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Induktion einer Endotoxämie in der humanisierten Maus Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Johanna Scholbach geboren in Leipzig angefertigt am: Institut für Klinische Immunologie, Medizinische Fakultät der Universität Leipzig Betreuer: Prof. Dr. Ulrich Sack Dr. Franziska Lange Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 26.01.2016 Inhaltsverzeichnis Bibliographische Beschreibung.............................................................................................................4 Abkürzungsverzeichnis.........................................................................................................................5 Einleitung .............................................................................................................................................8 Sepsis...............................................................................................................................................9 Pathomechanismen der Sepsis und des septischen Schocks......................................................9 Klinische Pathologie der Sepsis und des septischen Schocks.................................................9 Zelluläre Veränderungen im septischen Schock...................................................................10 Diagnose der Sepsis.............................................................................................................12 Induktion der Sepsis im Tiermodell..........................................................................................14 Toxämie-Modell....................................................................................................................14 Bakterielles Infektionsmodell...............................................................................................14 Zerstörung der natürlichen Abwehrbarriere........................................................................15 CLP...................................................................................................................................15 CASP.................................................................................................................................15 Humanisierte Mausmodelle..........................................................................................................17 Züchtung der immundefizienten Mäuse...................................................................................17 Gewinnung der hämatopoetischen Stammzellen.....................................................................19 Induktion der Sepsis in humanisierten Mäusen ...........................................................................20 Wahl des Induktionsmodells.....................................................................................................20 Charakterisierung der Sepsis in der humaniserten Maus.........................................................20 Zielstellung.....................................................................................................................................22 Material und Methoden.....................................................................................................................24 Verwendete Materialien................................................................................................................24 Materialien................................................................................................................................24 Messgeräte................................................................................................................................25 Software....................................................................................................................................26 Methodisches Vorgehen...........................................................................................................27 Tierhaltung...........................................................................................................................27 Aufbereitung des frischen Nabelschnurblutes ....................................................................28 Reagenzien.......................................................................................................................28 Durchführung...................................................................................................................29 Auftauen der Mononukleären Zellen und Transplantation der CD34+-Zellen.....................30 Methodische Grundlagen der magnetischen Seperation...............................................30 Reagenzien.......................................................................................................................30 Durchführung...................................................................................................................31 Durchflusszytometrie ..........................................................................................................32 Methodische Grundlagen des Durchflusszytometers.....................................................32 Reagenzien.......................................................................................................................32 Durchführung...................................................................................................................33 FACS-Ansatz nach Humanisierung..............................................................................33 FACS-Ansatz nach Sepsisinduktion..............................................................................34 Sepsisinduktion....................................................................................................................35 Reagenzien.......................................................................................................................35 Durchführung...................................................................................................................35 Enzym-linked Immunosorbentassay ....................................................................................35 Methodische Grundlagen des capture Enzym-linked Immunosorbentassays................35 Reagenzien.......................................................................................................................36 Durchführung...................................................................................................................36 Cytometric Bead Array ........................................................................................................37 Methodische Grundlagen des Cytometric Bead Arrays..................................................37 Reagenzien.......................................................................................................................37 Durchführung...................................................................................................................38 Statistik.................................................................................................................................38 Ergebnisse...........................................................................................................................................39 Charakterisierung der humanisierten Maus..................................................................................39 Charakterisierung vor Sepsisinduktion.....................................................................................39 Charakterisierung nach Sepsisinduktion...................................................................................42 Charakterisierung der immunologischen Subpopulationen ...............................................43 Charakterisierung der Aktivierung der Subpopulationen....................................................44 Charakterisierung der Zytokinproduktion............................................................................46 Charakterisierung der Produktion von Pentraxin 3..............................................................48 Diskussion...........................................................................................................................................50 Altersunterschiede in der Reaktion auf LPS...................................................................................51 Veränderungen nach LPS-Gabe.....................................................................................................54 Veränderungen des Gehalts der immunologischen Subpopulationen ....................................54 Veränderungen der B-Zellen und T-Zellen...........................................................................54 Veränderungen der CD34-Zellen..........................................................................................55 Veränderung der Granulozyten............................................................................................56 Veränderungen der Monozyten, mDCs und pDCs................................................................57 Aktivierung der immunologischen Subpopulationen...............................................................59 Produktion von Surrogatmarkern ............................................................................................61 Produktion humaner Zytokine.............................................................................................61 Produktion muriner Zytokine...............................................................................................61 Produktion von humanem und murinem Pentraxin 3.........................................................62 Zusammenfassung..............................................................................................................................64 Literaturverzeichnis............................................................................................................................68 Anlagen...............................................................................................................................................74 Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit....................................................................85 Lebenslauf und wissenschaftlicher Werdegang.................................................................................86 Veröffentlichungen.............................................................................................................................87 Danksagung........................................................................................................................................88 Bibliographische Beschreibung Johanna Scholbach „Induktion einer Endotoxämie in der humanisierten Maus“ Universität Leipzig, Dissertation 89 S., 92 Lit., 11 Abb., 19 Tab., 18 Anlagen Referat Die Sepsis ist ein gefürchtetes Krankheitsbild, das in hochentwickelten Industrienationen mit einer hohen Mortalität verknüpft ist und damit zu den häufigsten Todesursachen gehört. Die Pathomechanismen dieses komplexen und heterogenen Krankheitsbildes zu entdecken, gehört momentan zu den Hauptinteressengebieten der Sepsisforschung. Da die Interpretation klinischer Studien aufgrund der Heterogenität des Patientenguts schwierig ist, kommt der Entwicklung adäquater Tiermodelle eine entscheidende Bedeutung zu. Die hierbei gängigen Tiermodelle in Mäusen weisen jedoch Unzulänglichkeiten auf, die die Übertragung der in Tierexperimenten gewonnen Daten auf den klinischen Kontext nur teilweise ermöglichen. Eine Brücke kann hierbei das Tiermodell der humanisierten Maus schlagen, in der, durch Transplantation mit humanen hämatopoetischen Stammzellen, ein humanes Immunsystem reift. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Fragestellung, inwieweit die humanen Immunzellen in der humanisierten Maus in der Lage sind, auf LPS als Stimmulus zu reagieren. Darüberhinaus wird die Nutzung der Endotoxämie in der humanisierten Maus als alternatives Sepsismodell im Bezug zum klinischen Kontext untersucht. Hierbei ergab sich eine mögliche Nutzung des Endotoxämiemodells in der humanisierten Maus zur genaueren Erforschung des Zytokinmilieus, sowie neuer Surrogatmarker wie Pentraxin 3. Bezüglich der Reaktion einzelner immunologischer Subpopulationen und deren Bedeutung für die Klinik scheint eine Untersuchung an Modellen, die eine B- und T-Zell-Reifung nachvollziehen können und in der murine Residualzellen möglichst gering vorhanden sind, als sinnvoll. 4 Abkürzungsverzeichnis AK Antikörper ANOVA Analysis of Variance APC Aktiviertes Protein C CASP Colon Ascendencs Stent Peritonitis CBA Cytometric Bead Array CD Cluster of Differentiation CO2 Kohlendioxid CRP C-reaktives Protein DMEM Dulbecco's Modiefied Eagle Medium EDTA Ethylene Diamine Tertaacetic Accid ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay FACS Flow Assorted Cell Sorting HEPES Hydroxyethyl-Piperazinyl-Ethansulfonsäure HLA-DR Human Leukocyte Antigen-DR HSC Heamatopoetic Stemm Cell ICAM Intercellular Adhaesion Molecule IFN Interferon IL Interleukin i.p. intra peritoneal IRAK IL-1 Receptor-associated Kinase kg Kilogramm lEPCR löslicher endothelialer Protein-C-Rezeptor 5 LPS Lipopolysaccharid MCP Murine Chemoatractant Protein mDC myeloid Dendritic Cell mg Milligramm MHCII Major Histocompatibility Complex II min Minuten ml Milliliter MNC Mononuclear Cell MyD88 Myloid Differentiation Primary Response Gene 88 NaCl Natriumchlorid NFκB Nuclear Factor 'Kappa-light-chain-enhancer' of Activated B-cells NK-Zellen Natürliche Killer-Zellen NOD Nonobese Diabetic Maus NSB Nabelschnurblut NSG NOD Scid Gamma-k/o Maus PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern PBS Phosphate-buffered Saline PCT Procalcitonin pDC plasmacytoid Dendritic Cell pg Picogramm Prkdc Protein kinase DNA-activated Catalytic Polypeptide PTX3 Pentraxin 3 RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur Scid Severe Combined Immunodeficience SIRPα Signal Regulatory Protein α SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrom 6 TF Tissue Factor TLR Toll-like Receptor TNFα Tumornekrosefaktor α TRAF Tumornekrosefakor-Rezeptor-assoziierter Faktor TVV Tierversuchsvorhaben VCAM Vascular Cellular Adhaesion Molecule 7 Einleitung Sepsis, im Volksmund als „Blutvergiftung“ bekannt, ist ein historisch seit Jahrtausenden bekanntes Krankheitsbild, das die Menschheit seit jeher vor große Fragen stellte. Auch wenn Fälle, die wir heute unter dem Begriff Sepsis zusammenfassen würden, schon bei Hippokrates beschrieben sind, war die damalige Vorstellung von Sepsis mit der heutigen nicht vergleichbar. Sepsis leitet sich aus dem griechischen Wort „σῆψις“ ab, was „Fäulnis bedeutet und die damalige Vorstellung des Krankheitsgeschehens erklärt. Hierbei gab es im Laufe der Zeit unterschiedliche Theorien, denen jedoch die Vermutung zu Grunde liegt, dass Sepsis durch schädliche Gase verursacht wird. Mit der Entdeckung des Milzbranderregers durch Robert Koch und sowie durch die Einflüsse Louis Pasteurs und anderer bedeutender Wissenschaftler des 19. Jahrhunderts wurde Verständnis für die Übertragung von Krankheiten durch Erreger geschaffen. Die Sepsis blieb jedoch weiterhin ein unklares und diffus beschriebenes Krankheitsbild. Erst 1989 wurde durch den US-amerikanischen Mediziner Roger C. Bone [1] die noch heute gültige Sepsisdefinition postuliert, bei der Sepsis als Rekation des Organismus auf die Invasion von Mikroorganismen oder deren Toxine beschrieben ist. Auch wenn das Verständnis für die Pathogenese der Sepsis seit Hippokrates stark zugenommen hat, steht die hochspezialisierte Medizin immer noch vor entscheidenden Fragen. Laut Engel et al.[2] liegt die Mortalität bei Patienten mit schwerer Sepsis und intensivmedizinischer Betreuung in Deutschland bei ca. 55%. In den USA zählt Sepsis zu der dritthäufigsten Todesart. Nicht nur diese eindrücklichen Zahlen, sondern auch das Versagen klinischer Studien im Bezug auf die Etablierung diagnostischer Marker sowie therapeutischer Strategien, zeigen, dass trotz molekularbiologischer Forschung auf den kleinsten Ebenen der Entstehung von Krankheitsprozessen der Wissensstand immernoch unzureichend ist. Dies liegt nicht zuletzt an ungenügenden Krankheitsmodellen, die die Erforschung der Pathomechanismen erschweren. Ein häufiges Problem stellt hierbei die Übertragung von aus Tiermodellen gewonnen Erkenntnissen auf den Patienten dar. Außerdem sind verschiedene Tiermodelle, vor allem in der Maus, etabliert, die nur die Beschreibung bestimmter Teilaspekte des im Patienten beobachtbaren Geschehens abbilden [3]. In der Vergangenheit kam es dadurch zu frustranen Therapieversuchen mit neu entwickelten Therapeutika [4]. Diese Arbeit widmet sich daher der Charakterisierung eines neuen Tiermodells für Sepsis, dessen Ausgangsbedingungen grundsätzlich andere darstellen als bisherige Mausmodelle zur 8 Sepsisforschung. Bei diesem Tiermodell handelt es sich um die mittels hämatopoetischen Stammzellen humanisierte Maus. Die Transplantation humaner Stammzellen ermöglicht die Entwicklung eines humanen Immunsystems. Da es, bezogen auf das Immunsystem, vor allem im Bezug auf zytokinvermittlete Reaktionen und deren Rezeptoren, große Unterschiede zwischen Mensch und Maus gibt [5], stellt das Vorhandensein eines humanen Immunsystems in einer Maus einen großen Vorteil dar. Die erwähnten Unterschiede verlieren somit an Bedeutung. Da gerade in der Sepsisforschung großer Wert auf die Betrachtung der Zytokine gelegt wird, ist es möglich, dass mit der humanisierten Maus ein besseres Tiermodell geschaffen werden kann. So könnten in Zukunft der ausbleibende Erfolg von Therapien, wie der Einsatz von anti-TNFα [6], im Vorhinein besser eingeschätzt werden. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der ausführlichen Charakterisierung der zellulären und zytochemischen Veränderungen der humanen Immunzellen während einer Endotoxämie in der Maus und diskutiert, inwiefern sich dieses Tiermodell zur Erforschung der Pathogenese der Sepsis eignet. Sepsis Pathomechanismen der Sepsis und des septischen Schocks Klinische Pathologie der Sepsis und des septischen Schocks Die Sepsis ist ein Krankheitsbild, das durch das sytemische Einwirken pathogener Keime bzw. deren Toxine gekennzeichnet ist. Damit von einer Sepsis gesprochen werden kann müssen in erster Linie der Nachweis einer Infektion sowie einer systemischen Entzündungsantwort erfolgen. Diese ist durch das parallele Auftreten von zwei der Kriterien Fieber, Tachykardie, Tachypnoe und Leukopenie oder Leukozytose gekennzeichnet ist [1]. Um auf das systemische Einwirken der Bakterien zu reagieren, setzt der Körper Entzündungsmediatoren frei. Durch diese kommt es zu einem hypodynamen Kreislaufzustand sowie einer verstärkter intravasalen Gerinnung. Der geringe Blutdruck sowie die Bildung von Mikrothromben führen zur Minderversorgung in Milz, Niere und Leber. Daraus folgt eine Insuffizienz der Organe, Schadstoffe können nicht mehr ausgeschieden werden. Außerdem kommt es in der Lunge zur Weitstellung der Kapillarnetze, welche die Alveolen mit Blut versorgen. Das Endothel, das die Kapilarwände auskleidet, wird durchlässig. Dadurch kann Fibrin und Wasser in die Lunge gelangen, was die Lungenfunktion erheblich beeinträchtigt. Liegen eine oder mehrere Organdysfunktionen zusätzlich zur Infektion und zum generalisierten Entzündungsgeschehen vor, spricht man von einer schweren Sepsis. Kann die schwere Sepsis nicht 9 ausreichend therapiert werden, kann sie in einen septischen Schock münden, der zusätzlich zu den Kriterien der schweren Sepsis einen positiven Schockindex aufweist bzw. den Einsatz von Vasopressoren notwendig macht um den Blutdruck zu stabilisieren. Der septische Schock stellt eine akut lebensbedrohliche Situation dar [7]. Ein verwandtes Krankheitsbild ist das SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrom). Dieses Syndrom kann ebenfalls lebensbedrohlich verlaufen, wird aber im Gegensatz zur Sepsis nicht durch ein infektiöses Geschehen bedingt, sondern durch eine vermehrte Ausschüttung von Entzündungmediatoren in Folge einer Gewebsschädigung. Diese Syndrome werden unter dem Oberbegriff des Sepsissyndroms zusammengefasst. Zelluläre Veränderungen im septischen Schock Die Veränderungen, die der Organismus im Rahmen der Sepsis durchläuft und die im klinischen Bild sichtbar werden, werden nach dem heutigen Stand der Wissenschaft auf zellulärer Ebene vor allem durch Monozyten und Makrophagen hervorgerufen [8]. Es spielen aber auch andere Zellpopulationen wie Granulozyten, T- Zellen, B-Zellen und Endothelzellen eine Rolle. Als wichtigster pathogener Mediator gilt LPS , das sich vorrangig auf der Zellwand gram-negativer Bakterien befindet. Sobald sich gram-negative Bakterien im Blutkreislauf befinden bzw. Lipopolysaccharid (LPS) frei wird, bindet LPS an spezifische Rezeptoren, die sich vor allem auf Makrophagen befinden. Bei diesen Rezeptoren handelt es sich um die Toll-like-Rezeptoren der Klassen 2 und 4 (TLR2, TLR4) [9]. Es werden TLR2 und TLR4 durch LPS stimuliertwodurch innerhalb der Zelle eine Reihe von Proteinkomplexen aktiviert werden. Bisher wurden MyD88, IRAK und TRAF6 als Stufen dieser Kaskade identifiziert [10]. Es sind aber auch alternative Wege bekannt. Gemeinsame Endstrecke der Signaltransduktion ist der Transkriptionsfaktor NF-B. Durch die Aktivierung des Transkriptionsfaktor NF-B kommt es vermehrt zur Produktion von Zytokinen und Interleukinen [11]. Zu Beginn des septischen Schocks werden vor allem proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β, IL-6, IL-8, TNF und IFN freigesetzt [12]. Diese Zytokine aktivieren andere Zellpopulationen wie z.B. Endothelzellen [11]. Die Endothelzellen exprimieren daraufhin Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, VCAM-1), die es den ankommenden Makrophagen ermöglichen, in das Gewebe einzuwandern [13]. Sie sind somit in der Lage, zum Fokus der Infektion vorzudringen und können die Infektion bekämpfen. Zusätzlich kommt es zur Auslösung der Gerinnungskaskade: dies wird unter anderem durch die Freisetzung von tissue factor durch Makrophagen bewirkt [14]. Tissue factor stößt die extrinsische Gerinnungskaskade an und führt zur Bildung von Thrombin. Im gesunden Patienten herrscht zwischen dem gerinnungsfördernden Thrombin und dem 10 gerinnungshemmenden aktivierten Protein C ein Gleichgewicht, das durch einen negativen Rückkoppelungsmechanismus zwischen Thrombin-Thrombomudlin-Komplex und aktiviertem Protein C stabilisiert wird. Während der Sepsis wird aber die Bildung des dieses Gleichgewicht vermittelnden Thrombin-Thrombomodulin-Komplexes gestört. Dadurch steht einer steigenden Konzentration von Thrombin keine entsprechende Konzentration von Thrombin-ThrombomodulinKomplex bzw. aktiviertem Protein C gegenüber. Zugleich wird während der Sepsis die antikoagulatorische Wirkung von Protein C durch lösliche endotheliale Protein-C-Rezeptoren vermindert [15]. Diese Imbalance in der Gerinnungskaskade wird durch zahlreiche andere Mechanismen gefördert, deren Bedeutung noch nicht endgültig geklärt ist. Letztendlich führt sie zur verstärkten Bildung von Mikrothromben, die erst ein Nierenversagen und dann das Versagen der anderen Organe nach sich ziehen. M extrinsische Gerinnungskaskade TF Thrombin Protein C IL-6 TNFα IL-10 INFγ Fibrinogen lEPCR Fibrin APC T Thrombomodulin M Abb. 1 : Vereinfachte Darstellung des Zusammenspiels von Entzündungsreaktion und Gerinnungskaskade während Sepsis. LPS aktiviert die Monozyten (M) durch TLR2/4. Diese setzen daraufhin Zytokine (IL-6, TNF, IL-10, IFN) sowie Tissue factor (TF) frei. Die Freisetzung der Zytokine bewirkt unter anderem die Aktivierung von T-Zellen sowie die 11 Exprimierung von Adhäsionsmolekülen (ICAM) auf Endothelzellen. Die Freisetzung von TF stößt die extrinsische Gerinnungskaskade an. Dadurch entsteht Thrombin, was wiederrum die Spaltung Fibrinogen in aktives Fibrin umwandelt. Der Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes verstaärkt die Umwandlung von Protein C in aktiviertes Protein C (APC). APC hemmt die Bildung von Thrombin. Während einer Sepsis (rot markiert) werden sogenannte lösliche endotheliale Protein- C -Rezeptoren (lEPCR) gebildet, die die Aktivierung von Protein C hemmen (roter Blitz). Durch fehlendes APC findet eine verringerte Hemmung der Bildung des Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes statt (roter Blitz). Daraufhin wird vermehrt Fibrin gebildet. Außerdem steigt die Produktion der von Monozyten gebildeten Zytokine an, die eine starke Entzündungsreaktion hervorufen. Darüber hinaus kommt es zur Aktivierung des Komplementsystems [16]. Das Komplementsystem ist ein Teil des angeborenen Immunsystems und dient, neben den zellulären Bestandteilen des Immunsystems, zum Schutz des Körpers gegen infektiöse Pathogene, indem es ebenfalls die Freisetzung von Zytokinen ermöglicht, Entzündungszellen anlockt und die Pathogene durch Markierung für das Immunsystem sichtbar macht [17]. Letztendlich wird durch das Andocken des LPS an TLR2 und TLR4 auf den Makrophagen eine vielfache Verstärkung der Immunantwort erzeugt. Es kommt zu einer starken Immunreaktion des Körpers, die in den schweren klinischen Symptomen der Sepsis wie Fieber, Hypotnesion, Tachykardie, Tachypnoe und verstärkter intravasaler Gerinnung enden. Diagnose der Sepsis Neben den bereits erwähnten klinischen Veränderungen wie Fieber, Tachykardie, Blutdruckabfall, Abfall der Thrombozytenzahl, Nieren-, Leber- und Lungeninsuffizienz, gilt bisher zur Diagnose der Sepsis das Anlegen einer Blutkultur als Standardmethode. Hierbei wird dem Patient venöses Blut abgenommen und aerob und anaerob in Blutkulturflaschen gefüllt. Diese werden zur Kultivierung mehrere Tage bei 37°C inkubiert. Danach wird eine Keimbestimmung durchgeführt. Bei einer Sepsis sollte der Befund positiv sein. Allerdings kommt es nur bei ca. 17% der Sepsisfälle [18] zu einem positiven Blutkulturergebnis. Dies ist laut Schmitz et al. [19] vor allem der Variabilität der Durchführung in der Anlage der Blutkultur geschuldet. Problematisch ist auch, dass der Nachweis im Verhältnis zum Fortschreiten des septischen Geschehens sehr lange dauert. Deshalb sucht man verstärkt nach Laborparametern, die eine standardisierte Diagnostik der Sepsis möglich machen. Ein weiteres Problem stellt die Unterscheidung der Sepsis zum verwandten Krankheitsbild des SIRS dar. Die Krankheitsbilderähneln sich klinisch, erfordern jedoch unterschiedliche Therapien. Während bei der Sepsis die Sanierung des Infektionsherdes mit Antibiotika im Vordergrund steht, 12 muss bei dem SIRS der Auslöser identifiziert und behoben werden. Eine Antibiotikatherapie ist nicht immer indiziert. Als relativ unspezifischer Marker für die Sepsis gilt das C-reaktive Protein (CRP), das allerdings bei auch zahlreichen Krankheitsprozessen ansteigt, die nicht infektiös hervorgerufen sind, und keine Aussage über die Prognose einer Sepsis ermöglicht [20]. Es wurden auch Marker wie TNF oder IL-6 diskutiert. Probleme stellen jedoch der rasche Abbau von TNF bzw. die Unspezifität von IL-6 im septischen Krankheitsprozess dar [12]. TNFund IL-6 sind deshalb eher für die Prognose als für die Diagnose der Sepsis von Nutzen [12]. Als aktueller Biomarker für ein septisches Geschehen gilt bisher Procalcitonin (PCT) [21]. Es ist das Vorläufermolekül von Calcitonin, einem Schilddrüsenhormon. Sowohl Ort der Produktion als auch Funktion des PCT sind bisher noch unklar. Man vermutet jedoch, dass PCT in der Leber produziert [22] und bei einem inflammatorischen Geschehen freigesetzt wird. Daher wird PCT direkt mit dem Geschehen einer Sepsis in Verbindung gebracht. Es stellt sich jedoch immernoch die Frage, ob es möglich ist, mit Hilfe von PCT als klinischen Marker eine Sepsis von einem SIRS zu unterscheiden. Auch PTX3, ein löslicher Rezeptor des angeborernen Immunsystems, der zur Registrierung pathogener Muster dient, wird als potentieller Biomarker diskutiert [23, 24]. Er findet bisher vor allem in Tiermodellen Anwendung [25]. Außer den bisher erwähnten Markern gibt es noch zahlreiche andere Ansätze, die Diagnose eine Sepsis frühzeitig zu stellen, wie z.B. das Erfassen bestimmter Oberflächenmarker auf Granulozyten (CD64) oder Bestandteile der Gerinnungskaskade (Protein C). Durch die Zusammenschau verschiedenster Marker hofft man, eine genauere Einschätzung des Krankheitsgeschehenszu ermöglichen [12]. Aufgrund der zahlreichen, aber zum Teil unzureichend spezifischen existierenden Laborparameter ergibt sich der dringende Bedarf, die grundlegenden pathologischen Mechanismen zu klären, um dem Ziel des idealen Biomarkers ein Stück näher zu kommen. 13 Induktion der Sepsis im Tiermodell Da die Sepsis ein Krankheitsbild mit hoher Mortalität ist [26], deren Ursachen noch unklar sind, liegt der Schwerpunkt der Forschung auf dem rechtzeitigen Erkennen eines septischen Geschehens. Es wird davon ausgegangen, dass die frühzeitige Diagnose der Sepsis die Prognose der Patienten deutlich verbessert. Da klinische Studien sehr aufwendig sind und die Patienten meist ein diverses Krankheitsgeschehen mit unterschiedlichen Manifestationen der Sepsis aufweisen, gilt die Interpretation klinischer Studien als schwierig [3]. Tiermodelle wie die Maus haben gegenüber klinischen Untersuchungen den Vorzug, dass sie die Vergleichbarkeit der Individuen gewährleisten. Es wurden zahlreiche Modelle der Sepsisinduktion entwickelt. Diese unterscheiden sich vor allem in der Art und Weise, wie die Sepsis bzw. der septische Schock induziert werden [26–28]. Weiterhin weisen die Modelle Unterschiede hämodynamischer Natur auf [27] und spiegeln somit nur bestimmte Phasen des septischen Schocks wider. Toxämie-Modell Beim Toxämie-Modell wird durch ein septische Schock simuliert, indem ein exogenes Toxin einjiziert wird. Bei dem aplizierten Toxin handelt es sich in der Regel um LPS. LPS kommt unter anderem auf der Oberfläche gram-negativer Bakterien vor. Wie oben beschrieben, wird LPS eine große Rolle in der Auslösung der Immunkaskade zugeschrieben, aus der sich dann über die Aktivierung von Monozyten die typischen Veränderungen der Sepsis ergeben. Durch die intravenöse oder intraperitoneale Injektion von LPS kommt es in der Maus zu pathophysiologischen Veränderungen wie Blutdruckabfall, erhöhter Herz- und Atemfrequenz, die auch beim Menschen beschrieben sind [27]. Außerdem kommt es zu einer starken Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen, wie TNFα. Die Kinetik der Zytokinproduktion entspricht jedoch nicht der im septischen Patienten [28]. Einen weiterer Nachteil dieses Modells ist die relative Resistenz von Mäusen gegenüber LPS. Um eine Sepsis simulieren zu können, ist daher häufig die Verwendung von costimulatorischen Substanzen, wie D-Galactosamin [26], nötig. Die leichte Durchführbarkeit und gute Kontrollierbarkeit des Systems haben dennoch dazu geführt, dass das Toxämie-Modell häufig genutzt wird [28]. Bakterielles Infektionsmodell Bei dem bakteriellen Infektionsmodell wird den Tieren ein pathogener bakterieller Stamm geimpft. 14 Dabei kann es sich sowohl um reine als auch um gemischte Bakterienstämme handeln. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass gezielt das Wachstum der Bakterienstämme und die Mechanismen der Verteidigung des Organismus gegen die Bakterien untersucht werden können [27]. Dies stellt einen entscheidenden Unterschied zum Toxämie-Modell dar, bei dem kein bakterieller Fokus vorliegt [28]. Die Symptome der Tiere fallen jedoch zum Teil sehr unterschiedlich aus, was auf die interindividuelle Reaktion auf den pathologischen Keim zurückzuführen ist. Dadurch ist eine Vergleichbarkeit der Gruppen schwierig. Außerdem bestehen starke Unterschiede in der Reaktion verschiedener genetischer Mausstränge auf diese Methode [27]. Zerstörung der natürlichen Abwehrbarriere Bei der Methode der Zerstörung der natürlichen Abwehrbarriere des Wirts gibt es zwei Modelle. Beide Modelle vereint das grundlegende Prinzip, dass die natürliche Abwehr der Maus gegenüber pathogenen Keimen, z.B. durch die einfache Kompartimentierung von infektiösen Material im Darm, durch den Experimentator durchbrochen wird. Im folgenden sollen das Modell der Caecal Ligation and Puncture (CLP) und der Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) erläutert werden Beide Methoden erfordern ein großes Geschick des Durchführenden. CLP Bei der CLP handelt es sich um den Goldstandard des Sepsismodells in der Maus [29]. Hierbei wird das Caecum der Maus durch einen chirurgischen Eingriff distal der Ileocaecal-Klappe mit dem Colon verbunden. Anschließend erfolgt die Punktion des Ceacums mit einer dünnen Nadel. Infolgedessen tritt durch das Loch im Caecum gemischte bakterielle Darmflora in den Bauchraum aus. Außerdem führt die Punktion zur Nekrose des entsprechenden Gewebes. Damit sind die Ausgangsbedingungen für einen septischen Schock geschaffen. CASP Bei der CASP wird ein Stent mit einer definierten Größe in den Colon ascendes implantiert. Durch dieses Loch dringen kontinuierlich Darmbakterien in die Bauchhöhle. Der Vorteil gegenüber der CLP liegt in einer Regulation des septischen Geschehens durch die Veränderung des Durchmessers des implantierten Stents. Beide Modelle, CLP wie CASP, kommen aufgrund des Vorhandenseins einer gemischten 15 bakteriellen Besiedlung sowie der darauf folgenden pathophysiologischen Reaktion des Organismus den tatsächlichen Bedingungen eines septischen Schocks beim Menschen sehr nahe. Deutliche Nachteile weisen diese Modelle jedoch in ihrer experimentellen Durchführbarkeit auf. Durch die diffizilen chirurgischen Interventionen kann sowohl der Durchbruch der natürlichen Barriere sowohl bei derCLP als auch bei derCASP unterschiedlichen gut erfolgen [27]. Es kommt somit zu interindividuellen Unterschieden innerhalb der Versuchsgruppen, weshalb die Ergebnisse nur schwer verglichen werden können. 16 Humanisierte Mausmodelle Humanisierte Mäuse sind in den letzten Jahren immer stärker in den Fokus der medizinischen Forschung gerückt. Sie stellen ein bisher einzigartiges Modell dar, bei dem durch die Nutzung von menschlichen Zellen ein Organismus geschaffen wird, in dem humane Zellen und deren Interaktionen im Tiermodell untersucht werden können [30, 31]. Auf diese Weise lassen sich die Forschungsergebnisse, wie die Pathomechanismen verschiedenster Krankheiten, sowie pharmazeutische Aspekte der Krankheitsbekämpfung besser auf den Menschen übertragen. So besteht die Chance, dass unerwartete Nebenwirkungen von Medikamenten vorhergesehen werden können und man die Entstehung bisher unverstandener Krankheitenbesser erklären kann. Bisher wurden humanisierte Mäuse vor allem zu Studien bezüglich maligner Entartungen [32], Infektionskrankheiten [33] und ausgewählten Autoimmunerkrankungen, wie Diabetes mellitus [34] genutzt. Generell versteht man unter der Humanisierung von Mäusen das Transplantieren von menschlichem Zell-, Gewebe- oder Genmaterial [35]. Die Übertragung von menschlichem Genmaterial wird durch die Züchtung transgener Mäuse ermöglicht. Zur Humanisierung von Mäusen mit menschlichem Zell- und Gewebematerial wurden bisher zahlreiche Methoden etabliert, wobei beim heutigen Stand der Wissenschaft die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), die am häufigsten genutzte Methode darstellt. [30]. Das Ausgangsmaterial zur Gewinnung der HSCs ist vielfältig. Neben der Nutzung von Zellen aus dem Knochenmark und mobilisierten hämatopoetischen Zellen kommt vor allem die Nutzung von frischem Nabelschnurblut (NSB) in Betracht [36]. Züchtung der immundefizienten Mäuse Damit Mäusen menschliches Zellmaterial, im vorliegendenen Fall menschliche hämatopoetische Stammzellen, transplantiert werden kann, ist es notwendig, dass diese Mäuse einen genetischen Hintergrund vorweisen, der das Anwachsen dieser Zellen ermöglicht. Die Maus sollte immundefizient sein, damit es nicht zu einer Transplantatabstoßung kommt. Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurden Schritt für Schritt verschiedene Mausstämme gekreuzt, deren Immundefizienz auf unterschiedlichen Säulen beruht [35]. Den Ausgangspunkt für die Transplantation von menschlichen Stammzellen in immundefiziente 17 Mäuse stellte der CB17-scid-Mausstamm dar. In diesem Stamm liegt eine Mutation des sogenannten Prkdcscid- Proteins vor. Bei diesem Protein handelt es sich um eine DNA-abhängige Proteinkinase, die dafür zuständig ist die V(D)J-Rekombination zu katalysieren. Die V(D)JRekombination ermöglicht es, B-Zell- und T-Zell-Rezeptoren zu bilden. Ist diese Rekombination gestört, so sind die B-Zellen und T-Zellen des Organismus nicht in der Lage, ihrer Aufgabe nachzukommen. Demzufolge ist bei dem CB17-scid-Mausstamm die adaptive Immunantwort beeinträchtigt und der murine Organismus kann ein Transplantat, wie es die humanen hämatopoetischen Stammzellen darstellen, nicht angreifen. Dennoch werden bei der Transplantation von menschlichen Stammzellen in CB17-scid Mäuse Abstoßungsreaktionen beobachtet. Für diesen Effekt macht man das Vorhandensein von NK-Zellen verantwortlich, die aufgrund ihrer Zytotoxizität das Transplantat zerstören. Außerdem wurde ein verspätetes Auftreten von B- und T-Zellen in CB17-scid-Mäusen beobachtet, womit man sich ebenfalls die Abstoßungreaktion erklärt. Um die Anzahl der vorhandenen murinen NK-Zellen zu minimieren und somit das Anwachsen des Transplantates zu verbessern, konzentrierte man sich auf den NODStamm. Die NOD-Mäuse besitzen aufgrund der Mutation weniger NK-Zellen und weisen deshalb eine verringerte angeborene Immunantwort auf. Aufgrund dieser Eigenschaft kreuzte man den CB17-scid- Stamm mit dem NOD-Stamm. Weiterhin sind NOD-Mäuse wegen des bestehenden SIRPα-Polymorphismus nur bedingt zur Phagozytose humaner Stammzellen fähig. Der SIRPαPolymorphismus im Genom der NOD-Maus bewirkt eine verstärkte Bindung von humanen CD47, das sich auf der Oberfläche humaner hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) befindet. Durch die Verbindung des SIRPα auf murinen Phagozyten und des CD47 auf humanen transplantierten Zellen findet eine negative Regulation der Phagozytose statt, so dass vermindert humane HSCs phagozytiert werden. Um die angeborene Immunantwort der Mäuse noch intensiver einschränken zu können, griff man mit Hilfe der IL2-Rezeptor-Mutation zusätzlich in den Signalweg der murinen Zytokine ein. Bei dieser Mutation des IL2-Rezeptors handelt es sich um die Kürzung bzw. den vollständigen Verlust der γ-Kette des Rezeptors. Die γ-Kette ist essentieller Bestandteil des Signalwegs zahlreicher Zytokine in das Innere der Zelle. Durch die Manipulation der γ-Kette wird somit die Kommunikation der Immunzellen untereinander geschwächt. Die Kombination der Prkdcscid-Mutation, der NOD-Mutation und des IL2R γ-Knockouts führten zur Züchtung des NOD/Scid-ILRγ0-Stranges (NSG), der zurzeit den günstigsten genetischen Hintergrund für die Transplanation humaner hämatopoetischer Stammzellen liefert [36]. 18 Gewinnung der hämatopoetischen Stammzellen Im Laufe der Jahre, in denen sich die humanisierte Maus als Tiermodell entwickelt hat, wurden zahlreiche Quellen genutzt, aus denen menschliche HSCs gewonnen wurden. Dabei kamen zum einen die Nutzung mobilisierter HSCs aus dem Blut [31], sowie menschliches Gewebe in Frage. Da allerdings die Ausbeute an HSCs in dieser Art von Materialien gering ist, beschränkte man sich auf die Nutzung von Knochenmark und Nabelschnurblut (NSB) als Ausgangsmaterial. Knochenmark weist mit Abstand die höchste Konzentration an HSCs auf, ist jedoch mit dem Nachteil verbunden, dass nur wenige Spender zur Verfügung stehen. Weiterhin wirft die Spende von Knochenmark schwerer wiegende ethische Probleme auf, als die Nutzung von NSB, da dieses in der Regel ein Abfallprodukt darstellt. Aus diesem Grund hat die Nutzung von NSB als Quelle zur Gewinnung von HSCs zunehmend an Bedeutung gewonnen und gilt als Standardmaterial zur Aufbereitung von HSCs, die zur Transplantation in NOD/Scid-IL2Rγ0 –Mäuse genutzt werden. Die hämatopoetischen Stammzellen werden häufig mit Hilfe des magnetic labelling isoliert [37, 38]. Dabei werden die Zellen durch Antikörpern an Magneten gekoppelt und von den anderen Zellen des Blutes getrennt. Da es sich bei dem NOD/Scid-IL2Rγ0 –Strang um einen immundefizienten Mausstrang handelt, sind die Tiere nicht in der Lage sich gegen in den Organismus eindringende Keime zu wehren. Es ist daher entscheidend, dass ausschließlich nichtinfektiöses Material aufbereitet wird. Das bedeutet zum einen, dass nur Spenderblut von gesunden Individuen genutzt werden kann und zum anderen der gesamte Verarbeitungsprozess steril erfolgen muss. 19 Induktion der Sepsis in humanisierten Mäusen Wahl des Induktionsmodells Wie oben bereits geschildert, besteht aufgrund des defizitären Wissensstandes und der Schwere des Krankheitsbildes des septischen Schocks die dringende Notwendigkeit, ein Tiermodell zu entwickeln, das in der Lage ist die Zustände im Menschen zu simulieren. Hierbei stellt die humanisierte Maus ein vorteilhaftes Objekt dar, da sie es ermöglicht die Zustände des humanen Immunsystems nachzuahmen. Somit können gewisse Nachteile bisheriger Modelle, wie die starke Resistenz von Mäusen gegenüber LPS, ausgeräumt werden. Bisher liegen nur wenige Arbeiten vor, die sich mit der Sepsisinduktion in humansierten Mäusen befasst haben. Da in der vorliegenden Arbeit anhand des humanisierten Mausmodelles vor allem die Reaktion der menschlichen Immunzellen im Sinne einer Funktionalität untersucht werden sollte, fiel die Entscheidung für das Toxämie-Modell , wie es auch bei Gille et al. [39] Anwendung findet. Weiterhin sprachen die gute Durchführbarkeit sowie Kontrollierbarkeit für die Wahl des Endotoxinmodells in der humanisierten Maus. Charakterisierung der Sepsis in der humaniserten Maus Bisher wurde die Funktionalität des humanen Immunsystems in humanisierten Mäusen hauptsächlich zur Erforschung infektiöser und maligner Erkankungen, wie Mamma-Karzinomen, genutzt und in Bezug auf diese Krankheiten beschrieben [32, 33]. Bisher gibt es nur wenige Studien, die den septischen Schock in der humanisierten Maus umfassend beschreiben. [40, 39, 41]. Es wurde sich desshalb auf Parameter berufen, die auch beim septischen Patienten bekannt sind, um eine Einschätzung der Ausprägung einer Sepsis im Vergleich zum Patienten zu ermöglichen. Der Fokus der Betrachtung lag auf der Erfassung zytochemischer Parameter sowie der Beurteilung der Zusammensetzung und Aktivierung immunologischer Zellpopulationen. Es wurde der Plasmaspiegel von humanem IL-6, IFN, TNF, IL-1 und IL-10 im Blut der Tiere erfasst, da in der Literatur eine Erhöhung dieser pro- und antiinflammatorischen Zytokine im septischen Schock beschrieben ist [16, 11, 42]. Außerdem wurden die Konzentrationen von humanem und murinem PTX3 im Plasma der Tiere gemessen, da frühere Studien vermuten lassen, dass PTX3 im septischen Geschehen Wirkung zeigt [24, 43]. Zusätzlich wurde die Immunantwort mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Hierbei wurde die Zusammensetzung der immunologischen 20 Zellpopulationen in Blut, Knochenmark und Milz untersucht. Darüber hinaus wurde die Exprimierung von Aktivierungsmarkern von Monozyten, mDCs und pDCs untersucht. Dabei wurden Marker genutzt, die in der Literatur zur Charakterisierung der Aktivierung der Zellpopulationen verwendet werden [42, 44]. Im Falle der Makrophagen handelt es sich hier um das Molekül HLADR und CD86 [45, 46]. HLA-DR ist ein Molekül der Klasse der MHCII-Rezeptoren, die sich ausschließlich auf den antigenpräsentierenden Zellen des Immunsystems befinden. Der MHCIIRezeptor vermittelt die Kopplung an den T-Zell-Rezeptor von CD4-T-Zellen. Durch diese Verbindung bewirken die Makrophagen eine Aktivierung der T-Zellen und sind auf diese Weise in der Lage, eine Immunantwort in Gang zu setzen. Es wurde eine Erhöhung der MHCII-Rezeptoren bei inflammatorischen Geschehen beobachtet [47, 48]. CD86 wird bei dem durch LPS über die TLR2 und TLR4 ausgelösten Signalweg ebenfalls verstärkt an der Oberfläche exprimiert. Es fungiert bezüglich des HLA-DR-Moleküls als kostimulatorisches Molekül. Bei einer durch LPS induzierten Sepsis in Mäusen ist CD86 erhöht [49]. Die zytochemischen und zytometrischen Kriterien wurden genutzt, um das Ausmaß der Sepsis sowie die Reaktion der humanen Immunzellen in der humanisierten Maus besser zu charakterisieren und Aufschluss über die Entwicklung eines neuartigen Tiermodells in der Sepsisforschung zu gewinnen. 21 Zielstellung Der Forschungsschwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag daher in der Etablierung eines neuen Tiermodells für Sepsis am Institut für klinische Immunologie der Universität Leipzig. Als Grundlage diente hierbei die Humanisierung von Mäusen mit humanen hämatopoetische CD34 +-Zellen aus Nabelschnurblut. Der erste Teil der Arbeit bestand aus der Humanisierung von NOD/Scid-IL2Rγ 0 mit humanen CD34+- Zellen und der Beobachtung der Entwicklung von humanen Leukozyten, B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, Granulozyten und NK-Zellen über einen Zeitraum von 8-24 Wochen. Der zweite Teil bestand in der Charakterisierung der Sepsis in der humanisierten Maus. Dafür wurden die Tiere in zwei Altersgruppen eingeteilt. Es ergab sich eine Gruppe jüngerer und eine Gruppe älterer Tiere. Die jüngeren Tiere wurden im Alter von 8-10 Wochen und die älteren Tiere im Alter von 15-20 Wochen in den Versuch aufgenommen. Es erfolgte eine randomisierte Zuordnung der entsprechenden Altersgruppen in eine Kontroll- oder Versuchsgruppe. Den Tieren der Versuchsgruppe wurde 5mg/kg Körpergewicht LPS appliziert. Nach 6 h wurden Blut, Milz und Knochenmark entnommen und der FACS-Analyse zugeführt. Hierbei wurde sich auf die Untersuchung der Zusammensetzung der humanen immunologischen Zellpopulationen (Leukozyten, B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten, CD34+-Zellen) sowie deren Aktivierung konzentriert. Im Plasma wurden die humanen Zytokine IL-6, IL-10, IFN,TNFund IL1die murine Zytokine IL-6, IL-10, IL-12/IL23p40 und MCP sowie humanes un murines PTX3 bestimmt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten folgende Fragen beantwortet werden: 1. Wie verhalten sich immunologische Zellsubpopulationen in der humanisierten Maus nach LPS-Gabe? 2. Werden humane Monozyten, mDCs und pDCs durch LPS-Gabe aktiviert? 3. Werden humane pro- und antiinflammatorische Zytokine nach LPS-Gabe produziert? 4. Bilden humanisierte Mäuse murine pro- und antiinflammatorische Zytokine nach LPSGabe? 22 5. Produzieren humanisierte Mäuse nach LPS-Gabe vermehrt humanes PTX3? Wird nach LPSGabe murines PTX3 produziert? 6. Gibt es Unterschiede in der Reaktion auf LPS in Abhängigkeit vom Alter nach Transplantation? Durch die Beantwortung dieser Fragen sollte geklärt werden, ob die humanisierte Maus als Tiermodell für das Krankheitsbild Sepsis geeignet ist. Dabei war es wichtig die Funktionalität der Immunzellen über die Produktion von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen zu charakterisieren, da das Ausmaß der Produktion und das Verhältnis unterschiedlicher Zytokine einen Schwerpunkt in der Sepsisforschung darstellen. Weiterhin wurde auf die Veränderung der Zusammensetzung der immunologischen Zellpopulation wert gelegt, da für die Erforschung der Pathomechanismen das Verständnis der Reaktion der Zellen nützlich ist. Hierbei war es wichtig zu klären, ob die Reaktion der Zellpopulationen im Bezug auf ihren Gehalt in immunologisch wichtigen Organen der Maus und der Exprimierung von Aktivierungsmarkern, die Situation im Patienten widerspiegelt und einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Tiermodellen besteht. 23 Material und Methoden Verwendete Materialien Die im folgenden aufgeführten Materialien, Geräte und Software fanden in den unten aufgeführten Methoden Anwendung. Materialien 24-Well-Platte „Cellstar 662160“ greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland 96-Well-Platte „Zellkultur Testplatte 92096“ TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz CO2-Gas „CO2 medicAL“ AIR LIQUIDE Deutschland GmbH , Düsseldorf, Deutschland Cryoröhrchen „E 308.1“ Roth, Karlsruhe, Deutschland Bestrahlungsgerät „D3-225“ Ds Gulmay, ByFleet, Großbritannien Deckgläschen Gerhard Menzel GmbH , Braunschweig, Deutschland EDTA-Monovetten „S-Monovette 9ml K3E“ Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland Einfrierbox „Cryo 1°C Freezing Container“ Nalgene Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA FACS-Röhrchen „Polysterne Round-Bottom Tube 5ml“ Becton Dickinson Falcon, San Jose, USA Feinsieb „Cell strainer, 70µm Nylon, REF 352350“ Becton Dickinson Falcon, San Jose, USA Gefrierschrank (-80°C) „Forma 900 Series“ Thermo Scientific, Waltham, USA Glaskapillare „75mm,75µl, ISO 12772“ Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Hamburg, Deutschland Inkubator „Forma Scientific“ Thermo Life Sciences, Egelsbach, Deutschland Insulinspritze „Omnican F“ Braun, Melsungen, Deutschland Isofluran-Gas „Forene 100% (V/V) Abbott, Ludwigshafen, Deutschland Kanülen „Sterican Gr.14, 23 G, 0,6x30mm“ Braun, Melsungen, Deutschland Kolbenhubpipette Eppendorf, Hamburg, Deutschland Kryotom „Leica CM3050“ Leica, Nussloch, Deutschland Kühlschrank (4°C) Libherr gastroline, Biberach, Deutschland Laminarbox „Clean Air, DIN 12950, BS 5720, NSF 49“ Telstar Laboratory Equipment , Woerden, Niederlande Laminarbox „BZ-70“ BDK Luft-und Reinraumtechnik GmbH, 24 Sonnebühl-Genkingen, Deutschland Magnet „Octo MACS Seperator“ Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland Magnethalter „MACS Multistand“ Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland Mikroskop „Olympus CK30-F200“ Olympus Optical Co. LTD, Hamburg, Deutschland Mikroskop „Laborlux S“ Leitz, Wetzlar, Deutschland Mikrotom „JUNG SM 2000 R“ Leica, Nussloch, Deutschland Neubauer Zählkammer Labor Optik, Lancing, Großbritannien Pasteurpipetten greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland Pipettierhilfe „Accu-jet pro“ Brand, Wertheim, Deutschland Pipettierhilfe „Multipipette plus“ Eppendorf, Hamburg, Deutschland Pipettenspitzen (1000µl) greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland Pipettenspitzen (100µl) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland Pipettenspitzen (10µl) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland Ph-Meter „ph 540 GLP MultiCal“ Wissenschaftlich-Technische-Werkstätten, Weilheim, Deutschland Objektträger „Superfrost Plus“ Menzel-Gläser, Thermo Scientific, Waltham, USA Schüttler „PMS 1000, Mini-shaker“ Grant-Bio, Cambridgeshire, Großbritannien Seperationsfilter „Pre-Seperation Filters, 30 µm“ Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland Seperationssäulen „MACS Seperation Columns MS“ Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland Serumpipetten „Cellstar“ (10ml, 20 ml, 50 ml) greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland Spritzen „Omnifix-F, 1ml“ Braun, Melsungen, Deutschland Spritzenkolben „Discardit II“ (10ml) Becton Dickinson, San Jose, USA Zentrifuge „Centrifuge 5415 D“ Eppendorf, Hamburg, Deutschland Zentrifuge „Varifuge 3.ORS“ Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland Messgeräte FACSArray Becton Dickinson, San Jose, USA ELISA-Reader „sunrise“ TECAN, Männerdorf, Schweiz FACS Canto II Becton Dickinson, San Jose, USA 25 Feinwaage „BP 221S“ Sartorius Weighing Technologies GmbH, Göttingen, Deutschland Waage „Viper SW“ Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland Software FCAP Array v1.0.1 Soft Flow GmbH, Fredersdorf, Deutschland Magellan 6 Stüber Systems, Berlin, Deutschland FACS Diva Software Becton Dickinson, San Jose, USA Sigma Plot 11.0 Systat Software Inc., San Jose, USA 26 Methodisches Vorgehen Im Folgenden soll das grundlegende methodisches Vorgehen der Arbeit erläutert werden. Auf die genaue Ausführung der einzelnen Punkte der Arbeit wird in den weiteren Abschnitten in Material und Methoden genauer eingegangen. Zur Humanisierung der Maus wurde 24h-altes Nabelschnurblut von Spenderinnen aus dem Krankenhaus St. Elisabeth in Leipzig verwendet. Aus diesem Nabelschnurblut wurden mit Hilfe von Dichtegradientenzentrifugation mononukleäre Zellen gewonnen. Aus diesen Zellen wurden mittels magnetischer Separation humane CD34+-Zellen isoliert und in maximal 48h-alte NOD/SCID Mäuse transplantiert. Nach der Transplantation erfolgte die Untersuchung der humanen immunologischen Subpopulationen mit Hilfe von Durchflusszytometrie in zweichwöchigem Abstand in einem Zeitraum von 8-24 Wochen. Diese Langzeitbeobachtung sollte dem Überblick über die Entwicklickung des humanen Immunsystems in der Maus Rechnung tragen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Verlaufskontrolle erfolgte die Aufteilung der Tiere in zwei verschiedene Altersgruppen von 8-10 und von 15-20 Wochen. Ausgangsbedingung für die Aufnahme in den Versuch stellte dabei eine Humanisierungsrate von mindestens 15% dar. Die Humanisierungsrate ergab sich aus dem prozentualen Anteil von humanen Leukozyten an lebenden Zellen in der FACSAnalyse. Die Tiere im Alter von 8-10 Wochen wurden randomisiert einer Kontrollgruppe (A-0) und einer Versuchsgruppe (A) zugeteilt. Mit den Tieren im Alter von 15-20 Wochen wurde ebenso verfahren (Gruppe B-0 und Gruppe B). Den Tieren der Versuchsgruppen wurde LPS appliziert um ein septisches Geschehen zu simulieren, wobei die Tiere der Kontrollgruppe ausschließlich NaCl erhielten. Nach 6 h wurden die Tiere euthanasiert und es wurden Blut, Milz und Knochenmark gewonnen. Anschließend erfolgte eine Charakterisierung der Sepsis in der humanisierten Maus. Hierbei wurdendie Zusammensetzung der einzelnen immunologischen Zellpopulationen und deren Aktivierung in den einzelnen Organen, sowie diehumanen und murinen pro- und antiinflammatorischen Zytokinen und PTX3 gemessen. Tierhaltung Das Tierversuchsvorhaben wurde durch die Landesdirektion Sachsen unter dem Namen „Induktion einer Sepsis in humanisierten NSG Mäusen – TVV36/12“ gemäß § 8 des Tierschutzgesetzes genehmigt. Die Tierhaltung erfolgte im Medizinisch-Experimentellen-Zentrum (MEZ) der Universität Leipzig. Pflege und Versorgung wurden dabei durch Frau Vet.-Ing. Hannelore Scholz 27 vorgenommen. Die medizinische Versorgung der Tiere übernahm Frau Dr. vet. med. Petra FinkSterba. Die Züchtung der Tiere des Stamms NOD.Cg-Prkd scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, im weiteren bezeichnet als NSG, stellte The Jackson Laboratory, USA, sicher. Es wurden 24-48 h alte NSG Mäuse beiderlei Geschlechts bei 23°C unter apathogenen Bedingungen gehalten. Nach spätestens 48 h nach der Geburt erfolgte eine Bestrahlung der Mäuse mit einer Dosis von 1 Gy/min radioaktiver Strahlung für 3-5 Minuten an einem 200kV-Bestrahlungsgerät. Nach 3-5 h erfolgte die Transplantation der CD34+-Zellen mittels intrahepatischer Injektion. Im Alter von 3-5 Wochen erfolgte die Absetzung von der Mutter nach getrenntem Geschlecht. Zu Beginn des Versuchs betrug das Gewicht der Tiere ca. 14-23 g. Es wurden Tiere beider Geschlechter in den Versuch aufgenommen wurden. Innerhalb des Tierversuchsvorhabens wurde das Wohlbefinden der Tiere regelmäßig anhand des in Tab. 1 aufgeführten Scores überprüft. Lag die Scoresumme über 6 wurden die Tiere mittels CO 2 euthanasiert, um unnötiges Leiden zu verhindern. Parameter Grad 0 1 2 3 Körperhaltung Kein Buckel Gebuckelte Laufhaltung Keine Streckhaltung Hochgradige Buckelung Mobilität Mobil und lebendig Mittelgradig Erzwungene verminderte Lokomotion Spontanlokomotio n Keine erzwungene Lokomotion möglich Haut Ohne besonderen Befund Exantheme und Akanthose Schuppen und Ulzera Fell Keine Auffälligkeiten Nacken und Bauch Mäßig multifokal leicht zerzaust zerzaust und verfilzt Erytheme und vermehrte Schuppung Multifokal, diffus stark zerzaust und verfilzt Tab. 1 : Scoringsystem zur Beurteilung des Allgemeinzustandes der NSG Mäuse. Die Tiere werden im Bezug auf die Parameter Körperhaltung, Mobilität, Haut und Fell beurteilt. Dabei werden je nach Befund entsprechende Scoringpunkte vergeben. Die einzelnen Punkte werden addiert. Liegt die Summe über 6 dann werden die Tiere frühzeitig vom Versuch ausgeschlossen und mittels CO 2 euthanasiert. Aufbereitung des frischen Nabelschnurblutes Reagenzien Pancoll Pan Biotech GmbH 28 PBS/EDTA PBS/0,3 mM EDTA PAA Laboratories GmbH Einfriermedium 20% DMSO 10% FKS 25% Dextran-Lösung 5% ACD-A In RPMI AppliChem GmbH PAA Laboratories Dextran-Lösung 50 g Dextran 9 g NaCl In 500 ml Wasser Sigma Roth Braun RPMI 1640 with stable Glutamin PAA Laboratories GmbH DMEM Low Glucose (1g/l), with LGlutamine, with 25 mM HEPES PAA Laboratories GmbH Türk’sche Lösung Sigma Merck KGaA Durchführung Die Spende des Nabelschnurblutes wurde durch das Ethikkomitee der Universität Leipzig unter der Nummer 121-11-18042011 genehmigt. Das Nabelschnurblut wurde durch die Hebammen des Krankenhauses St. Elisabeth in Leipzig in EDTA-Monovetten abgenommen. Die Aufarbeitung erfolgte steril unter einer Laminar Flow Box mit sterilen Materialien. Maximal 24 h altes Nabelschnurblut wurde 1:1 mit PBS/EDTA verdünnt. Dazu wurde das PBS/EDTA auf Raumtemperatur erwärmt. Zur Dichtegradientenzentrifugation wurden 10 ml Pancoll mit 25-35 ml verdünntem Vollblut mit Hilfe einer Serumpipette überschichtet und für 25 min, 600 g, bei Raumtemperatur mit niedriger Bremse zentrifugiert. Danach wurden die MNCs aus der Interphaseschicht mit Hilfe einer Pasteurpipette abgenommen und in ein neues Röhrchen überführt. Die Zellsuspension wurde 1:2 mit PBS/EDTA aufgefüllt und erneut zentrifugiert (10 min, 500g, 4°C). Nach dem folgenden Waschschritt mit PBS/EDTA (8 min, 300g, 4°C) wurden die Zellen in Türk’scher Lösung aufgenommen und gezählt. Es wurden maximal 5x107 Zellen in 1 ml DMEM/Einfriermedium (1:1) mittels eines Cryoröhrchens eingefroren. Dafür wurde eine Einfrierbox genutzt, um die Zellen schrittweise auf -80°C abzukühlen. Nachdem die Zellen diese Temperatur erreicht hatten, wurden sie in flüssigem Stickstoff gelagert. 29 Auftauen der Mononukleären Zellen und Transplantation der CD34 +-Zellen Methodische Grundlagen der magnetischen Seperation Bei der magnetischen Separation (auch: Magnetic labeling) handelt es sich um eine gängige Methode um bestimmte Zellpopulationen aus einer Mischpopulation an Zellen zu isolieren. Hierbei macht man sich, wie bei vielen immunologischen Techniken, zunutze, dass die meisten Zellpopulationen ein spezifisches Oberflächenmolekül besitzen, was sie von anderen Zellpopulationen unterscheidet. Im Falle von Immunzellen handelt es sich um den sogenannten Cluster of Differtiation (CD). Die HSCs, bei denen in der vorliegenden Arbeit die magnetische Seperation genutzt wurde, tragen den spezifischen CD34. Bei der magnetischen Separation wird die Mischpopulation verschiedener Zellen mit einem Antikörper (AK) inkubiert, der gegen das spezielle Oberflächenmolekül gerichtet ist. Zusätzlich ist dieser AK an einen sogenannten MagnetBead gekoppelt. Versieht man also die HSCs mit dem entsprechenden MagnetBead, der gegen CD34 gerichtet ist, so binden die magnetisch markierten AK an die Zellen. Wird das Zellgemisch nun in ein Magnetfeld gebracht, so verbleiben nur die Zellen mit dem magnetischen AK im Magnetfeld, da diese magnetisch angezogen werden. Unerwünschte Zellen wandern durch das magnetische Feld hindurch und können verworfen werden. Die gewünschte isolierte Population kann weiter verwendet werden. Der Vorteil der Methode gegenüber anderen Methoden zur Zellisolation, wie dem Elutrieren, besteht in seiner vergleichsweise einfachen Durchfürbarkeit und seiner Unanfälligkeit gegenüber äußeren Einflüssen. Reagenzien DMEM Low Glucose (1g/l), with LGlutamine, with 25 mM HEPES PAA Laboratories GmbH DNAse-Puffer 0,5% FKS 2mM MgCl2 10µg/ml DNAse in PBS PAA Laboratories GmbH Sigma-Aldrich Appli Chem PAA Laboratories GmbH PBS PAA Laboratories GmbH CD34 MicroBead Kit FcR Blocking Reagent human CD34 MicroBeads human Miltenyi Biotec GmbH Macs-Puffer Macs-Puffer Miltenyi Biotec GmbH 30 5% FKS PAA Laboratories Türk’sche Lösung Merck KGaA Trypanblau VWR Durchführung Dei Separation der CD34-Zellen erfolgte unter sterilen Bedingungen in einer Laminar Flow Box mit sterilen Materialien. Die eingefrorenen MNCs wurden zügig bei 37°C im Wasserbad aufgetaut. Die Zellen wurden mit 40 ml warmen (37°C) DMEM gewaschen (8 min, 300g, RT). Danach wurde der Überstand verworfen und ein weiterer Waschschritt mit DNAse-Puffer durchgeführt. Es wurde die Zellzahl mit Türk’scher Lösung in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Zellen wurden auf 300l Macs-Puffer pro 1x 108 Zellen eingestellt. Es folgte die Zugabe von 100l Blocking Reagenz und 100l CD34-Magnet Beads pro 1x 108 Zellen. Nach 30 minütiger Inkubationszeit bei 4°C wurde die Zellsuspension mit 10 ml Macs-Puffer aufgefüllt und bei 300g, 8 min und 4°C zentrifugiert. Danach wurde der Überstand restlos abgenommen. Es erfolgte die Einstellung der Zellsuspension vor dem Separieren auf 500l Macs-Puffer je 1x108 Zellen. Zur Vorbereitung der Separation wurden MS-Macs-Säulen mit Hilfe des Magneten im Magentfeld platziert und jeweils mit 500l Macs-Puffer gespült um toxische Substanzen aus der Säule zu entfernen. Danach schloss sich die Gabe der Zellsuspensionen über die MS-Säulen an. Hierbei wurden durch einen Seperationsfilter pro Säule 500l der Zellsuspension mit maximal 1x108 Zellen über eine Säule gegeben. Der Durchfluss wurde aufgefangen und erneut über die Säule gegeben. Danach erfolgte ein dreimaliges Spülen der Säule mit jeweils 500l Macs-Puffer. Die Zellen wurden mit 1 ml Macs-Puffer eluiert. Im Anschluss wurden die Zellen eines Nabelschnurblutes vereinigt und nach einem zusätzlichen Zentrifugationsschritt (300g, 8min, 4°C) in 500l Macs-Puffer aufgenommen. Die zweite Säule, die im Vorhinein ebenfalls mit 500l Macs-Puffer gespült wurde, wurde im Magnetfeld platziert. Die Zellsuspension sowie der entstandene Durchfluss wurden nacheinander über die selbe Säule gegeben. Es folgte ein dreimaliges Spülen der Säule mit 500l Macs-Puffer. Das Eluieren der Zellen erfolgte mit 1 ml Macs-Puffer. Danach wurden die Zellen mit Trypanblau gezählt. Pro zu humanisierender Maus wurden 2-4x105 Zellen in jeweils 50 µl Medium gelöst und in eine Insulinspritze aufgezogen. Die Transplantation der HSCs erfolgte mittels Injektion in die Leber der 31 bestrahlten Mäuse unter sterilen Bedingungen. Durchflusszytometrie Methodische Grundlagen des Durchflusszytometers Die Durchflusszytometrie ist eine Technik, mit der mehrere verschiedene Zellpopulationen innerhalb einer Probe identifiziert werden können. Die Probe wird mit verschiedenen AK versehen, die erstens gegen ein spezifisches CD gerichtet sind zweitens eine Fluoreszenz in einem bestimmten Farbbereich aufweisen. Auf diese Art und Weise wird jede Zellpopulation mit einem AK unterschiedlicher Farbe markiert. Dadurch können später die Zellpopulationen im Durchflusszytometer unterschieden werden. Zu Beginn wird die Probe, die mit den verschiedenen AK markiert ist, in das Durchflusszytometer eingebracht. Dort wird die Zellsuspension durch eine dünne Kapillare gesaugt. Dadurch ist es möglich, jede Zelle einzeln an einem Laserstrahl vorbeizuführen. Der Laserstrahl wird nun zum Einen an der Zelle gestreut. Durch diesen Effekt kann mittels des Forward Light Scatter die Größe und mittels des Sideward Light Scatter die Granularität der Zelle bestimmt werden. So sind erste Aussagen über die Morphologie der Zelle möglich. Zum Anderen führt das Auftreffen des Laserstrahls auf die Zelle dazu, dass die fluoreszierenden AK, mit denen die Zelle markiert ist, beginnen Licht in einer spezifischen Wellenlänge auszusenden. Dieses Licht kann mit Hilfe von Detektoren registriert werden. Die Probe wird Stück für Stück durch die Kapillare gesaugt, so dass jede Zelle gemessen werden kann. Die empfangenen Daten können dann in einem charakteristischen Dot-Plot dargestellt und zur Auswertung herangezogen werden. Dabei ist es möglich die prozentuale Zusammensetzung der Zellsuspension aus den einzelnen Zellpopulationen zu bestimmen. Dabei können mehrerer Zellpopulationen pro Probe bestimmt werden, sodass wenig Probenmaterial ausreicht um eine Identifikation durchzuführen. Reagenzien PBS/FKS Lyse-Puffer PBS 2% FKS Aqua B. Braun 10 % BD FACS Lysing Solution PAA Laboratories GmbH PAA Laboratories GmbH Braun Melsungen AG BD Biosciences Heparin Heparin Natrium-25000 Ratiopharm Formaldehyd 1% ig in PBS gelöst Merck 32 Antihuman CD3 Fitc CD4 Amcyan CD8 PerCP CD11c PE CD14 APC-Cy7 CD16 PE-Cy7 CD19 PE CD45 APC CD56 V450 CD80 Fitc CD86 V450 CD123 Per-CP-Cy5.5 HLA-DR PE-Cy7 Lineage Coctail Fitc CD34 PE Mouse IgG1 Fitc Isotype Control Mouse IgG1 PE Isotype Control Mouse IgG1 PerCP Isotype Control Mouse IgG1 PE-Cy7 Isotype Control Mouse IgG2b APC-Cy7 Isotype Control Mouse IgG1 V450 Isotype Control Mouse IgG1 Amcyan Isotype Control Mouse IgG1 APC Isotype Control Mouse IgG2a PE Isotype Control Klon UCHT1 Klon SK3 Klon SK1 Klon Bly6 Klon MPhiP9 Klon 3G8 Klon HIB19 Klon HI30 Klon B159 Klon L307.4 Klon 2331(FUN-1) Klon 7G3 Klon L243 Klon SK7 (CD3), 3G8 (CD16), SJ25C1 (CD19), L27 (CD20), MP9 (CD14), NCAM16.2 (CD56) Klon AC136 Klon MOPC-21 Klon MOPC-21 Klon MOPC-21 Klon MOPC-21 Klon 27-35 BD Bioscience Miltenyi Biotec BD Bioscience Klon MOPC-21 Klon X40 Klon MOPC-21 Klon S43.10 Miltenyi Biotec Durchführung Je nach Versuchszeitpunkt wurden verschiedene Antikörper zur FACS-Analyse genutzt, wobei die Herstellung des FACS-Ansatzes gleich durchgeführt wurde. Zu jedem Ansatz wurden die entsprechenden Isotyp-Kontrollen nach dem selben Protokoll mitgeführt. Die Analyse der FACSProben erfolgte am Gerät FACS Canto II von BD. Die Daten wurden mit Hilfe der FACS Diva Software ausgewertet. FACS-Ansatz nach Humanisierung Die Mäuse wurden mittels Inhalationsnarkose durch Isofluran betäubt. Durch retrobulbäre 33 Punktion mit einer heparinisierten Glaskapillare wurde ca. 75 µl Augenblut abgenommen. Dieses wurde mit 10µl Heparin antikoaguliert. Das Blut wurde 10 min bei Raumtemperatur (RT) und 300g zentrifugiert. Das Plasma wurde abgenommen und bei -80°C eingefroren. Es wurden 50 µl des verbleibenden Blutes mit 100 µl PBS/FKS und den entsprechenden Mengen der AK für 30 min bei 4°C inkubiert. Bei diesen Antikörpern handelte es sich um anti-human CD3 Fitc [4µl], anti-human CD19 PE [5µl], anti-human CD8 PerCP [4µl], anti-human CD16 PE-Cy7 [5µl], anti-human CD45 APC [5µl], anti-human CD14 APC-Cy7 [2µl], anti-human CD56 V450 [2,5µl] und anti-human CD4 Amcyan [2,5µl]. Danach wurde mit Hilfe des Lyse-Puffers eine Lyse der Erythrozyten durchgeführt um eine Verunreinigung der späteren FACS-Analyse zu vermeiden. Dazu wurde jede Probe mit 2 ml LysePuffer versetzt und 15 min bei RT im Dunklen inkubiert. Nach dem Lyse-Schritt wurden 2ml PBS/FKS zu der Probe gegeben. Die Probe wurde bei 300g, 8 min, 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Es folgte ein zweimaliger Waschschritt mit je 2 ml PBS/FKS bei 300g, 8 min, 4°C. Im letzten Schritt wurde der Überstand ebenfalls verworfen und die Probe mit 200µl PBS/FKS aufgefüllt und im Durchflusszytometer gemessen. FACS-Ansatz nach Sepsisinduktion Nachdem die Sepsisinduziert wurde, wurde den Mäusen Herzblut entnommen und mit 10µl Heparin antikoaguliert. Das Blut wurde 10 min bei RT und 300g zentrifugiert. Das Plasma wurde abgenommen und nochmals für 10 min bei RT und 16 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und bei -80°C eingefroren. Zusätzlich wurde den Mäusen zum Versuchsende Milz und Knochenmark entnommen. Bis zur Weiterverarbeitung wurden die Organe in 1 ml PBS in je einer Kavität einer 24-Well-Platte gelagert. Danach erfolgte die Gewinnung einer Zellsuspension der Milz durch das Durchdrücken durch ein Feinsieb mit Hilfe eines Spritzenkolbens. Die Siebe wurden mit PBS gespült, bis der Durchfluss klar erschien. Danach wurden die Zellsuspensionen von Milz und Knochenmark 8 min bei 300g und 4°C zentrifugiert. Die Zellen wurden in 1 ml (Knochenmark) bzw. 5 ml (Milz) PBS aufgenommen und es schloss sich ein Zählschritt mit Türk'scher Lösung an. Für den FACS-Ansatz wurden die Zellsuspensionen der verschiedenen Organe mit PBS/FKS auf je 5x105 Zellen pro FACS-Ansatz eingestellt. Außerdem wurden jeweils 50µl der Blutzellen je FACS-Ansatz verwendet. Pro Organ wurden zwei FACS-Ansätze durchgeführt. Im ersten Ansatz wurden folgende AK in entsprechenden Mengen zugegeben: anti-human CD3 Fitc [4µl], anti-human CD19 PE [5µl], anti-human CD16 PE-Cy7 [5µl], anti-human CD45 APC [5µl], antihuman CD56 V450 [2,5µl]. Im zweiten Ansatz wurden folgende AK in entsprechenden Mengen 34 zugegeben: anti-human Linaege Coctail Fitc [10µl], anti-human CD11c PE[10µl], anti-human CD123 PerCP-Cy5.5 [10µl] , anti-human HLA-DR PE-Cy7 [1µl], anti-human CD86 V450 [1,5µl], anti-human CD14 APC-Cy7 [2µl], anti-human CD45 APC [5µl]. Nach 30minütiger Inkubation im Dunkeln bei 4°C schloss sich ein 15 minütiger Lyseschritt mit 2ml Lyse-Puffer bei RT im Dunklen an. Nach der Inkubation wurde zu jedem FACS-Ansatz jeweils 2ml PBS/FKS gegeben. Die Proben wurden bei 300g und 4°C 8min zentrifugiert. Danach wurde zweimal mit jeweils 2 ml PBS/FKS bei 300g und 4 °C für 8 min gewaschen. Im letzten Schritt wurde der Überstand verworfen und jede Probe mit 200µl PBS/FKS aufgefüllt und im Durchflusszytometer gemessen. Sepsisinduktion Reagenzien LPS NaCl Escherichia coli 0111:B4 9%-physiologische NaCl Sigma-Aldrich VWR Durchführung Es wurden in den Versuch der Sepsisinduktion alle Tiere aufgenommen, deren Humanisierungsgrad nach der FACS-Analyse über 15% lag. Dieser ergab sich dabei aus dem prozentualen Anteil der CD45-positiven Zellen im Life Gate. Die Tiere wurden randomisiert einer Versuchsgruppe und in einer Kontrollgruppe zugeteilt. Die Sepsisinduktion wurde unter sterilen Bedingungen mit sterilen Instrumenten durchgeführt. Die Tiere der Versuchsgruppe erhielten 5 mg/kg Körpergewicht LPS i.p. gelöst in 200µl NaCl. Die Tiere der Kontrollgruppe erhielten ausschließlich 200µl NaCl. Nach der Injektion wurden die Tiere stündlich überwacht. Nach 6 h wurden die Tiere mit CO2 euthanasiert und Organe für die Histologie sowie für den FACS-Ansatz entnommen. Herzblut wurde mit Hilfe einer Spritze entnommen. Enzym-linked Immunosorbentassay Methodische Grundlagen des capture Enzym-linked Immunosorbentassays Der Enzym-linked Immunosorbentassay (ELISA) dient zur quantitativen Bestimmung von Substanzmengen in einer Probe. Hierbei wird diese Substanzmenge photometrisch über die Kopplung an eine Enzymreaktion gemessen. Für einen sogenannten capture-ELISA wird zu Beginn 35 eine Platte mit dem Antikörper beschichtet, der spezifisch gegen die Substanz aus der Probe gerichtet ist. Danach wird die Probe dazu gegeben. Sobald die Substanz vorhanden ist, bindet sie an den AK mit dem die Platte beschichtet wurde.Ein zugegebener Detektions-AK bindet ebenfalls an die Substanz. Die Zugabe eines weiteren AK, der an den Detektions-AK bindet, bewirkt, dass durch die Kopplung an ein Enzym die Umsetzung eines spezifischen Substrats katalysiert wird. Durch die Zugabe des Substrats kommt es zu einer enzymatischen Spaltung, die mit einem Farbumschlag einhergeht. Dieser Farbumschlag kann photometrisch gemessen werden und steht in positiver Korrelation mit der Konzentration der zu messenden Substanz. Der Vorteil eines capture-ELISAs im Gegensatz zu einem herkömmlichen ELISA ist vor Allem die Signalverstärkung durch den Einsatz eines Sekundär-AK. Dadurch ist es möglich, geringste Mengen der gesuchten Substanz in einer Probe nachzuweisen. Reagenzien Humaner PTX3 ELISA RD Systems, Minneapolis, USA RD Systems, Minneapolis, USA Cusabio, Wuhan, China Cusabio, Wuhan, China Muriner PTX3 ELISA Humaner PCT ELISA Muriner PCT ELISA Durchführung Nach erfolgter Sepsisinduktion wurde den Tieren Herzblut entnommen. Dieses wurde mit 10µl antikoaguliert. Das Plasma wurde durch zweimalige Zentrifugation bei 300g bzw. 16 000g, 8 min, RT gewonnen. Es wurde humanes sowie murines Pentraxin 3 (PTX3) in den Plasmaproben der Tiere bestimmt. Jede Bestimmung sowie die Standardverdünnungsreihe wurden doppelt durchgeführt. Außerdem wurde das Plasma eines nicht humanisierten Tieres, das ebenfalls LPS erhielt, mitgeführt um eine Kreuzreaktivität der Antikörper des ELISAs auszuschließen. Die Durchführung des ELISAs erfolgte nach Angaben des Herstellers. Dabei wurden alle Schritte, sofern nicht anders aufgeführt, bei RT durchgeführt. Die Plasmaproben wurden aufgetaut und für die Bestimmung des humanen PTX3 entweder 1:2 (Versuchsgruppe) vorverdünnt bzw. unverdünnt (Kontrollgruppe) eingesetzt. Für die Bestimmung des murinen PTX3 wurden bei der NaCl-Gruppe die Proben 1:50 und in der der LPS-Gruppe 1:100 vorverdünnt. Es wurde eine Standardverdünnungsreihe angelegt. Zur Bestimmung des humanen PTX3 wurde eine 96-Well-Platte mit dem biotinilierten PTX336 Antikörper beschichtet. Die Platte für das murine PTX3 wurde bereits beschichtet geliefert. Nach mehrmaligem Waschen der Platte für humanes PTX3 erfolgte, sowohl für die Bestimmung von humanem als auch von murinem PTX3 die Zugabe von Assay Diluent in jedes Well der unterschiedlichen 96-Well-Platten. Die im Vorhinein mit Calibrator Diluent verdünnten Proben und Standards wurden in die Wells pipettiert und 2 h auf einem Schüttler inkubiert. Danach wurde die Platte zur Bestimmung von humanem PTX3 viermal und die Platte zur Bestimmung von murinem PTX3 fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Es wurde Konjugat zu jedem Well dazu gegeben. Die Platten wurden erneut 2h auf dem Schüttler inkubiert. Danach wurden die Platten nochmals vierbzw. fünfmal gewaschen. Es erfolgte die Zugabe des Substrates und eine 30minütige Inkubation im Dunkeln. Danach wurde in jedes Well eine Stop Solution gegeben und die Platten wurden innerhalb der nächsten 20 min am ELISA-Reader TECAN sunrise gemessen. Die Auswertung der Platten erfolgte mit dem Programm Magellan 6. Der Mittelwert der Konzentration der Doppelbestimmungen wurde zur Auswertung herangezogen. Cytometric Bead Array Methodische Grundlagen des Cytometric Bead Arrays Bei dem Cytometric Bead Array (CBA) handelt es sich um eine Methode, quantitativ Konzentrationen bestimmter Substanzen in einer Probe zu bestimmen. Der Vorteil zum ELISA besteht in der Möglichkeit der simultanen Messung mehrer Substanzen innerhalb einer Probe. Das Verfahren wird über die Kopplung von spezifischen AK an unterschiedlich große Magnetkugeln (Beads) ermöglicht. Jedes Zytokin wird hierbei über die AK-Bindung an einen definiert großen Bead gekoppelt. Durch die Nutzung unterschiedelicher großer Beads je Zytokin ist somit eine kombinierte Messung verschiedener Zytokine je Probe möglich. Ist die Bindung des Zytokin an der Bead erfolgt, wird ein zweiter fluoreszenmarkierter AK hinzugegeben, der die Messung im FACSGerät ermöglicht. Durch das Mitführen einer Standardverdünnungsreihe kann über die Fluroeszenrate die Konzentration des Zytokins in der Probe ermittelt werden. Reagenzien CBA-Kit BD CBA Human IL-1 Flex Set BD CBA Human IL-6 Flex Set BD CBA Human IL-10 Flex Set BD CBA Human INFγ Flex Set BD CBA Human TNF Flex Set 37 BD Bioscience CBA-Kit BD CBA Mouse IL-6 Flex Set BD CBA Mouse IL-10 Flex Set BD CBA Mouse IL-12/IL23p40 Flex Set BD CBA Mouse MCP Flex Set BD CBA Mouse TNF Flex Set BD Bioscience Durchführung Das bei -80°C gelagerte Plasma wurde bei RT aufgetaut. Danach erfolgte die Zytokinbestimmung der Proben mittels des CBA-Kit für die humanen Zytokine IL-1, IL-6, IL-10. TNF und die murinen Zytokine IL-6, IL-10, IL12/IL23p40, MCP, TNF laut Angaben des Herstellers. Außerdem wurde das Plasma eines nicht humanisierten Tieres, das ebenfalls LPS erhielt, mitgeführt, um eine Kreuzreaktivität der Antikörper des CBAs auszuschließen. Der Standard wurde in dem bereit gestellten Assay Diluent gelöst und eine Standardverdünnungsreihe erstellt. Die Plasmaproben wurden unverdünnt mit den CaptureBeads in einer 96-Well-Platte 1h inkubiert. Danach wurde das Detektionsreagenz dazu gegeben. Die Konzentration der Zytokine wurde im BD FACS Array mit Hlfe der FACS Array System Software gemessen und mit Hilfe der FCAP Array Software 1.0 ausgewertet. Statistik Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit Hilfe SigmaPlot 11.0. Hierbei wurde für den Vergleich von zwei ungepaarten Gruppen mit normalverteilte Daten der einfache t-Test genutzt. Bei dem Vergleich von zwei ungepaarten Gruppen mit nicht normalverteilten Daten wurde der Mann-Withney-Rank-Sum-Test genutzt. Bei dem Vergleich von zwei gepaarten Gruppen mit normalverteilten Daten wurde der gepaarte t-Test genutzt. Bei dem Vergleich von zwei gepaarten Gruppen mit nicht normalverteilten Daten fand der Mann-Withney-Rank-Sum-Test Anwendung. Um mehrere Gruppen mit einem bestimmten Merkmal zu vergleichen, wurde eine One Way ANOVA on Ranks durchgeführt, sofern es sich um nicht normalverteilte Daten handelte. In diesem Fall wurde als posthoc Test der Dunn's test genutzt. Waren die Daten normalverteilt, wurde eine One Way ANOVA genutzt um die Daten zu vergleichen. Als posthoc Test diente dann der TukeyTest. Die Ermittlung der Normalverteilung erfolgte entweder mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test oder mit dem Shapiro-Wilk-Test. 38 Ergebnisse Charakterisierung der humanisierten Maus Charakterisierung vor Sepsisinduktion Mit Hilfe von Dichtegradientenzentrifugation wurden mononukleäre Zellen aus maximal 24 h alten Nabelschnurblut (NSB) isoliert. Nach für die Lagerung notwendigem, schonenden Einfrieren, wurden die mononukleäre Zellen aufgetaut und durch magnetische Separation CD34 + -Zellen isoliert. Die humanen Stammzellen wurden 24-48 h alten NOD/SCID-IL2R0-Mäusen intrahepatisch Injiziert. Im Zeitraum von 8-24 Wochen nach Stammzelltransplantation erfolgten Blutentnahmen von 6 Tieren mittels retrobulbärer Punktion unter Narkose mit Isofluran. Der Gehalt humaner Lukozyten, humaner B-Zellen, humaner T-Zellen, humaner Granulozyten, humaner NK-Zellen und 39 humaner Monozyten der Blutproben wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Über diesen Zeitraum zeigte sich ein Anstieg der Leukozytenpopulation (One way ANOVA p=0,014) (Abb. 2). Weiterhin gab es einen deutlichen prozentualen Anstieg an T-Zellen (One way ANOVA p< 0,001) (Abb. 2) und einen Abfall von B-Zellen (One way ANOVA p=0,021) (Abb. 2) über den Zeitraum von 24 Wochen. Bei Granulozyten zeigte sich ein signifikanter Anstieg in Woche 12 im Vergleich zu Woche 8-22 (Tukey test p<0,05). NK-Zellen verzeichneten einen signifikanten Abfall in Woche 12 im Vergleich zu Woche 24 (Dunn's test p< 0,05). Im Vergleich des Gehaltes von NK-Zellen zwischen Woche 12 und Woche 8-22 ergab sich ein Trend im Abfall der NK-Zellen in Woche 12. Monozyten zeigten weder Abfall noch Ansteig der prozentualen Verteilung über diesen Zeitraum. 40 a CD45 [%life gate] 100 80 60 40 20 0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Wochen nach Transplantation b B-Zellen [%CD45+] 100 80 60 40 20 0 8 10 14 16 18 20 22 24 Wochen nach Transplantation c T-Zellen [%CD45+] 100 80 60 40 20 0 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Wochen nach Transplantation Abb. 2: Darstellung der prozentualen Anteile von CD45-Zellen an lebenden Zellen (a), B-Zellen an CD45-Zellen (b) und TZellen an CD45-Zellen (c) im zweiwöchigen Zeitintervall 8-24 Wochen nach Transplantation von humanen CD34-Zellen im Blut der NSG Mäuse. Dargestellt sind der Median der einzelnen Gruppen. Jeder Punkt spiegelt ein Individuum wieder. Darüber wurden 3 Tiere vor Ablauf der 24-Wochen mit CO2 euthanasiert, da der Wert der Summe des in Tab. 1 aufgführten Scores über 6 lag. Der Score diente zur Bestimmung des 41 Allgemeinzustandes der Mäuse und sollte unnötiges Leiden der Tiere vermeiden. Der Zusammenhang zwischen dem Beobachtungszeitraum und der Anzahl der überlebenden Tiere ist in Abb.3 dargestellt. 7 Anzahl der Tiere 6 5 4 humanisierte Mäuse nach CD34+-Transplantation 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Wochen nach Transplantation Abb.3: Kaplan-Maier-Kurve der humanisierten Mäuse im Zeitraum von 0-24 Wochen nach Transplantation von humanen CD34-Zellen. Die Ordinatenachse zeigt die Anzahl der Tiere und auf der Abszissenachse ist der Zeitpunkt in Wochen nach der Transplanation angegeben. Nach 24 Wochen wurde der Versuch beendet. 42 Charakterisierung nach Sepsisinduktion Aufgrund der starken Änderung der Zusammensetzung der humanen Leukozyten in Abhängigkeit vom Alter nach der Transplantation ergaben sich vier unterschiedliche Versuchsgruppen zur Sepsisinduktion. Hierbei wurden Tiere im Alter von 8-10 Wochen entweder der Versuchsgruppe A oder der Kontrollgruppe A-0 zugewiesen. Tiere im Alter von 15-20 Wochen wurden der Versuchsgrupe B oder der Kontrollgruppe B-0 zugeteilt. Die Aufteilung in Versuchs- oder Kontrollgruppe erfolgte randomisiert. 0 mg/kg LPS 8-10 Wochen Gruppe A-0 Gruppe Aa Gruppe A 5 mg/kg LPS Humanisierte NSG Mäuse 0 mg/kg LPS Gruppe B-0 Gruppe Bb 15 -20 Wochen 5 mg/kg LPS Gruppe B Abb. 4: Zuordnung der Tiere in die jeweiligen Versuchsgruppen. Tiere, deren Humanisierungsgrad [%huCD45/lebenden Zellen] über 15% lag, wurden in den Versuch aufgenommen. Es erfolgte die Einteilung nach Alter. Dabei bildeten Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation die Gruppe Aa. Tiere im Alter von 15-20 Wochen wurden der Gruppe Bb zugeteilt. Es wurde jeweils entweder 5 mg/kg Körpergewicht LPS in 200 µl NaCl oder 0 mg/kg Körpergewicht LPS in 200 µl NaCl appliziert. Die Tiere, die 5 mg/kg Körpergewicht LPS erhielten, wurden je nach Ausgangsgruppe entweder mit A oder B bezeichnet und stellen die Versuchsgruppen dar. Die Tiere der Kontrollgruppen erhielten 0 mg/kg Körpergewicht LPS und wurden je nach Ausgangsgruppe mit A-0 bzw. B-0 bezeichnet. Die Tiere der Gruppen A und B erhielten 5mg LPS/kg Körpergewicht gelöst in 200 µl NaCl. Die Tiere der Gruppe A-0 und B-0 erhielten dieselbe Menge NaCl ohne LPS. Nach einem Zeitintervall von 6 h 43 wurden die Tiere euthanasiert und es erfolgte die Aufbereitung von Blut, Milz und Knochenmark zur FACS-Analyse. Hierbei wurde auf die Betrachtung des prozentualen Anteils der humanen Leukozyten an der Gesamtzahl der Zellen sowie des prozentuale Anteils von B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, Granulozyten, myeloid-dendritischen Zellen, plasmazytoid-dendritischen Zellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen in den entnommenen Organen wert gelegt. Zusätzlich wurden die Aktivierungsmarker CD86 und HLA-DR auf Monozyten, mDCs und pDCs im Blut, in der Milz und im Knochenmark gemessen. Es wurden die entsprechenden Messwerte der Gruppe A und A-0 und der Gruppe B und B-0 separat verglichen. Zusätzlich wurde das Plasma der Tiere mittels CBA auf das Vorhandensein von humanen und murinen Zytokinen getestet. Hierbei wurden humanes IL-1, IL-6, IL-10, INFγ, TNF sowie murines Il-6, IL-10, IL-12/IL-23p40, MCP und TNF betrachtet. Außerdem wurde in den Gruppen A und A-0 sowie B und B-0 im Plasma der Tiere nach dem Versuchsende mittels ELISA humanes und murines PTX3 bestimmt. Charakterisierung der immunologischen Subpopulationen Aus dem Vergleich der Gruppe A und A-0 ergab sich ein signifikanter Anstieg der B-Zellen im Blut der Tiere der Gruppe A wie in Abb. 5 dargestellt. Außerdem wurde ein signifikanter Abfall der Monozyten im Blut der Tiere aus Gruppe A im Vergleich zur Kontrollgruppe A-0 festgestellt (Abb. 5). Andere Zellpopulationen zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen A und A-0. In Milz oder Knochenmark wurden keine Unterschiede der Zellpopulationen zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe beobachtet. Blut a b * 10 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 80 60 40 Monozyten [%CD45+] B Zellen [%CD45+ ] 100 20 0 * 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 8 6 4 2 0 A-0 A-0 A A Abb. 5: Darstellung der prozentualen Anteile der B-Zellen (a) und Monozyten (b) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. 44 Die Abbildung zeigt den prozentualen Anteil der B-Zellen an humanen Leukozyten in Abhängigkeit von der Gruppe (A-0 und A) im Blut der humanisierten NSG Mäuse. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=17 und in Gruppe A n=22. Das Signifikanzniveau betrug p=0,02. (b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=17 und in Gruppe A n=22. Das Signifikanzniveau betrug p< 0,001. Im Vergleich der Gruppen B und B-0 konnte ein Trend im Anstieg der B-Zellen sowie im Abfall der Monozyten in Gruppe B registriert werden (Abb. 6). Weiterhin zeigte der Vergleich dieser Gruppen ein signifikanter Anstieg von CD34+- Zellen in Gruppe B (Abb. 6). Außerdem wurde kein Anstieg anderer Zellpopulationen in Gruppe B gemessen. Milz und Knochenmark zeigten ebenfalls keine Veränderung ihrer Zusammensetzung in Gruppe B-0 und Gruppe B. Blut a b 80 60 40 20 0 * 10 5 B * 4 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 3 2 1 0 0 B-0 5 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS CD34+ [%CD45+] * c 15 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS Monozyten [%CD45+] B Zellen [%CD45+ ] 100 B-0 B B-0 B Abb. 6: Darstellung der prozentualen Anteile der B-Zellen (a) , Monozyten (b) und CD34+-Zellen (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 15-20 Wochen nach Transplantation. Die Abbildung zeigt den prozentualen Anteil der B-Zellen an humanen Leukozyten in Abhängigkeit zur Gruppe (B-0 und B) im Blut der humanisierten NSG Mäuse. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=11 und in Gruppe B n=12. Das Signifikanzniveau betrug p=0,07. (b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=12 und in Gruppe B n=12. Das Signifikanzniveau betrug p=0,06. (c) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=11 und in Gruppe B n=12. Das Signifikanzniveau betrug p=0,05. Charakterisierung der Aktivierung der Subpopulationen Gruppe A zeigt einen signifikanten Anstieg der Exprimierung des Oberflächenmarkers CD86 auf Monozyten und mDCs im Blut im Vergleich zur Gruppe A-0, wie in Abb. 7 dargestellt. Es konnte ein 45 Trend in der erhöhten Exprimierung von CD86 auf pDCs im Blut der Tiere aus Gruppe A relativ zur Gruppe A-0 fesgestellt werden (Abb. 7). Weiterhin wurde eine verstärkte Exprimierung von CD86 auf Monozyten im Knochenmark in Gruppe A im Vergleich zur der Gruppe A-0 gemessen. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Präsentation weitere Oberflächenmarker in Blut, Milz und Knochenmark. Blut 6000 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS * 5000 3000 2000 1000 c 2000 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS * 1500 1000 500 20000 CD86 pDC [Mean Fluoreszenz] b CD86 mDC [Mean Fluoreszenz] CD86 Monozyten [Mean Fluoreszenz] a 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 0 A-0 A 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS A-0 A A-0 A Abb. 7: Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität [Mean Fluoreszenz] von CD86 auf Monozyten (a) , mDCs (b) und pDCs (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. Die Abbildung zeigt die Mean Fluoreszenz Intensität (Mean Fluoreszenz) in Abhängigkeit zur Gruppe (A-0 und A) im Blut der humanisierten NSG Mäuse. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=17 und in Gruppe A n=21. Das Signifikanzniveau betrug p=0,01. (b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=6 und in Gruppe A n=7. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. (c) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=6 und in Gruppe A n=7. Das Signifikanzniveau betrug p=0,10. In den Gruppen der älteren Tiere besteht ein signifikanter Anstieg von CD86 auf pDCs im Blut der Tiere mit der Versuchsgruppe im Kontrast zu den Tieren der Gruppe B-0 (Abb. 8). CD86 auf mDCs und Monozyten im Blut zeigen einen Trend in der vermehrten Exprimierung in Gruppe B relativ zur Kontrollgruppe (Abb. 8). In der Milz wird CD86 auf mDCs der Gruppe B signifikant stärker präsentiert als in der Gruppe B-0. Dies gilt auch für den Oberflächenmarker HLA-DR auf pDCs im Knochenmark. 46 Blut 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 3000 2000 1000 0 c 40000 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 30000 20000 10000 8000 6000 4000 2000 0 B-0 B 5000 CD86 pDC [Mean Fluoreszenz] b 4000 CD86 mDC [Mean Fluoreszenz] CD86 Monozyten [Mean Fluoreszenz] a 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS * 4000 3000 2000 1000 0 B-0 B B-0 B Abb. 8: Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität [Mean Fluoreszenz] von CD86 auf Monozyten (a) , mDCs (b) und pDCs (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 15-20 Wochen nach Transplantation. Die Abbildung zeigt die Mean Fluoreszenz Intensität (Mean Fluoreszenz) in Abhängigkeit zur Gruppe (B-0 und B) im Blut der humanisierten NSG Mäuse. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=10 und in Gruppe B n=10. Das Signifikanzniveau betrug p=0,13. (b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=9 und in Gruppe B n=10. Das Signifikanzniveau betrug p=0,08. (c) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=8 und in Gruppe B n=10. Das Signifikanzniveau betrug p=0,05. Charakterisierung der Zytokinproduktion Sowohl in Gruppe A als auch in Gruppe B kam es zu einem signifikanten Anstieg der humanen Zytokine IL-1, IL-6, IL-10, INFγ und TNF im Kontrast zur jeweiligen Kontrollgruppe A-0 bzw. B-0 (Abb. 9). 47 b 60 * 50 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 6 4 * 400 huIL-1b [pg/ml] huTNFa [pg/ml] 40 8 c 500 200 100 0 0 * 2000 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 1500 300 2 2500 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS huIFNg [pg/ml] a 1000 800 600 400 200 A-0 0 A-0 A d e40 12000 * 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 6000 A 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS * 30 huIL-10 [pg/ml] 9000 huIL-6 [pg/ml] A-0 A 20 10 3000 0 0 A-0 A A-0 A Abb. 9: Darstellung der Konzentration von humanem TNFα (a) , IL-1β (b) , INFγ (c) , IL-6 (d) und IL-10 (e) im Plasma der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. Die Abbildung zeigt die Konzentration in pg/ml der jeweiligen Zytokine in Abhängigkeit zur Gruppe (A-0 und A) im Plasma der humanisierten NSG Mäuse. Es wurden die Daten von Gruppe A-0 und A reprästentativ für beide Altersgruppen dargestellt. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=21. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. (b,d,e) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=22. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. (c) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=22. Das Signifikanzniveau betrug p=0,016. 48 Darüberhinaus wurde ein signifikanter Anstieg der murinen Zytokine Il-6, IL-10, MCP und TNF verzeichnet (Abb. 10). Der Anstieg von murinem IL-12/IL-23p40 nach LPS-Gabe war in beiden Altersgruppen nicht signifikant. a b * * 12000 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 9000 1000 muIL-6 [pg/ml] muTNFa [pg/ml] 1500 500 6000 3000 0 0 A-0 A A-0 d c 800 * 200000 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 600 muMCP [pg/ml] muIL-10 [pg/ml] A 400 200 * 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 150000 100000 50000 0 0 A-0 A-0 A A Abb. 10:Darstellung der Konzentration von murinem TNFα (a) , IL-6 (b) , IL-10 (c) und MCP (d) im Plasma der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. Die Abbildung zeigt die Konzentration in pg/ml der jeweiligen Zytokine in Abhängigkeit von der Gruppe (A-0 und A) im Plasma der humanisierten NSG Mäuse. Es wurden die Daten von Gruppe A-0 und A reprästentativ für beide Altersgruppen dargestellt. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (ad) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=23. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. Charakterisierung der Produktion von Pentraxin 3 Es stellte sich ein signifikanter Anstieg sowohl von humanem als auch von murinem PTX3 in den Gruppen A und B bezüglich ihrer entsprechenden Kontrollgruppen A-0 und B-0 heraus. In Abb. 11 49 ist der Anstieg von humanem und murinem PTX3 stellvertretend durch die Tiere der Gruppe A und A-0 dargestellt. a b 1500 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS * muPTX3 [ng/ml] huPTX3 [ng/ml] 15 10 5 * 0 mg/kg LPS 5 mg/kg LPS 1000 500 0 0 A-0 A-0 A A Abb. 11: Darstellung der Konzentration von humanem PTX3 (a) und murinem PTX3 (b) im Plasma der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. Die Abbildung zeigt die Konzentration in ng/ml des entsprechenden PTX3 in Abhängigkeit zur Gruppe (A-0 und A) im Plasma der humanisierten NSG-Mäuse. Es wurden die Daten von Gruppe A-0 und A reprästentativ für beide Altersgruppen dargestellt. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=11 und in Gruppe A n=17. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. (b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=23. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. 50 Diskussion Die Sepsis sowie der damit verbundene septische Schock stellen in der modernen Medizin noch immer ein großes Problem dar. Trotz des Einsatzes umfangreicher technischer Hilfsmittel auf Intensivstationen sowie vorangeschrittener pharmazeutischer Möglichkeiten, ist die schwere Sepsis ein schlecht zu beherrschendes Problem, was sich in einer hohen Mortalitätsrate niederschlägt [50]. Hauptursache für die unzureichende Therapie sind die mangelnde Kenntnis der grundlegenden pathologischen Mechanismen im septischen Geschehen. Tiermodelle eröffnen dabei den Weg zum Verständnis der Grundlagen. In der Sepsisforschung besteht seit Jahrzehnten der Wunsch, ein Tiermodell zu entwickeln, das die Verhältnisse im septischen Patienten widerspiegelt und es darüber hinaus ermöglicht, die gewonnen Ergebnisse vom Tier auf den Patienten zu übertragen. Es wurden zahlreiche Modelle etabliert, die jedoch bisher nicht in der Lage waren alle Anforderungen an ein adäquates Tiermodell zu erfüllen [27, 51]. Gerade für die mangelhafte Übertragung der gewonnen Daten aus Tiermodellen kommt eine große Bedeutung zu, da im Laufe der Zeit viele neue Therapiemethoden versagten. Die Ergebnisse der Tierexperimente hielten hierbei dem klinischen Kontext nicht stand [3]. Es ist wichtig, die Übertragung von Daten aus Tierversuchen zu verbessern, da auf diese Art und Weise potentieller Schaden von Patienten abgewendet werden kann. Diese Arbeit widmet sich deshalb einer neuen Form eines Tiermodells, dem der humanisierten Maus. Durch die Transplantation von humanen CD34-Zellen aus Nabelschnurblut in neugeborene Mäuse des immundefizienten NOD.Cg-Prkd scid Il2rg tm1Wjl/SzJ – Stammes entwickelt sich in diesen Tieren in einem Zeitraum von 8-20 Wochen ein menschliches Immunsystem. Da es sich bei der Sepsis um ein vornehmlich immunologisch vermitteltes Krankheitsbild handelt, stellen diese Tiere verbesserte Ausgangsbedingungen dar. Unteschiede zwischen Mensch und Maus in der Vermittlung der Immunantwort durch Zytokine und deren Wirkung auf die Immunzellen, spielen somit eine untergeordnete Rolle. Aufgrund des unterschiedlichen Anwachsens der humanen Stammzellen kommt es jedoch zwischen den Tieren zu interindividuellen Unterschieden in der Ausprägung und Funktionalität des humanen Immunssystems [31]. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung der Reaktion der einzelnen Immunzellen auf eine Stimulation mit LPS und untersucht, inwieweit die Immunzellen in der Lage sind, Zytokine und PTX3 zu produzieren. Es wurden dabei Tiere in zwei verschiedenen Altersgruppen (8-10 Wochen und 15-20 Wochen) untersucht, um einer möglichen unabgeschlossenen Entwicklung des humanen Immunsystems nach Transplantation Rechnung zu 51 tragen. Damit soll die Arbeit Aufschluss darüber geben, inwieweit sich die humanisierte Maus als neuartiges Tiermodell zur Erforschung von Sepsis eignet. Altersunterschiede in der Reaktion auf LPS Das humane Immunsystem befindet sich im Menschen nicht in einem unveränderlichen Zustand, sondern unterliegt der ständigen Entwicklung. Zum einen verändert sich die Zusammensetzung des adaptiven Immunsystem im hohen Alter [52], zum anderem erfolgt nach der Geburt eine kontinuierliche Entwicklung und Reifung des Immunsystems, die für das Überleben von entscheidender Bedeutung sind [53–55]. Auch im Kontext der humanisierten Maus, in dem Stammzellen die Entwicklung eines Immunsystems in einem neugeborenen Individuum bewirken, liegt der Gedanke an einen progredienten Reifeprozess nahe. Aufgrund von Vorversuchen und der in der Literatur [39, 56] beschriebenen altersabhängigen Zusammensetzung der Subpopulationen des humanen Immunsystems in der Maus und der vergleichbaren Situation der Knochenmarktransplantation im klinischen Alltag [57] wurde in der vorliegenden Arbeit daher eine Unterteilung der Versuche in zwei Altersgruppen vorgenommen. Die Einteilung der Altersgruppen stützte sich dabei ebenfalls auf die in Vorversuchen entdeckten Veränderungen der Zusammensetzung der einzelnen immunologischen Subpopulationen über einen Zeitraum von 8-24 Wochen. Im klinischen Alltag [57] findet nach der Transplantation von Knochenmark eine kontinuierliche Reifung des Immunsystems statt. Dazu gehören ein rascher Anstieg von Granulozyten, NK-Zellen und Monozyten, der zeitnah nach der Transplantation einsetzt [57]. Die Untersuchung der Entwicklung humanen Lymphozytenpopulationen in humanisierten Mäusen von Lang et al. [58] beschreiben einen raschen Anstieg der B-Zelllinie sowie ein verspätetes Auftreten von T-Zellen. Dieses Verhältnis verschiebt sich zu Gunsten der T-Zellen, sodass im Alter von 20 Wochen vor Allem T-Zellen im Blut zu finden sind. Diese Beschreibung deckt sich mit den in dieser Arbeit gefundenen Daten. Da die adaptive Immunantwort einen großen Teil der Immunantwort des Individuums darstellt und demzufolge keinen bloß unerheblichen Einfluss auf die Immunreaktion auf exogene Reize besitzt, wurde eine Experimentansatz gewählt, der diese Entwicklung berücksichtigt. Um dem diffizilen Geschehen der Entwicklung des adaptiven Immunsystems Rechnung zu tragen, wurde in den folgenden Experimenten die Tiere in zwei unterschiedliche Altersgruppen eingeteilt. Dabei wurde sich für die Einteilung in eine Gruppe junger Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach 52 Transplantation (Gruppe A und A-0), sowie für eine Gruppe alter Tiere im Alter von 15-20 Wochen nach Transplantation (Gruppe B und B-0) entschieden. Die Aufstellung der Gruppe A und A-0 ergab sich aus dem zeitigsten Zeitpunkt einer anzunehmenden Funktionalität der Immunzellen, wie er auch bei Gille et al. [39] angenommen wurde. Gruppe B und B-0 ergaben sich aus der Annahme einer Funktionalität von T-Zellen ab 15 Wochen nach Transplantation wie sie Ernst et al. [56] vornahmen. Das Maximalalter von 20 Wochen ergab sich aus der Verlaufsbeobachtung der sechs Tiere im Zeitraum von 8-24 Wochen, bei der sich mit steigendem Alter ein zunehmend schlechterer Allgemeinzustand der Tiere einstellte. Dieser wurde mit Hilfe eines Scoringsystems erfasst. Im Alter von 20 Wochen musste die Mehrheit der Tiere aufgrund des schlechten Allgemeinzustandes euthanasiert werden. Aufgrund der im TVV 36/12 deklarierten human endpoints und einer möglichen Verfälschung künftiger Ergebnisse durch eine nicht repräsentative Ausgangssituation wurde ein Maximalalter von 20 Wochen festgelegt. Die differenzierte Betrachtung der Reaktion der humanen Zellpopulationen auf LPS im Bezug auf das Alter nach Transplantation ergab hierbei einen signifikanten Anstieg (p=0,05; Tab. 5 ) von CD34-Zellen nach LPS-Gabe im Blut der alten Tiere, der sich in der jungen Population nicht wiederfindet (Tab. 2). Der Anstieg der CD34-Zellen in der Gruppe der älteren Tiere legt die Hypothese einer fortlaufende Entwicklung nahe, bei der die Tiere im Alter von 15-20 Wochen bereits in der Lage sind, CD34-Zellen aus dem Knochenmark als Reaktion auf ein infektiöses Geschehen freizusetzen. Diese Freisetzung geschieht möglicherweise im Sinne einer Rekrutierung von Immunzellen, die durch das septische Geschehen vermindert sind [59, 60]. Diese Hypothese wird durch die Ergebnisse von Parravicini [61] gestützt. Dort wird eine verringerte Bildung verschiedenster Chemokine im Nabelschnurblut Neugeborener im Vergleich zu peripherem Blut Erwachsener beschreiben. Bei diesen Chemokinen handelt es sich um Mediatoren, die die Hämatopoese unterstützen. Bei der altersabhängigen Betrachtung der Exprimierung von Oberflächenmarkern nach LPS-Gabe wurde ein Trend einer vermehrten Exprimierung von CD86 auf Monozyten, mDCs und pDCs im Blut in beiden Altersgruppen erkannt (Abb. 7 und Abb. 8). Lediglich die Exprimierung der Aktivierungsmarker in Milz und Knochenmark divergiert in den Altersgruppen. So zeigten die jungen Tiere eine verstärktes Auftreten von CD86 auf Monozyten im Knochenmark, wohingegen die älteren Tiere signifikant mehr CD86 auf mDCs in der Milz und HLA-DR auf pDCs im Knochenmark präsentierten. Die Unterschiede bezüglich der Oberflächenmarker lassen sich 53 vermutlich vorrangig durch eine unzureichende Entwicklung des humanen Immunsystems zum Versuchszeitpunkt erklären. Ergebnisse anderer Arbeiten, die sich mit der Exprimierung von Aktivierungsmarkern nach LPS-Gabe beschäftigen [62], legen in Zusammenschau mit Abreiten an humanisierten Mäusen [39] nahe, dass die inhomogene Reaktion der Oberflächenmarker in Blut, Milz und Knochenmark vorrangig Ausdruck der unzureichenden Reifung des humanen Immunsystems in der Maus darstellt. Ähnlich wie die verringerte Exprimierung von HLA-DR auf fetalen Monozyten im Blut [63] ist ein Mangel an Aktivierung in Milz und Knochenmark sowohl auf Monozyten als auch auf mDCs und pDCs denkbar, die sich teilweise aus Monozyten ableiten.Da die Gruppe der alten Tiere (15-20 Wochen) ebenfalls ein inhomogenes Reaktionsmuster zeigen, ist davon auszugehen, dass auch zu diesem späteren Zeitpunkt noch nicht von einem vollständig funktionstüchtigen humanem Immunssystem ausgegangen werden kann. Die in der Arbeit gewonnen Ergebnisse lassen jedoch diesen Zusammenhang nur vermuten, weshalb eine genauerer Abklärung mittels verändertem Experimentansatz nötig wäre. Neben der relativen Zusammensetzung der immunologischen Subpopualationen und der Aktivierung dieser durch LPS, kann die Produktion von Zytokinen Aufschluss über die Funktionalität der Immunzellen geben, weshalb zusätzlich der Produktion von humanem IL-1, IL-6, IL-10, INFγ und TNF und murinem TNF, IL-6, IL-10 und MCP nach LPS-Administration Aufmerksamkeit geschenkt wurde. Hierbei ergab sich ein Anstieg der Konzentration von humanem IL-1, IL-6, IL10, INFγ und TNF (Abb. 9) sowie von murinem TNF, IL-6, IL-10 und MCP (Abb. 10) nach LPSGabe, der sich in beiden Altersgruppen zeigte. Aufgrund dieser Ergebnisse ist davon auszugehen, dass die Zellen bereits im Alter von 8-10 Wochen funktionell in der Lage sind, als Antwort auf einen bestimmten immunologischen Reiz Zytokine zu bilden und dass diese Fähigkeit bis zum Alter von 15-20 Wochen bestehen bleibt. Da PTX3 als Teil der Pentraxinfamilie [64] in der aktuellen Sepsisforschung als Surrogatmarker zur Prognose der Sepsis im Patienten Anwendung findet [43](usitaloo-seppälä 2013), wurde sich neben der Zytokinproduktion auf die altersabhängige Produktion von humanem und murinem PTX3 konzentriert. Es konnte sowohl bei den jungen als auch bei den alten Tieren ein signifikanter Anstieg (p< 0,002) der Konzentration von humanem und murinem PTX3 nach LPS-Gabe im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet werden (Abb. 11). Die Ergebnisse legen nahe, dass die humanen Immunzellen bereits im Alter von 8-10 Wochen in der Lage sind, PTX3 zu produzieren und diese Eigenschaft auch im Alter von 15-20 Wochen ausgeprägt ist. 54 Die Unterschiede zwischen den Altersgruppen beziehen sich demzufolge vor Allem auf die sepzifische Zellpopulation der CD34-Zellen und die Aktivierung von Monozyten, mDCs und pDCs in Milz und Knochenmark. Veränderungen nach LPS-Gabe Veränderungen des Gehalts der immunologischen Subpopulationen Wie bereits aus klinischen Studien [65] bekannt und ebenfalls im tierexperimentellen Zusammenhang festgestellt [28], kommt es während des septischen Geschehens zu einem extremen Anstieg von Zytokinen, die die Entzündungsreaktion vermitteln. Außerdem ändert sich die Zusammensetzung der immunologischen Subpopulationen, vorrangig von Monozyten und Granulozyten [15]. Aber auch andere Subpopulationen, wie B-Zellen, T-Zellen und dendritische Zellen sind für die Sepsisforschung immer mehr von Interesse [66–69]. Da sich das humane Immunsystem in der humanisierten Maus zum Teil recht stark in der Vermittlung von Zytokinreaktionen unterscheidet und eine Funktionalität vor Allem des adaptiven Weges weiterhin in Frage gestellt wird [56, 70], wurde bei der vorliegenden Arbeit auf die Betrachtung der Reaktion sowohl der adaptiven als auch angeborenen Subpopulationen Wert gelegt. Veränderungen der B-Zellen und T-Zellen Obwohl in der Sepsisforschung seit langem der Schwerpunkt auf der Erforschung des angeborenen Immunsystems liegt, rückt auch die Betrachtung der Rolle der B- und T-Zellen immer mehr in den Fokus. Die bisherige Datenlage liefert Ergebnisse bezüglich der Prognoseeinschätzung der Sepsis im Bezug auf den Abfall von B-Zellen in Patienten mit Sepsis [71]. Das Fehlen von B-Zellen wird dabei für ein schlechteres Überleben nach Sepsis verantwortlich gemacht [71]. Es wird davon ausgegangen, dass die Reduktion der B-Zellen unter anderem durch Apoptose zustande kommt [72]. Experimente an humanisierten Mäusen zeigen jedoch gegensätzliche Ergebnisse. Hier kommt es nach Stimulation des Immunsystems zu einem Anstieg von B-Zellen [56]. In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls ein Anstieg der B-Zellen nach LPS-Stimulation beobachtet, was die bisherigen Ergebnisse mit Blick auf humanisierte Mäuse unterstützt, jedoch im Kontrast zur klinisch beschriebenen Datenlage steht. Um diese Spezifität des humanisierten Immunsystems zu erklären, kommt eine Konstellation der Immunantwort in der humanisierten Maus in Frage, die möglicherweise eine relative Resistenz der B-Zellen gegenüber LPS bewirkt. Denkbar wäre, dass die in anderen Arbeiten beschriebene mangelnde Funktionalität der B-Zellen [56, 70] Grund für diese 55 Resistenz sein könnte. Um genaueren Aufschluss über die Situation der B-Zellen in humanisierten Mäusen und deren Reaktion auf LPS zu gewinnen, wäre ein experimenteller Ansatz denkbar, der die genauere Charakterisierung der humanen B-Zellen nach LPS-Gabe bezüglich ihres Reifezustandes mittels Durchflusszytometrie verwirklicht. Ein solcher Ansatz würde den Rahmen der Arbeit jedoch überschreiten und wurde deshalb nicht weiter verfolgt. Ähhnlich der B-Zellen [71], eine Verringerung des Gehaltes der T-Zellen während der Sepsis beschrieben und als ursächlich für die Immunsupression angesehen [73]. Zudem steht in der Literatur zum einen eine Dysregulation der regulatorischen T-Zellen sowie der CD4 + - und CD8+ -TZellen im Vordergrund [74]. Dabei wird unter anderem eine Erhöhung des Gehalts an regulatorischen T-Zellen beschrieben, die mit einer Prognoseverschlechterung der Sepsis einhergeht [75]. Das in der vorliegenden Arbeit dargestellte Ergebnis, welches keine Veränderungen der T-Zell-Population nach LPS-Gabe im Blut oder anderen Organen erkennen lässt, muss dabei jedoch im speziellen Kontext der humanisierten Maus betrachtet werden. Durch die gewünschte fehlende Entwicklung muriner B- und T-Zellen in der NSG-Maus, kommt es zur inadäquaten Ausbildung sekundärer lymphatischer Organe wie Thymus oder Lymphknoten [31]. Die sekundär lymphatischen Organe stellen jedoch eine essentielle Rolle für die Reifung der TZellen dar, da es hier unter anderem zur Selektion autoreaktiver T-Zellen sowie doppelt positiver oder doppelt negativer T-Zellen kommt. Von dieser Fehlanlage des Thymus sind nach der Transplantation ebenfalls die humanen T-Zellen betroffen, weshalb eine unzureichende Reifung der humanen T-Zellen in einer ungenügenden Repräsentation der T-Zell-Antwort im septischen Geschehen in der humanisierten Maus mündet. Durch die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Versuche zur Entwicklung des Gehaltes der T-Zellen in Abhängigkeit vom Alter der humanisierten Mäuse (Abb. 2) ist ebenfalls eine Unterentwicklung der T-Zellen, wie sie bei Neugeborenen beschrieben wird [76] auch im Kontext der humanisierten Maus wahrscheinlich. Veränderungen der CD34-Zellen CD34-Zellen stellen aufgrund ihrer Eigenschaft als hämatopoetische Vorläuferzelle eine für die Forschung extrem vielfältige und damit interessante Zellpopulation dar. Durch die mittlerweile im klinischen Alltag angewandte Knochenmarktransplantation [77], bei der diese Zellgruppe transplantiert wird, ist das Interesse der Forschung direkt mit dem medizinischen Alltag verknüpft. Als Ursache für Sepsis wird momentan ein komplexes Netzwerk aus Überreaktion des Immunsystems durch extreme Zytokinproduktion und damit verbundene Schwächung durch 56 zytokininduzierten Zellverlust beschrieben [15, 72, 16]. Der Gedanke, diesen Zellverlust durch die Bereitstellung von CD34-Zellen zu beeinflussen und damit eine Stärkung des Immunsystems hinsichtlich Zellpräsenz zu schaffen, wurde dabei von Brudecki 2011 aufgenommen. In dieser Arbeit ließ sich durch den Transfer von CD34-Zellen bei Mäusen mit schwerer Sepsis die Überlebensrate verbessern. Da verschiedene Subpopulationen der Immunzellen im septischen Geschehen vermindert sind, kann es für den Organismus nützlich sein hämatopoetische Vorläuferzellen freizusetzen. Diese CD34-Zellen sind in der Lage sich in jede Zelle des Immunsystems zu entwickeln, weshalb sie einen Zellverlust ausgleichen können. Dies legt den Gedanken nahe, dass ein vermehrtes Vorhandensein von CD34-Zellen das Überleben verbessert. Neue Therapieansätze, wie die ex-vivo-Kultivierung und Rücktransplantation von Granulozyten, die aus CD34-Zellen des Knochenmarks von betroffenen Patienten gewonnen wurden, spiegeln die allgemeine Auffassung der unterstützenden Wirkung von CD34-Zellen im septischen Geschehen wider [60]. Der in der vorliegenden Arbeit beschriebene Anstieg von CD34-Zellen nach LPS-Gabe im Blut der Gruppe der alten Tiere spricht daher für das Freisetzen von CD34-Zellen aus dem Knochenmark als Reaktion auf ein massives Immungeschehen. Eine ähnliche Reaktion wird bei starken Entzündungen beobachtet, bei denen sich eine sogenannte Linksverschiebung im Blutbild von Neutrophilen hin zu Vorläuferzellen manifestieren kann [78]. Veränderung der Granulozyten Granulozyten wurden bislang als eine der Hauptvermittler des sepsisspezifischen Geschehens gesehen [16]. Ihnen kommt dabei vor Allem die Aufgabe der Aktivierung der Immunantwort zu, da sie durch die Detektion und die Einwanderung zum infektiösen Fokus eine Zytokinkaskade in Gang setzten, die wiederrum andere Zellen des Immunsystems aktiviert [79, 72]. In diesem Zusammenhang wird im septischen Geschehen eine verstärkte Freisetzung von Granulozyten aus dem Knochenmark beschrieben [78]. Die vorliegende Arbeit sollte klären, ob der Effekt des Anstieges der Granulozytenzahl ebenfalls in der humanisierten Maus zu beobachten ist. Der fehlende Anstieg humaner Granulozyten im peripheren Blut nach LPS-Gabe kann unterschiedliche Ursachen haben. Am wahrscheinlichsten ist hierbei die für die humanisierte Maus typische Koexistenz von humanen und murinen Granulozyten Aufschluss zu liefern. Durch die NOD.Cg-Prkd scid Il2rg tm1Wjl/SzJ- Mutation wird vor allem die Bildung und Funktion des adaptiven Immunsystems sowie von NK-Zellen verringert, nicht jedoch die Bildung von Granulozyten. Die Mäuse sind daher in der Lage, weiterhin Granulozyten zu bilden [80]. Begleitende Versuche, deren Daten in dieser 57 Arbeit nicht aufgeführt sind, liefern hierbei Anhaltspunkte für ein Übergewicht der murinen Granulozyten. Dieser Sachverhalt wirkt sich nun bei der Reaktion auf einen immunologischen Reiz aus: Es reagieren nicht auschließlich humane Granulozyten, sondern zusätzlich murine Granulozyten, da LPS einen relativ unspezifischen Reiz darstellt. Es ist daher vorstellbar, dass die murinen Granulozyten aufgrund ihrer Überzahl den Großteil der Reaktion übernehmen und die Reaktion der humanen Granulozyten in diesem Fall in den Hintergrund tritt. Ein anderes Forschungsgebiet, das sich mit dem angeborenen Teil der Immunantwort beschäftigt, ist die Allergieforschung. Da Granulozyten zum Teil der angeborenen Immunabwehr zählen, stellt sich hier dieser Sachverhalt ebenfalls problematisch dar. Aus diesem Grund wird versucht, Modelle humanisierter Mäuse zu entwickeln, die in der Lage sind funktionale humane Granulozyten zu bilden [81]. Veränderungen der Monozyten, mDCs und pDCs Bei der Sepsis handelt es sich um ein Krankheitsbild, dass vorallem durch die angeborene Immunantwort vermittelt wird. Monozyten gelten neben Granulozyten als wichtigster Vermittler der Immunreaktion während der Sepsis [8]. Durch das Vorhandensein von TLRs auf ihrer Oberfläche ermöglichen sie das Erkennen von LPS und anderer pathogen-assozierter molekularer Muster (PAMPs) [9]. Durch die Aktivierung der Monozyten über TLRs kommt es über verschiedene Signalwege zur Ausschüttung von Zytokinen, die andere Immunzellen aktivieren und in das Bild einer Sepsis münden können. In Anbetracht dieser vorrangigen Bedeutung der Monozyten im septischen Geschehen wurde sich in der vorliegenden Arbeit mit der Veränderung des Gehalts der Monozyten nach LPS-Applikation beschäftigt. Hierbei wurde ein Abfall der Monozyten beschrieben, der sich durch die vermehrte Apoptose von Monozyten während der Sepsis erklären lässt, wie sie sowohl im septischen Patienten [82, 16] als auch in Tiermodellen beschrieben ist [39, 41]. Neben Granulozyten und Monozyten stellen dendritische Zellen einen besonderen Teil der angeborenen Immunabwehr dar, da im Gegensatz zu diesen in der Lage sind Erreger zu opsonieren und somit eine direkte Verbindung zur adaptiven Immunantwort darstellen. Im septischen Geschehen macht sich dieses Zusammenspiel vor Allem im Bezug auf die Supression der bestehenden Immunreaktion als Teil der Regulation der Immunantwort bemerkbar [83, 67]. Aus diesem Grund war es von Bedeutung, das Verhalten der dendritischen Zellen in der humanisierten Maus nach LPS-Gabe zu betrachten. 58 Die beobachtete Stagnation des Gehalts von mDCs und pDCs in beiden Altersgruppen nach LPSGabe im Blut kann verschiedene Ursachen haben. Zum Einen wird ein Anstieg von mDCs durch die Stimulation mit LPS beschrieben [40], zum Anderen scheint sich diese Expansion laut Riccardi [84], deren Arbeit sich dendritischen Zellen in septischen Patienten widmet, erst nach einigen Tagen, d. h. in der antiinflammatorischen Phase des Sepsisgeschehens zu ereignen. Da die antiinflammatorische Phase unter Anderem durch dendritische Zellen vermitteln wird, ist eine Expansion der dendritischen Zellen in dieser Phase plausibel [83]. Das in der vorliegenden Arbeit gewählte Versuchsende 6 h nach LPS-Administration spiegelt jedoch vorrangig die proinflammatorische Phase wieder, da vor Allem proinflammatorische Zytokine wie u.A. TNFα und INFγ gebildet werden. Die Kenntnis über die Dominanz der proinflammatorischen Zytokine erklärt somit die Stagnation des Gehalts der dendritischen Zellpopulation. Eine fehlende Reaktion der dendritischen Zellen aufgrund Unreife kommt ebenfalls als mögliche Ursache in Betracht, da beispielsweise zur Reifung von pDCs der Kontakt mit naiven T-Zellen in sekundär lymphatischen Organen notwendig ist [84], der in der humanisierten Maus aufgrund unzureichender Anlage erschwert ist [80, 85]. 59 Aktivierung der immunologischen Subpopulationen Einen wichtigen Punkt in der Vermittlung des Immungeschehens stellt unter Anderem die Kommunikation der Immunzellen untereinander dar. Diese Kommunikation ist Ausgangspunkt für die gezielte Reaktion des Organismus auf einen bestimmten pathogenen Keim und spielt im weiteren Verlauf eine Rolle in der Hinabregulation der Immunreaktion nach stattgehabter Infektion [15]. Als wichtiger Kommunikationspfad dienen hierbei vor Allem Zytokine und Chemokine, die von den Immunzellen ausgeschüttet werden. Als Zeichen oder Vorraussetzung des Freisetzens der Zytokine wird eine Zelle aktiviert. Dieser Aktivierungszustand drückt sich in der Expression spezieller Oberflächenmoleküle aus, die für die Familie einer Zellpopulation spezifisch sind [86]. Die Präsentation dieser Oberflächenmoleküle ist dabei nicht bloßer Ausdruck der Aktivierung, sondern dient wiederum der Vernetzung und Kommunikation der Zellen unterschiedlicher immunologischer Zelltypen. Daraufhin regulieren Immunzellen letztendlich nicht nur durch die Produktion von Zytokinen, sondern auch durch die Exprimierung der Oberflächenmarker das immunologische Geschehen [62]. In der Sepsisforschung wurde bereits versucht, spezifische Oberflächenmarker vor Allem auf Monozyten in Kombination mit anderen Surrogatmarkern für die Differentialdiagnose der Sepsis einzusetzen [45]. Da die Bestimmung von Oberflächenmarkern mittels Durchflusszytometrie ein relativ gängiges und im klinischen Alltag anwendbares Konzept darstellt, lag eine Fragestellung der Arbeit ebenfalls auf der Charakterisierung der Exprimierung spezieller Oberflächenmarker auf Monozyten und dendritischen Zellen. Hierbei wurde die Reaktion in der humanisierten Maus mit der im menschlichen Organismus beschriebenen Rekation verglichen: Die Untersuchung der Aktivierung von Monozyten, mDCs, pDCs in Blut, Milz und Knochenmark durch Messung der Exprimierung der Oberflächenmoleküle HLA-DR und CD86 (Monozyten, mDcs und pDCs) im Durchflusszytometer ergaben einen Trend bzw. signifikante Unterschiede in der verstärkten Präsentation von CD86 auf Monozyten, mDCs und pDCs im Blut nach LPS-Gabe. Dieser Effekt konnte in beiden Altersgruppen beobachtet werden. In der Literatur wurde das vermehrte Auftreten von CD86 sowohl auf Monozyten als auch auf dendritischen Zellen beschrieben [67]. Zusätzlich wird während einer Endotoxämie jedoch auch ein Anstieg von HLA-DR beschrieben, der durch die kostimulatorischen Wirkung von CD86 bedingt ist . Dieser Effekt konnte in dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Ein Ausbleiben des Anstieges von HLA-DR lässt sich jedoch mit den von Jones 2002 beschriebenen Ergebnissen begründen, bei der die Untersuchung von fetalen Monozyten ein 60 grundsätzlich verringertes Vorhandensein von HLA-DR beschreibt. Im Gegenzug wird eine mit adulten Zellen vergleichbar adäquate Exprimierung von CD86 beschrieben. In Anbetracht der Tatsache, dass es sich bei der Entstehung des humanen Immunsystems in der Maus um einen Entwicklungsprozess handelt, liegt der Vergleich mit der Entwicklung in Neugeborenen nahe [56]. Da sich mDCs aus Monozyten entwickeln, wäre es möglich, dass sich die Entwicklung der HLA-DR und CD86-Expression vergleichbar vollzieht. Eine ähnliche Erklärung ergibt sich für das Verhalten der pDCs in der vorliegenden Arbeit, die zum Teil monozytäre und zum Teil B- und T-Zell-assozierte Entwicklungsschritte aufweisen [87, 88]. Die erhöhte Exprimierung von CD86 auf Monozyten im Knochenmark der jüngeren Tiere nach LPSAdministration und die verstärkte Exprimierung von CD86 auf mDCs in der Milz bzw. von HLA-DR auf pDCs im Knochenmark der älteren Tiere nach LPS-Gabe entsprechen einer Aktivierung der jeweiligen Zellen in den entsprechenden Organen. Da wenig Material zur Beurteilung der Aktivierung von Monozyten, mDCs und pDCs in Milz und Knochenmark nach LPS-Gabe vorliegt, stellt sich eine Interpretation als schwierig dar. Betrachtet man jedoch die Ergebnisse [89, 48, 86], die sich zur Aktivierung von mDCs, pDCs und Monozyten im peripheren Blut finden und nimmt an, dass diese sich auch auf die Zellpopulationen in der Milz und im Knochenmark übertragen lassen, scheint in der humanisierten Maus ein Defizit bezüglich der Aktivierung der Zellpopulationen vorzuliegen, was im oberen Abschnitt bereits für die Reaktion der Zellen im peripheren Blut genauer erläutert wurde. Da nur wenig Daten über eine explizite Aufschlüsselung des Verhaltens von Aktivierungsmarkern nach LPS-Gabe in der humanisierten Maus existiert, können nur hypothetische Schlüsse gezogen werden, die eine Unreife des humanen Immunsystems und damit eine inadäquate und inhomogene Reaktion der Monozyten, mDCs und pDCs einschließen [39]. Eine genaue Klärung des Geschehens ist mit den angewandten Methoden nicht möglich, jedoch würde möglicherweise ein Versuchsansatz, der die Differenzierbarkeit und Aktivierung von humanen Monozyten, mDCs und pDCs aus humanisierten Mäusen ex vivo einschließt einen zusätzlichen Erkenntnisgewinn bringen. 61 Produktion von Surrogatmarkern Produktion humaner Zytokine Das heutige Verständnis der Sepsis drückt sich in dem typischen Bild einer Überreaktion des Immunsystems aus. Diese Überreaktion ist zum Eeinen gekennzeichnet durch den Verlust von Zellen die für die Immunabwehr und die Gerinnung von Bedeutung sind. Als Komplikation einer Sepsis kann es deshalb unter anderen zur Störung des Gerinnungsprozesses, zur Bildung von Mikrothromben und einem damit verbundenen Multiorganversagen kommen [13, 14]. Der Verlust der Immunzellen und die Störung in der Gerinnung sind nach heutiger Aufassung vor Allem einem enormen Ausmaß an Zytokinfreisetzung zuzuschreiben [15]. Durch die Überproduktion von Zytokinen, wie TNFα, IL-1β oder INFγ, kommen die regulatorischen Prozesse des Immunsystems, die die Abwehr des Erregers auf lokaler Ebene steuern sollen, ins Ungleichgewicht, weshalb die systemische Inflammationsreaktion letztendlich bei dem Auftreten eines Erregers in eine Sepsis mündet. Um die Funktionalität der humanen Immunzellen zu überprüfen und den in der Sepsis bekannten Zytokinsturm darzustellen, erfolgte die Messung der Konzentrationen humaner Zytokine im Plasma mittels CBA. Sie ergab einen signifikanten Anstieg von IL-1, IL-6, IL-10, INFγ und TNF nach LPSAdministration sowohl in der Gruppe junger als auch in der Gruppe alter Tiere. Die Produktion proinflammatorischer Zytokine, wie IL-1, IL-6, INFγ und TNF sind sowohl in Tiermodellen [41, 39] als auch im klinischen Kontext [12, 15] bekannt. Der Anstieg von IL-10, welches ein antiinflammatorisches Zytokin ist, kann den Übergang der endotoxämischen Vorgänge in den Tieren von dem Zustand der pro- zur antiinflammatorischen Phase widerspiegeln [12]. Die vergleichsweise niedrige mittlere Konzentration von IL-10 von 7 pg/ml (Gruppe A) bzw. 13,8 pg/ml (Gruppe B) nach LPS-Gabe im Gegensatz zu den mittleren Konzentrationen der proinflammatorischen Zytokine (IL-6: 2926 pg/ml [Gruppe A] und 2304 pg/ml [Gruppe B]) legen die Vermutung nahe, dass es sich jedoch um den Beginn der antiinflammatorischen Phase handelt. Produktion muriner Zytokine Durch die residualen Anlagen von murinen Granulozyten und Monozyten [80], die vorrangig für die Produktion der Zytokine im Entzündungsgeschehen verantwortlich sind, erschien die Frage nach der Produktion muriner Zytokine als interessanter Teilaspekt der Arbeit. Um einen möglichen Einfluss des murinen Immunsystems auf die Veränderung der Zytokinproduktion in den Tieren zu 62 untersuchen, wurden die Konzentrationen murinen Zytokine TNF, IL-6, IL-10, MCP und IL-12/IL23p40 mittels CBA im Plasma der Tiere bestimmt. Überraschend war hierbei nicht nur der signifikante Anstieg von TNF, IL-6, IL-10 und MCP, sondern die zugleich um eine bis zu dreifach höhere mittlere Konzentration der murinen Zytokine im Vergleich zu entsprechenden humanen Zytokinen (Tab. 14,Tab. 15) nach LPS-Gabe. In der Literatur ist die Bildung muriner Zytokine in humanisierten Mäusen noch nicht bekannt. Wie bereits beschrieben, ist die humanisierte Maus zusätzlich zu humanen Granulozyten und humanen Monozyten ebenfalls mit murinen Äquivalenten dieser Zellpopulationen ausgestattet. Es ist daher vorstellbar, dass diese murinen Zellen ebenfalls durch LPS aktiviert werden und eine Auschüttung muriner Zytokine bewirken. Zu klären bleibt die Frage, ob es sich bei der Reaktion um eine vornehmlich vom murinen Immunsystem gesteuerte Pathogenese handelt, die anschließend eine Reaktion der humanen Immunzellen nach sich zieht, oder ob beide Immunsysteme parallel agieren. Eine Klärung dieser Frage würde die Inkubation humaner Zellen mit murinen Zytokinen und die anschließende Messung von Aktivierungsmarkern per Durchflusszytometerie ermöglichen. Die Prüfung der Abhängigkeit der humanen Zytokinproduktion von dem residualen murinen Immunsystem wäre von Nutzen um optimaleres Tiermodell zu schaffen. Produktion von humanem und murinem Pentraxin 3 PTX3 gehört gemeinsam mit CRP zur Gruppe der Akut-Phase-Proteine und ermöglicht als sogenannter löslicher pathogen-pattern-recognition-receptor die Identifikation von pathogenem Material [90, 91]. Im Gegensatz zu dem in der Medizin seit langer Zeit bekannten CRP ist es nicht ausschließlich von der Syntheseleistung der Leber abhängig [92], da es von unter Anderem von den Immunzellen gebildet wird, die sich im Fokus der Infektion befinden. Die damit verbundene Korrelation zwischen PTX3 und dem infektiösen Fokus hat PTX3 als diagnostischen und vor Allem prognostischen Marker für Sepsis interessant gemacht. Aufgrund vielversprechender Ergebnisse im Tierversuch [25] fand PTX3 auch im klinischen Kontext als prognostischer Marker Anwendung. PTX3 kommt in der Sepsisforschung eine vermehrte Bedeutung zu, da bisherige Ergebnisse aus klinischen Studien PTX3 als prognostischen Marker nutzen [43, 24]. Um diesen Studien eine verbesserte tierexperimentelle Grundlage liefern zu können, wurde die Konzentration von humanem und murinem PTX3 im Plasma der Tiere nach Sepsisinduktion in den Altersgruppen 8-10 Wochen und 15-20 Wochen nach Transplantation bestimmt. Hierbei wurde ein signifikanter Anstieg von humanem PTX3 in beiden Altersgruppen sowie ebenfalls von murinem PTX3 63 festgestellt. Wie im vorangegangen Abschnitt (murine Ztyokinproduktion nach LPS) beschrieben, handelt es sich im Vergleich der mittleren Konzentrationen von humanem und murinem PTX3 nach LPS-Gabe um eine deutlich stärkeren Anstieg von murinem PTX3 nach LPS-Gabe bei ähnlichen Ausgangskonzentrationen ohne LPS-Gabe (Tab. 18,Tab. 19). Da PTX3 nach dem heutigen Stand der Wissenschaft vorrangig durch Monozyten und Granulozyten produziert wird [92], ist ein Anstieg des murinen PTX3 vorallem durch die residuale Anlage muriner Granulozyten zu vermuten. Nichtsdestotrotz stellt der Nachweis von humanem PTX3 in humanisierten Mäusen einen Fortschritt dar, mit dem es möglich wird, die Rolle von PTX3 im septischen Geschehen weiter zu beleuchten und mögliche Therapien von Entzündungen, die sich auf die Beeinflussung von PTX3 stützen, zu testen. Der Nachweis von murinem PTX3 wiederum ermöglicht es in der Zusammenschau mit den gemessenen murinen Zytokinen, die residuale Reaktion des murinen Immunsystems auf LPS einzuschätzen. 64 Zusammenfassung Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. „Induktion einer Endotoxämie in der humanisierten Maus“ eingereicht von: Johanna Scholbach angefertigt am: Institut für Klinische Immunologie, Medizinische Fakultät der Universität Leipzig betreut von: Prof. Dr. Ulrich Sack Dr. Franziska Lange November 2014 Der Forschungsschwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Charakterisierung des Tiermodelles der Endotoxämie in der humanisierten Maus. Dabei wurde sich auf die Betrachtung der humanen immunologischen Subpopulationen der B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, dendritischen Zellen und CD34-Zellen, sowie der Aktivierung von Monozyten und dendritischen Zellen konzentriert. Weiterhin stand die Produktion humaner und muriner proinflammatorischer und antiinflammatorischer Zytokine, sowie die Bildung von humanem und murinem Pentraxin 3 im Fokus. Darüberhinaus wurden die Beobachtungen getrennt nach Altersgruppen vollzogen, im Sinne des Alters nach Transplantation der CD34-Zellen. Dabei wurde eine Gruppe junger (8-10 Wochen) und alter (15-20 Wochen) Tiere definiert, um eine mögliche Reifung des Immunsystems im Bezug auf die Endotoxämiereaktion verifizieren zu können. Die Ergebnisse gaben Aufschluss darüber inwieweit sich die humanisierte Maus als Tiermodell zur Sepsisforschung eignet. Dabei wurden die gefundenen Ergebnisse der aktuellen Studienlage gegenüber gestellt. Es wurde sich dabei auf den Vergleich der gefundenen Ergebnisse mit Ergebnissen aus Tiermodellen und klinischen Studien konzentriert. Aus der Betrachtung ergab sich, dass die humanisierte Maus ein gutes Modell für die Widerspiegelung des humanes Zytokinprofils darstellt, wie es sich im septischen Patienten findet. Damit ist ein vereinfachter Transfer von Ergebnissen auf die klinische 65 Situation möglich. Dies unterstützt, zukünftige therapeutische Strategien vor der klinischen Prüfung besser zu evaluieren, da unerwünschte Nebenwirkungen von Medikamenten im Tiermodell eher sichtbar wären. Bezüglich der Produktion von humanem Pentraxin 3, das zur Diskriminierung der Prognosen von septischen Patienten bereits in klinischen Studien Anwendung findet, dient die humanisierte Maus dazu die Situation im Patienten zu simulieren und eröffnet damit den Weg zur eingehenden Forschung des Pentraxin 3 in Bezug auf seine Wirkung während der Sepsis und möglicher therapeutischer Beeinflussbarkeit. Außerdem konnte festgestellt werden, dass nur in vereinzelten Punkten Unterschiede in der Reaktion der humanisierten Mäuse auf LPS zwischen den Altersgruppen bestehen. Damit sind kürzere Versuchszeiträume möglich, da die Tiere schon mit jüngerem Alter in die Experimente aufgenommen werden können. Nachteile der humanisierten Maus im Bezug auf die Nutzung in der Sepsisforschung liegen vor Allem in der residualen Anlage muriner Bestandteile des Immunsystems, vornehmlich der Monozyten und Granulozyten. Durch die Persitenz dieser Zellen, die hauptverantwortlich für das septische Geschehen zu sein scheinen, ist es schwierig, typische zelluläre Reaktionen, wie die Aktivierung von Monozyten zu simulieren. Außerdem bleibt die Frage offen, inwieweit das murine und das humane Immunsystem unabhängig voneinader agieren, was sich in der massiven Produktion von murinen Zytokinen niederschlägt. Weiterhin sind Komplikationen bei der Betrachtung der Interaktion von angeborenem und erworbenem Immunsystem bezüglich der Reaktion auf LPS zu erwarten, da sowohl B- als auch T-Zellen unreif erscheinen. Außerdem bleibt die Frage zu klären, inwieweit das humane Immunsystems reif entwickelt ist um die sepsistypische Aktivierung von Monozyten und dendritischen Zellen darzustellen. Die humanisierte Maus ist zwar nicht in der Lage zelluläre Spezifitäten während der Sepsis optimal zu repräsentieren. Letztendlich besteht jedoch gegenüber herkömmlichen Tiermodellen ein Vorteil in der Betrachtung humaner Zytokine und Pentraxin 3. Die humanisierte Maus kann zum besseren Verständnis der zytokinvermittelten Reaktionen eingesetzt werden, da sie die Reaktion im Patienten gut widerspiegelt. Außerdem können therapeutische Strategien bezüglich der Beeinflussung der Zytokinproduktion sowie diagnostische Kriterien aufgrund zytochemischer Veränderungen mit der humanisierten Maus besser erforscht werden. 66 Abbildungsverzeichnis Abb. 1 : Vereinfachte Darstellung des Zusammenspiels von Entzündungsreaktion und Gerinnungskaskade während Sepsis. ................................................................................................11 Abb. 2: Darstellung der prozentualen Anteile von CD45-Zellen an lebenden Zellen (a), B-Zellen an CD45-Zellen (b) und T-Zellen an CD45-Zellen (c) im zweiwöchigen Zeitintervall 8-24 Wochen nach Transplantation von humanen CD34-Zellen im Blut der NSG Mäuse. ...............................................40 Abb.3: Kaplan-Maier-Kurve der humanisierten Mäuse im Zeitraum von 0-24 Wochen nach Transplantation von humanen CD34-Zellen. .....................................................................................41 Abb. 4: Zuordnung der Tiere in die jeweiligen Versuchsgruppen. ....................................................42 Abb. 5: Darstellung der prozentualen Anteile der B-Zellen (a) und Monozyten (b) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. ......................................................43 Abb. 6: Darstellung der prozentualen Anteile der B-Zellen (a) , Monozyten (b) und CD34+-Zellen (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 15-20 Wochen nach Transplantation. ............................44 Abb. 7: Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität [Mean Fluoreszenz] von CD86 auf Monozyten (a) , mDCs (b) und pDCs (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. ........................................................................................................................45 Abb. 8: Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität [Mean Fluoreszenz] von CD86 auf Monozyten (a) , mDCs (b) und pDCs (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 15-20 Wochen nach Transplantation. ........................................................................................................................46 Abb. 9: Darstellung der Konzentration von humanem TNFα (a) , IL-1β (b) , INFγ (c) , IL-6 (d) und IL10 (e) im Plasma der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. ..................................47 Abb. 10: Darstellung der Konzentration von murinem TNFα (a) , IL-6 (b) , IL-10 (c) und MCP (d) im Plasma der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. .................................................48 Abb. 11: Darstellung der Konzentration von humanem PTX3 (a) und murinem PTX3 (b) im Plasma der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. ..............................................................49 67 Tabellenverzeichnis Tab. 1 : Scoringsystem zur Beurteilung des Allgemeinzustandes der NSG Mäuse. ...........................28 Tab. 2 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Blut junger Tiere ............................74 Tab. 3 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen in der Milz junger Tiere......................74 Tab. 4 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Knochenmark junger Tiere ............74 Tab. 5 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Blut alter Tiere...............................75 Tab. 6 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen in der Milz alter Tiere..........................75 Tab. 7 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Knochenmark alter Tiere................76 Tab. 8 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Blut junger Tiere...............................................77 Tab. 9 : Exprimierung von Oberflächenmarkern in der Milz junger Tiere .........................................78 Tab. 10 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Knochenmark junger Tiere.............................79 Tab. 11 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Blut alter Tiere................................................80 Tab. 12 : Exprimierung von Oberflächenmarkern in der Milz alter Tiere...........................................81 Tab. 13 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Knochenmark alter Tiere................................82 Tab. 14 : Konzentration humaner Zytokine im Plasma junger Tiere..................................................83 Tab. 15 : Konzentration muriner Zytokine im Plasma junger Tiere....................................................83 Tab. 16 : Konzentration humaner Zytokine im Plasma alter Tiere.....................................................83 Tab. 17 : Konzentration muriner Zytokine im Plasma junger Tiere....................................................83 Tab. 18 : Konzentration von PTX3 im Plasma junger Tiere.................................................................84 Tab. 19 : Konzentration von PTX3 im Plasma alter Tiere....................................................................84 68 Literaturverzeichnis [1] Bone R. 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Cell and tissue research 343, 237–249 (2011). 74 Anlagen Blut CD45+-Zellen B-Zellen T-Zellen Monozyten mDCs pDCs Granulozyten CD34+-Zellen n 17 17 17 17 6 6 18 4 Gruppe A-0 Mean [%] 34.11 62.09 12.30 4.93 2.83 0.96 5.34 2.93 StDev [%] 14.28 12.26 10.26 2.26 4.23 1.06 7.08 3.27 n 22 22 22 22 8 8 22 5 Gruppe A Mean [%] 43.90 75.53 7.52 1.04 1.24 0.28 4.67 5.36 StDev [%] 18.59 13.04 7.35 1.33 2.18 0.39 4.98 3.16 p 0.08 0.02 0.13 <0.001 0.49 0.2 0.99 0.19 Tab. 2 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Blut junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse des Blutes der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Milz CD45+-Zellen B-Zellen T-Zellen Monozyten mDCs pDCs Granulozyten CD34+-Zellen n 14 14 14 13 6 6 13 4 Gruppe A-0 Mean [%] 65.11 68.14 8.35 3.15 1.40 0.78 5.11 2.25 StDev [%] 13.31 22.75 8.28 2.50 0.83 0.29 6.63 1.95 n 16 16 16 15 8 8 16 5 Gruppe A Mean [%] 58.73 68.88 8.74 3.56 1.93 0.90 5.99 3.24 StDev [%] 20.35 14.88 9.35 3.51 1.55 0.56 11.32 1.64 p 0.326 0.603 0.835 0.835 0.468 0.468 0.895 0.435 Tab. 3 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen in der Milz junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse der Milz der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. 75 76 Knochenmark CD45+-Zellen B-Zellen T-Zellen Monozyten mDCs pDCs Granulozyten CD34+-Zellen n 14 12 12 13 5 5 12 4 Gruppe A-0 Mean [%] 64.21 74.31 0.43 3.78 0.66 1.58 4.03 6.43 StDev [%] 13.74 10.51 0.87 2.22 0.46 1.35 5.86 4.37 Gruppe A Mean [%] 69.35 73.87 1.53 3.94 1.05 1.22 4.88 7.68 n 16 16 16 16 8 8 16 5 StDev [%] 13.06 8.64 3.56 2.44 1.11 1.29 6.61 3.55 p 0.289 0.904 0.98 0.85 0.482 0.435 0.926 0.648 Tab. 4 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Knochenmark junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse des Knochenmarks der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Blut CD45+-Zellen B-Zellen T-Zellen Monozyten mDCs pDCs Granulozyten CD34+-Zellen n 12 11 11 12 12 12 10 11 Gruppe B-0 Mean [%] 49.07 40.31 37.47 4.36 2.24 1.82 7.21 1.12 StDev [%] 21.78 23.14 19.78 2.82 2.16 2.09 9.74 1.43 n 10 12 12 12 12 12 11 12 Gruppe B Mean [%] 39.10 56.58 24.06 2.44 1.07 1.21 8.38 2.17 StDev [%] 12.72 11.75 11.97 3.11 0.76 1.45 7.23 1.57 p 0.22 0.07 0.06 0.057 0.28 0.56 0.42 0.05 Tab. 5 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Blut alter Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse des Blutes der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Milz CD45+-Zellen B-Zellen T-Zellen Monozyten mDCs pDCs Granulozyten CD34+-Zellen n 12 12 12 12 12 12 12 12 Gruppe B-0 Mean [%] 73.74 58.36 28.20 3.74 0.61 0.33 3.27 1.85 StDev [%] 17.99 20.47 19.99 4.94 0.58 0.32 3.92 1.59 n 14 12 13 12 11 12 11 12 Gruppe B Mean [%] 63.69 61.08 20.58 3.83 0.32 0.38 2.33 1.92 StDev [%] 16.68 14.93 12.03 4.90 0.15 0.27 2.42 1.50 p 0.106 0.714 0.255 0.977 0.249 0.69 0.781 0.862 Tab. 6 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen in der Milz alter Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen, 77 Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse der Milz der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Knochenmark CD45+-Zellen B-Zellen T-Zellen Monozyten mDCs pDCs Granulozyten CD34+-Zellen n 12 12 12 12 12 12 12 12 Gruppe B-0 Mean [%] 58.72 57.20 9.06 3.01 2.34 2.79 6.05 6.92 StDev [%] 23.15 15.94 9.56 1.77 2.13 2.97 5.76 3.86 n 12 11 11 10 12 12 11 12 Gruppe B Mean [%] 46.59 60.71 5.55 5.33 1.62 1.34 6.89 5.46 StDev [%] 27.07 20.51 10.86 4.77 1.59 1.19 9.22 3.68 p 0.251 0.65 0.196 0.07 0.272 0.355 0.518 0.354 Tab. 7 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Knochenmark alter Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse des Knochenmarks der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. 78 Blut n Gruppe A-0 Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] n Gruppe A Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] p HLA-DR Monozyten 17 42164 43218 22 71216 55988 0.074 CD86 Monozyten 17 773 488 21 1516 1063 0,011 HLA-DR mDCs 6 90150 42390 8 77314 28776 0.511 CD86 mDCs 6 484 134 7 1060 267 <0.001 HLA-DR pDCs 6 27739 10008 8 37063 17678 0.271 CD86 pDCs 6 426 120 7 2639 5266 0.101 Tab. 8 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Blut junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse des Blutes der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Milz n Gruppe A-0 Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] n Gruppe A Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] p HLA-DR Monozyten 23 30909 10975 15 39580 28982 0.963 CD86 Monozyten 23 1083 771 14 1316 736 0.428 HLA-DR mDCs 5 58577 24068 8 52331 37193 0.354 CD86 mDCs 5 446 316 7 831 422 0.117 HLA-DR pDCs 5 15966 4528 8 23396 16297 0.348 CD86 pDCs 5 282 317 7 1003 1181 0.073 Tab. 9 : Exprimierung von Oberflächenmarkern in der Milz junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse der Milz der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Knochenmark n Gruppe A-0 Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] n Gruppe A Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] p HLA-DR Monozyten 13 21087 17722 15 36644 33526 0.08 CD86 Monozyten 13 574 273 15 1262 786 0.019 HLA-DR mDCs 5 85144 33005 8 79814 51657 CD86 mDCs 5 575 359 8 1574 1403 HLA-DR pDCs 5 15727 4444 8 22105 9130 CD86 pDCs 5 208 160 7 286 256 0.435 0.724 0.177 0.53 Tab. 10 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Knochenmark junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse des Knochenmarks der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Blut n Gruppe B-0 Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] n Gruppe B Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] p HLA-DR Monozyten 12 58149 49196 10 71273 62948 0.621 CD86 Monozyten 10 613 494 10 1171 996 0.13 HLA-DR mDCs 10 100052 49727 10 156899 85830 0.087 CD86 mDCs 9 4503 12097 10 2047 1615 0.079 HLA-DR pDCs 9 48730 24921 10 88951 80290 0.54 CD86 pDCs 8 491 428 10 1429 1198 0.052 Tab. 11 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Blut alter Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse des Blutes der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Milz n Gruppe B-0 Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] n Gruppe B Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] p HLA-DR Monozyten 10 59021,7 57909,959 10 76444,3 54644,28 0.345 CD86 Monozyten 10 584,1 912,399 10 719,7 840,747 0.345 HLA-DR mDCs 8 85566,875 36372,472 10 122711 48155,387 0.09 CD86 mDCs 7 575,714 229,318 10 2002,7 1257,288 0.022 HLA-DR pDCs 8 25037,625 14238,107 11 42326,909 27904,496 0.148 CD86 pDCs 7 111,286 61,988 11 5008,909 15909,458 0.341 Tab. 12: Exprimierung von Oberflächenmarkern in der Milz alter Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse der Milz der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. Knochenmark n Gruppe B-0 Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] n Gruppe B Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz] p HLA-DR Monozyten 11 47374 44720 11 45749 43810 0.844 CD86 Monozyten 10 656 912 9 488 368 0.967 HLA-DR mDCs 12 87346 39613 11 114084 50301 0.169 CD86 mDCs 12 410 275 11 1208 1523 0.186 HLA-DR pDCs 11 24116 13047 10 41396 23549 0.049 CD86 pDCs 10 103 71 10 217 227 0.186 Tab. 13 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Knochenmark alter Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse des Knochenmarks der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden. humane Zytokine TNFα IL-1β IL-6 IL-10 IFN γ n 18 18 18 18 18 Gruppe A-0 Mean [pg/ml] 2.823 11.028 2.114 0 7.986 StDev [pg/ml] 11.341 46.787 5.422 0 11.023 n 21 22 22 22 22 Gruppe A Mean [pg/ml] 291.535 95.931 2925.902 7.007 281.878 StDev [pg/ml] 865.751 119.581 3381.637 8.467 593.343 p < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.016 Tab. 14 : Konzentration humaner Zytokine im Plasma junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Konzentration der humanen Zytokine TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 und INFγ im Plasma der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf die Produktion des entsprechenden Zytokins signifikant unterscheiden. murine Zytokine TNFα IL-6 IL-10 MCP IL-12/IL-23p40 n 18 18 18 18 18 Gruppe A-0 Mean [pg/ml] 6.292 15.617 3.251 100.911 11.533 StDev [pg/ml] 13.408 29.429 9.358 99.123 30.041 n 23 23 23 23 23 Gruppe A Mean [pg/ml] 314.082 6663.157 153.828 30012.311 43.949 StDev [pg/ml] 289.166 4282.71 177.086 44155.56 100.871 p < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.256 Tab. 15 : Konzentration muriner Zytokine im Plasma junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Konzentration der murinen Zytokine TNFα, IL-6, IL-10, MCP und IL-12/IL-23p40 im Plasma der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf die Produktion des entsprechenden Zytokins signifikant unterscheiden. humane Zytokine TNFα IL-1β IL-6 IL-10 IFNγ n 12 12 12 12 12 Gruppe B-0 Mean [pg/ml]StDev [pg/ml] 0.475 1.112 0 0 30.173 30.173 1.187 2.062 39.07 102.814 n 11 11 11 11 11 Gruppe B Mean [pg/ml] StDev [pg/ml] 196.774 523.426 112.222 93.916 2303.982 2623.226 13.782 18.744 252.76 437.707 p 0.003 <0.001 0.007 0.011 0.05 Tab. 16 : Konzentration humaner Zytokine im Plasma alter Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf die Konzentration der humanen Zytokine TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 und INFγ im Plasma der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf die Produktion des entsprechenden Zytokins signifikant unterscheiden. murine Zytokine TNFα IL-6 IL-10 MCP IL-12/IL-23p40 n 12 12 12 12 12 Gruppe B-0 Mean [pg/ml]StDev [pg/ml] 33.048 42.01 27.189 38.433 10.415 15.742 201.149 104.015 41,043 46,705 n 12 12 12 12 12 Gruppe B Mean [pg/ml] StDev [pg/ml] 521.323 303.326 4639.629 3286.631 190.742 191.751 420047.981 839949.462 196139 231772 p < 0.001 < 0.001 0.002 < 0.001 0.09 Tab. 17: Konzentration muriner Zytokine im Plasma junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im 85 Bezug auf die Konzentration der murinen Zytokine TNFα, IL-6, IL-10, MCP und IL-12/IL-23p40 im Plasma der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf die Produktion des entsprechenden Zytokins signifikant unterscheiden. PTX3 huPTX3 muPTX3 n 11 18 Gruppe A-0 Mean [ng/ml] 0.841 74.071 StDev [ng/ml] 0.821 40.781 n 17 23 Gruppe A Mean [ng/ml] 4.469 579.456 StDev [ng/ml] 2.502 268.596 p < 0.001 < 0.001 Tab. 18 : Konzentration von PTX3 im Plasma junger Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean] in ng/ml, die Standardabweichung [StDev] in ng/ml sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Konzentration von humanem PTX3 [huPTX3] und murinem PTX3 [muPTX3] im Plasma der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf die Produktion von humanem bzw. murinem PTX3 signifikant unterscheiden. PTX3 huPTX3 muPTX3 n 11 11 Gruppe B-0 Mean [ng/ml]StDev [ng/ml] 0.281 0.487 76.037 58.784 n 13 14 Gruppe B Mean [ng/ml] StDev [ng/ml] 2.378 1.9 563.553 312.472 p 0.002 < 0.001 Tab. 19 : Konzentration von PTX3 im Plasma alter Tiere Die Tabelle zeigt den Mean [Mean] in ng/ml, die Standardabweichung [StDev] in ng/ml sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf die Konzentration von humanem PTX3 [huPTX3] und murinem PTX3 [muPTX3] im Plasma der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf die Produktion von humanem bzw. murinem PTX3 signifikant unterscheiden. 86 Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als angegebener Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistung für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Innland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alle aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommenes Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. Datum Unterschrift 87 Lebenslauf und wissenschaftlicher Werdegang Name Johanna Scholbach Gebrtsort Leipzig Geburtsdatum 21.11.1990 Schulbildung 1996-2000 Grundschule August-Bebel Leipzig 2000-2008 Wilhelm-Ostwald-Schule Leipzig 2008 Allgemeine Hochschulreife Ausbildung seit 2008 Studium der Humanmedizin 2010 1. Teil des Staatsexamens 2010 Beginn der Doktorarbeit Doktorarbeit „Induktion einer Endotoxämie in der humanisierten Maus “ Weiterbildung 2012 Tierexperimenteller Kurs im MedizinischExperimentellen Zentrum der Medizinischen Fakultät Leipzig 88 Veröffentlichungen Scholbach J, Köberle M, Rodewohl A, Lange F Detektion von menschlichen Immunzellen in der humanisierten Maus BIOspektrum, 2013, DOI: 10.1007/s12268-013-0269-1 Scholbach J, Schulz A, Westphal F, Egger D, Wege AK, Patties I, Köberle M, Sack U, Lange F. Comparison of hematopoietic stem cells derived from fresh and cryopreserved whole cord blood in the generation of humanized mice. PLoS One. 2012;7(10):e46772. DOI: 10.1371/journal.pone.0046772 Impactfaktor (2012): 3,730 Kühnle S, Ludwig AA, Meuret S, Küttner C, Witte C, Scholbach J, Fuchs M, Rübsamen R. Development of auditory localization accuracy and auditory spatial discrimination in children and adolescents. Audiol Neurootol. 2013;18(1):48-62. DOI: 10.1159/000342904 Impactfaktor (2013): 1,852 89 Danksagung Hiermit möchte ich allen danken, die zum Entstehen und Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Ich möchte Herrn Professor Frank Emmrich danken, der mir die Durchführung der Promotionsarbeit am Institut für Klinische Immunologie der Universität Leipzig ermöglichte. Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Sack für die Betreuung der Doktorarbeit, die gezielte Lösungssuche bei wissenschaftlichen Problemen und die Unterstützung jeglicher wissenschaftlicher Bemühungen. Mein aufrichtiger Dank gilt Frau Doktor Franziska Lange, die mich auf jedem Schritt der Arbeit begleitete. Ihre ständige Motivation und Anerkennung der Leistungen, sowie ihe kompetente Führung der Forschungsarbeiten, schafften großes Interesse an der Arbeit und einen angenehme Arbeitsatmosphäre. Frau Doktor Anett Schulz möchte ich herzlich danken. Durch ihre tägliche Hilfe Im Labor, lernte ich das Chaos der Forschungsarbeit besser zu strukturieren und die klassischen Probleme der Laborarbeit zu meistern Ihre Organisation lernte mich den Vorteil gut geführter Laborbücher zu schätzen. Bei der gesamten Arbeitsgruppe Lange: Margarethe Köberle, Anja Rodewohl, Eva Kendzia, Dr. Anna Leichsenring, Dr. Ingo Bäcker und Ramona Blaschke möchte ich für ständige Unterstützung in Fragen jedweder Art danken. Zusätzlich möchte ich mich bei Frau Doktor Franziska Lange und Margarethe Köberle für das Durchführen der tierexperimentellen Arbeiten bedanken, die damit die vorliegende Arbeit erst ermöglichten. Für die Unterstützung der tierexperimentellen Arbeit möchte ich besonders Frau Dipl.-Ing. Hannelore Scholz danken, die mit ihren Mitarbeitern den einwandfreien Ablauf der Versuche gewährleistete. Dr. Franka Kahlenberg, Katrin Bauer, Heike Knaack, Barbara Witwer, Bettina Glatte, Dr. Andreas Boldt und Nadja Hilger möchte ich für jede amüsante Pause und jedes gemeinsame Mittagessen 90 danken, die mir immer ein wunderbarer Ausgleich waren. Meinem Bruder Jonathan Scholbach möchte ich herzlich für umfangreiche Korrektur meiner Arbeit im Hinblick auf Grammatik und Rechtschreibung danken. Meinen Eltern danke ich für das Mitfiebern mit Ergebnissen und für ihre finanzielle Unterstützung der Arbeit . Kerstin danke ich für die emotionale Unterstützung, das Backen von Motivationsplätzchen und den Glauben an das Gelingen der Arbeit. 91
