blossey Hamburg 2015 Dekan der Medizinischen Fakultät: Herr Professor Doktor rer. nat. Thomas Wirth Erster Berichterstatter: Frau Professor Doktor rer. nat. Gudrun Strauß Zweiter Berichterstatter: Herr Professor Doktor med. Bernd Jahrsdörfer Tag der Promotion: 07.Juli.2016 II Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis V 1. Einleitung 1 1.1. Myeloid derived suppressor cells (MDSCs) 1 1.2. Das Zusammentreffen von T-Zellen und MDSCs im pathologischen Milieu 2 1.3. Die Todessignalwege der cytotoxischen T-Zellen (CTLs) 3 1.4. Die Suppressionsmechanismen der myeloid derived suppressor cells (MDSCs) 3 1.5. Fragestellung 7 2. Materialien und Methoden 9 2.1. Materialien 9 2.2 Methoden 13 3. Ergebnisse 23 3.1. MDSCs Generierung 23 3.2. Isolation der MDSC-Subpopulationen 23 3.3. MDSCs exprimieren Todesrezeptoren 25 3.4. MDSCs exprimieren Todesliganden 26 3.5. MDSCs supprimieren die Proliferation von T-Zellen 28 3.6. MDSCs supprimieren die T-Zellproliferation über Zelltodinduktion 29 3.7. Die Zelltodinduktion in den T-Zellen durch MDSCs ist unabhängig von CD95/CD95L 3.8. Die Zelltodinduktion in T-Zellen durch MDSCs ist CD95- und zum Teil caspasenunabhängig 3.9. 31 34 Die Zelltodinduktion in T-Zellen durch MDSCs ist zum Teil über lösliche Faktoren vermittelt 35 3.10. MDSCs induzieren Zelltod in anti-CD3/CD28 aktivierten CD8+ T-Zellen und nicht in CD4+ T-Zellen 37 3.11. MDSCs sind sensibel gegenüber TNFα induziertem Zelltod 39 3.12. MDSCs sind sensibel gegenüber TRAIL induziertem Zelltod 40 3.13. Granulozytäre und monozytäre MDSCs sind sensibel für CD95L induzierten Zelltod 41 III 3.14. CD95negative und CD95positive MDSCs supprimieren die T-Zellproliferation in gleichem Umfang 42 3.15. Anti-CD3/CD28 aktivierte T-Zellen induzieren in MDSCs Zelltod, naive T-Zellen nicht 44 3.16. Anti-CD3/CD28 aktivierte T-Zellen induzieren Zelltod in MDSCs zum Teil über lösliche Faktoren 46 4. Diskussion 48 4.1. In vitro Generierung und ex vivo Isolation von MDSCs 48 4.2. Apoptoseeigenschaften der MDSCs 50 4.3. Einfluss der MDSCs auf die T-Zellen 52 4.4. Einfluss der T-Zellen auf die MDSCs 54 5. Zusammenfassung 57 6. Literaturverzeichnis 59 Danksagung i Lebenslauf ii IV Abkürzungsverzeichnis 7-AAD 7-Aminoacetinomycin D αMEM α modification of minimal essential medium ADAM17 a disintegrin and metallopeptidase domain 17 AF AlexaFluor AIP Aryl-Hydrocarbon- Rezeptor-interagierendes Protein APC (Farbstoff) Allophycocyan APC professionelle antigenpräsentierende Zelle APS Ammoniumperoxodisulfat Arg1 Arginase 1 B6 C57BL/6 B6.lpr B6MRL-Faslpr B6.SJL B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ Bcl-2 B-Zelllymphom 2 Bcl-xL B-Zelllymphom extra groß (XL) BSA Rinderserum-Albumin CCL2 Chemokin (C-C Motiv) Ligand 2 CD cluster of differentiation cDNA kopier-DNA CFSE Carboxyfluorescin Succinimidylester CL Quervernetzter ConA Concanavalin A COX2 Cyclooxigenase 2 CSF koloniestimulierender Faktor CTL zytotoxische T-Zelle Cy Cyanin DC dendritische Zelle DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DR5 Todesrezeptor 5/ TRAIL-Rezeptor 2 DTT Dithioreitol V EDTA Ethylendiamintetraessigsäure eFl/eF eFluor eNOS endotheliale NO-Synthase ER endoplasmatisches Retikulum FACS Fluoreszense aktivierte Zelltrennung (Durchflusszytometrie) Fas Mitglied der TNF-Rezeptor Familie (Fas=CD95) FasL Fas-Ligand FBS fetales Rinderserum FCS fetales Kalbsserum FITC Fluorescein Isothiocyanat FSC Vorwärtsstreuung GM-CSF Granulozyten/ Makrophagen CSF gMDSC granulozytäre MDSC Gr1 Granulozyten-Differenzierung Antigen 1 GvHD Graft gegen Wirt Reaktion GvL/GvT Graft H-2 Histokompatibilitätskomplex 2 HEPES 2-Ethansulfonsäure HLA-DR humanes Leukozytenantigen - Antigen D gegen Leukämie/Tumor Reaktion verwand IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin iNOS induzierbare NO-Synthase JAK2 Januskinase 2 KM Knochenmark LIN Zelllinien-Marker (u.a. CD3, CD14 oder CD19) L-NMMA N-Monomethyl-L-Arginin LPS Lipopolysaccharid Ly6C Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus C Ly6G Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus G VI MACS magnetische Zelltrennung M-CSF Makrophagen CSF MDSC myeloid-derived suppressor cell MHC Haupthisokompatibilitätskomplex MLR gemischte Lymphozytenreaktion mMDSC monozytäre MDSC MZ Milzzellen NF-κB nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells nNOS neutrale NO-Synthase NO Stickstoffmonoxid nor-NOHA N-Hydroxy-nor-L-Arginin OGP N-octyl-β-glucopyranoside Page Polyacrylamid-Gelelektorphorese PB pacific blue PBS Phosphatpuffersalzlösung PE Phykoerythrin PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid RNA Ribonukleinsäure RPMI Rooswell park memorial institute-Medium ROS Reaktive Sauerstoffspezies rpm Umdrehungen pro Minute qRT-PCR quantitative Reverse Transkriptase Kettenreaktion sDC suppressive dendritische Zellen SDS Natriumdodecylsulfat SSC Seitstreunung STAT signal transducer and activator of transcription TEMED Tetramethylethylenediamin TGF transformierender Wachstumsfaktor TIM-3 T-Zellimmunglobulin und Mucindomäne VII tragendes Protein 3 TNF Tumornekrosefaktor TRAIL TNF-verwandter Apoptose induzierender Ligand Triton X-100 Octoxinol 9 Tris Trishydroxymethylaminomethan Tween Polysorbate VEGF vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor zVAD-fmk Carbobenzoxy-Valyl-Alanyl-Aspartyl[O-Methyl]-Fluoromethylketone VIII Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 1. Einleitung 1.1. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) sind eine Gruppe von unreifen myeloiden Zellen, die durch die Expression der Oberflächenmolekühle cluster of differentation 11b (CD11b) und Granulozyten Differenzierungs Antigen 1 (Gr1) phänotypisch charakterisiert sind. Ihre wichtigste Eigenschaft ist, die T-Zell-Immunität zu supprimieren. Sie akkumulieren unter pathologischen Bedingungen im Knochenmark und in lymphatischen Organen. MDSCs sind phänotypisch identisch mit unreifen myeloiden Vorstufen von Makrophagen, Granulozyten und Dendritischen Zellen. Diese unreifen Vorläuferzellen weisen allerdings keine immunsuppressiven Eigenschaften auf und sind somit keine MDSCs. Das Vorkommen von MDSCs ist im Zusammenhang mit Tumoren erstmalig beschrieben worden, aber auch andere chronisch pathologische Bedingungen wie Entzündungen oder Infektionen, rufen ihre Akkumulation hervor. Hierfür ist das während dieser Erkrankungen vorherrschende inflammatorische Milieu mit Zytokinen, Wachstumsfaktoren oder toll-like receptor Agonisten wie Interferon γ (IFNγ), Granulozyten und Makrophagen- koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) oder Lipopolysaccharid (LPS) verantwortlich. Dabei ist vor allem die Induktion des Transkriptionsfaktors signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) von Bedeutung. Die Zellen verbleiben in ihrem unreifen Zustand und entwickeln ihre charakteristischen immunsuppressiven Eigenschaften. Dabei sind MDSCs sowohl in der Lage, das adaptive als auch das angeborene Immunsystem zu beeinflussen. Neben den immunmodulatorischen Eigenschaften begünstigen MDSCs die Angioneogenese und die Metastasierung von Tumoren (Gabrilovich et al. 2012). Die Akkumulation wird durch Makrophagen koloniestimulierender Faktor (M-CSF), GMCSF, VEGF und Interleukin-6 (IL-6) induziert. Diese Faktoren induzieren in den myeloiden Vorläuferzellen über die Januskinase 2 (JAK2) vorallem den Transkriptionsfaktor STAT3. Dieser bewirkt unter anderem vermehrtes Überleben und Proliferation der myeloiden Vorläuferzellen durch die Hochregulation von zum Beispiel B-Zelllymphom extra groß (BclxL) oder cyclin D1 (Bronte und Zanovello 2005). Des Weiteren bewirkt eine übermäßige und lang andauernde Stimulation von STAT3 einen Differenzierungsstopp in den MDSCs. Dies geschieht über eine Hochregulation von S100 Calcium-bindende Proteine auf der 1 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Oberfläche von myeloiden Vorläuferzellen, die ebenfalls auf MDSCs exprimiert werden (Cheng et al. 2008; Sinha et al. 2008). Neben der Akkumulation der CD11b+ Gr1+ Zellen erfolgt eine weitere Aktivierung der Zellen. Durch diesen Schritt werden Enzyme wie induzierbare NO-Synthase (iNOS), Arginase oder Cyclooxygenase-2 (COX2) hochreguliert, welche für die immunsuppressiven Eigenschaften der MDSCs verantwortlich sind. Die Aktivierung geschieht durch Zytokine und Wachstumsfaktoren wie INFγ, toll-like Rezeptor (TLR) Agonisten, IL-4 oder IL-13, die auch schon an der Akkumulation beteiligt sind (Kusmartsev und Gabrilovich 2005; Bronte et al. 2003; Sinha et al. 2005). Dabei ist die Induktion der Transkriptionsfaktoren STAT1 und 6 sowie nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells (NF-κB) von Bedeutung (Gabrilovich und Nagaraj 2009). Akkumulation und Aktivierung sind daher eng mit einander verknüpft und bedingen sich zum Teil gegenseitig. Es werden zwei Subpopulationen unterschieden, granulozytäre und monozytäre MDSCs. Die granulozytären MDSCs exprimieren CD11b+ Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus G hoch und Locus C niedrig (Ly6Ghoch und Ly6Cniedrig); die monozytären MDSCs exprimieren CD11b+ Ly6Gneg. Ly6Choch (Gabrilovich und Nagaraj 2009). Gr1 ist ein Oberflächenmarker der myeloiden Zelllinie und wird auf deren unreifen Zellen präsentiert. Es hat den Anschein, als hätte Gr1 im Zusammenhang mit MDSCs auch eine Rezeptorwirkung mit ähnlicher Signalwirkung wie GM-CSF (Ribechini et al. 2009). CD11b ist auch bekannt als IntegrinαM oder Mac-1. Es spielt eine Rolle bei der Adhäsion und Migration von Leukozyten oder bei der Komplementkaskade (Solovjov et al. (2005). 1.2. Das Zusammentreffen von T-Zellen und MDSCs im pathologischen Milieu Damit die MDSCs ihrer Funktion nachkommen können, die T-Zellen zu supprimieren, benötigen sie den direkten Kontakt zu der T-Zelle (Sinha 2007). Dieser Kontakt findet im Rahmen der MDSC-vermittelten Tumorimmunität in einem Milieu statt, in dem eine Vielzahl von verschiedenen Zytokinen und Metaboliten vorhanden sind und in dem die meisten Zellen nicht überleben können. Dies liegt zum einen an dem Tumor, der für den Körper Fremdprotein produziert, zum anderen an der körpereigenen Abwehr in Form der zytotoxischen T-Zellen (CTLs), die durch das Fremdantigen des Tumors aktiviert werden 2 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ und zahlreiche Zelltodinduktoren hochregulieren. Ähnliche Zustände herrschen in entzündlichen Geweben vor. Die Entzündung ist neben dem Tumor die meist beschriebene pathologische Situation, bei der die immunsuppressiven Fähigkeiten der MDSCs von Bedeutung sind (Ostrand-Rosenberg und Sinha 2009). 1.3. Die Todessignalwege der zytotoxischen T-Zellen (CTLs) Die Eigenschaften der CTLs sind sehr gut untersucht. Man weiß, dass die T-Zellen die Todesliganden CD95L (FasL, CD178), Tumornekrosefaktor α (TNFα) und TNF-verwandter Apoptose induzierender Ligand (TRAIL) exprimieren (Rouvier et al 1993; Thompson et al. 1989; Kayagaki et al. 1999). Die Liganden werden zum einen auf der Oberfläche exprimiert, und zum anderen werden sie auch ins umliegende Gewebe sezerniert (Hassin et al 2011; Black et al. 1997; Kagawa et al. 2001). Durch Bindung der Liganden an ihre Rezeptoren lösen sie in rezeptorpositiven Zellen den Zelltod aus. CTLs produzieren ebenfalls Granzyme und Perforin, die bei Stimulation des TCR aus ihren Speichergranula in den Extrazellulärraum ausgeschüttet werden. Sie sind über ein weiteres Protein komplexiert. Perforin schleusst Granzym in die Zielzelle ein, welches innerhalb der Zelle über das Schneiden von BH3 interactin death agonist (BID) in tBID und Pro-Caspase3 in Caspase3 Apoptose induziert (Murphy et al. 2008). 1.4. Die Suppressionsmechanismen der myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) Für die MDSCs sind mehrere Mechanismen beschrieben, wie sie die T-Zellfunktion supprimieren (Gabrilovich und Nagaraj 2009). MDSCs supprimieren in vitro die Proliferation von CD8+ und CD4+ T-Zellen, die CD8+ werden etwas stärker supprimiert als die CD4+ (Delano et al. 2007). Um die T-Zellproliferation zu supprimieren, müssen die MDSCs in direkten Zell-Zell-Kontakt mit den T-Zellen treten (Sinha et al. 2007). MDSCs exprimieren iNOS und Arginase 1 (Arg1). Beide Enzyme verstoffwechseln die nicht-essentielle Aminosäure L-Arginin, was zu einer Deprivation der T-Zellen von LArginin im Mikroenvironment führt. L-Arginin ist für die T-Zell- Homöostase eine essentielle Aminosäure (Wu und Morris 2001). iNOS wird von verschiedenen Zellen des Immunsystems exprimiert, unter anderem von myeloiden Zellen und NK-Zellen 3 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ (Diefenbach et al 1999; Angulo et al 2000). Das Enzym katalysiert eine Redox-Reaktion, bei der L-Arginin mit O2 zu L-Citrullin und NO oxidiert wird (Stuehr 1999; MacMicking et al. 1997). Das Produkt NO ist über mehrere Wege in der Lage, die T-Zell-Aktivität zu supprimieren. Eines der Ziele ist der IL-2-Rezeptorsignalweg in den T-Zellen, der durch Nitrosylierung von wichtigen Cystein-Residuen des Signalweges oder über eine Nitrosylierung von JAK1 oder 3 beziehungsweise von STAT5 gehemmt wird (Bissinger et al. 1998). Die IL-2 Wirkung wird auch durch eine verminderte Ausschüttung des Interleukins erschwert (Mazzoni et al. 2002; Fischer et al. 2001). Arginase 1 hydrolysiert L-Arginin zu L-Ornithin und Harnstoff (Wu und Morris 1998). Die gemeinsame Aktivität der Arginase-1 und eines Arginin-Transporters führt zu einer Reduktion der L-Arginin-Konzentration unter die normale Serumkonzentration (Rodriguez et al. 2004). Durch die Deprivation wird die Synthese der CD3-ζ- Kette vermindert, was zu einem Proliferationsstopp der T-Lymphozyten führt (Rodriguez et al. 2003). MDSCs produzieren über NADPH-Oxidase oder iNOS reactive oxygen species (ROS). Superoxidanionen reagieren zum Teil mit NO weiter zu Peroxynitrit (ONOO-) oder anderen reactive nitrogen-oxide species (RNOS) (Xia und Zweier 1997; Xia et al. 1998). ROS und Peroxynitrit oxidieren oder nitrosylieren zum Beispiel den T-Zellrezeptor, das CD8- oder das CD3 Molekül, wodurch die Aktivierung der T-Lymphozyten verhindert wird (Gabrilovich, Ostrand-Rosenberg und Bronte 2012). ROS und Peroxynitrit können Membranen durchqueren und den Zelltod induzieren (Denicola et al. 1998; Reth 2002). Durch die Permeabilisierung von Mitochondrienmembranen gelangt zum Bespiel Cytochrom C in das Zytosol; dies bewirkt in den Zellen die Apoptoseinduktion (Brito et al. 1999; Aulak et al 2001). Neben Peroxynitrit ist vor allem Wasserstoffperoxid (H2O2) an der Suppression der T-Zellen beteiligt. H2O2 bewirkt den Verlust der ζ-Kette in den T-Zellen (Kusmartsev et al. 2004). Wasserstoffperoxid hat einen direkten Einfluss auf die Apoptoseinduktion in antigen-aktivierten T-Zellen. Es bewirkt ein Ungleichgewicht von pro- und anti-apoptotischen Molekülen. Ebenfalls wird die Expression von CD95L auf den T-Zellen induziert, so dass sich die T-Zellen gegenseitig auslöschen (Hildeman et al. 2003). Weitere Mechanismen der T-Zellsuppression umfassen die Beeinflussung der Lymphozytenwanderung und Homöostase. MDSCs exprimieren a disintegrin and metallopeptidase domain 17 (ADAM17) auf ihrer Zelloberfläche, welches CD62L auf der 4 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Oberfläche von naiven CD4+ und CD8+ reduziert. Dadurch wird eine T-Zellrezirkulation in die Lymphknoten verhindert (Hanson et al. 2009). Peroxynitrit entsteht durch die Reaktion verschiedener MDSC-Enzym Produkte. Es verhindert über die Nitrosylierung von CCL2 auf der Oberfläche von CD8+ T-Zellen die Migration der CTLs in den Tumorkern (Molon et al. (2011). Über die Expression von Galectin9 induzieren MDSCs in anergen TZellimmunglobulin und Mucindomäne tragendes Protein 3 positiven (TIM-3+) T-Zellen Apoptose (Sakuishi et al. 2011). Auf der Oberfläche von MDSCs exprimiertes transformierender Wachstumsfaktor β (TGFβ) vermindert zum einen die Anzahl der natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), zum anderen findet ein Funktionsverlust der NKZellen statt (Li et al. 2009; Hoechst et al. 2009; Elkabets et al. 2010). Neben diesen direkten Mechanismen der T-Zellsuppression durch die MDSCs wird auch ein indirekter Mechanismus diskutiert, der über die Induktion von regulatorischen TZellen (Tregs) führt. MDSCs stimulieren über die Interaktion von CD40-CD40L die Klonierungsrate von natürlichen Tregs und vermehren so ihre Anzahl (Pan et al. 2010). Durch die Sezernierung von löslichen Faktoren, insbesondere IL-10 und INFγ werden Tregs aus naiven CD4+ T-Zellen induziert (Huang et al. 2006). Die Expression von Arginase 1 führt ebenfalls zur Induktion von Tregs (Serafini et al. 2008). Todesliganden und Todesrezeptoren Todesliganden und -rezeptoren sind ein weitverbreitetes System zur Geweberegulation und zur Immunabwehr. MDSCs exprimieren unterschiedliche Rezeptoren, die zu den Todesrezeptoren zählen. Sinha et al. (2011) konnte zeigen, dass MDSCs den Todesrezeptor CD95 exprimieren und bei Koinkubation mit CD95L exprimierenden CTLs in Apoptose gehen (Sinha et al. 2011). Andere Studien weisen auf einen Zusammenhang der CD95-Empfindlichkeit und dem vorherrschenden Zytokinmilieu hin. Die Vorbehandlung mit IL-2 und einem agonistischen anti-CD40 Antikörper führt zu einer vermehrten Apoptoseinduktion in MDSCs (Weiss et al. 2014), wohingegen das inflamatorische Milieu eines Tumors die CD95-Sensibilität in MDSCs verringert (Chornoguz et al. 2011). MDSCs exprimieren CD120b, welcher auch als TNF-Rezeptor 2 bekannt ist. Die Stimulation des Rezeptors mit TNFα führt zum Differenzierungsstopp von unreifen myeloiden Zellen und deren Aktivierung zu MDSCs (Zhao et al. 2012; Sade-Feldman et al. 2013). Membrangebundenes TNFα ist für die Aktivierung der immunsuppressiven 5 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Eigenschaften der MDSCs, wie iNOS oder Arginase-1 Expression verantwortlich (Hu et al. 2014). Der TRAIL-Rezeptor 2 (death receptor 5; DR5) wird ebenfalls von den MDSCs exprimiert. Die Stimulation des Rezeptors führt zur Apoptoseinduktion in MDSCs über Stress des endoplasmatischen Retikulums (Condamine et al. 2014). CD95/CD95L-Signalweg Der CD95/CD95L (Fas/FasL)-Signalweg induziert den programmierten Zelltod, die Apoptose (Schulze-Osthoff et al. 1998). Dieser Vorgang ist bei vielen physiologischen Vorgängen von Bedeutung. Als Beispiel kann man die zytotoxischen T-Zellen nennen, die über die Expression des CD95L in Zellen die Apoptose auslösen, die den Rezeptor CD95 tragen; diese Apoptoseinduktion geschieht bei Tumoren oder in entzündlichem Gewebe. Die Bindung von CD95L an CD95 induziert eine Trimerisierung von CD95. Der intrazelluläre Teil von CD95 beinhaltet die sogenannte death domain, diese bindet FADD (Fas-associated death domain) welche wiederum die Pro-Caspase 8 bindet (Kischkel et al. 1995). Dieser Komplex ist ein wichtiger Baustein des extrinsischen Apoptosesignalweges. Dieser aktiviert die nachfolgenden Effektorcaspasen Caspase-3, -6 und -7, die dann die Apoptose bewirken (Zheng et al. 2000). Tumornekrosefaktor α (TNFα)-Signalweg Die Funktion von TNFα im physiologischen Gefüge ist, eine Entzündung zu initiieren und zu unterhalten (Beutler und Cerami 1986). Dafür wird TNFα hauptsächlich von Makrophagen produziert und sezerniert (Satomi et al. 1981). TNFα ist beteiligt an Prozessen wie Autoimmunität oder Tumorerkrankungen. Für TNFα gibt es zwei Rezeptoren: CD120a (TNF-R1) und CD120b (TNF-R2). CD120a ist auf einer Vielzahl von Zellen exprimiert, wohingegen CD120b von nur wenigen Zellen, hauptsächlich Zellen des Immunsystems, exprimiert wird. Die Rezeptoren unterscheiden sich auch in ihrem Aktivierungsmechanismus: CD120a kann sowohl durch lösliches als auch membrangebundenes TNFα aktiviert werden (Chen und Goeddel 2002); CD120b hingegen kann nur durch membrangebundenen TNFα stimuliert werden (Wajant et al. 2003). TNFα kann über seine Bindung an die Rezeptoren anti-apoptotische Signale auslösen, also Überleben. Dies geschieht über eine Aktivierung des NF-κB-Signalweges (Shaulian 2002). Nur wenn der NF-κB-Signalweg gehemmt ist, induziert TNFα über seine Rezeptoren den 6 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Zelltod (Wang et al. 1996). Die Bindung des Liganden an den Rezeptor bei ausgeschaltetem NF-κB bewirkt über die Bildung von zwei Komplexen. Dabei aktiviert der zweite Komplex nur dann die Caspase-8, wenn NF-κB deaktiviert ist (Micheau und Tschopp 2003). Caspase-8 aktiviert dann wiederum die Effektorcaspasen -3, -6- und -7. Ein weiterer Weg, wie TNFα die Apoptose auslösen kann, geht über die Aktivierung der Effektorcaspase Caspase-2 (Duan und Dixit 1997). TNFα wird unteranderem auch für die Aktivierung von MDSCs bei in vitro und ex vivo Versuchen verwendet (Zhao et al. 2012). TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)- Signalweg TRAIL wird vor allem von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), Makrophagen und T-Zellen gebildet, aber auch einige nicht immunologische Zellen exprimieren TRAIL (Thomas et al. 1998; Smyth et al. 2001; Kayagaki et al. 1999). Für TRAIL gibt es mindestens fünf verschiedene Rezeptoren, im murinen System ist aber nur einer von Relevanz in Bezug auf Apoptoseinduktion: death receptor 5 (DR5; TRAIL-R2; KILLER). Die Apoptoseinduktion über diesen Rezeptor läuft ähnlich ab wie die CD95Lvermittelte Zelltodinduktion. Es wird ein Initiierungskomplex gebildet, der über das Adapterprotein FADD die Pro-Caspase-8 bindet (Huang et al. 2002; Thomas et al. 2004; Bodmer et al. 2000). Pro-Caspase-8 wird autolytisch in die aktive Form Caspase-8 überführt. Caspase-8 aktiviert die nachfolgenden Effektorcaspasen-3, -6 und -7 welche dann den Zelltod auslösen (Cohen 1997). 1.5. Fragestellung Die Funktion der MDSCs erfordert ein direktes Zusammentreffen mit T-Zellen, um diese zu supprimieren. Dies geschieht vor allem an Orten mit inflammatorischem Milieu wie Tumore oder entzündliche Gewebe. MDSCs sind dabei den aktivierten und naiven TZellen direkt ausgesetzt. Es kommt somit zum Kontakt mit Todesliganden wie CD95L, TNFα oder TRAIL, für die MDSCs Rezeptoren exprimieren und auch sensibel für sind. Auf der anderen Seite produzieren und sezernieren MDSCs Substanzen wie ROS oder Peroxynitrit, die ebenfalls potentielle Zelltodinduktoren sind. In dieser Arbeit wurde in in vitro Experimenten der Frage nachgegangen, inwieweit die 7 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Apoptoseinduktion bei der Interaktion von MDSCs und T-Zellen von Bedeutung ist. Dabei wurde sowohl untersucht, ob MDSCs durch T-Zellen in Apoptose gehen und ob MDSCs in T-Zellen Apoptose induzieren können. 8 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 2. Material und Methoden 2.1. Materialien: Medien und Puffer: α modification of minimal essential medium (α MEM): alpha MEM [-] L-Glutamin, fetales Rinderserum (FBS) (10%), L-Glutamin (2mM), Natriumpyruvat (1mM), Penicillin (100U/ml) ,Streptomycin (100µg/ml), 2- Mercaptoethanol (0,05mM) Rooswell park memorial institute-Medium (RPMI) (-): RPMI 1640 [-] L-Glutamin, FBS (Gibco) (10%), L-Glutamin (2mM) und Natriumpyruvat (1mM) Erythrozyten-Lysepuffer (EL-Puffer): Ammoniumchlorid (8,29g/l), Kaliumhydrogencarbonat (1,0g/l), Ethyldiamintetraessigsäure (EDTA) (0,037g/l), pH 7,2-7,4. Fluoreszense aktivierte Zelltrennung-Puffer (FACS-Puffer): PBS, fetales Kalbsserum (FCS) (10%), Natriumacetat (0,1%) Annexin-Puffer: Sterofundin, 2-Ethansulfonsäure (HEPES) (5%) Zelllyse-Puffer: Trishydroxymethylaminomethan (Tris) /HCl (30mM, pH 7,5), Natriumchlorid (150mM), Octoxinol 9 (Triton X-100) (1%) und Glycerol (10%), SPI (1mM), Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (1mM) Dithiothreitol (DTT) (1mM) Laufpuffer für Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektorphorese (SDS-Page): Tris-Base (60g/l) und SDS (4g/l),pH 6,8. 6 x Ladepuffer für SDS-Page: N-octyl-β-glucopyranoside (OGP) (70%), Glycerol (0,38g/ml), SDS (0,1g/ml), DTT (93mg/ml) und Bromphenol Blau (0,12mg/ml) 9 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Blotting-Puffer: Tris base (5,8g/l), Glycin (2,9g/l), SDS (0,037%) Methanol (20%) PBS- Polysorbate (Tween) 0,1%: H2O bidest. (90%), 10fach PBS (10%), Tween (0,1%) 10 x Laufpuffer für SDS-Page: Glycin (144g/l), Tris base (30,3g/l), SDS (10g/l) 10 x PBS: Natriumchlorid (80g/l), Di-Natriumhydrogenphosphat (14,4g/l), Kaliumchlorid (2g/l) Kaliumdihydrogenphosphat (2g/l) PBS-Tween (PBST): PBS Tween 20 (0,1%) 1 x Blottingpuffer: Tris base (5,8g/l), Glycin (2,9g/l), SDS (0,037%) Methanol (20%) PBST Milchpulver (5%): Die Lösung wurde zentrifugiert, 30min, 13000 rpm, RT, um nicht gelöste Bestandteile abzutrennen. Der gewonnene Überstand wurde mit 0,05% Natriumazid versetzt. Western Blot-Gele: 10 % Laufgel (SDS-Page): Acrylamid 30%, Aqua bidest, Tris (3M, pH 8,8), SDS 10%, Ammoniumperoxodisulfat (APS) 10%, Tetramethylethylenediamin (TEMED) Ladegel (SDS-Page): Acrylamid 30% (1,6ml), Aqua bidest (5,9ml), OGP (2,5ml), APS 10% (0,03ml) und TEMED (0,01ml) 10 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Tabelle 1: Verwendete Antikörper für Fluoreszenz aktivierte Zelltrennung(FACS). Verwendet wurden AlexaFluor 700 (AF700), Allophycocyan (APC), APC-Cyanin 7 (APC-Cy7),APC-e Flour 780 (APC-eF780), Fluorescein Isothiocyanat (FITC), pacific blue (PB), Phykoerythrin (PE), PE-Cyanin 7(Pe-Cy7). eBioscience BD Pharmingen CD3 AF700, APC, Pe-Cy7 FITC CD4 APC-eF780 FITC, PB, Pe-Cy7, PE CD8 APC, PB, FITC CD11b AF700, APC-eF780, APC CD45.1 APC CD95 CD120a PE purified CD120b Todesrezeptor 5 PE PE (DR5; CD262) H-2Kd APC; PE Lymphozyten PE-Cy7 Antigen 6 Komplex, Locus G (Ly6G) Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus C (Ly6C) APC-Cy7 Mausstämme: Folgende Mausstämme wurden im Laufe dieser Arbeit verwendet. Die Tiere waren zwischen sechs und acht Wochen alt. C57BL/6J (B6): H-2b, CD45.2 Jackson Laboratory 11 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ B6MRL-Faslpr (B6.lpr): H-2b, CD45.2, CD95- Jackson Laboratory (Zuchtpärchen) B6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ (B6.SJL): H-2b, CD45.1 Jackson Laboratory (Zuchtpärchen) B6.SJL/lpr: H-2b, CD45.1, CD95- Eigenzucht DBA/2: H-2d Charles River In dieser Arbeit wurde der Einfluss von CD95/CD95L auf die Interaktion von T-Zellen und MDSCs untersucht. Um besser differenzieren zu könne, ob dieser Signalweg hierbei von Bedeutung ist wurde ein Mausstamm genutzt, der eine Mutation im CD95 Gen trägt. Diese Mausstämme tragen die Zusatzbezeichnung lpr. Es handelt sich bei der Mutation um eine Insertion eines Retrotransponson, das zur Transkription einer abnormen mRNA führt (Watanabe-Fukunaga et al. 1992; Adachi et al. 1993). In lpr-Mäusen ist daher das Vorkommen normaler CD95 mRNA stark vermindert (Chu et al. 1993). Die Tiere exprimieren deshalb kaum nachweisbare Mengen an CD95 auf ihrer Oberfläche (Mariani et al. 1994). Somit handelt es sich nicht um knock-out Mäuse Zelllinien: L929: murine Fibroblastenzelllinie (ATCC) Jurkat: humane T-Zelllinie (ATCC) Chemikalien Substanzen Firma 7-Aminoacetinomycin (7-AAD), Acrylamid, Ammoniumpersulfat Sigma Glycerol, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Tris base, Triton X 100, Tween 20, Natriumdodecylsulfat (SDS), Alpha MEM BioWhittaker Ammoniumchlorid Merck AnnexinV Roche Bromphenolblau, Dithiothreitol (DTT), Easycoll Biochrome 2-Ethansulfonsäure (HEPES) Ethyldiamintetraessigsäure (EDTA), Roth Tetramethylethylenediamin (TEMED) 12 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Fetal Rinderserum (FBS), L-Glutamin, Penicillin/Streptavidin, Gibco Trypan Blue magnitische Zelltrennung (MACS)-Puffer MiltenyBiotec peqGOLD ProteinMarker IV peqlab Carbobenzoxy-Valyl-Alanyl-Aspartyl-[O-Methyl]- Fluoromethylketon (zVAD-fmk) Bachem Kits: LightCycler Fast Start DNA Master Roche RNeasy Lipid Tissue Mini Kit Qiagen CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen ECLWestern Blotting Detection Reagent GE Healthcare Todesliganden und Wachstumsfaktoren rekombinanter humaner CD95L (FasL) mit CrossLinker (Enhancer) Enzo rekombinanter humaner Tumornekrosefaktor α (TNFα) Cell Signaling TNF-verwandter Apoptose induzierender Ligand (TRAIL) Eigenproduktion Granulozyten-/ Makrophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) Peprotech Software: FlowJo Version 8.7.1 (copyright Stanford Universität 1995-1996, Tree Inc. 1997-2008) Microsoft Excel 2008 für Mac, Microsoft Excel 2007 für Windows (beide Microsoft Corporation) LightCycler Software Version 4.1 (Roche) 2.2. Methoden Die Zellen für die Experimente stammen aus 6-12 Wochen alten Mäusen der Stämme B6, B6.lpr, B6.SJL, SJL.lpr oder DBA2. Die Tiere werden vor der Organentnahme zervikal disloziert. Die Zellzahlbestimmung erfolgt mittels Neubauerzählkammer. 13 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Isolation von Knochenmarkzellen (KM) Der Maus werden Femur und Tibia unter der Sterilbank entnommen und das Knochenmark mithilfe einer Kanüle mit PBS-FCS ausgewaschen. Die Zellen werden danach mit 2ml EL-Puffer zur Lyse der Erythrozyten für 5min im 37°C warmen Wasserbad inkubiert. Anschließend erfolgt ein dreimaliges Waschen mit PBS. Isolation von Milzzellen Die Milz wird nach steriler Entnahme mit Hilfe eines Zellsiebs zur Einzelzellsuspension aufgearbeitet. Danach erfolgt die Inkubation in 2ml EL-Puffer für 5min im 37°C warmen Wasserbad. Danach wird dreimal mit PBS gewaschen. Fluoreszense aktivierte Zelltrennung (FACS) - Färbungen Für jede Messung werden jeweils 1x106 Zellen pro Well verwendet. Die Färbung erfolgt mit den jeweiligen FACS-Antikörpern. Diese werden in FACS-Puffer verdünnt. Pro Well benötigt man 100µl Antikörperlösung. Als Färbeplatte dient eine 96-Well Rundbodenplatte. Inkubiert wird für 30min auf Eis in Dunkelheit. Danach wird dreimal mit 200µl FACS-Puffer gewaschen. Die Zellen werden nun in 300µl FACS-Puffer aufgenommen und in FACS-Tubes überführt. Zusätzlich wird jeder Probe 1µg 7-AAD beigefügt zur Erkennung toter Zellen; 7AAD dringt in tote Zellen durch Löcher in der Zellmembran ein und interkaliert dort mit der DNA. Die Färbung mit nicht direkt Farbstoff gekoppelten Antikörpern wird in mehreren Schritten durchgeführt. Um unspezifische Bindungen zu verhindern, wird mit CD16/32 (0,5µg/100µl) für 15min auf Eis geblockt. Dann fügt man den biotinierten Erstantiköper zu und färbt für 30min. bei Raumtemperatur. Es folgt dreimaliges Waschen. Dann erfolgt die Zugabe des PE-Streptavidin gekoppelten Zweitantikörpers, 30min auf Eis in Dunkelheit. In Verbindung mit dem Zweitantikörper wird auch mit anderen direkt farbstoffkonjugierten Antikörpern gefärbt. 7-AAD wird als Vitalitätstest hinzugefügt. Gemessen werden die Proben am LSRII. In vitro Generierung von MDSCs KM-Zellen werden isoliert und in α-MEM aufgenommen. Danach werden sie auf 3x105 KM-Zellen/ml eingestellt und GM-CSF wird mit 200U/ml (10ng/ml) hinzugegeben. Die Aussaht erfolgt auf Zellkulturschalen (Durchmesser 20cm) mit 9x106 Zellen pro Schale. Die 14 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Inkubation erfolgt für 4 Tage im Brutschrank (37°C, 7,5% CO2). Danach sind ca. 90% der Zellen CD11b+ Gr1+positiv. Aktivierung von T-Zellen aus Milzzellen Milzzellen werden wie oben beschrieben isoliert und in α-MEM aufgenommen. Die Zellen werden auf 2x106 Milzzellen/ml eingestellt und mit CD3 (500µg/ml) und CD28 (1000µg/ml) für 3 Tage im Brutschrank (37°C, 7,5% CO2) inkubiert. Naive T-Zellen aus Milzzellen Der Anteil der CD3+ Zellen wird mittels Durchflusszytometrie (FACS) ermittelt. Die Zellen werden wie in oben beschrieben auf CD3 gefärbt. Die Anzahl angefärbter Zellen entspricht dem T-Zell Anteil in der Zellsuspension. Markierung von Zellen mit Carboxyfluorescin Succinimidylester (CFSE) Um die Proliferation von T-Zellen zu untersuchen, werden die T-Zellen mit CFSE markiert. CFSE diffundiert in die Zellen und bindet kovalent an Proteine. Bei jeder Zellteilung geht die Hälfte der so markierten Proteine auf die Tochtergeneration über, die Farbstoffintensität halbiert sich, und somit kann die Proliferationsrate bestimmt werden. CFSE wird in DMSO gelöst. Vor dem Versuch wird eine 5µM Lösung mit PBS 5% FCS hergestellt. Die Zellen werden für 10min bei 37°C gefärbt. Unmittelbar danach kommen die Zellen für 5min auf Eis, um die Reaktion zu beenden. Es wird viermal mit eisgekühltem PBS 5% FCS gewaschen. Um die Effizienz der CFSE Markierung zu bestimmen, werden die Zellen nach Markierung am LSRII gemessen. Gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) Effektoren Milzzellen einer B6 Maus dienen als Effektoren. Entnahme und Aufbereitung erfolgen wie oben beschrieben. Sie werden mit CFSE markiert und auf 5x10 6 Zellen/ml in αMEM eingestellt. Stimulatoren Milzzellen einer allogenen DBA2 Maus werden als Stimulatoren eigesetzt. Sie werden präpariert und mit 33Gy bestrahlt, um die Proliferation zu verhindern. Sie werden auf 5x106 Zellen/ml in αMEM eingestellt. 15 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ MDSCs Es werden MDSCs aus dem Knochenmark von B6 und B6.lpr Mäusen in vitro generiert. Diese sind syngen zu den Effektoren. Die adhärenten MDSCs müssen mit Hilfe eines "cellskratchers" von den Kulturplatten gekratzt werden. Die MDSCs werden in unterschiedlichen Zellzahlen zugefügt; MDSCs : Effektorzellen 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:10 und 1:20. MLR Die MLR wird in 96-Well Rundbodenplatten durchgeführt. Pro Well werden 2,5x105 Effektoren mit ebenso vielen Stimulatoren inkubiert. Hinzu kommen MDSCs in unterschiedlicher Zellzahl. Insgesamt sind 200µl Zellsuspension in jedem Well. Die Inkubation erfolgt im Brutschrank (37°C, 7,5% CO2) für 24h, 72h oder 6-7 Tage. Die Proliferation der CSFE markierten Effektorzellen wird am LSRII gemessen. Isolation von MDSC-Subtypen durch Magnetische Zelltrennung (MACS) MDSC werden wie oben beschrieben aus B6 Mäusen in vitro generiert und nach 4 Tagen geerntet. Das Prinzip dieser Isolation ist die positive Selektion. Die Zellen werden über einen biotinierten Antikörper an magnetische Beads gekoppelt und danach über eine magnetische Säule gegeben. Isolation der granulozytären MDSCs (gMDSCs) 1x107 MDSCs werden in 400µl MACS-Puffer aufgenommen und 200µl des Anti-Ly6GBiotin - Antikörpers hinzugegeben. Es erfolgt eine Inkubationszeit von 10min bei 4°C. Danach werden 400µl der Streptavidin gekoppelten magnetischen Beads (Anti-Biotin-MB) hinzugegeben. Dies wird wiederum für 15min bei 4°C rollend inkubiert. Die Säulen werden vor Gebrauch dreimal mit MACS-Puffer gespült. Die Probe wird mit MACS-Puffer gewaschen und anschießend auf die in den Magneten eingespannte Säule gegeben. Es folgen drei weitere Waschschritte mit MACS-Puffer. Der Durchfluss (D1) wird aufgefangen. Aus ihm werden später die monozytären MDSCs (mMDSCs) isoliert. Die Säule wird nun mit MACS-Puffer eluiert. Dieses Eluat (E1) enthält zu >90% Ly6G+ gMDSCs. Isolation der monozytären MDSCs (mMDSCs) Die Zellen des Durchflusses (D1) werden gezählt und 3,3x10 7 Zellen/ml in MACS-Puffer aufgenommen. Zu jeweils 90µl dieser Zellsuspension werden 10µl der CD11b-Beads 16 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ hinzugegeben. Die Inkubationszeit beträgt 15min bei 4°C. Die Probe wird nun mit MACSPuffer gewaschen und anschließend über die Säule gegeben. Der Durchfluss D2 kann verworfen werden. Die Säule wird mit MACS-Puffer eluiert. Dieses Eluat (E2) enthält zu >90% CD11b+Ly6G- MDSCs, und somit mMDSCs. Zur Qualitätssicherung werden FACSFärbungen für die Ausgangszellsuspension, D1, E1 und E2 durchgeführt (CD11b AF700, Ly6G PE-Cy7, Ly6C APC-Cy7 & 7-AAD). Quantitative Reverse Transkriptase Kettenreaktion (RT-PCR) Isolation von RNA RNA wird aus MDSCs oder aus den Subpopulationen gewonnen. Hierfür werden die Zellen in 1ml Qiazol aufgenommen und 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann werden 200µl Chloroform hinzugegeben und 15sek geschüttelt, danach lässt man das Röhrchen für 2min bei Raumtemperatur stehen. Es folgt eine Zentrifugation für 15min bei 4°C, 13000rpm. Dabei bilden sich zwei Phasen, die Chloroformphase und die rote Qiazolphase. Die RNA ist in der Chloroformphase und wird mit einer Pipette abgenommen. 600µl Ethanol werden hinzugegeben und das Gemisch wird geschüttelt. Dieses Gemisch wird nun auf die Säulen des Qiagen RNeasy - Kits gegeben. Anschließend wird mit den beiden Puffern des Kits (RW1- und RPE-Puffer) gewaschen. Die RNA befindet sich in der Säule und wird mit RNase-freiem Wasser eluiert. Die RNA wird bei -80°C gelagert. Der RNAGehalt wird photometrisch bestimmt. Umschreiben der RNA in cDNA 1µg RNA wird mit 1µl Random Primer bei 85°C für 3min denaturiert. Danach werden 5x 1st Strand Buffer, DTT, desoxy-Nukleotide und Superscript RT hinzu gegeben und geschüttelt. Danach erfolgt die reverse Transkription (15min 37°C --> 30min 45°C --> 15min 50°C --> 2min 95°C). Die cDNA wird bei -20°C gelagert. Polymerase Kettenreaktion Es wird das LightCycler PCR System von Roche genutzt. Zunächst wird ein LightCycler SYBR-Green Mix (LC-Mix) nach Packungsbeilage hergestellt. Die Primer werden alle auf 5µM eingestellt. Der Mastermix enthält LC-Mix, Magnesium und Wasser. Mastermix und Primer werden gemischt. Nachfolgend wird die cDNA hinzu gegeben. Die Polymerase Kettenreaktion erfolgt im LightCycler 2.0 von Roche. Die Expression des Housekeeping-Gens AIP (Aryl17 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Hydrocarbon- Rezeptor-interagierendes Primer für AIP: Protein) dient als Referenzwert. 5´-GCTCCGTTATAGATGACAGC-3´/ 5´-ATCTCGATGTGGAAGATGAG-3´ Primer für TRAIL: 5´-TCACCAACGAGATGAAGCAG-3´/ 5´-TGGAGTCCCAGAAATCCTCA-3´ Western Blot Die Proteine werden aus in vitro generierten MDSCs oder aus deren Subpopulationen isoliert. Proteinisolation Die Zellen werden von den Platten geerntet und dann einmal mit eisgekühltem PBS gewaschen oder zuvor per MACS in die MDSC-Subpopulationen aufgetrennt. Die Lyse erfolgt mittels Lyse-Puffer für 15min auf Eis. Danach wird die Probe zentrifugiert 15min bei 4°C, 14000rpm. Das Lysat wird in ein neues Röhrchen überführt. Die Proteinbestimmung wird mit dem BCA Protein Assay Kit von Pierce nach Packungsbeilage durchgeführt. Die Lagerung erfolgt bei -20°C oder -80°C. Laden des Gels und Elektrophorese Die Proteinproben werden mit 6x loading buffer und bidestilliertem Wasser gemischt und anschließend für 5min bei 96°C denaturiert; dann werden sie in die Geltaschen geladen. Danach folgt die Elektrophorese 35min, 85V, bis sich die Proben im Gel befinden; anschließend wird die Elektrophorese bei 120V weitergeführt. Blotten und Blocken Nach der Elektrophorese werden die Proteine per semi-trocken Blotting Technik auf eine Nitrocellulosemembran übertragen (120V, 50min). Danach wird die Membran für 10min mit PBST gewaschen. Anschließend blockt man die Membran für 1h mit PBST-Milchpulver (5%) bei Raumtemperatur und leichtem Schwenken. Es folgt ein 10min Waschschritt mit PBST. Färbung Der Primärantikörper wird in PBST 0,1% verdünnt und bei 4°C über Nacht bei leichtem Schwenken inkubiert. Es folgen drei Waschschritte mit PBST 0,1% für jeweils 20min bei Raumtemperatur. Der Sekundärantikörpers in PBST 0,1% wird hinzugegeben und der 18 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Ansatz. 1h bei Raumtemperatur und leichtem Schwenken inkubiert. Dreimaliges Waschen für jeweils 10min mit PBST 0,1% folgt. Entwicklung Es wird die Enhanced Chemoluminescence Methode genutzt, um gefärbte Proteine sichtbar zu machen. Hierfür wird das Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent von GE Healthcare nach Packungsanweisung eingesetzt. Koinkubation von naiven und aktivierten T-Zellen mit MDSCs MDSCs werden wie oben beschrieben aus B6 und B6.lpr Mäusen in vitro generiert. TZellen werden aus B6.SJL und B6.SJL.lpr Mäusen präpariert. Aktivierte T-Zellen werden durch Stimulation von Milzzellen mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern für 3 Tage generiert. Die MDSCs werden nach 4 Tagen von den Platten geerntet, und mit 3,75x105 Zellen/Well, 1,25x105 Zellen/Well und 6,25x104 Zellen/Well auf die 96 Well Platten verteilt. Die stimulierten T-Zellen werden nach 3 Tagen aus den Flaschen geerntet, und es wird der Anteil der toten Zellen per Vorwärtsstreuung (FSC)/ Seitwärtsstreuung (SSC) am FACSScan Durchflusszytometer bestimmt. Ist der Anteil der toten Zellen >30%, wird ein Ficoll Gradient durchgeführt, um die toten Zellen abzutrennen. Die naiven T-Zellen werden am Tag des Experiments aus Milzzellen gewonnen. Hierfür werden Milzzellen präpariert und anschließend per FACS-Färbung der Anteil der CD3+ Zellen bestimmt. Dieser Wert dient dann als Maß für den T-Zell Gehalt in den Milzzellen. Die Qualität aller am Experiment beteiligten Zellen wird per FACS-Färbung überprüft. Die stimulierten und naiven T-Zellen werden dann auf 1,25x105 T-Zellen/Well eingestellt und zu den MDSCs auf die 96 Well Platten gegeben. Die Koinkubation erfolgt entweder in Ab- oder Anwesenheit des Caspasen Inhibitors Carbobenzoxy-Valyl-Alanyl-Aspartyl-[OMethyl]- Fluoromethylketon (zVAD-fmk). Die Kultivierung von MDSCs in Abwesenheit von T-Zellen erfolgt in Gegenwart von GMCSF (200U/ml), da sie ohne Wachstumsfaktoren schnell sterben. Die Zelltodkontrollen erfolgten mit rekombinantem humanen CD95L (100ng/ml) und CrossLinker (1µg/ml). 19 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Die Koinkubation erfolgt im Brutschrank (37°C, 7,5% CO2) für drei Zeitpunkte: 24h, 48h und 72h. Es wird alle 24h ein Mediumwechsel durchgeführt, wobei immer Z-VAD.fmk und in den MDSC-Kontrollen GM-CSF zugegeben wird. Die Messungen des Zelltodes der TZellen erfolgt am LSRII, wobei der FSC/SSC zur Bestimmung des Zelltodes genutzt wird. Koinkubation von T-Zellen und MDSCs in Transwells Mit Hilfe der Transwells soll geklärt werden, ob der MDSC-induzierte T-Zelltod durch lösliche Faktoren oder durch den direkten Zellkontakt von MDSCs mit den T-Zellen vermittelt wird. Die Koinkubation erfolgt hier in 24-Well Flachbodenplatten mit 48WellTranswelleinsätzen (Porendurchmesser: 0,4µm). Zur Zelltodkontrolle und zur Durchgängigkeitsüberprüfung wird rekombinanter humaner CD95L (100ng/ml) und CrossLinker (1µg/ml) eingesetzt. Die auf Zelltod zu untersuchenden Zielzellen sind in den 24-Well Flachbodenplatten leichter zu untersuchen als in den 48-Well Transwelleinsätzen. Daher werden die Zielzellen in die unteren Wells, die Effektorzellen in die oberen Wells gegeben. Je nach Fragestellung sind MDSCs Ziel- oder Effektorzellen oder naive T-Zellen sind Zielund aktivierte T-Zellen Effektorzellen (Tab. 1). Das Verhältnis von MDSCs zu T-Zellen (naive, aktivierte) ist immer 3 zu 1. Die Zellzahlen werden so angepasst, dass sich die Ergebnisse aus dem Versuch “Koinkubation von naiven und aktivierten T-Zellen mit MDSCs“ vergleichen lassen. Die MDSCs werden auf 4x106 MDSCs/Well und die T-Zellen auf 1,3x106 T-Zellen/Well eingestellt. Das Gesamtvolumen ist 1000µl/Well. Die Platten werden im Brutschrank (37°C, 7,5% CO2) für 24h, 48h und 72h inkubiert. 20 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Tabelle 2: Pipettierschema für die Koinkubationen von myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) und aktivierten oder naiven T-Zellen in Transwellexperimenten. MDSCs wurden aus Knochenmarkszellen durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage in vitro generiert. T-Zellen wurden mit anti-CD3/CD28 für 4 Tage stimuliert und anschließend mit MDSCs in Transwellplatten wie gezeigt ausgesät. (---) steht für die Trennung der Kompartimente durch eine semipermeable Membran. Kontrollen mit CD95L und CrossLinker sowie Mediumkontrollen. Transwell 3x 3x MDSCs Aktivierte 3x 3x CD95L+CrossLinker CD95L+CrossLinker T-Zellen Naive MDSCs Naive T-Zellen MDSCs T-Zellen Direkter Kontakt Mediumkontrollen MDSCs Aktivierte Naive T-Zellen T-Zellen MDSCs MDSCs Aktivierte CD95L+CrossLinker CD95L+CrossLinker Naive T-Zellen MDSCs Naive T-Zellen T-Zellen Zelltod-Assays mit verschiedenen Todesliganden MDSCs von B6 Mäusen werden in 96-Well Rundbodenplatten mit Todesliganden stimuliert. Pro Well werden 2x105 MDSCs eingesetzt. Apoptoseassays von Jurkat- und L929-Zellen werden mit je 2x104 Zellen durchgeführt CD95L. MDSCs von B6 oder B6lpr Mäusen werden für 24h und 48h mit rekombinantem humanen CD95L (100ng/ml) und CrossLinker (1µg/ml) im Brutschrank (37°C, 7,5% CO2) inkubiert. Der Zelltod wird durch Messung des FSC/SSC oder Annexin-Positivität am LSRII bestimmt. TNFα MDSCs werden mit verschiedenen Konzentrationen (1000U/ml, 5000U/ml, 10000U/ml und 50000U/ml) des rekombinanten humanen TNFα für 24h und 48h im Brutschrank (37°C, 7,5% CO2) inkubiert. Als Positivkontrolle dienen L929-Zellen, die sensitiv für TNFalpha induzierte Apoptose sind. 21 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ TNF-verwandter Apoptose induzierender Ligand (TRAIL) MDSCs werden mit verschiedenen Konzentrationen (100ng/ml, 1000ng/ml, 3000ng/ml, 10000ng/ml und 30000ng/ml) des rekombinanten humanen TRAIL für 24h und 48h im Brutschrank (37°C, 7,5% CO2) inkubiert. Als Positivkontrolle dienen Jurkat-Zellen, die sensitiv für TRAIL-induzierte Apoptose sind. Berechnung der Suppression: Berechnung der spezifischer Zelltod: Statistik: Die Signifikanz wurde mit Hilfe des student´s t-test bestimmt. http://graphpad.com/quickcalcs/ttest1/?Format=SD Mit einem Signifikanzniveau von *= p<0,05; **= p<0,0001; ***= p<0,000001. 22 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 3. Ergebnisse 3.1. Myeloide-derived suppressor cell (MDSC) Generiergung Für die in vitro Generierung von MDSCs wurden Knochemarkszellen (KM-Zellen) von 8-10 Wochen alten C57BL/6 (B6), B6MRL-Faslpr (B6.lpr), B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (B6.SJL) oder B6.SJL/lpr (SJL.lpr) Mäusen mit Granulozyten/ Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage inkubiert. Nach dem Ernten der Zellen erfolgte ein Fluoreszenz aktivierte Zelltrennung (FACS)-Testfärbung mit 7-Aminoacetinomycin D (7AAD), cluster of diffentiation 11b (CD11b), Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus G und Locus C (Ly6G und Ly6C), um die Reinheit der generierten MDSCs festzustellen. 7-AAD wurde hinzugegeben, um tote Zellen auszugaten. Es wurde auf 7-AADneg., CD11b+, Ly6G+/Ly6C+ Zellen gegatet. Die Abbildung 1 zeigt als Beispiel die Dot-Plots einer Testfärbung für die MDSCs. Nach vier Tagen sind mindestens 90% der Zellen CD11b + Ly6G+/Ly6C+ (Blossey et al. 2012). B SSC Ly6G A CD11b Ly6C Abbildung 1: Charakterisierung der myeloid-derived suppressor cell (MDSC)-Subpopulationen nach MDSC-Generierung in vitro. A: Inkubation von Knochenmarkszellen für 4 Tage mit Granulozyten/ Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) resultiert in >90% cluster of diffentiation 11b + positiv (CD11b) MDSCs. B: Die CD11b Zellen werden durch die Expression von Lymphozyten Antigen 6 hoch niedrig Komplex, Locus G und Locus C (Ly6G und Ly6C), in Ly6G Ly6C granulozytäre MDSCs (gMDSCs) neg. hoch und Ly6G Ly6C monozytäre MDSCs (mMDSCs) unterschieden. Seitwärtsstreuung (SSC). 3.2. Isolation der MDSC-Subpopulationen MDSCs können über die Oberflächenmarker Granulozyten Differenzierungs Antigen 1 (Gr1) und CD11b in zwei Subpopulationen unterteilt werden. Granulozytäre MDSCs (gMDSCs) sind definiert als CD11b+ Ly6Ghoch Ly6Cniedrig und monozytäre MDSCs (mMDSCs) als CD11b+ Ly6Gneg. Ly6Choch. Die Isolation der beiden Subpopulationen erfolgte mittels magnetischer Zelltrennung (MACS)-Isolation. MDSCs wurden wie üblich in vitro generiert 23 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ und eine FACS-Testfärbung durchgeführt. Im Anschluss erfolgte die Isolation der beiden Subpopulationen über positive Selektion durch magnetische Beads. Granulozytäre MDSCs wurden in einem ersten Schritt über eine Selektion der Ly6G positiven Zellen isoliert. Da bei der in vitro Generierung nicht alle Zellen nach vier Tagen den MDSC-Phänotyp aufweisen, wurde in einem zweiten Schritt eine Selektion der CD11b positiven Zellen durchgeführt. Die so isolierten Zellen haben den mMDSC-Phänotyp. Die Gating-Strategie entsprach der der MDSC FACS-Testfärbung. Abbildung 2 zeigt die Dot-Plots der verschiedenen Phasen einer MACS-Isolation der Subpopulationen (Blossey et al. 2012). Abbildung 2A zeigt die Zellen vor Isolation. Die Pfeile symbolisieren die Isolationsschritte. Abbildung 2B zeigt die Zellen nach der Selektion der Ly6G positiven Zellen. Abbildung 2C zeigt die CD11b selektionierten Zellen, und die Abbildung 2D zeigt die gleichen Zellen nur mit Ly6G gegen Ly6C aufgetrennt Die Reinheit der Subpopulationen liegt bei mindestens 90% für beide Subpopulationen. A B C D Abbildung 2: Magnetische Zelltrennung (MACS-Isolation) der MDSC-Subpopulationen. Aus in vitro, durch Inkubation von Knochenmarkszellen mit Granulozyten/Makrophagen + koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF), generierten CD11b myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) (A) wurden granulozytäre MDSCs (gMDSCs) über die Positivselektion von Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus G (Ly6G) isoliert (B). In einem zweiten Schritt neg. + wurden aus dem Ly6G -Durchfluss (C) CD11b Zellen selektioniert, die monozytären MDSCs (mMDSCs) (D). Die Reinheit der Subpopulationen ist >90%. Seitwärtsstreuung (SSC); Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus C (Ly6C). 24 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 3.3. MDSCs exprimieren Todesrezeptoren Im Hinblick auf die Fragestellung dieser Arbeit wurden FACS-Färbungen für die Todesrezeptoren CD95, Todesrezeptor 5 (DR5 / TNF-verwandter Apoptose induzierender Ligand (TRAIL)-Rezeptor 2) sowie für CD120a (Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor 1) und CD120b (TNF-Rezeptor 2) mit in vitro generierten B6 MDSCs durchgeführt. Zur Differenzierung der Subpopulationen erfolgte zuvor eine MACS-Isolation. Es wurden Isotyp-Kontrollen mit gefärbt, um eine unspezifische Bindung ausschließen zu können. Abbildung 3 zeigt Histogramme für die unterschiedlichen Färbungen (Blossey et al. 2012). Die obere Reihe der Abbildung entspricht den gMDSCs, die untere den mMDSCs. Die Abbildung zeigt, dass beide Subpopulationen CD95 +, CD120b+ und CD120anegativ sind. Bei der Expression von DR5 unterscheiden sie sich. Die monozytären MDSCs exprimieren DR5 auf ihrer Oberfläche, die granulozytären nicht. Bei CD120b zeigt das Histogramm der monozytären MDSCs eine Zweigipfligkeit. Der erste etwas kleine Gipfel liegt innerhalb der Isotyp-Kontrolle, weshalb man von zwei Unterpopulationen der mMDSCs ausgehen kann. Die eine Unterpopulation ist CD120bnegativ, und die andere ist CD120b+. Zellen [%] gMDSCs mMDSCs CD95 DR5 CD120a CD120b Abbildung 3: Todesrezeptoren Färbungen auf den MDSC-Subpopulationen. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) werden aus Knochenmarkszellen von C57BL/6 Mäusen durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage in vitro generiert. Die Expression von CD95, Todesrezeptor 5 (DR5), CD120a und CD120b auf in vitro generierten MDSCs wurde über eine Fluoreszenz aktivierte Zelltrennung (FACS)-Färbung bestimmt. Unterschieden wird zwischen + granulozytären MDSCs (gMDSCs ―, CD11b , Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus G hoch positiv, Locus hoch positiv + negativ hoch C positiv (Ly6G Ly6C )) und monozytären MDSCs (mMDSCs ―, CD11b , Ly6G , Ly6C ), sowie der Isotyp-Kontrolle (―). 25 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 3.4. MDSCs exprimieren Todesliganden Neben der Expression von Todesrezeptoren wurde auch die Expression von Todesliganden auf in vitro generierten B6 MDSCs untersucht. Da die Liganden zum Teil erst durch Aktivierung auf der Oberfläche exprimiert oder direkt als lösliche Faktoren sezerniert werden, wurden keine Oberflächenfärbungen durchgeführt, sondern die Nachweise wurde auf Ribonukleinsäuren- (RNA-) und Proteinebene geführt. In Ermangelung eines suffizienten Tumornekrosefaktor (TNF) -verwandter Apoptose induzierender Ligand (TRAIL)-Western-Blot Antikörpers wurde die TRAIL Produktion auf RNA-Ebene untersucht. CD95L und Tumornekrosefaktor α (TNFα) wurden auf Proteinebene untersucht. Die in vitro generierten MDSCs wurden in ihre Subpopulationen aufgetrennt und Proteine beziehungsweise RNA isoliert. Die Detektion erfolgte mittels Western-Blot und quantitative Reverse Transkriptase Kettenreaktion (qRT-PCR). Die Abbildung 4 zeigt Western-Blot Banden für CD95L und TNFα sowie β-Actin als Ladungskontrolle. Als Positiv-Kontrolle liefen Proteinisolate von anti-CD3/CD28 aktivierten T-Zellen mit. Beide Subpopulationen der MDSCs exprimieren den CD95L. Dies ist unseres Wissens noch nicht beschrieben worden. Monozytäre MDSCs exprimieren neben CD95L auch den Todesliganden TNFα, gMDSCs nicht (Abb. 4). Die Abbildung 5 zeigt die qRT-PCR Ergebnisse für TRAIL. Aryl-Hydrocarbon- Rezeptor-interagierendes Protein (AIP) diente als house-keeping Gen. Nur monozytäre MDSCs exprimieren TRAIL auf RNAEbene. 26 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ TNFα 26kDa TNFα 17kDa ß-Aktin 40kDa mMDSCs aktivierte T-Zellen 37kDa gMDSCs CD95L Abbildung 4: In vitro generierte MDSCs exprimieren die Proteine TNFα und CD95L. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) wurden aus Knochenmarkszellen von C57BL/6 Mäusen durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage in vitro generiert + und mittels Magnetischer Zelltrennung (MACS) in monozytäre MDSCs (mMDSCs, CD11b neg hoch Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus G negativ und Locus C hoch positiv (Ly6G Ly6C )) und + + hoch granulozytäre MDSCs (gMDSCs, CD11b Ly6G Ly6C ) aufgetrennt. Aus den Subpopulationen wurden Proteine isoliert. Anschließend wurde ein Western Blot für CD95L und Tumornekrosefaktor α (TNFα) durchgeführt. Als Positivkontrolle dienten anti-CD3/28 aktivierter T-Zellen. ß-Aktin diente als Ladungskontrolle. Expression relativ zu AIP 0,03 * gMDSCs mMDSCs 0,02 0,01 0 Abbildung 5: In vitro generierte monozytäre MDSCs exprimieren TRAIL mRNA. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) wurden aus Knochenmarkszellen von C57BL/6 Mäusen durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage in vitro generiert und + mittels magnetischer Zelltrennung (MACS) in monozytäre MDSCs (mMDSCs, CD11b Lymphozyten Antigen neg hoch 6 Komplex, Locus G negativ und Locus C hoch positiv (Ly6G Ly6C )) und granulozytäre MDSCs + + hoch (gMDSCs, CD11b Ly6G Ly6C ) aufgetrennt. Aus den Subpopulationen wurde RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Es folgte eine quantitative reverse Transkriptions-PCR für TRAIL. Die Expression wurde relativ zum house-keeping-Gen Aryl-Hydrocarbon- Rezeptor-interagierendes Protein (AIP) berechnet. Die Daten zeigen die Mittelwerte und Standartabweichung aus biologischen Triplikaten. Signifikanz wurde mittels des student’s t-test ermittelt (* p<0,05). 27 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 3.5. MDSCs supprimieren die Proliferation von T-Zellen In der Literatur ist beschrieben, dass MDSCs die Proliferation und Aktivierung der T-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo inhibieren können (Gabrilovich und Nagaraj 2009). MDSCs sind neben ihrem Phänotyp durch ihre Funktion charakterisiert. Um zu zeigen, dass die MDSCs, die wir in vitro aus Knochenmark generieren, auch funktionell aktiv sind und nicht nur ihre phänotypischen Oberflächenmarker exprimieren, wurden T-Zell- Suppressionsassays durchgeführt. Hierfür wurden aus B6 Mäusen MDSCs in vitro generiert und mit B6 (H-2b) Milzzellen koinkubiert, welche zuvor subletal bestrahlt wurden um diese an der Proliferation zu hindern. Die Effektor-Milzzellen wurden zuvor mit Carboxyfluorescin Succinimidylester (CFSE) gelabelt, um die Proliferation bestimmen zu können. Zur Stimulation der Effektor T-Zellen aus den Milzzellen wurden Stimulator Milzzellen aus einer DBA/2 (H-2d) Maus hinzugegeben. Die MDSCs wurden in diese gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) titriert. Die Suppression wurde nach 6 Tagen gemessen mittels einer FACS-Färbung. Hierfür wurde folgendes Gating-Schema benutzt: H-2b + --> CD3+ --> CD4+ beziehungsweise CD8+/CFSE-Histogramm. Als Kontrollen dienten unstimulierte und stimulierte B6 Milzzellen. Das Ergebnis des Versuches zeigt, dass man nach 6 Tagen bei einem Verhältnis von MDSC zu Milzzelle von 1:1, was einem MDSC zu TZellverhältnis von 3:1 entspricht, eine fast vollständige Suppression sowohl der CD8+ als auch der CD4+ T-Zellen erzielt. Dieser Suppressionseffekt ist titrationsabhängig und nimmt mit dem Verhältnis von MDSC zu T-Zellen ab. Bisher wird dieser Effekt durch die MDSCvermittelte L-Arginin Deprivation erklärt (Gabrilovich et al. 2012). Ein andere Erklärung wäre die Zelltodinduktion in den T-Zellen durch die MDSCs (siehe folgende Abschnitte) 28 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen spezifische Suppression [%] _ 100 CD4 CD8 80 60 40 20 0 Verhältnis MDSCs: Milzzellen b Abbildung 6: MDSCs supprimieren T-Zell-Proliferation. Milzzellen einer C57BL/6 (H-2 ) Maus wurden mit Carboxyfluorescin Succinimidylester (CFSE) markiert. Als Stimulatoren zur Td Zellproliferation dienten bestrahlte DBA/2 (H-2 ) Milzzellen. In vitro, aus Knochenmarkszellen b einer C57BL/6 Maus (H-2 ), generierte myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) wurden mit + den Milzzellen koinkubiert. Nach 6 Tagen wurde die Prozentzahl proliferierender CD4 und + CD8 T-Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die spezifische Suppression wurde wie folgt berechnet. Spez. Suppression = 100-((Probe/ Positivkontrolle)*100) 3.6. MDSCs supprimieren die T-Zellproliferation über Zelltodinduktion Um zu überprüfen, ob die Suppression der T-Zellproliferation durch die MDSCs über die Zelltodinduktion vermittelt wird, wurden die T-Zellen zusätzlich mit 7-AAD gefärbt. Dieser Farbstoff färbt tote Zellen an. Der Versuchsaufbau entspricht dem in Abbildung 6 mit dem Zusatz der 7-AAD-Färbung bei der Messung nach 6 Tagen. Anstelle des CFSE-Histogramms wurde bei der Auswertung 7-AAD gegen CFSE als Dot-Plot verwendet. Eine entsprechende Auswertung ist in Abbildung 7 gezeigt. Bei den Dot-Plots 7-AAD gegen CFSE werden vier Quadranten unterschieden. Dabei sind die 7-AAD+ Zellen als tot und die CFSE+ Zellen als nicht proliferiert anzusehen. Die Dot-Plots haben somit eine zusätzliche Dimension (Zelltod). Die Abbildung 7 zeigt in A zwei Histogramme und von B-E verschiede Dot-Plots 7-AAD gegen CFSE. In Abbildung 7A zeigt der rote Graph stimulierte T-Zellen. Dieser Graph entspricht dem Dot-Plot der Abbildung 7C. Der blaue Graph zeigt T-Zellen mit Stimulatorzellen und MDSCs (MDSC:T-Zell-Verhältnis 3:1). Dieser Graph entspricht der Abbildung 7D. Abbildung 7E zeigt T-Zellen mit Stimulatorzellen und MDSCs (MDSC:T-ZellVerhältnis 1,5:1).In Abbildung 7B sind etwas mehr als 97% der Zellen CFSE +, also nicht proliferiert. 80% dieser Zellen sind 7-AADnegativ, also am Leben. In Abbildung 7C sind ca. 29 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 93% der Zellen CFSEnegativ, also proliferiert. Von diesen Zellen sind etwa gleich viele Zellen 7-AAD+ beziehungsweise 7-AADnegativ. In Abbildung 7D sind mehr als 90% der Zellen CFSE+, also nicht proliferiert. Es fällt auf, dass 2/3 der CFSE+ Zellen in Abbildung 7D ebenfalls 7AAD+ und damit tot sind. Dieser Effekt ist titrationsabhängig. In Abbildung 7E sind etwa 40% der Zellen CFSE+. Von diesen nicht proliferierten Zellen sind ca. gleich viele 7-AAD+ und 7-AADnegativ. Die Ergebnisse aus Abbildung 7C und 7E zeigen, dass die proliferierenden T-Zellen, nachdem sie proliferiert sind, zum Teil absterben. Dies kann mit einer gegenseitigen Zelltodinduktion untereinander (T-Zelle versus T-Zelle) erklärt werden. Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich folgendes zusammenfassen. Die alleinige Suppression der T-Zellproliferation durch die MDSCs würde den Verbleib der T-Zellen im rechten unteren Quadranten (CFSE+, 7-AADnegativ) entsprechen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die T-Zell-Suppression durch die MDSCs über Zelltodinduktion in den T-Zellen vermittelt ist. Dies wird in Abbildung 7D durch den Shift der T-Zellen in den rechten oberen Quadranten (CFSE+, 7-AAD+) wiedergegeben. 30 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Zellen [%] A CFSE C D E 7-AAD B CFSE Abbildung 7: In vitro generierte MDSCs supprimieren T-Zellproliferation mittels Zelltodinduktion. b Carboxyfluorescin Succinimidylester (CFSE) markierte T-Zellen einer C57BL/6 (B6) (H-2 ) Maus wurden d mit subletal bestrahlten allogenen Milzzellen einer DBA/2 (H-2 ) Maus, in An- oder Abwesenheit von in vitro generierten myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), stimuliert. Die Generierung von MDSCs in vitro erfolgte aus Knochenmarkszellen einer B6 Maus durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor für 4 Tage. Die Proliferation der CFSE markierten Milzzellen wurde nach 6 Tagen durch die Bestimmung der CFSE-Verdünnung gemessen. Zusätzlich erfolgte die Zelltodbestimmung mittels 7-Aminoacetinomycin (7-AAD). Gezeigt sind repräsentative Dot-Plots und + die Histogramme für die CD8 T-Zellen. (A) Proliferierte B6 T-Zellen (―) und B6 T-Zellen mit MDSCs (1:3) (―), (B) Medium-Kontrolle, (C) Proliferierte B6 T-Zellen, (D)B6 T-Zellen mit MDSCs im Verhältnis 1:3 und b+ + + (E) im Verhältnis 1:1,5. Gegatet wurde auf H-2 CD3 CD8 T-Zellen. 3.7. Die Zelltodinduktion in den T-Zellen durch MDSCs ist unabhängig von CD95/CD95L Beide MDSC-Subpopulationen exprimieren CD95L (Abb. 4). T-Zellen exprimieren CD95 und sind sensitiv für die Apoptoseinduktion über diesen Rezeptor (Debatin et al. 1990). Ein möglicher Weg, wie die MDSCs in den T-Zellen Zelltod auslösen, ist somit über den CD95/CD95L-Siganlweg gegeben. Um zu überprüfen, ob T-Zellen über diesen Signalweg durch MDSCs in Apoptose gehen, wurden MLRs durchgeführt. Dabei wurden die MLRs 31 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ parallel mit Effektor Milzzellen von B6 (H-2b) Mäusen und von B6.lpr (H-2b, CD95negativ) Mäusen durchgeführt. Die B6.lpr Zellen sind unsensibel gegen über CD95/CD95L induziertem Zelltod. Dabei wurde zwischen CD4+ (Abbildung 8A) und CD8+ (Abbildung 8B) T-Zellen unterschieden. Die Stimulatoren wurden aus DBA/2 (H-2d) Mäusen gewonnen. Die MDSCs wurden in vitro aus Knochenmark von B6 (H-2b) Mäusen generiert und in die MLR titriert. Die Gatingstategie entspricht der des Versuches aus Abbildung 7. Als tote Zellen wurden die CFSE+, 7-AAD+ Zellen definiert. Die Abbildungen 8A und 8B zeigen jeweils parallel die Ergebnisse für die B6 und die B6.lpr T-Zellen. Beide Abbildungen zeigen, dass die stimulierten Zellen im Vergleich zu den unstimulierten Kontrollen weniger absterben. Die Zugabe der MDSCs bewirkt eine deutliche Zunahme der toten T-Zellen sowohl bei den CD4+ (Abb. 8A) als auch den CD8+ T-Zellen (Abb. 8B). Bei einem Verhältnis MDSC: T-Zelle von 3:1 (MDSC: Milzzelle 1:1) sterben bei CD4+ und CD8+ mehr als 80% der Zellen ohne proliferiert zu sein. Dies gilt sowohl für B6 als auch für B6.lpr T-Zellen. Dieser Zelltodinduktionseffekt ist titrationsabhängig und nimmt mit Reduktion von MDSCs bei konstanten T-Zellen ab. 32 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ A (CD4+) p<0,004 tote T-Zellen [%] 100 80 p<0,004 B6.SJL (H-2b, CD95+) SJL.lpr (H-2b, CD95-) p<0,004 p<0,004 60 40 20 0 Verhältnis Milzzellen: MDSCs (B6, H-2b) B (CD8+) p<0,004 tote T-Zellen [%] 100 80 60 p<0,004 p<0,004 p<0,004 40 20 0 Verhältnis Milzzellen: MDSCs (B6, H-2b) Abbildung 8: MDSCs induzieren in allogen aktivierten T-Zellen den Zelltod CD95-unabhängig. a b b + b Milzzellen von B6.SJL-Ptprc Pepc /BoyJ (B6.SJL) (H-2 , CD45.1, CD95 ) und B6.SJL.lpr (SJL.lpr) (H-2 , d CD45.1, CD95 ) Mäusen wurden mit subletal bestrahlten Milzzellen einer DBA/2 (H-2 ) Maus inkubiert. In vitro, mit Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor generierte b myeloid-derived suppressor cells (MDSCs, aus Knochenmarkszellen einer C57BL/6 Maus, H-2 , CD45.2) wurden in unterschiedlichen Zellzahlen zugefügt. Der Zelltod wurde nach 24h, 48h und 72h mittels Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines Durchflusszytometers (FACS) + + bestimmt. Gezeigt ist der Prozentsatz an toten CD4 (A) und CD8 (B) T-Zellen nach 72h Inkubation. Mittelwerte und Standartabweichungen von biologischen Triplikaten werden gezeigt. Signifikanzen werden mittels des student´s t-test gegen die Kontrolle ermittelt (* p<0,004). 33 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 3.8. Die Zelltodinduktion in T-Zellen durch MDSCs ist CD95- und zum Teil caspasenunabhängig Um den Mechanismus der Zelltodinduktion von MDSCs in T-Zellen genauer zu untersuchen, wurde der Versuchsaufbau verändert. Es wurden Koinukbations-Assays mit T-Zellen aus B6.SJL (H-2b, CD45.1+, CD95+) oder SJL.lpr (H-2b, CD45.1, CD95negativ) Mäusen sowie mit MDSCs von B6 (H-2b, CD45.2) Mäusen durchgeführt. Zusätzlich wurde der Versuch in An- und Abwesenheit des Caspaseninhibitor Carbobenzoxy-Valyl-AlanylAspartyl-[O-Methyl]- Fluoromethylketone (zVAD-fmk) durchgeführt. Es wurde zwischen CD4+ und CD8+ T-Zellen unterschieden. Die Messungen erfolgten nach 24h, 48h und 72h. Die Gating-Strategie wurde ebenfalls modifiziert: CD45.1+ --> CD3+--> CD4+/CD8+. Zelltod wurde über den Vorwärtsstreuung / Seidwärtsstreuung (FSC/SSC) bestimmt. Die Abbildung 9A zeigt die CD4+-, die Abbildung 9B die CD8+ T-Zellen exemplarisch nach 48h, zu den beiden anderen Zeitpunkten waren die Ergebnisse ähnlichen (Die Daten werden nicht. Die basale Zelltodrate liegt bei den CD4+ T-Zellen bei ca.48% für die B6.SJL und ca.62% für die SJL.lpr. Die Zelltodrate steigt für beide auf ca. 84% an, bei der Koinkubation mit MDSCs im Verhältnis 3:1 (MDSCs zu T-Zellen). In Anwesenheit von zVAD-fmk liegt die Zelltodrate bei ca. 64% für die B6.SJL und bei ca.70% für die SJL.lpr. Bei den CD8+ T-Zellen liegt die basale Zelltodrate bei ca. 41% für die B6.SJL und ca.58% für die SJL.lpr. Die Zelltodrate steigt für beide auf ca. 92% an, bei der Koinkubation mit MDSCs im Verhältnis 3:1 (MDSCs zu T-Zellen). In Anwesenheit von zVAD-fmk liegt die Zelltodrate bei ca. 82% für sowohl B6.SJL als auch SJL.lpr. Die Ergebnisse des Versuchs 9 zeigen einen signifikante Zelltodinduktion in den T-Zellen. Diese ist CD95/CD95L-unabhängig. Die Anwesenheit von zVAD-fmk verringert diese Zelltodinduktion im Vergleich zu den Proben ohne zVAD-fmk. Dennoch verbleibt auch mit zVAD-fmk eine signifikante Zelltodinduktion in den T-Zellen durch die MDSCs. 34 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ B (CD8+) + A (CD4 ) 80 ** ** * 100 * 60 40 20 tote T-Zellen [%] tote T-Zellen [%] 100 * ** ** * * 80 60 40 20 0 0 Verhältnis T-Zellen:MDSCs (B6, H-2b) Verhältnis T-Zellen :MDSCs (B6, H-2b) B6.SJL (H-2b, CD95+) SJL.lpr (H-2b, CD95-) + + Abbildung 9: MDSCs induzieren CD95/CD95L unabhängig Zelltod in naiven CD4 und CD8 T-Zellen. a b b b Naive T-Zellen von B6.SJL-Ptprc Pepc /BoyJ (B6.SJL) (H-2 , CD45.1) und B6.SJL.lpr (SJL.lpr) (H-2 , CD45.1, CD95 ) Mäusen wurden mit in vitro, generierten myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), in An- und Abwesenheit von 50µM carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]-fluoromethylketon (zVAD-fmk) b inkubiert. MDSCs wurden aus Knochenmarkszellen einer C57BL/6 (B6) (H-2 , CD45.2) Maus durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor für 4 Tage in vitro generiert. Der Zelltod wurde nach 24h, 48h und 72h mittels Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines + + Durchflusszytometers (FACS) bestimmt. Gezeigt ist der Prozentsatz an toten CD4 (A)und CD8 (B) T Zellen nach 48h Inkubation. Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung von repräsentativen Ergebnissen von drei unabhängig durchgeführten Experimenten. Statistische Signifikanz wurde mittels des student´s t-tests ermittelt (* p<0,05; ** p<0,0001). 3.9. Die Zelltodinduktion in T-Zellen durch MDSCs ist zum Teil über lösliche Faktoren vermittelt Die vorhergehenden Experimente zeigen, dass MDSCs Zelltod in T-Zellen induzieren. Der Mechanismus ist unabhängig von CD95 und zum Teil caspasenunabhängig. Es ist jedoch nicht geklärt, wie der Zelltod in den T-Zellen induziert wird. In der Literatur wird diskutiert, ob die Suppressionsmechanismen der MDSCs Zell-Zell-Kontakt benötigen oder ob auch lösliche Faktoren für die Suppression der T-Zellen verantwortlich sind (Gabrilovich et al. 2012). Um zu überprüfen, ob die Zelltodinduktion über lösliche Faktoren oder über Zell-Zell-Kontakt vermittelt ist, wurden Transwell-Experimente durchgeführt. Hierfür wurde ein ähnlicher Versuchsaufbau wie bei Abbildung 9A und 9B verwendet. Es wurden MDSCs aus B6 (H-2b, CD45.2) Mäusen in vitro generiert, die T35 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Zellen stammen aus B6.SJL (H-2b, CD45.1) Mäusen. Die Zellen wurden sowohl direkt koinkubiert, als auch über Transwelleinsätze mit einer Porenmembran (Durchmesser 0.4µm) koinkubiert. Die T-Zellen befanden sich im unteren Kompartiment der Wells, die MDSCs im oberen Kompartiment. Der Zelltod der T-Zellen wurde nach 24h, 48h und 72h mittels FSC/SSC am Durchflusszytometer bestimmt. Es wurde zwischen CD4+ und CD8+ TZellen unterschieden. Die Abbildung 10 zeigt das Resultat des Versuches nach 48h, zu den beiden anderen Zeitpunkten waren die Ergebnisse ähnlich (Daten werden nicht gezeigt). Bei direkter Koinkubation werden beide T-Zellarten zu etwas mehr als 60% abgetötet. Im Transwellaufbau werden etwa 50% der Zellen abgetötet. Der Spontanzelltod beträgt etwa 30%. Der Zelltod der T-Zellen ist also sowohl über direkten Kontakt der T-Zellen mit den MDSCs als auch über lösliche Faktoren induziert, die von den MDSCs sezerniert werden. 100 tote T-Zellen [%] 80 CD4 CD8 ** ** 60 40 20 0 Abbildung 10: MDSCs induzieren den Zelltod in T-Zellen partiell über lösliche Faktoren. Naive TZellen (C57BL/6 (B6), unteres Kompartiment) wurden mit in vitro generierten myeloid-derived suppressor cells (MDSCs, B6, oberes Kompartiment) im Verhältnis 1:3 in flachen 24Welltranswellplatten inkubiert. MDSCs wurden aus Knochenmarkszellen durch Zugabe von Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage in vitro generiert. Als Kontrolle wurden die Zellen in direktem Zellkontakt im Verhältnis 1:3 inkubiert. Der Zelltod wurde nach 24h und 48h mittels Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines Durchflusszytometers (FACS) bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standartabweichungen von Triplikaten nach 48h eines repräsentativen Ergebnisses von drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mittels des student´s t-test gegen die Kontrolle ermittelt (** p<0,0001). 36 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 3.10. MDSCs induzieren Zelltod in anti-CD3/CD28 aktivierten CD8+ T-Zellen und nicht in CD4+ T-Zellen Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass MDSCs naive T-Zellen abtöten. Dies geschieht unabhängig von CD95 und zum Teil unabhängig von Caspasen. Der Zelltod ist teilweise über lösliche Faktoren vermittelt. MDSCs induzieren den T-Zelltod auch während der TZell-Stimulation in einer MLR. Unklar ist, ob die MDSCs Zelltod auch in aktivierten T-Zellen induzieren können. Hierfür wurde der Versuchsaufbau von dem in Abbildung 9 gezeigten Experiment modifiziert. Es wurden T-Zellen von B6.SJL (H-2b, CD95+, CD45.1) und SJL.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.1) Mäusen verwendet. Die T-Zellen wurden für 4 Tage mit anitCD3/CD28 Antikörpern aktiviert. MDSCs wurden in üblicher Weise aus B6 (H-2b, CD45.2) Mäusen in vitro generiert. Das Experiment wurde in An- und Abwesenheit des Caspaseninhibitors zVAD-fmk durchgeführt. MDSCs und T-Zellen wurde für 24h, 48h und 72h koinkubiert, danach wurde der Anteil von toten T-Zellen mittels FSC/SSC bestimmt. Es wurde zwischen CD4+ und CD8+ T-Zellen unterschieden. Das Gating-Schema war wie folgt: CD45.1+--> CD3+--> CD4+/CD8+ --> FSC/SSC. Die Abbildung 11A zeigt die toten CD4+ TZellen, die Abbildung 11B die toten CD8+ T-Zellen nach 24h. Zu beiden anderen Zeitpunkten waren die Ergebnisse ähnlich (Daten werden nicht gezeigt). Der Spontanzelltod liegt bei den CD4+ T-Zellen von B6.SJL bei etwa 70% und SJL.lpr bei 65%. Die Zelltodrate der CD4+ T-Zellen zeigt eine geringe aber signifikante Verminderung bei der Zugabe von MDSCs auf 60-65%. Die Zugabe von zVAD-fmk führt zu einer weiteren signifikanten Abnahme der Zelltodrate auf ca. 60% für B6.SJL und 55% für SJL.lpr T-Zellen. Die Abbildung 11B zeigt die toten CD8+ T-Zellen. Der Spontanzelltod liegt bei etwa 65% für die B6.SJL (H-2b, CD95+, CD45.1) T-Zellen und bei etwa 50% für die SJL.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.1) T-Zellen. In Gegenwart der MDSCs nimmt die Zelltodrate geringfügig aber signifikant zu, auf ca. 70% beziehungsweise 65%. Die Zugabe von zVAD-fmk steigert die Zelltodrate auf ca. 80% für B6.SJL (H-2b, CD95+, CD45.1) und SJL.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.1) T-Zellen. Dies bedeutet, dass MDSCs die Zelltodrate in anti-CD3/CD28 aktivierten CD8+ T-Zellen steigern. In Anwesenheit des Caspaseninhibitors zVAD-fmk wird dieser Effekt verstärkt. MDSCs induzieren jedoch keinen Zelltod in anti-CD3/CD28 aktivierten CD4+ T-Zellen. 37 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ + 100 A (CD4 ) + 100 B (CD8 ) 80 p<0,006 p<0,001 p<0,001 60 40 20 tote T-Zellen [%] tote T-Zellen [%] p<0,006 80 p<0,0006 p<0,0004 p<0,0006 p<0,0004 60 40 20 0 0 Verhältnis T-Zellen:MDSCs (B6, H-2b) B6.SJL (H-2b, CD95+) SJL.lpr (H-2b, CD95-) Verhältnis T-Zellen:MDSCs (B6, H-2b) Abbildung 11: MDSCs induzieren keinen Zelltod in aktivierten T-Zellen. T-Zellen von B6.SJLa b b b Ptprc Pepc /BoyJ (B6.SJL) (H-2 , CD45.1) und B6.SJL.lpr (SJL.lpr) (H-2 , CD45.1, CD95 ) Mäusen wurden mit anti-CD3/28 für 4 Tage stimuliert. Die T-Zellen wurden mit in vitro generierten myeloid-derived suppressor b cells (MDSCs) von C57BL/6 (B6) Mäusen (H-2 , CD45.2), in An- und Abwesenheit von 50µM CarbobenzoxyValyl-Alanyl-Aspartyl-[O-Methyl]-Fluoromethylketon (zVAD-fmk) inkubiert. MDSCs wurden aus Knochenmarkszellen durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GMCSF) für 4 Tage in vitro generiert. Der Zelltod wurde nach 24h, 48h und 72h mittels Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines Durchflusszytometers (FACS) bestimmt. Gezeigt ist + + der Prozentsatz toter CD4 (A) und CD8 (B) T-Zellen nach 48h Inkubation. Gezeigt sind Mittelwerte und Standartabweichungen von Triplikaten eines repräsentativen Ergebnisses aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten. Statistische Signifikanz wurde mittels des student´s t-test ermittelt. MDSCs induzieren in naiven T-Zellen und in T-Zellen einer MLR Zelltod. Dies gilt auch für anti-CD3/CD28 aktivierte CD8+ T-Zellen, jedoch in deutlich geringerem Umfang und nicht für anti-CD3/CD28 aktivierte CD4+ T-Zellen. Die Frage ist, wie sich die aktivierten T-Zellen gegen die Zelltodinduktion durch die MDSCs schützen? Möglich wäre, dass die T-Zellen antiapoptotische Faktoren wie B-Zelllymphom 2 (Bcl-2) oder B-Zelllymphom extra groß (Bcl-xL) hochreguliert haben und so weniger empfindlicher gegenüber einer Zelltodinduktion sind. Möglich wäre auch, dass die aktivierten T-Zellen ihrerseits die MDSCs abtöten. Aktivierte T-Zellen haben ein großes Arsenal an zelltodinduzierenden 38 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Mechanismen. Zum einen exprimieren sie Enzyme und Substanzen wie Perforin und Granzyme, zum anderen Todesliganden wie CD95L, TRAIL oder TNFα; mit all diesen Molekülen können T-Zellen in anderen Zellen den Zelltod auslösen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass MDSCs die Rezeptoren für CD95L, TRAIL und TNFα exprimieren. Die Frage ist nun, ob sie auch sensibel für die ligandenvermittelte Zelltodinduktion sind? Um diese Frage zu untersuchen, wurden MDSCs in üblicher Weise in vitro aus B6 Mäusen generiert und die rekombinanten Todesliganden in unterschiedlichen Konzentrationen auf die MDSCs titriert. Zur Kontrolle wurden parallel zu den MDSCs, unterschiedliche Zelllinien mit den Todesliganden inkubiert, die bekanntermaßen sensibel für die Todesliganden sind. 3.11. MDSCs sind sensibel gegenüber TNFα induziertem Zelltod Die murine Fibroblastenzelllinie L929 ist TNFα sensibel. MDSCs und die Fibroblastenzelllinie wurden über 24h und 48h mit unterschiedlichen Konzentrationen von rekombinantem TNFα inkubiert. Die Zelltodmessung erfolgte mittels Durchflusszytometer. Die Abbildung 12 zeigt die Ergebnisse zu den beiden Messzeitpunkten. Nach 24h reagieren die L929-Zellen so gut wie nicht auf TNFα. Die MDSCs zeigen erst bei einer TNFα-Konzentration von 50000U/ml eine geringe aber signifikante Zunahme der Zelltodrate. Nach 48h sterben die L929-Zellen dosisabhängig ab. Die Zelltodrate steigt von ca. 10% basaler Zelltodrate auf ca. 75%. Die MDSCs zeigen eine geringe aber signifikante Zunahme der Zelltodrate. Nach 48h zeigen die MDSCs eine basale Zelltodrate von ca. 40%, diese steigt bei Zugabe von TNFα auf ca. 44% an. Diese Zunahme ist bei allen TNFαKonzentrationen gleichbleibend und damit nicht dosisabhängig. 39 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 100 24h 48h p<0,01 tote Zellen [%] 80 p<0,01 60 p<0,005 40 20 0 L929 MDSC TNFα [U/ml] Abbildung 12: TNFα induziert in MDSCs Zelltod. In vitro generierte myeloid-derived suppressor cells (MDSCs C57BL/6 (B6), durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor) und L929 Zellen (murine Fibroblastenzelllinie) wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen rekombinantem Tumornekrosefaktor α (TNFα) (1000-50000U/ml) behandelt. Der Zelltod wurde nach 24h und 48h per Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines Durchflusszytometers (FACS) bestimmt. Gezeigt werden Mittelwert und Standardabweichung technischer Triplikate. Statistische Signifikanz wurde mittels des student´s t-test gegen die Kontrolle ermittelt. 3.12. MDSCs sind sensibel gegenüber TRAIL induziertem Zelltod MDSCs wurden in üblicher Weise aus B6 Mäusen in vitro generiert. Zur Kontrolle diente die humane T-Zelllinie Jurkat, die TRAIL sensibel ist. Beide Zelltypen wurden über 24h und 48h mit unterschiedlichen Konzentrationen von rekombinantem TRIAL inkubiert. Die Zelltodmessung erfolgte mittels Durchflusszytometers. Die Abbildung 13 zeigt die Ergebnisse zu den beiden Messzeitpunkten. Nach 24h zeigt sich eine messbare Zelltodinduktion in den Jurkat-Zellen von 26% in der Mediumkontrolle auf ca. 75% bei 1000 ng/ml TRAIL, sowie 98% bei 10000 ng/ml TRAIL. In den MDSCs steigt die Zelltodrate von 29% in der Mediumkontrolle auf 40% bei 10000 ng/ml und auf 50% bei 30000 ng/ml. Nach 48h zeigt sich bei den Jurkat-Zellen das annähernd gleiche Bild wie nach 24h. Die MDSCs zeigen nur bei 30000 ng/ml TRAIL eine signifikante Zunahme der Zelltodrate. MDSCs sind erst bei sehr hohen Konzentrationen sensibel für TRAIL-vermittelte Zelltodinduktion und deutlich weniger empfindlich als Jurkat-Zellen. 40 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ p<0,001 24h 48h p<0,001 100 tote Zellen [%] 80 p<0,001 p<0,04 60 40 20 0 Jurkart neo MDSC TRAIL [ng/ml] Abbildung 13: TRAIL induziert in MDSCs konzentrationsabhängig Zelltod. In vitro generierte myeloid-derived suppressor cells (MDSCs, C57BL/6, durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor) und Jurkat Zellen (humane T-Zelllinie) wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen rekombinantem Tumornekrosefaktor (TNF)-verwandter Apoptose-induzierender Ligand (TRAIL) (100-30000ng/ml) behandelt. Der Zelltod wurde nach 24h und 48h per Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines Durchflusszytometers (FACS) bestimmt. Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung von technischen Triplikaten. Die statistische Signifikanz wurde mittels des student´s t-test gegen die Kontrolle ermittelt. 3.13. Granulozytäre und monozytäre MDSCs sind sensibel für CD95L induzierten Zelltod MDSCs können aufgrund von Oberflächenmarkern in zwei Subpopulationen unterteilt werden: granulozytäre MDSCs (gMDSCs) CD11b+ Ly6Ghoch Ly6Cniedrig und monozytäre MDSCs (mMDSCs) CD11b+ Ly6Gneg. Ly6Choch. Aus Vorversuchen unserer Arbeitsgruppe ist bekannt, dass MDSCs sensibel für CD95L vermittelte Zelltodinduktion sind; dabei wurde bisher nicht zwischen den beiden Subpopulationen unterschieden. Um zu untersuchen, ob es bei der Koinkubation von MDSCs mit CD95L Unterschiede zwischen den Subpopulationen gibt, wurde folgender Versuchsaufbau gewählt. Es wurden MDSCs in üblicher Weise aus B6 (H-2b, CD95+, CD45.2) Mäusen in vitro generiert. Anschließend erfolgt die MACS-Isolation der beiden Subpopulationen, wie sie in Abbildung 2 gezeigt ist. Beide Subpopulationen wurden anschließend mit 100 ng/ml CD95L und 1µg/ml 41 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ CrossLinker koinkubiert. Die Zelltodmessung erfolgt nach 24h mittels FSC/SSC. Die gMDSCs zeigen eine leicht gesteigerte basale Zelltodrate im Vergleich zu den mMDSCs (42% zu 30%)(Abb. 14). In beiden Subpopulationen wird Zelltod induziert, in den gMDSCs ca. 92% in den mMDSCs ca. 82% (Abb. 14). Das entspricht einem spezifischen Zelltod in den gMDSCs von 86% und 74% in den mMDSCs (s. Methoden S.27). Die gMDSCs sind sensibler für die CD95L-vermittelte Zelltodinduktion. tote MDSCs [%] 100 ** 80 ** Medium + CD95L 60 40 20 0 Abbildung 14: MDSCs sind sensitiv für CD95L vermittelten Zelltod. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) wurden in vitro aus Knochenmarkszellen einer C57BL/6 (B6) Maus durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage generiert. Anschließend + wurden sie mittels magnetischer Zelltrennung (MACS-Isolation) in monozytäre MDSCs (mMDSCs, CD11b neg. hoch Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus G negativ und Locus C hoch positiv (Ly6G Ly6C )) und + hoch + granulozytäre MDSCs (gMDSCs, CD11b Ly6G Ly6C ) getrennt. Die Subpopulationen wurden mit rekombinantem humane CD95 Ligand (CD95L, 100ng/ml) und CrossLinker (1µg/ml) für 24h inkubiert. Die Messung des Zelltodes erfolgte durch Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines Durchflusszytometers (FACS). Gezeigt sind Mittelwerte und Standartabweichungen von Triplikaten eines repräsentativen Ergebnisses von drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mittels des student´s t-test ermittelst (** p<0,0001). 3.14. CD95negative und CD95positive MDSCs supprimieren die T-Zellproliferation in gleichem Umfang Die Ergebnisse von Abbildung 14 zeigen, dass MDSCs für CD95L induzierten Zelltod sensibel sind. MDSCs supprimieren in Stimulation befindliche T-Zellen durch Zelltodinduktion (Abb. 8). Die Frage ist, ob CD95neagtive MDSCs einer B6.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.2) Maus die T-Zellproliferation besser supprimieren können, da sie nicht über das CD95/CD95L-System abgetötet werden können. Es wurde eine MLR durchgeführt mit Effektoren aus einer B6.SJL (H-2b, CD95L+, CD45.1) Maus, Stimulatoren aus einer DBA/2 (H-2d) Maus und MDSCs aus sowohl B6 (H-2b, CD95+, CD45.2) als auch 42 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ aus B6.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.2) Mäusen. Die MDSCs wurden in üblicher Weise in vitro generiert und in die MLR titriert. Die Effektoren wurden CFSE markiert. Gemessen wurde die Proliferation der Effektorzellen unterschieden nach CD4 + und CD8+ T-Zellen nach 6 Tagen. Das Gating-Schema war wie folgt: H-2d negativ CD4/CD8 zeigt, --> CFSE/7-AAD. Die Abbildung 15 --> CD45.1+ --> CD3+ --> dass es zu einer konzentrationsabhängigen Suppression der T-Zellproliferation kommt sowohl für CD4+ als auch für CD8+ T-Zellen (Blossey et al. 2012). Dies ist unabhängig davon, ob die MDSCs aus B6 (CD95+) oder B6.lpr (CD95negativ) Mäusen generiert wurden. Die suppressive Kapazität ist also unabhängig vom CD95/CD95L-System. p<0,04 100 T-Zellproliferation [%] p<0,002 80 60 40 20 0 CD4 CD8 B6 (H-2b, CD95+) B6.lpr (H-2b, CD95-) Verhältnis Milzzellen(B6, H-2b) : MDSCs Abbildung 15: B6 MDSCs und B6.lpr MDSCs supprimieren die T-Zell-Proliferation. b Carboxyfluorescin Succinimidylester (CFSE) markierte Milzzellen einer C57BL/6 (B6) (H-2 ) Maus wurden d mit subletal bestrahlten allogenen Milzzellen einer DBA/2 (H-2 ) Maus, in An- oder Abwesenheit von myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) stimuliert. Die MDSCs wurden aus Knochenmarkszellen von + lpr entweder B6 (CD95 ) oder B6MRL-Fas (B6.lpr) (CD95 ) Mäusen durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage in vitro generiert. Die Proliferation wurde nach 6 Tagen durch die Bestimmung der CFSE-Verdünnung mittels Durchflusszytometrie gemessen. Gezeigt sind Mittelwerte und Standartabweichungen von Triplikaten eines repräsentativen Ergebnisses aus drei unabhängig durchgeführten Experimenten. Statistische Signifikanz wurde mittels des student´s t-test gegen die Kontrolle ermittelt. 43 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 3.15. Anti-CD3/CD28 aktivierte T-Zellen induzieren in MDSCs Zelltod, naive T-Zellen nicht Die Ergebnisse aus Abbildung 14 und 15 sagen aus, MDSCs sind CD95L sensibel. Dies führt aber nicht zu einer höheren suppressiven Kapazität von CD95negativen MDSCs. Die Frage ist, ob MDSCs auch im direkten Kontakt mit CD95L exprimierenden anti-CD3/CD28 aktivierte T-Zellen abgetötet werden. Hierfür wurden MDSCs in üblicher Weise aus B6 (H-2b, CD95+, CD45.2) und B6.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.2) Mäusen in vitro generiert. Die MDSCs aus den B6.lpr Mäusen wurden generiete um zu überprüfen, ob die Zelltodinduktion über CD95/CD95L-System abläuft. T-Zellen wurden aus B6.SJL (H-2b, CD95L+, CD45.1) Mäusen isoliert und für 4Tage mit anti-CD3/CD28 Antikörpern inkubiert. Als Kontrolle wurden naive T-Zellen aus B6.SJL Mäusen isoliert. Die aktivierten und naiven T-Zellen wurde in unterschiedlichen Konzentrationen mit den MDSCs aus B6 (H-2b, CD95+, CD45.2) sowie aus B6.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.2) Mäusen koinkubiert. Des Weiteren wurde das Experiment in An- und Abwesenheit des Caspaseninhibitors zVAD-fmk durchgeführt. Nach 24h und nach 48h wurde der Zelltod mittels FSC/SSC bestimmt. Die Gatingstrategie war: CD45.2+ --> CD11b+ --> Ly6G/Ly6C --> FSC/SSC. Die Abbildung 16 A und B zeigen die Ergebnisse des Versuches nach 24h (Blossey et al. 2012). Abbildung 16 A zeigt den Zelltod der B6 und der B6.lpr MDSCs, die mit naiven TZellen koinkubiert wurden. Die Zelltodrate der MDSCs liegt für Mediumkontrollen sowie für die unterschiedlichen T-Zellkonzentrationen bei 38-42%. In Anwesenheit des Caspaseninhibitors zVAD-fmk sinkt die Zelltodrate leicht ab. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass weder B6 (H-2b, CD95+, CD45.2) noch B6.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.2) MDSCs durch die naiven T-Zellen abgetötet werden. Die Abbildung 16 B zeigt im Vergleich den Zelltod der B6 und der B6.lpr MDSCs, die mit anti CD3/CD28 aktivierten T-Zellen koinkubiert wurden. Die Zelltodrate der CD95+ und der CD95negativen MDSCs ist annähernd gleich. Es gibt eine basale Zelltodrate von ca. 41%. Die Zelltodrate bei Koinkubation mit den aktivierten T-Zellen steigt in Abhängigkeit des Zellzahlverhältnisses bis auf ca. 90% an. Die Anwesenheit des Caspaseninhibitors zVADfmk bringt keine Veränderung der Zelltodrate. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass sowohl B6 (H-2b, CD95+, CD45.2) als auch B6.lpr (H-2b, CD95negativ, CD45.2) MDSCs durch die aktivierten T-Zellen abgetötet werden. Dies gilt für alle Konzentrationen der aktivierten TZellen. Ein Titrationseffekt ist erkennbar. Das bedeutet, dass der Zelltod der MDSCs nur 44 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ durch aktivierte T-Zellen induziert wird und dass dieser Zelltod nicht über das CD95/CD95L-System abläuft. Die Zelltodinduktion ist unabhängig vom Caspasensystem. A (naive T-Zellen) B (aktivierte T-Zellen) 100 100 p<0,001 p<0,001 80 60 * 40 20 0 Verhältnis T-Zellen (B6; H-2b): MDSCs tote MDSCs [%] tote MDSCs [%] * 80 60 40 20 0 Verhältnis T-Zellen (B6; H-2b): MDSCs B6 (H-2b, CD95+) B6.lpr (H-2b, CD95-) Abbildung 16 Anti-CD3/CD28 aktivierte T-Zellen, aber nicht naive T-Zellen induzieren Zelltod in MDSCs a b CD95-und caspasenunabhängig. (A) Naive T-Zellen von B6.SJL-Ptprc Pepc /BoyJ (B6.SJL) (CD45.1) Mäusen wurden mit in vitro generierten myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) inkubiert. MDSCs wurden aus + lpr Knochenmarkszellen von entweder C57BL/6 (B6, CD45.2, CD95 ) oder B6MRL-Fas (B6.lpr, CD45.2, CD95 ) Mäusen durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage in vitro generiert. Eine Caspasenabhängigkeit wurde mit der Zugabe von 50µM Carbobenzoxy-Valyl-AlanylAspartyl-[O-Methyl]-Fluoromethylketon (zVAD-fmk) überprüft. Der Zelltod der MDSCs wurde mittels Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines Durchflusszytometers nach 24h bestimmt. (B) B6.SJL T-Zellen (CD45.1) wurden mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern für 4 Tage aktiviert (jeweils 125ng/ml) und anschließend mit in vitro generierten MDSCs (aus B6 oder B6.lpr Mäusen), in An- und Abwesenheit + + von zVAD-fmk, koinkubiert. Gegatet wurde auf CD45.2 CD11b MDSCs. Gezeigt sind Mittelwerte und Standartabweichungen von Triplikaten eines repräsentativen Ergebnisses von drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mittels des student´s t-test gegen die Kontrolle ermittelt (* p<0,05). 45 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 3.16. Anti-CD3/CD28 aktivierte T-Zellen induzieren Zelltod in den MDSCs zum Teil über lösliche Faktoren MDSCs werden abgetötet, wenn sie mit aktivierten T-Zellen koinkubiert werden (Abb. 16B). Dabei ist die Zelltodinduktion unabhängig vom CD95/CD95L-System und unabhängig vom Caspasensystem. Der Versuch lässt allerdings die Frage offen, wie der Zelltod in den MDSCs vermittelt ist. Grundsätzlich können aktivierte T-Zellen über mehrere Mechanismen den Zelltod in ihren Zielzellen induzieren. Dabei kann man zwischen über lösliche Faktoren und über Zell-Zellkontakt vermittelten Induktionswegen unterscheiden. Um zu untersuchen, wie die aktivierten T-Zellen den Zelltod in den MDSCs induzieren, wurden Transwellexperimente durchgeführt. Hierfür wurden MDSCs aus B6 (H-2b, CD95+, CD45.2) Mäusen in vitro generiert. T-Zellen wurden aus B6.SJL (H-2b, CD95L+, CD45.1) Mäusen isoliert und für 4Tage mit anti-CD3/CD28 Antikörpern inkubiert. Die Zellen wurden in eine Transwellplatte gegeben, dabei waren sie durch eine für lösliche Faktoren permeable Membran mechanisch voneinander getrennt. Die T-Zellen befanden sich dabei im oberen, die MDSCs im unteren Kompartiment. Als Kontrollen wurden MDSCs mit Medium, mit aktivierten T-Zellen und mit dem Überstand von aktivierten T-Zellen koinkubiert. Der Zelltod der MDSCs wurde nach 24h und 48h mittels FSC/SSC bestimmt. Dabei war die Gatingstategie wie folgt: CD45.2+ --> CD11b+ --> FSC/SSC Die Abbildung 17 zeigt das Ergebnis dieses Versuchs nach 24h (Blossey et al. 2012). Die basale Zelltodrate der MDSCs liegt hier bei ca. 38%. Bei direkter Koinkubation mit den aktivierten T-Zellen steigt die Zelltodrate auf ca. 75% an. Im Transwell liegt sie bei ca. 58%. Bei der Koinkubation mit dem Überstand der aktivierten T-Zellen bei ca. 60%. Das Ergebnis des Versuchs bestätigt, dass aktivierte T-Zellen den Zelltod in MDSCs induzieren. Dabei ist ein Teil über lösliche Faktoren vermittelt. Diese Faktoren sind sowohl im Transwell als auch im Überstand der T-Zellen vorhanden. 46 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ tote MDSCs [%] 100 80 MDSC p<0,005 * 60 40 20 0 Abbildung 17: Aktivierte T-Zellen induzieren zum Teil über lösliche Faktoren in den MDSCs Zelltod. a b Anti-CD3/28 stimulierte T-Zellen (B6.SJL-Ptprc Pepc /BoyJ (B6.SJL), oberes Well) wurden mit in vitro generierten myeloid-derived supressor cells (MDSCs) (C57BL/6 (B6), unteres Well) in einem Verhältnis von 1:3 in Transwellplatten koinkubiert. MDSCs wurden durch Zugabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) für 4 Tage in vitro generiert. Als Positivkontrolle wurden, die Zellen mit Zellkontakt im Verhältnis 1:3 koinkubiert, sowie der Überstand aktivierter T-Zellen auf MDSCs gegeben. Der Zelltod wurde durch Vorwärtsstreuung/Seitwärtsstreuung (FSC/SSC) eines Durchflusszytometers nach 24h bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standartabweichungen von Triplikaten eines repräsentativen Ergebnisses von drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Signifikanz wurde mittels student´s t-test gegen die Kontrolle ermittelt (* p<0,05). 47 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 4. Diskussion 4.1. In vitro Generierung und ex vivo Isolation von Myeloid-derived suppressor cells Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) wurden in den letzten Jahren immer mehr Beachtung geschenkt. Dies ist mit ihrer zentralen Funktion in der T-Zell-Suppression bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs oder Multipler Sklerose zu erklären (Bronte et al. 1998; Moliné-Velázques et al. 2011). Die murinen MDSCs sind definiert über ihre Funktion der T-Zell-Suppression und über die Oberflächenmarker cluster of differetiation 11b (CD11b) und Granulozyten Differenzierungs Antigen 1 (Gr-1) mit seinen Epitopen Lymphozyten Antigen 6 Komplex, Locus C und Locus G (Ly6C und Ly6G). Diese Charakteristiken sind den granulozytären (CD11b+Ly6GhochLy6Cniedrig) und monozytären (CD11b+Ly6Gneg.Ly6Choch) MDSCs im murinen System gemein (Kusmartsev et al. 2004; Gabrilovich und Nagaraj 2009). Im humanen System sind MDSCs definiert als ZelllinienMarker negativ, humanes Leukozytenantigen - Antigen D verwand negativ (LIN- HLA-DR-) CD33+ oder als CD11b+ CD14- CD33+ Zellen (Ochoa et al. 2007; Srivastava et al. 2008). Es gibt kein Gr-1 Analogon für das menschliche System. Die vorherrschende Ausprägungsform der murinen MDSC-Subpopulationen ist abhängig von den pathologischen Situationen, durch die sie induziert werden, wie zum Beispiel Tumorerkrankungen oder Autoimmunprozesse (Cripps et al. 2010). Die Akkumulation der MDSCs wird durch Wachstumsfaktoren getriggert, wie beispielsweise Granulozyten und Makrophagen- koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) oder Interleukin 3 (IL-3) (Bronte et al. 1998; Gabrilovich et al. 1998; Young et al. 1991). Diese Faktoren werden auch genutzt, um diese Zellen in vitro zu generieren. Die Zusammensetzung der Wachstumsfaktoren ist dafür verantwortlich, welche Subpopulation sich vorwiegend ausbildet (Wu et al. 2011). Für die in vitro Generierung von MDSCs reicht die reine Inkubation mit GM-CSF aus, um mehr als 90% CD11b+ und Gr-1+ Zellen - MDSCs - zu induzieren (Abb. 1; Blossey et al. 2012). In der Literatur werden weitere Methoden zur Generierung von MDSCs beschrieben. Es wird grundsätzlich zwischen der ex vivo Isolation und der in vitro Generation unterschieden. Nach Induktion einer Entzündung (Tumor, Autoimmunität) in Mäusen können MDSCs aus lymphatischen Organen ex vivo isoliert werden (Gabrilovich et al. 48 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 2001). Zur in vitro Generierung von MDSCs aus Knochenmarkszellen verwenden Youn et al. (2008) tumorkonditioniertes Medium. Aufgrund der Generierung von MDSCs im komplexen Tumormilieu ist es in den oben beschriebenen Verfahren jedoch schwer, die für die Akkumulation verantwortlichen Mediatoren und deren Verhältnisse zu einander zu benennen. Obwohl die entstehenden Zellen den publizierten Definitionskriterien für MDSCs entsprechen (CD11b+, Gr1+, T-Zellsuppression), unterscheiden sie sich jedoch untereinander in Eigenschaften und Oberflächenmarkern. Die Zusammensetzung der Wachstumsfaktoren und Zytokine hat einen entscheidenden Einfluss auf die Eigenschaften der daraus resultierenden MDSCs (Bronte und Zanovello 2005). Die in dieser Arbeit verwendeten MDSCs werden ausschließlich durch die Inkubation eines Wachstumsfaktors (GM-CSF) in vitro aus Knochenmark generiert. Dadurch lassen sich spezifische Aussagen zu den durch GM-CSF generierten Zellen treffen. Die Arbeiten von Delano et al. (2007) und Greifenberg et al. (2009) zeigen, dass MDSCs nicht nur zur Akkumulation angeregt, sondern in einem zweiten Schritt auch aktiviert werden müssen. Die Aktivierung der MDSCs wird über Interferonγ (IFNγ) oder IL-4 vermittelt (Kusmartsev et al. 2005; Movahedi et al. 2008; Greifenberg et al. 2009; Chesrown et al. 1994). Der Aktivierungschritt wird in der Literatur als maßgeblich für die suppressiven Eigenschaften der MDSCs angesehen (Wu et al. 2011; Greifenberg et al. 2009). Andererseits zeigt die Arbeit von Highfill et al. (2010), dass MDSCs auch ohne eine vorhergehende Aktivierung eine T-Zell-suppressive Kapazität haben. Diese kann durch die Aktivierung mit IL-13 verstärkt werden (Highfill et al. 2010). Die in vitro generierten MDSCs in dieser Arbeit hemmen auch ohne eine Aktivierung die T-Zellproliferation in einer gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) hoch signifikant (Abb. 15; Blossey et al. 2012). Eine mögliche Erklärung liefert Gallina et al. (2006). Hier erfolgt die Aktivierung der MDSCs unmittelbar durch die T-Zellen. Dies wird in der Arbeit von Highfill et al. (2010) diskutiert. Es ist nicht auszuschließen, dass es zu einer Aktivierung der MDSCs gekommen ist; diese könnte sowohl parakrin durch die T-Zellen als auch autokrin erfolgen. Eine weitere Frage ist, ob es durch das Zusammentreffen der MDSCs und der T-Zellen in einer MLR zu einer Veränderung des Phänotyps oder suppressiven Kapazität der MDSCs kommt. In Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen wurde der Übergang von MDSCs zu anderen myeloiden Zelltypen wie Tumor assoziierte Makrophagen (TAM) oder 49 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ suppressive dendritischen Zellen (sDC) beschrieben (Narita et al. 2008; Kusmartsev und Gabrilovich 2005). 4.2. Apoptoseeigenschaften der MDSCs Wie bereits Arbeiten von Sinha et al. (2011) und Zhao et al. (2012) zeigen, tragen MDSCs die Rezeptoren für die Todesliganden CD95L (CD95) und TNFα (CD120b) auf ihrer Oberfläche. Zusätzlich konnte jetzt gezeigt werden, dass MDSCs den Tumornekrosefaktor (TNF) -verwanter Apoptose induzierender Ligand (TRAIL)-Rezeptor Todesrezeptor 5 (DR5) auf ihrer Oberfläche exprimieren (Abb. 2). Dies ist kürzlich von Arbeitsgruppe um Condamine bestätigt worden (Condamine et al. 2014). Die Expression ist jedoch nicht allein entscheidend, da keine Aussage über die Funktion dieser Signalwege getroffen werden kann. Die funktionelle Integrität der Rezeptoren ist von entscheidender Bedeutung. Die Rezeptoren funktionieren über ein komplexes System von Enzymen und Signalmolekülen. Das Fehlen oder die Funktionslosigkeit eines Bestandteils des Systems kann die Zelltodinduktion verhindern. Beispielsweise ist für den Tumornekrosefaktor α (TNFα) induzierten Zelltod die Inaktivierung des nuclear factor 'kappa-light-chainenhancer' of activated B-cells (NF-κB) Signalweges entscheidend (Wang et al. 1996). MDSCs exprimieren den TNFα-Rezeptor CD120b (Zhao et al. 2012; Abb. 2). Auffallend ist, dass nur hohe Konzentrationen TNFα den Zelltod in MDSCs induzieren und das in sehr geringem Ausmaß (Abb. 12). Eine Erklärung dafür ist, dass der von den MDSCs exprimierte TNFα-Rezeptor CD120b als Überlebensrezeptor und als neutralisierender Rezeptor in myeloiden Zellen fungiert (Rothe et al. 1995; Wang et al. 1998). TNFα induziert in MDSCs Proliferation und Differenzierung zu reifen professionell Antigen präsentierende Zellen (APCs) (Zhao et al. 2012; Bronte et al. 2000). CD120b ist ebenfalls wichtig für die suppressiven Eigenschaften der MDSCs; CD120b-/- MDSCs zeigen keine T-Zellsuppressive Aktivität (Polz et al. 2014). In der vorliegenden Arbeit waren die MDSCs weitgehend unempfindlich gegenüber TNFαinduziertem Zelltod (Abb. 12). Zu untersuchen wäre, ob auch in unserem System die MDSCs durch TNFα einen Proliferationsreiz erhalten oder ihren Phänotyp ändern. 50 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ TRAIL induziert Zelltod (Thomas et al 1998). Andererseits kann TRAIL auch antiapoptotische Signalwirkung haben (Marsters et al. 1997). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MDSCs den TRAIL-Rezeptor DR5 auf ihrer Oberfläche exprimieren (Abb. 2). TRAIL induziert in MDSCs Zelltod (Abb. 13). Das Ausmaß der Zelltodinduktion ist recht gering im Vergleich zu den Kontrollen. Condamine et al. (2014) zeigen, dass TumorMDSCs in der Peripherie durch Apoptoseinduktion über das TRAIL/TRAIL-Rezeptor System reguliert werden. Dabei exprimieren die Tumor-MDSCs vermehrt TRAIL-Rezeptor. Diese Hochregulation ist durch endoplasmatisches Retikulum (ER)-Stress bedingt und konnte nicht durch eine Zytokinbehandlung hervorgerufen werden. Die höhere Expression des TRAIL-Rezeptors wird für die stärkere Sensibilität der Tumor-MDSCs für TRAIL verantwortlich gemacht (Condamine et al. 2014). Dies könnte die niedrige Sensibilität der in dieser Arbeit verwendeten MDSCs gegenüber TRAIL-induziertem Zelltod erklären. In unseren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die von uns generierten MDSCs CD95 positiv sind (Abb. 2; Blossey et al. 2012). Die Inkubation der Zellen mit CD95L führte zur Apoptoseinduktion in den MDSCs (Abb. 14). Somit konnte in dieser Arbeit die Aussage von Sinha et al. (2011) bestätigt werden, dass MDSCs CD95 auf ihrer Oberfläche exprimieren und dafür sensibel sind. Auf der anderen Seite bewirkt die Inkubation der CD95+ MDSCs mit aktivierten CD95L+ T-Zellen einen CD95/CD95L unabhängigen Zelltod in den MDSCs (Abb.16B; Blossey et al. 2012) (siehe Abschnitt 4.3.). Für unterschiedliche myeloide Zellen wurde gezeigt, dass sie Todesliganden wie TNFα, TRAIL oder CD95L produzieren und sezernieren können (Beutler et al. 1986; Süss und Shortman 1996; Taieb et al. 2006). MDSCs sind myeloide Vorläuferzellen; die Frage ist, ob auch sie Todesliganden exprimieren. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass TRAIL auf Ribonukleinsäuren (RNA)-Ebene, CD95L und TNFα auf Protein-Ebene durch MDSCs exprimiert werden (Abb. 4 und 5). Dass MDSCs TNFα exprimieren, wurde bereits bei Tumor-MDSCs beschrieben: die MDSCs wurden aus Tumor tragenden Mäusen isoliert und im Anschluss entweder mit IFNγ und Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert (Sinha et al. 2007), oder die Zellen waren bereits zu Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) weiter differenziert (Kusmartsev und Gabrilovich 2005). Der Nachweis der Expression des Todesliganden CD95L durch die MDSCs ist unserer 51 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Kenntnis nach neu (Abb. 4). In Zusammenschau der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse liegt der Schluss nahe, dass die Zelltodinduktion in den T-Zellen durch die MDSCs über den CD95/CD95L-Signalweg vermittelt ist (siehe Abschnitt 4.3.). Die Expression von TRAIL durch die MDSCs ist, unserer Kenntnis nach, eine neue Entdeckung (Abb. 5). Unsere Versuche lassen allerdings die Frage offen, ob TRAIL auch auf Protein-Niveau exprimiert wird und ob MDSCs TRAIL auf ihrer Oberfläche exprimieren oder sezernieren. 4.3. Einfluss der MDSCs auf die T-Zellen Die MDSCs fungieren als Mediatoren für Immuntoleranz gegenüber einem Tumor oder einem Infektionserreger (Ochoa et al. 2007; Goni et al. 2002). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Suppressionshemmung der MDSCS parallel für CD4+ und CD8+ T-Zellen (Abb. 15; Blossey et al. 2012). In der Literatur wurden CD4+ und CD8+ T-Zellen immer separat untersucht (Sinha et al. 2005; Zea et al. 2005). In dieser Arbeit konnten wir die Suppression der T-Zell-Untergruppen parallel für die gleichen Antigene zeigen (Abb. 15; Blossey et al. 2012). Dabei ist es ohne Bedeutung, ob die MDSCs CD95 auf ihrer Oberfläche tragen oder nicht. Ein erhöhte suppressive Kapazität der CD95- MDSCs wäre zu erwarten gewesen, wenn - wie von Sinha et al. (2011) beschrieben - die Homöostase der MDSCs durch CD95/CD95L regulierte würde. Dies trifft in dieser Arbeit nicht zu (siehe Abschnitt 4.4.). In der Literatur werden zwei Wege beschrieben, wie MDSCs die T-Zell-Proliferation supprimieren. Die MDSCs nutzen sowohl induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) als auch Arginase 1 (Arg1) als Suppressionsmechanismen (Mazzoni et al. 2002; Chang et al. 2001; Pericle et al. 1997). Beide Enzyme können unabhängig voneinander supprimieren (Kusmartsev et al. 2004; Bingisser et al. 1998). Die Suppression funktioniert primär über die verminderte Expression der ζ-Kette des CD3 Moleküls und die Deprivation der T-Zellen von L-Arginin (Rodriguez et al. 2002, 2003, 2004 und 2007). Die ζ-Kette ist die entscheidende Komponente in der Signaltransduktion des T-Zell-Rezeptors (TCR) (Baniyash 2004). Zusätzlich wird der IL-2-Rezeptor daran gehindert, sein Signal an die Zelle weiterzugeben (Mazzoni et al 2002). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass der primäre Suppressionsweg die Zelltodinduktion in den T-Zellen ist (Abb. 7 und 8). Des Weiteren wird gezeigt, dass die 52 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ MDSCs CD95L und TNFα auf Protein-Niveau exprimieren (Abb. 4). Nahe liegend wäre daher die Zelltodinduktion über einen dieser beiden Todesliganden. Da beide MDSCSubpopulationen CD95L exprimieren, konzentrierten wir uns auf diesen Signalweg. Die Versuche zeigen eine vollständige Unabhängigkeit der Zelltodinduktion in den T-Zellen von CD95/CD95L. Eine mögliche Erklärung liefert die Arbeit von Combadiére et al. (1997); hier wird beschrieben, dass eine funktionstüchtige CD3 ζ-Kette vorhanden sein muss, um über CD95 den Zelltod zu induzieren. Die Produktion der ζ-Kette wird aber von den MDSCs gehemmt, was ein entscheidender Suppressionsmechanismus ist (Otsuij et al. 1996). Inwieweit dieser Mechanismus auch für den CD95/CD95L unabhängigen Zelltod der T-Zellen gilt, ist nicht bekannt. In der Literatur wird eine mögliche Erklärung des Suppressionsmechanismuses beschrieben. Arbeiten die Enzyme iNOS und Arg1 zusammen, entsteht aus ihren Produkten Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Stickstoffmonoxid (NO) das Molekül Peroxynitrit (ONOO-), das als eines der stärksten Oxidantien im Organismus gilt. Peroxinitrit ist in der Lage, in den T-Zellen Apoptose zu induzieren (Brito et al. 1999). Bronte et al. (2005) und Nagaraj et al. (2007) konnten diese Aussage nicht bestätigen; MDSC-produziertes Peroxynitrit induziert keinen Zelltod in T-Zellen (Bronte et al. 2005; Nagaraj et al. 2007). Die MDSCs der vorliegenden Arbeit induzieren T-Zelltod und exprimieren die Enzyme iNOS und Arg1, was in Vorarbeiten dieser Arbeitsgruppe gezeigt wurde (Hierweger 2012). Es ist zu untersuchen, ob die Zelltodinduktion durch diesen Mechanismus erklärt werden kann. Die Beobachtung der Transwellexperimente spricht allerdings gegen eine alleinige Todesinduktion durch Peroxynitrit im hier verwendeten System. Peroxynitrit hat eine Halbwertszeit von ca. 10ms, weshalb es nur in einem geringen Radius von 5-20µm um die produzierende Quelle wirkt (Szabó et al. 2007; Nagaraj et al. 2007). Ein gewisser Teil der Zelltodinduktion muss über einen stabileren löslichen Faktor ablaufen (Abb. 10). Ein möglicher Faktor ist NO. Macphail et al. (2003) und Mannickl et al. (1999) gehen von einer NO vermittelten Zelltodinduktion aus. Das durch MDSCs produzierte NO induziert eine Autoreaktivität der T-Zellen über die Hochregulation von Todesrezeptoren und -liganden in den T-Zellen (Macphail et al. 2003; Mannickl et al. 1999). Die Halbwertszeit des NO ist 53 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ mit 2-3s deutlich länger als die des Peroxynitrit, dennoch ist die mathematisch bestimmte Diffusionsstrecke von ca. 200µm deutlich geringer als die im Transwellexperiment zu überbrückende Distanz. Die durch NO induzierte Autoreaktivität ist somit auch keine hinreichende Erklärung für die Zelltodinduktion im Transwellexperiment. Die Beobachtung im Transwellexperiment widerspricht den Ergebnissen von Gabrilovich et al. (2001), der nur bei direktem Zellkontakt eine Inhibition der T-Zellen durch die MDSCs nachweist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die MDSCs spezifisch stimulierte TZellen supprimieren und die Proliferation sowohl der CD4+ als auch der CD8+ T-Zellen gleichermaßen inhibieren (Abb. 8 und 15; Blossey et al. 2012). Gabrilovich et al. (2001) postuliert eine Inhibition nur für die CD8+ T-Zellen, da diese primär antigenspezifisch supprimiert werden (Gabrilovich et al. 2001; Nagaraj et al 2007; Movahedi et al. 2008). Eine mögliche Erklärung sind die Unterschiede der von uns und in der Literatur verwendeten MDSCs. Gabrilovich et al. (2001) verwendet ex vivo isolierte MDSCs von tumortragenden Mäusen. Diese MDSCs unterscheiden sich sehr wahrscheinlich in der Expression von Oberflächenmolekülen und in ihren Eigenschaften. Eine andere Erklärung liefert der Versuchsaufbau. Bei uns werden die T-Zellen (B6; H-2b) über Fremdantigen (DBA/2; H-2d) stimuliert, bei Gabrilovich über Concanavalin A (ConA) und spezifische Peptide. Die von uns und in der Literatur verwendeten Verhältnisse von MDSCs zu Milzoder Lymphknotenzellen unterscheiden sich deutlich voneinander. Wir arbeiten mit Verhältnissen von MDSC zu Milzzelle von 1:1 bis 1:10. In der Literatur werden Verhältnisse von MDSC zu Milzzelle oder Lymphknotenzelle von 1:10 bis 1:100 beschrieben. Dies kann als mögliche Erklärung der Unterschiede dienen. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der primäre Suppressionsmechanismus der MDSCs in unserem System die Zelltodinduktion in den T-Zellen ist. Die Abschwächung der Todesinduktion im Transwellexperiment könnte dadurch erklärt werde, dass es mehrere Mechanismen der Zelltodinduktion gibt. Einer ist sicher über einen löslichen Faktor vermittelt, der andere ist kontaktabhängig. 4.4. Einfluss der T-Zellen auf die MDSCs In pathologischen Situationen besteht die Funktion der MDSCs in der Suppression von T54 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Zellen, um eine Immuntoleranz zu induzieren. Die MDSCs müssen dafür in direkten ZellZell Kontakt mit den T-Zellen treten (Kusmartsev et al. 2005; Nagaraj et al. 2007). In der vorliegenden Arbeit wird der Frage nachgegangen, wie MDSCs in einem Milieu überleben können, welches durch das Vorhandensein von aktivierten T-Zellen geprägt ist. Aktivierte T-Zellen besitzen ein ganzes Arsenal an Möglichkeiten, in Zielzellen Apoptose oder andere Zelltod-Mechanismen auszulösen. Als Beispiel für solche Mechanismen sind unter anderem die Todesliganden CD95L, TNFα oder TRAIL zu nennen, sowie Ligandenunabhängige Mechanismen wie Perforin, Granzym B oder ROS (Nagata 1996; Andersson et al. 1988; Mariani et al. 1998; Podack et al. 1984; Masson et al. 1987). Auch Tumorzellen exprimieren und sezernieren Todesliganden wie CD95L (Lettau et al. 2008). MDSCs scheinen dagegen unempfindlich zu sein, da sie die T-Zellproliferation am Ort des Tumors oder der Entzündung supprimieren. Die Arbeit von Sinha et al. (2011) zeigt, dass die MDSCs CD95+ sind und durch CD95L+ TZellen getötet werden (Sinha et al. 2011). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass die hier verwendeten MDSCs CD95+ sind (Abb. 2) und sensibel für CD95Lvermittelte Zelltodinduktion sind (Abb. 14). Ebenfalls wird gezeigt, dass anti-CD3/28 aktivierte T-Zellen in MDSCs Zelltod induzieren (Abb. 16). Abweichend von der Veröffentlichung von Sinha et al. (2011) ist, dass der T-Zell induzierte Zelltod der MDSCs CD95/CD95L unabhängig ist (Abb. 16; Blossey et al. 2012). Die Zelltodinduktion in den MDSCs ist auch caspasenunabhängig (Abb. 16; Blossey et al. 2012). Ein möglicher Hinweis auf den zugrunde liegenden Mechanismus geben die Transwellexperimente. Diese zeigten, dass zumindest ein Teil der Zelltodinduktion in den MDSCs über einen löslichen Faktor geschehen muss, den die aktivierten T-Zellen in ihr Medium sezernieren (Abb. 17; Blossey et al. 2012). Die Identität dieses oder dieser Faktoren ist bisher unbekannt. Obwohl die MDSCs sensibel für die T-Zell vermittelte Zelltodinduktion sind, supprimieren sie in einer MLR die T-Zellproliferation. Eine mögliche Erklärung liefert die Arbeit von Chornoguz et al. (2011). Hier wird gezeigt, dass ein inflammatorisches Milieu die MDSCs unsensibel für Zelltodinduktion durch T-Zellen macht. Die Arbeit geht besonders auf den CD95/CD95L-Signalweg ein. Eine andere mögliche Erklärung wäre, dass die T-Zellen in der 55 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ MLR noch nicht in dem Maße aktiviert sind wie nach einer viertägigen Behandlung mit anti-CD3/28 Antikörpern. Das Auftreten der MDSCs in verschiedenen pathologischen Situationen und ihre Fähigkeit, die T-Zell vermittelte Immunantwort zu supprimieren, macht sie zu potenziell nutzbaren Gegenspielern der T-Zellen. In Autoimmunerkrankungen wie Multipler-Sklerose oder rheumatoider Arthritis könnten sie zum Abschwächen der durch autoreaktive T-Zellen vermittelten Immunreaktion therapeutisch eingesetzt werden. Ähnliches gilt für den therapeutischen Nutzen in der Graft gegen Wirt Reaktion (GvHD); hier könnten die GraftT-Zellen durch MDSCs supprimiert werden, um so das Anwachsen des Transplantats zu verbessern und eine potentiell lebensbedrohliche Abstoßungsreaktion zu verhindern. Das Auftreten der MDSCs wurde aber vor allem in Tumorerkrankungen beschrieben. Hier haben die MDSCs durch die Suppression der körpereignen Immunantwort auf den Tumor einen aus medizinischer Sicht negativen Effekt. Sie verhindern so die Reduktion des Tumorwachstums durch T-Zell-vermittelte Immunreaktion gegen die Tumorzellen. Dieser Effekt verhindert auch die Graft gegen Leukämie/Tumor Reaktion (GvL oder GvT), der durch die Transplantation von Spenderknochenmark erzielt werden soll. Wünschenswert wäre, MDSCs ganz gezielt nur an einem Ort beziehungsweise nur in einem Zielgewebe zu induzieren. Dies bedeutet, dass prospektiv die Steuerbarkeit der MDSCs von großer Bedeutung sein wird. 56 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 5. Zusammenfassung Myeloide-derived suppressor cells (MDSCs) sind CD11b+ Granulozyten Differenzierung Antigen 1 positive (Gr1) myeloide Vorläuferzellen, die die T-Zell-Proliferation supprimieren. Die Akkumulation von MDSCs wird durch unterschiedliche pathologische Situationen wie Tumor oder Entzündung hervorgerufen. MDSCs supprimieren die TZellproliferation primär über die Enzyme induzierbare NO-Synthase (iNOS) und Arginase 1 (Arg1). In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Suppression der TZellproliferation durch Induktion von T-Zelltod durch MDSCs vermittelt ist. Fraglich war auch, ob T-Zellen ihrerseits in der Lage sind in MDSCs Zelltod zu induzieren. Dazu haben wir MDSCs in vitro generiert und mit naiven und anti-CD3/CD28 aktivierten T-Zellen koinkubiert. Des Weiteren wurden MDSCs in gemischte Lymphozytenreaktionen (MLRs) titriert. Untersucht wurde auf T-Zellsuppression und auf Zelltod sowohl der T-Zellen als auch der MDSCs. Fluoreszenz aktivierte Zelltrennungsanalysen (FACS) zeigen, dass MDSCs die Todesrezeptoren CD95, CD120b und Todesrezeptor 5 (DR5) auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die Inkubation mit den Todesliganden CD95L, TNFα und TRAIL induziert in MDSCs signifikant Zelltod. Der stärkste Effekt wird bei der Inkubation der MDSCs mit CD95L beobachtet. MDSCs, die CD95negativ sind, zeigen keine höhere suppressive Kapazität als CD95+ MDSCs in einer gemischte Leukozytenreaktion (MLR). Die Koinkubation mit anti-CD3/CD28 aktivierten T-Zellen induziert in MDSCs Zelltod. Der MDSC-Zelltod ist CD95/CD95L und caspasenunabhängig und zum Teil über lösliche Faktoren vermittelt. Naive T-Zellen induzieren keinen Zelltod in MDSCs. MDSCs exprimieren die Todesliganden CD95L und TNFα auf Proteinniveau und TRAIL auf RNA-Ebene. Die MDSCs supprimieren die T-Zellproliferation in einer MLR fast vollständig. Die T-Zellen einer MLR mit in vitro generierten MDSCs sterben in Abhängigkeit des Verhältnisses von MDSCs zu T-Zellen. Der T-Zelltod ist CD95 unabhängig. Diese wird bei CD4+ und CD8+ T-Zellen beobachtet. MDSCs induzieren in naiven T-Zellen Zelltod, der CD95 unabhängig und zum Teil caspasenunabhängig ist. Anti-CD3/CD28 aktivierte T-Zellen zeigen eine gering gesteigerte Zelltodrate bei Koinkubation mit MDSCs. Der Anstieg ist deutlich geringer als bei den naiven T-Zellen. Die Zelltodinduktion in den naiven T-Zellen durch die MDSCs ist zum Teil über lösliche Faktoren vermittelt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Inhibition der T57 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Zellproliferation durch die MDSCs in vitro vorrangig durch Zelltodinduktion der T-Zellen vermittelt ist. Welche Relevanz dieser neu entdeckte Suppressionsmechanismus bei der Interaktion von MDSCs mit T-Zellen hat, muss noch geklärt werden. 58 Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ 6. Literaturverzeichnis 1. Adachi M, Watanabe-Fukunaga R, Nagata S: Aberrant transcription caused by the insertion of an early transposable element in an intron of the Fas antigen gene of lpr mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 90: 1756-1760 (1993) 2. 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Des Weiteren gebührt mein besonderer Dank Joanna Messmann, die mir immer mit Rat und Tat zur Seite stand und mich mit Ihrer Begeisterung für die Forschung immer neu motiviert hat auch Rückschläge zu ertragen. Da neben möchte ich auch Maxi Weisswange danken, die mir viel gezeigt und beigebracht hat. Ebenso danke ich Sahra Gering und Corinna Busch. Doktor Daniel Tews danke ich für die nette Zusammenarbeit und seine Hilfe und Ratschläge beim Erlernen der qRT-PCR. Ich möchte all meinen Freunden danken, die mich immer wieder fürs Weitermachen motiviert haben. Besonders danke ich Jonas Korbmacher und Michael Gerisch für die Kaffeepausen. Alexandra Hierweger danke ich für Ihre Geduld und dafür immer die richtigen Worte zu finden wenn alles verloren scheint. Zum Schluss möchte ich meiner Familie danken, die mir mit Ratschlägen und Ablenkung immer zur Seite stand. Besonders danke ich meinem Vater für seine Hilfe und das unzählige Korrekturlesen sowie seine große Geduld. i Die Bedeutung der Zelltodinduktion bei der in vitro Interaktion von MDSCs und T-Zellen _ Richard David Sebastian Blossey, Persönliche Daten: Geburtstag: Geburtsort: Familienstand: Mutter: Vater: Schulbildung: 08/1995 - 07/1999 08/1999 - 06/2008 23.08.1988 Hamburg ledig Dr. med. Auguste Maria Susanne Blossey, geb. Hofmeister Ärztin Prof. Dr. med. Hans-Christian Friedrich Arthur Blossey Arzt (Internist und Endokrinologe) Grundschule am Heideweg, Kassel Wilhelmsgymnasium, Kassel Abschluss: Allgemeinen Hochschulzugangsberechtigung (Abitur) Studium der Humanmedizin: 10/2008 - 09/2010 Vorklinik, Universität Ulm Abschluss: Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung 10/2010 - 04/2014 Klinik, Universität Ulm Abschluss: Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung 10/2011 - 05/2012 Freisemester im Rahmen des Promotionsprogramms für Experimentelle Medizin der Graduierten Schule der Universität Ulm 05/2014 - 04/2015 Praktisches Jahr: Chirurgisches Tertial: Universitätsklinikum Ulm (Unfallchirurgie) Inneres Tertial: Luzerner Kantonsspital, Schweiz (Universität Basel) Wahltertial: Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde, Marienkrankenhaus Hamburg, (Universität Hamburg) Abschluss: Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung 05/2015 Approbation als Arzt Publikation: Blossey, R.D., Messmann, J.J., Debatin, K.-M., Strauss, G., 2012, "Survival and immunosuppressive functions of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) are not regulated by the CD95/CD95L system", poster presentation at the European Congress of Immunology in Glasgow (2012), Poster Sessions. Immunology, 137:185-772. doi:10.1111/imm.12002 Richard Blossey 20.07.2015 ii
