Volltext

Werbung
Induktion einer Endotoxämie in der humanisierten Maus
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von
Johanna Scholbach
geboren in Leipzig
angefertigt am:
Institut für Klinische Immunologie, Medizinische Fakultät der Universität Leipzig
Betreuer:
Prof. Dr. Ulrich Sack
Dr. Franziska Lange
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 26.01.2016
Inhaltsverzeichnis
Bibliographische Beschreibung.............................................................................................................4
Abkürzungsverzeichnis.........................................................................................................................5
Einleitung .............................................................................................................................................8
Sepsis...............................................................................................................................................9
Pathomechanismen der Sepsis und des septischen Schocks......................................................9
Klinische Pathologie der Sepsis und des septischen Schocks.................................................9
Zelluläre Veränderungen im septischen Schock...................................................................10
Diagnose der Sepsis.............................................................................................................12
Induktion der Sepsis im Tiermodell..........................................................................................14
Toxämie-Modell....................................................................................................................14
Bakterielles Infektionsmodell...............................................................................................14
Zerstörung der natürlichen Abwehrbarriere........................................................................15
CLP...................................................................................................................................15
CASP.................................................................................................................................15
Humanisierte Mausmodelle..........................................................................................................17
Züchtung der immundefizienten Mäuse...................................................................................17
Gewinnung der hämatopoetischen Stammzellen.....................................................................19
Induktion der Sepsis in humanisierten Mäusen ...........................................................................20
Wahl des Induktionsmodells.....................................................................................................20
Charakterisierung der Sepsis in der humaniserten Maus.........................................................20
Zielstellung.....................................................................................................................................22
Material und Methoden.....................................................................................................................24
Verwendete Materialien................................................................................................................24
Materialien................................................................................................................................24
Messgeräte................................................................................................................................25
Software....................................................................................................................................26
Methodisches Vorgehen...........................................................................................................27
Tierhaltung...........................................................................................................................27
Aufbereitung des frischen Nabelschnurblutes ....................................................................28
Reagenzien.......................................................................................................................28
Durchführung...................................................................................................................29
Auftauen der Mononukleären Zellen und Transplantation der CD34+-Zellen.....................30
Methodische Grundlagen der magnetischen Seperation...............................................30
Reagenzien.......................................................................................................................30
Durchführung...................................................................................................................31
Durchflusszytometrie ..........................................................................................................32
Methodische Grundlagen des Durchflusszytometers.....................................................32
Reagenzien.......................................................................................................................32
Durchführung...................................................................................................................33
FACS-Ansatz nach Humanisierung..............................................................................33
FACS-Ansatz nach Sepsisinduktion..............................................................................34
Sepsisinduktion....................................................................................................................35
Reagenzien.......................................................................................................................35
Durchführung...................................................................................................................35
Enzym-linked Immunosorbentassay ....................................................................................35
Methodische Grundlagen des capture Enzym-linked Immunosorbentassays................35
Reagenzien.......................................................................................................................36
Durchführung...................................................................................................................36
Cytometric Bead Array ........................................................................................................37
Methodische Grundlagen des Cytometric Bead Arrays..................................................37
Reagenzien.......................................................................................................................37
Durchführung...................................................................................................................38
Statistik.................................................................................................................................38
Ergebnisse...........................................................................................................................................39
Charakterisierung der humanisierten Maus..................................................................................39
Charakterisierung vor Sepsisinduktion.....................................................................................39
Charakterisierung nach Sepsisinduktion...................................................................................42
Charakterisierung der immunologischen Subpopulationen ...............................................43
Charakterisierung der Aktivierung der Subpopulationen....................................................44
Charakterisierung der Zytokinproduktion............................................................................46
Charakterisierung der Produktion von Pentraxin 3..............................................................48
Diskussion...........................................................................................................................................50
Altersunterschiede in der Reaktion auf LPS...................................................................................51
Veränderungen nach LPS-Gabe.....................................................................................................54
Veränderungen des Gehalts der immunologischen Subpopulationen ....................................54
Veränderungen der B-Zellen und T-Zellen...........................................................................54
Veränderungen der CD34-Zellen..........................................................................................55
Veränderung der Granulozyten............................................................................................56
Veränderungen der Monozyten, mDCs und pDCs................................................................57
Aktivierung der immunologischen Subpopulationen...............................................................59
Produktion von Surrogatmarkern ............................................................................................61
Produktion humaner Zytokine.............................................................................................61
Produktion muriner Zytokine...............................................................................................61
Produktion von humanem und murinem Pentraxin 3.........................................................62
Zusammenfassung..............................................................................................................................64
Literaturverzeichnis............................................................................................................................68
Anlagen...............................................................................................................................................74
Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit....................................................................85
Lebenslauf und wissenschaftlicher Werdegang.................................................................................86
Veröffentlichungen.............................................................................................................................87
Danksagung........................................................................................................................................88
Bibliographische Beschreibung
Johanna Scholbach
„Induktion einer Endotoxämie in der humanisierten Maus“
Universität Leipzig, Dissertation
89 S., 92 Lit., 11 Abb., 19 Tab., 18 Anlagen
Referat
Die Sepsis ist ein gefürchtetes Krankheitsbild, das in hochentwickelten Industrienationen mit einer
hohen Mortalität verknüpft ist und damit zu den häufigsten Todesursachen gehört. Die
Pathomechanismen dieses komplexen und heterogenen Krankheitsbildes zu entdecken, gehört
momentan zu den Hauptinteressengebieten der Sepsisforschung. Da die Interpretation klinischer
Studien aufgrund der Heterogenität des Patientenguts schwierig ist, kommt der Entwicklung
adäquater Tiermodelle eine entscheidende Bedeutung zu. Die hierbei gängigen Tiermodelle in
Mäusen weisen jedoch Unzulänglichkeiten auf, die die Übertragung der in Tierexperimenten
gewonnen Daten auf den klinischen Kontext nur teilweise ermöglichen. Eine Brücke kann hierbei
das Tiermodell der humanisierten Maus schlagen, in der, durch Transplantation mit humanen
hämatopoetischen Stammzellen, ein humanes Immunsystem reift. Die vorliegende Arbeit
beschäftigt sich mit der Fragestellung, inwieweit die humanen Immunzellen in der humanisierten
Maus in der Lage sind, auf LPS als Stimmulus zu reagieren. Darüberhinaus wird die Nutzung der
Endotoxämie in der humanisierten Maus als alternatives Sepsismodell im Bezug zum klinischen
Kontext untersucht. Hierbei ergab sich eine mögliche Nutzung des Endotoxämiemodells in der
humanisierten Maus zur genaueren Erforschung des Zytokinmilieus, sowie neuer Surrogatmarker
wie Pentraxin 3. Bezüglich der Reaktion einzelner immunologischer Subpopulationen und deren
Bedeutung für die Klinik scheint eine Untersuchung an Modellen, die eine B- und T-Zell-Reifung
nachvollziehen können und in der murine Residualzellen möglichst gering vorhanden sind, als
sinnvoll.
4
Abkürzungsverzeichnis
AK
Antikörper
ANOVA
Analysis of Variance
APC
Aktiviertes Protein C
CASP
Colon Ascendencs Stent Peritonitis
CBA
Cytometric Bead Array
CD
Cluster of Differentiation
CO2
Kohlendioxid
CRP
C-reaktives Protein
DMEM
Dulbecco's Modiefied Eagle Medium
EDTA
Ethylene Diamine Tertaacetic Accid
ELISA
Enzym Linked Immunosorbent Assay
FACS
Flow Assorted Cell Sorting
HEPES
Hydroxyethyl-Piperazinyl-Ethansulfonsäure
HLA-DR
Human Leukocyte Antigen-DR
HSC
Heamatopoetic Stemm Cell
ICAM
Intercellular Adhaesion Molecule
IFN
Interferon
IL
Interleukin
i.p.
intra peritoneal
IRAK
IL-1 Receptor-associated Kinase
kg
Kilogramm
lEPCR
löslicher endothelialer Protein-C-Rezeptor
5
LPS
Lipopolysaccharid
MCP
Murine Chemoatractant Protein
mDC
myeloid Dendritic Cell
mg
Milligramm
MHCII
Major Histocompatibility Complex II
min
Minuten
ml
Milliliter
MNC
Mononuclear Cell
MyD88
Myloid Differentiation Primary Response
Gene 88
NaCl
Natriumchlorid
NFκB
Nuclear Factor 'Kappa-light-chain-enhancer' of
Activated B-cells
NK-Zellen
Natürliche Killer-Zellen
NOD
Nonobese Diabetic Maus
NSB
Nabelschnurblut
NSG
NOD Scid Gamma-k/o Maus
PAMP
Pathogen Associated Molecular Pattern
PBS
Phosphate-buffered Saline
PCT
Procalcitonin
pDC
plasmacytoid Dendritic Cell
pg
Picogramm
Prkdc
Protein kinase DNA-activated Catalytic
Polypeptide
PTX3
Pentraxin 3
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
RT
Raumtemperatur
Scid
Severe Combined Immunodeficience
SIRPα
Signal Regulatory Protein α
SIRS
Systemic Inflammatory Response Syndrom
6
TF
Tissue Factor
TLR
Toll-like Receptor
TNFα
Tumornekrosefaktor α
TRAF
Tumornekrosefakor-Rezeptor-assoziierter
Faktor
TVV
Tierversuchsvorhaben
VCAM
Vascular Cellular Adhaesion Molecule
7
Einleitung
Sepsis, im Volksmund als „Blutvergiftung“ bekannt, ist ein historisch seit Jahrtausenden bekanntes
Krankheitsbild, das die Menschheit seit jeher vor große Fragen stellte. Auch wenn Fälle, die wir
heute unter dem Begriff Sepsis zusammenfassen würden, schon bei Hippokrates beschrieben sind,
war die damalige Vorstellung von Sepsis mit der heutigen nicht vergleichbar. Sepsis leitet sich aus
dem griechischen Wort „σῆψις“ ab, was „Fäulnis bedeutet
und die damalige Vorstellung des Krankheitsgeschehens erklärt. Hierbei gab es im Laufe der Zeit
unterschiedliche Theorien, denen jedoch die Vermutung zu Grunde liegt, dass Sepsis durch
schädliche Gase verursacht wird. Mit der Entdeckung des Milzbranderregers durch Robert Koch
und sowie durch die Einflüsse Louis Pasteurs und anderer bedeutender Wissenschaftler des 19.
Jahrhunderts wurde Verständnis für die Übertragung von Krankheiten durch Erreger geschaffen.
Die Sepsis blieb jedoch weiterhin ein unklares und diffus beschriebenes Krankheitsbild. Erst 1989
wurde durch den US-amerikanischen Mediziner Roger C. Bone [1] die noch heute gültige
Sepsisdefinition postuliert, bei der Sepsis als Rekation des Organismus auf die Invasion von
Mikroorganismen oder deren Toxine beschrieben ist. Auch wenn das Verständnis für die
Pathogenese der Sepsis seit Hippokrates stark zugenommen hat, steht die hochspezialisierte
Medizin immer noch vor entscheidenden Fragen. Laut Engel et al.[2] liegt die Mortalität bei
Patienten mit schwerer Sepsis und intensivmedizinischer Betreuung in Deutschland bei ca. 55%. In
den USA zählt Sepsis zu der dritthäufigsten Todesart. Nicht nur diese eindrücklichen Zahlen,
sondern auch das Versagen klinischer Studien im Bezug auf die Etablierung diagnostischer Marker
sowie therapeutischer Strategien, zeigen, dass trotz molekularbiologischer Forschung auf den
kleinsten Ebenen der Entstehung von Krankheitsprozessen der Wissensstand immernoch
unzureichend ist. Dies liegt nicht zuletzt an ungenügenden Krankheitsmodellen, die die
Erforschung der Pathomechanismen erschweren. Ein häufiges Problem stellt hierbei die
Übertragung von aus Tiermodellen gewonnen Erkenntnissen auf den Patienten dar. Außerdem sind
verschiedene Tiermodelle, vor allem in der Maus, etabliert, die nur die Beschreibung bestimmter
Teilaspekte des im Patienten beobachtbaren Geschehens abbilden [3]. In der Vergangenheit kam
es dadurch zu frustranen Therapieversuchen mit neu entwickelten Therapeutika [4]. Diese Arbeit
widmet sich daher der Charakterisierung eines neuen Tiermodells für Sepsis, dessen
Ausgangsbedingungen grundsätzlich andere darstellen als bisherige Mausmodelle zur
8
Sepsisforschung. Bei diesem Tiermodell handelt es sich um die mittels hämatopoetischen
Stammzellen humanisierte Maus. Die Transplantation humaner Stammzellen ermöglicht die
Entwicklung eines humanen Immunsystems. Da es, bezogen auf das Immunsystem, vor allem im
Bezug auf zytokinvermittlete Reaktionen und deren Rezeptoren, große Unterschiede zwischen
Mensch und Maus gibt [5], stellt das Vorhandensein eines humanen Immunsystems in einer Maus
einen großen Vorteil dar. Die erwähnten Unterschiede verlieren somit an Bedeutung. Da gerade in
der Sepsisforschung großer Wert auf die Betrachtung der Zytokine gelegt wird, ist es möglich, dass
mit der humanisierten Maus ein besseres Tiermodell geschaffen werden kann. So könnten in
Zukunft der ausbleibende Erfolg von Therapien, wie der Einsatz von anti-TNFα [6], im Vorhinein
besser eingeschätzt werden. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der ausführlichen
Charakterisierung der zellulären und zytochemischen Veränderungen der humanen Immunzellen
während einer Endotoxämie in der Maus und diskutiert, inwiefern sich dieses Tiermodell zur
Erforschung der Pathogenese der Sepsis eignet.
Sepsis
Pathomechanismen der Sepsis und des septischen Schocks
Klinische Pathologie der Sepsis und des septischen Schocks
Die Sepsis ist ein Krankheitsbild, das durch das sytemische Einwirken pathogener Keime bzw. deren
Toxine gekennzeichnet ist. Damit von einer Sepsis gesprochen werden kann müssen in erster Linie
der Nachweis einer Infektion sowie einer systemischen Entzündungsantwort erfolgen. Diese ist
durch das parallele Auftreten von zwei der Kriterien Fieber, Tachykardie, Tachypnoe und
Leukopenie oder Leukozytose gekennzeichnet ist [1]. Um auf das systemische Einwirken der
Bakterien zu reagieren, setzt der Körper Entzündungsmediatoren frei. Durch diese kommt es zu
einem hypodynamen Kreislaufzustand sowie einer verstärkter intravasalen Gerinnung. Der geringe
Blutdruck sowie die Bildung von Mikrothromben führen zur Minderversorgung in Milz, Niere und
Leber. Daraus folgt eine Insuffizienz der Organe, Schadstoffe können nicht mehr ausgeschieden
werden. Außerdem kommt es in der Lunge zur Weitstellung der Kapillarnetze, welche die Alveolen
mit Blut versorgen. Das Endothel, das die Kapilarwände auskleidet, wird durchlässig. Dadurch kann
Fibrin und Wasser in die Lunge gelangen, was die Lungenfunktion erheblich beeinträchtigt. Liegen
eine oder mehrere Organdysfunktionen zusätzlich zur Infektion und zum generalisierten
Entzündungsgeschehen vor, spricht man von einer schweren Sepsis. Kann die schwere Sepsis nicht
9
ausreichend therapiert werden, kann sie in einen septischen Schock münden, der zusätzlich zu den
Kriterien der schweren Sepsis einen positiven Schockindex aufweist bzw. den Einsatz von
Vasopressoren notwendig macht um den Blutdruck zu stabilisieren. Der septische Schock stellt
eine akut lebensbedrohliche Situation dar [7]. Ein verwandtes Krankheitsbild ist das SIRS (Systemic
Inflammatory Response Syndrom). Dieses Syndrom kann ebenfalls lebensbedrohlich verlaufen,
wird aber im Gegensatz zur Sepsis nicht durch ein infektiöses Geschehen bedingt, sondern durch
eine vermehrte Ausschüttung von Entzündungmediatoren in Folge einer Gewebsschädigung. Diese
Syndrome werden unter dem Oberbegriff des Sepsissyndroms zusammengefasst.
Zelluläre Veränderungen im septischen Schock
Die Veränderungen, die der Organismus im Rahmen der Sepsis durchläuft und die im klinischen
Bild sichtbar werden, werden nach dem heutigen Stand der Wissenschaft auf zellulärer Ebene vor
allem durch Monozyten und Makrophagen hervorgerufen [8]. Es spielen aber auch andere
Zellpopulationen wie Granulozyten, T- Zellen, B-Zellen und Endothelzellen eine Rolle. Als
wichtigster pathogener Mediator gilt LPS , das sich vorrangig auf der Zellwand gram-negativer
Bakterien befindet. Sobald sich gram-negative Bakterien im Blutkreislauf befinden bzw.
Lipopolysaccharid (LPS) frei wird, bindet LPS an spezifische Rezeptoren, die sich vor allem auf
Makrophagen befinden. Bei diesen Rezeptoren handelt es sich um die Toll-like-Rezeptoren der
Klassen 2 und 4 (TLR2, TLR4) [9]. Es werden TLR2 und TLR4 durch LPS stimuliertwodurch innerhalb
der Zelle eine Reihe von Proteinkomplexen aktiviert werden. Bisher wurden MyD88, IRAK und
TRAF6 als Stufen dieser Kaskade identifiziert [10]. Es sind aber auch alternative Wege bekannt.
Gemeinsame Endstrecke der Signaltransduktion ist der Transkriptionsfaktor NF-B. Durch die
Aktivierung des Transkriptionsfaktor NF-B kommt es vermehrt zur Produktion von Zytokinen und
Interleukinen [11]. Zu Beginn des septischen Schocks werden vor allem proinflammatorische
Zytokine, wie IL-1β, IL-6, IL-8, TNF und IFN freigesetzt [12]. Diese Zytokine aktivieren andere
Zellpopulationen wie z.B. Endothelzellen [11]. Die Endothelzellen exprimieren daraufhin
Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, VCAM-1), die es den ankommenden Makrophagen ermöglichen, in
das Gewebe einzuwandern [13]. Sie sind somit in der Lage, zum Fokus der Infektion vorzudringen
und können die Infektion bekämpfen. Zusätzlich kommt es zur Auslösung der Gerinnungskaskade:
dies wird unter anderem durch die Freisetzung von tissue factor durch Makrophagen bewirkt [14].
Tissue factor stößt die extrinsische Gerinnungskaskade an und führt zur Bildung von Thrombin.
Im gesunden Patienten herrscht zwischen dem gerinnungsfördernden Thrombin und dem
10
gerinnungshemmenden aktivierten Protein C ein Gleichgewicht, das durch einen negativen
Rückkoppelungsmechanismus zwischen Thrombin-Thrombomudlin-Komplex und aktiviertem
Protein C stabilisiert wird. Während der Sepsis wird aber die Bildung des dieses Gleichgewicht
vermittelnden Thrombin-Thrombomodulin-Komplexes gestört. Dadurch steht einer steigenden
Konzentration von Thrombin keine entsprechende Konzentration von Thrombin-ThrombomodulinKomplex bzw. aktiviertem Protein C gegenüber. Zugleich wird während der Sepsis die
antikoagulatorische Wirkung von Protein C durch lösliche endotheliale Protein-C-Rezeptoren
vermindert [15]. Diese Imbalance in der Gerinnungskaskade wird durch zahlreiche andere
Mechanismen gefördert, deren Bedeutung noch nicht endgültig geklärt ist. Letztendlich führt sie
zur verstärkten Bildung von Mikrothromben, die erst ein Nierenversagen und dann das Versagen
der anderen Organe nach sich ziehen.
M
extrinsische
Gerinnungskaskade
TF
Thrombin
Protein C
IL-6 TNFα IL-10 INFγ
Fibrinogen
lEPCR
Fibrin
APC
T
Thrombomodulin
M
Abb. 1 : Vereinfachte Darstellung des Zusammenspiels von Entzündungsreaktion und Gerinnungskaskade während
Sepsis.
LPS aktiviert die Monozyten (M) durch TLR2/4. Diese setzen daraufhin Zytokine (IL-6, TNF, IL-10, IFN) sowie
Tissue factor (TF) frei. Die Freisetzung der Zytokine bewirkt unter anderem die Aktivierung von T-Zellen sowie die
11
Exprimierung von Adhäsionsmolekülen (ICAM) auf Endothelzellen. Die Freisetzung von TF stößt die extrinsische
Gerinnungskaskade an. Dadurch entsteht Thrombin, was wiederrum die Spaltung Fibrinogen in aktives Fibrin
umwandelt. Der Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes verstaärkt die Umwandlung von Protein C in aktiviertes
Protein C (APC). APC hemmt die Bildung von Thrombin. Während einer Sepsis (rot markiert) werden sogenannte
lösliche endotheliale Protein- C -Rezeptoren (lEPCR) gebildet, die die Aktivierung von Protein C hemmen (roter Blitz).
Durch fehlendes APC findet eine verringerte Hemmung der Bildung des Thrombin/Thrombomodulin-Komplexes
statt (roter Blitz). Daraufhin wird vermehrt Fibrin gebildet. Außerdem steigt die Produktion der von Monozyten
gebildeten Zytokine an, die eine starke Entzündungsreaktion hervorufen.
Darüber hinaus kommt es zur Aktivierung des Komplementsystems [16]. Das Komplementsystem
ist ein Teil des angeborenen Immunsystems und dient, neben den zellulären Bestandteilen des
Immunsystems, zum Schutz des Körpers gegen infektiöse Pathogene, indem es ebenfalls die
Freisetzung von Zytokinen ermöglicht, Entzündungszellen anlockt und die Pathogene durch
Markierung für das Immunsystem sichtbar macht [17]. Letztendlich wird durch das Andocken des
LPS an TLR2 und TLR4 auf den Makrophagen eine vielfache Verstärkung der Immunantwort
erzeugt. Es kommt zu einer starken Immunreaktion des Körpers, die in den schweren klinischen
Symptomen der Sepsis wie Fieber, Hypotnesion, Tachykardie, Tachypnoe und verstärkter
intravasaler Gerinnung enden.
Diagnose der Sepsis
Neben den bereits erwähnten klinischen Veränderungen wie Fieber, Tachykardie, Blutdruckabfall,
Abfall der Thrombozytenzahl, Nieren-, Leber- und Lungeninsuffizienz, gilt bisher zur Diagnose der
Sepsis das Anlegen einer Blutkultur als Standardmethode. Hierbei wird dem Patient venöses Blut
abgenommen und aerob und anaerob in Blutkulturflaschen gefüllt. Diese werden zur Kultivierung
mehrere Tage bei 37°C inkubiert. Danach wird eine Keimbestimmung durchgeführt. Bei einer
Sepsis sollte der Befund positiv sein. Allerdings kommt es nur bei ca. 17% der Sepsisfälle [18] zu
einem positiven Blutkulturergebnis. Dies ist laut Schmitz et al. [19] vor allem der Variabilität der
Durchführung in der Anlage der Blutkultur geschuldet. Problematisch ist auch, dass der Nachweis
im Verhältnis zum Fortschreiten des septischen Geschehens sehr lange dauert. Deshalb sucht man
verstärkt nach Laborparametern, die eine standardisierte Diagnostik der Sepsis möglich machen.
Ein weiteres Problem stellt die Unterscheidung der Sepsis zum verwandten Krankheitsbild des SIRS
dar. Die Krankheitsbilderähneln sich klinisch, erfordern jedoch unterschiedliche Therapien.
Während bei der Sepsis die Sanierung des Infektionsherdes mit Antibiotika im Vordergrund steht,
12
muss bei dem SIRS der Auslöser identifiziert und behoben werden. Eine Antibiotikatherapie ist
nicht immer indiziert. Als relativ unspezifischer Marker für die Sepsis gilt das C-reaktive Protein
(CRP), das allerdings bei auch zahlreichen Krankheitsprozessen ansteigt, die nicht infektiös
hervorgerufen sind, und keine Aussage über die Prognose einer Sepsis ermöglicht [20]. Es wurden
auch Marker wie TNF oder IL-6 diskutiert. Probleme stellen jedoch der rasche Abbau von TNF
bzw. die Unspezifität von IL-6 im septischen Krankheitsprozess dar [12]. TNFund IL-6 sind deshalb
eher für die Prognose als für die Diagnose der Sepsis von Nutzen [12]. Als aktueller Biomarker für
ein septisches Geschehen gilt bisher Procalcitonin (PCT) [21]. Es ist das Vorläufermolekül von
Calcitonin, einem Schilddrüsenhormon. Sowohl Ort der Produktion als auch Funktion des PCT sind
bisher noch unklar. Man vermutet jedoch, dass PCT in der Leber produziert [22] und bei einem
inflammatorischen Geschehen freigesetzt wird. Daher wird PCT direkt mit dem Geschehen einer
Sepsis in Verbindung gebracht. Es stellt sich jedoch immernoch die Frage, ob es möglich ist, mit
Hilfe von PCT als klinischen Marker eine Sepsis von einem SIRS zu unterscheiden. Auch PTX3, ein
löslicher Rezeptor des angeborernen Immunsystems, der zur Registrierung pathogener Muster
dient, wird als potentieller Biomarker diskutiert [23, 24]. Er findet bisher vor allem in Tiermodellen
Anwendung [25]. Außer den bisher erwähnten Markern gibt es noch zahlreiche andere Ansätze,
die Diagnose eine Sepsis frühzeitig zu stellen, wie z.B. das Erfassen bestimmter Oberflächenmarker
auf Granulozyten (CD64) oder Bestandteile der Gerinnungskaskade (Protein C). Durch die
Zusammenschau verschiedenster Marker hofft man, eine genauere Einschätzung des
Krankheitsgeschehenszu ermöglichen [12]. Aufgrund der zahlreichen, aber zum Teil unzureichend
spezifischen existierenden Laborparameter ergibt sich der dringende Bedarf, die grundlegenden
pathologischen Mechanismen zu klären, um dem Ziel des idealen Biomarkers ein Stück näher zu
kommen.
13
Induktion der Sepsis im Tiermodell
Da die Sepsis ein Krankheitsbild mit hoher Mortalität ist [26], deren Ursachen noch unklar sind,
liegt der Schwerpunkt der Forschung auf dem rechtzeitigen Erkennen eines septischen
Geschehens. Es wird davon ausgegangen, dass die frühzeitige Diagnose der Sepsis die Prognose
der Patienten deutlich verbessert. Da klinische Studien sehr aufwendig sind und die Patienten
meist ein diverses Krankheitsgeschehen mit unterschiedlichen Manifestationen der Sepsis
aufweisen, gilt die Interpretation klinischer Studien als schwierig [3]. Tiermodelle wie die Maus
haben gegenüber klinischen Untersuchungen den Vorzug, dass sie die Vergleichbarkeit der
Individuen gewährleisten. Es wurden zahlreiche Modelle der Sepsisinduktion entwickelt. Diese
unterscheiden sich vor allem in der Art und Weise, wie die Sepsis bzw. der septische Schock
induziert werden [26–28]. Weiterhin weisen die Modelle Unterschiede hämodynamischer Natur
auf [27] und spiegeln somit nur bestimmte Phasen des septischen Schocks wider.
Toxämie-Modell
Beim Toxämie-Modell wird durch ein septische Schock simuliert, indem ein exogenes Toxin
einjiziert wird. Bei dem aplizierten Toxin handelt es sich in der Regel um LPS. LPS kommt unter
anderem auf der Oberfläche gram-negativer Bakterien vor. Wie oben beschrieben, wird LPS eine
große Rolle in der Auslösung der Immunkaskade zugeschrieben, aus der sich dann über die
Aktivierung von Monozyten die typischen Veränderungen der Sepsis ergeben. Durch die
intravenöse oder intraperitoneale Injektion von LPS kommt es in der Maus zu
pathophysiologischen Veränderungen wie Blutdruckabfall, erhöhter Herz- und Atemfrequenz, die
auch beim Menschen beschrieben sind [27]. Außerdem kommt es zu einer starken Freisetzung von
inflammatorischen Zytokinen, wie TNFα.
Die Kinetik der Zytokinproduktion entspricht jedoch nicht der im septischen Patienten [28]. Einen
weiterer Nachteil dieses Modells ist die relative Resistenz von Mäusen gegenüber LPS. Um eine
Sepsis simulieren zu können, ist daher häufig die Verwendung von costimulatorischen Substanzen,
wie D-Galactosamin [26], nötig. Die leichte Durchführbarkeit und gute Kontrollierbarkeit des
Systems haben dennoch dazu geführt, dass das Toxämie-Modell häufig genutzt wird [28].
Bakterielles Infektionsmodell
Bei dem bakteriellen Infektionsmodell wird den Tieren ein pathogener bakterieller Stamm geimpft.
14
Dabei kann es sich sowohl um reine als auch um gemischte Bakterienstämme handeln. Der Vorteil
dieser Methode liegt darin, dass gezielt das Wachstum der Bakterienstämme und die
Mechanismen der Verteidigung des Organismus gegen die Bakterien untersucht werden können
[27]. Dies stellt einen entscheidenden Unterschied zum Toxämie-Modell dar, bei dem kein
bakterieller Fokus vorliegt [28]. Die Symptome der Tiere fallen jedoch zum Teil sehr unterschiedlich
aus, was auf die interindividuelle Reaktion auf den pathologischen Keim zurückzuführen ist.
Dadurch ist eine Vergleichbarkeit der Gruppen schwierig. Außerdem bestehen starke Unterschiede
in der Reaktion verschiedener genetischer Mausstränge auf diese Methode [27].
Zerstörung der natürlichen Abwehrbarriere
Bei der Methode der Zerstörung der natürlichen Abwehrbarriere des Wirts gibt es zwei Modelle.
Beide Modelle vereint das grundlegende Prinzip, dass die natürliche Abwehr der Maus gegenüber
pathogenen Keimen, z.B. durch die einfache Kompartimentierung von infektiösen Material im
Darm, durch den Experimentator durchbrochen wird. Im folgenden sollen das Modell der Caecal
Ligation and Puncture (CLP) und der Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) erläutert werden
Beide Methoden erfordern ein großes Geschick des Durchführenden.
CLP
Bei der CLP handelt es sich um den Goldstandard des Sepsismodells in der Maus [29]. Hierbei wird
das Caecum der Maus durch einen chirurgischen Eingriff distal der Ileocaecal-Klappe mit dem
Colon verbunden. Anschließend erfolgt die Punktion des Ceacums mit einer dünnen Nadel.
Infolgedessen tritt durch das Loch im Caecum gemischte bakterielle Darmflora in den Bauchraum
aus. Außerdem führt die Punktion zur Nekrose des entsprechenden Gewebes. Damit sind die
Ausgangsbedingungen für einen septischen Schock geschaffen.
CASP
Bei der CASP wird ein Stent mit einer definierten Größe in den Colon ascendes implantiert. Durch
dieses Loch dringen kontinuierlich Darmbakterien in die Bauchhöhle. Der Vorteil gegenüber der
CLP liegt in einer Regulation des septischen Geschehens durch die Veränderung des Durchmessers
des implantierten Stents.
Beide Modelle, CLP wie CASP, kommen aufgrund des Vorhandenseins einer gemischten
15
bakteriellen Besiedlung sowie der darauf folgenden pathophysiologischen Reaktion des
Organismus den tatsächlichen Bedingungen eines septischen Schocks beim Menschen sehr nahe.
Deutliche Nachteile weisen diese Modelle jedoch in ihrer experimentellen Durchführbarkeit auf.
Durch die diffizilen chirurgischen Interventionen kann sowohl der Durchbruch der natürlichen
Barriere sowohl bei derCLP als auch bei derCASP unterschiedlichen gut erfolgen [27]. Es kommt
somit zu interindividuellen Unterschieden innerhalb der Versuchsgruppen, weshalb die Ergebnisse
nur schwer verglichen werden können.
16
Humanisierte Mausmodelle
Humanisierte Mäuse sind in den letzten Jahren immer stärker in den Fokus der medizinischen
Forschung gerückt. Sie stellen ein bisher einzigartiges Modell dar, bei dem durch die Nutzung von
menschlichen Zellen ein Organismus geschaffen wird, in dem humane Zellen und deren
Interaktionen im Tiermodell untersucht werden können [30, 31]. Auf diese Weise lassen sich die
Forschungsergebnisse, wie die Pathomechanismen verschiedenster Krankheiten, sowie
pharmazeutische Aspekte der Krankheitsbekämpfung besser auf den Menschen übertragen. So
besteht die Chance, dass unerwartete Nebenwirkungen von Medikamenten vorhergesehen
werden können und man die Entstehung bisher unverstandener Krankheitenbesser erklären kann.
Bisher wurden humanisierte Mäuse vor allem zu Studien bezüglich maligner Entartungen [32],
Infektionskrankheiten [33] und ausgewählten Autoimmunerkrankungen, wie Diabetes mellitus [34]
genutzt.
Generell versteht man unter der Humanisierung von Mäusen das Transplantieren von
menschlichem Zell-, Gewebe- oder Genmaterial [35]. Die Übertragung von menschlichem
Genmaterial wird durch die Züchtung transgener Mäuse ermöglicht. Zur Humanisierung von
Mäusen mit menschlichem Zell- und Gewebematerial wurden bisher zahlreiche Methoden
etabliert, wobei beim heutigen Stand der Wissenschaft die Transplantation von hämatopoetischen
Stammzellen (HSCs), die am häufigsten genutzte Methode darstellt. [30]. Das Ausgangsmaterial zur
Gewinnung der HSCs ist vielfältig. Neben der Nutzung von Zellen aus dem Knochenmark und
mobilisierten hämatopoetischen Zellen kommt vor allem die Nutzung von frischem
Nabelschnurblut (NSB) in Betracht [36].
Züchtung der immundefizienten Mäuse
Damit Mäusen menschliches Zellmaterial, im vorliegendenen Fall menschliche hämatopoetische
Stammzellen, transplantiert werden kann, ist es notwendig, dass diese Mäuse einen genetischen
Hintergrund vorweisen, der das Anwachsen dieser Zellen ermöglicht. Die Maus sollte
immundefizient sein, damit es nicht zu einer Transplantatabstoßung kommt. Im Laufe der letzten
Jahrzehnte wurden Schritt für Schritt verschiedene Mausstämme gekreuzt, deren Immundefizienz
auf unterschiedlichen Säulen beruht [35].
Den Ausgangspunkt für die Transplantation von menschlichen Stammzellen in immundefiziente
17
Mäuse stellte der CB17-scid-Mausstamm dar. In diesem Stamm liegt eine Mutation des
sogenannten Prkdcscid- Proteins vor. Bei diesem Protein handelt es sich um eine DNA-abhängige
Proteinkinase, die dafür zuständig ist die V(D)J-Rekombination zu katalysieren. Die V(D)JRekombination ermöglicht es, B-Zell- und T-Zell-Rezeptoren zu bilden. Ist diese Rekombination
gestört, so sind die B-Zellen und T-Zellen des Organismus nicht in der Lage, ihrer Aufgabe
nachzukommen. Demzufolge ist bei dem CB17-scid-Mausstamm die adaptive Immunantwort
beeinträchtigt und der murine Organismus kann ein Transplantat, wie es die humanen
hämatopoetischen Stammzellen darstellen, nicht angreifen. Dennoch werden bei der
Transplantation von menschlichen Stammzellen in CB17-scid Mäuse Abstoßungsreaktionen
beobachtet. Für diesen Effekt macht man das Vorhandensein von NK-Zellen verantwortlich, die
aufgrund ihrer Zytotoxizität das Transplantat zerstören. Außerdem wurde ein verspätetes Auftreten
von B- und T-Zellen in CB17-scid-Mäusen beobachtet, womit man sich ebenfalls die
Abstoßungreaktion erklärt. Um die Anzahl der vorhandenen murinen NK-Zellen zu minimieren und
somit das Anwachsen des Transplantates zu verbessern, konzentrierte man sich auf den NODStamm. Die NOD-Mäuse besitzen aufgrund der Mutation weniger NK-Zellen und weisen deshalb
eine verringerte angeborene Immunantwort auf. Aufgrund dieser Eigenschaft kreuzte man den
CB17-scid- Stamm mit dem NOD-Stamm. Weiterhin sind NOD-Mäuse wegen des bestehenden
SIRPα-Polymorphismus nur bedingt zur Phagozytose humaner Stammzellen fähig. Der SIRPαPolymorphismus im Genom der NOD-Maus bewirkt eine verstärkte Bindung von humanen CD47,
das sich auf der Oberfläche humaner hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) befindet. Durch die
Verbindung des SIRPα auf murinen Phagozyten und des CD47 auf humanen transplantierten Zellen
findet eine negative Regulation der Phagozytose statt, so dass vermindert humane HSCs
phagozytiert werden. Um die angeborene Immunantwort der Mäuse noch intensiver einschränken
zu können, griff man mit Hilfe der IL2-Rezeptor-Mutation zusätzlich in den Signalweg der murinen
Zytokine ein. Bei dieser Mutation des IL2-Rezeptors handelt es sich um die Kürzung bzw. den
vollständigen Verlust der γ-Kette des Rezeptors. Die γ-Kette ist essentieller Bestandteil des
Signalwegs zahlreicher Zytokine in das Innere der Zelle. Durch die Manipulation der γ-Kette wird
somit die Kommunikation der Immunzellen untereinander geschwächt. Die Kombination der
Prkdcscid-Mutation, der NOD-Mutation und des IL2R γ-Knockouts führten zur Züchtung des
NOD/Scid-ILRγ0-Stranges (NSG), der zurzeit den günstigsten genetischen Hintergrund für die
Transplanation humaner hämatopoetischer Stammzellen liefert [36].
18
Gewinnung der hämatopoetischen Stammzellen
Im Laufe der Jahre, in denen sich die humanisierte Maus als Tiermodell entwickelt hat, wurden
zahlreiche Quellen genutzt, aus denen menschliche HSCs gewonnen wurden. Dabei kamen zum
einen die Nutzung mobilisierter HSCs aus dem Blut [31], sowie menschliches Gewebe in Frage. Da
allerdings die Ausbeute an HSCs in dieser Art von Materialien gering ist, beschränkte man sich auf
die Nutzung von Knochenmark und Nabelschnurblut (NSB) als Ausgangsmaterial. Knochenmark
weist mit Abstand die höchste Konzentration an HSCs auf, ist jedoch mit dem Nachteil verbunden,
dass nur wenige Spender zur Verfügung stehen. Weiterhin wirft die Spende von Knochenmark
schwerer wiegende ethische Probleme auf, als die Nutzung von NSB, da dieses in der Regel ein
Abfallprodukt darstellt. Aus diesem Grund hat die Nutzung von NSB als Quelle zur Gewinnung von
HSCs zunehmend an Bedeutung gewonnen und gilt als Standardmaterial zur Aufbereitung von
HSCs, die zur Transplantation in NOD/Scid-IL2Rγ0 –Mäuse genutzt werden. Die hämatopoetischen
Stammzellen werden häufig mit Hilfe des magnetic labelling isoliert [37, 38]. Dabei werden die
Zellen durch Antikörpern an Magneten gekoppelt und von den anderen Zellen des Blutes getrennt.
Da es sich bei dem NOD/Scid-IL2Rγ0 –Strang um einen immundefizienten Mausstrang handelt, sind
die Tiere nicht in der Lage sich gegen in den Organismus eindringende Keime zu wehren. Es ist
daher entscheidend, dass ausschließlich nichtinfektiöses Material aufbereitet wird. Das bedeutet
zum einen, dass nur Spenderblut von gesunden Individuen genutzt werden kann und zum anderen
der gesamte Verarbeitungsprozess steril erfolgen muss.
19
Induktion der Sepsis in humanisierten Mäusen
Wahl des Induktionsmodells
Wie oben bereits geschildert, besteht aufgrund des defizitären Wissensstandes und der Schwere
des Krankheitsbildes des septischen Schocks die dringende Notwendigkeit, ein Tiermodell zu
entwickeln, das in der Lage ist die Zustände im Menschen zu simulieren. Hierbei stellt die
humanisierte Maus ein vorteilhaftes Objekt dar, da sie es ermöglicht die Zustände des humanen
Immunsystems nachzuahmen. Somit können gewisse Nachteile bisheriger Modelle, wie die starke
Resistenz von Mäusen gegenüber LPS, ausgeräumt werden. Bisher liegen nur wenige Arbeiten vor,
die sich mit der Sepsisinduktion in humansierten Mäusen befasst haben. Da in der vorliegenden
Arbeit anhand des humanisierten Mausmodelles vor allem die Reaktion der menschlichen
Immunzellen im Sinne einer Funktionalität untersucht werden sollte, fiel die Entscheidung für das
Toxämie-Modell , wie es auch bei Gille et al. [39] Anwendung findet. Weiterhin sprachen die gute
Durchführbarkeit sowie Kontrollierbarkeit für die Wahl des Endotoxinmodells in der humanisierten
Maus.
Charakterisierung der Sepsis in der humaniserten Maus
Bisher wurde die Funktionalität des humanen Immunsystems in humanisierten Mäusen
hauptsächlich zur Erforschung infektiöser und maligner Erkankungen, wie Mamma-Karzinomen,
genutzt und in Bezug auf diese Krankheiten beschrieben [32, 33]. Bisher gibt es nur wenige
Studien, die den septischen Schock in der humanisierten Maus umfassend beschreiben. [40, 39,
41]. Es wurde sich desshalb auf Parameter berufen, die auch beim septischen Patienten bekannt
sind, um eine Einschätzung der Ausprägung einer Sepsis im Vergleich zum Patienten zu
ermöglichen. Der Fokus der Betrachtung lag auf der Erfassung zytochemischer Parameter sowie
der Beurteilung der Zusammensetzung und Aktivierung immunologischer Zellpopulationen. Es
wurde der Plasmaspiegel von humanem IL-6, IFN, TNF, IL-1 und IL-10 im Blut der Tiere erfasst,
da in der Literatur eine Erhöhung dieser pro- und antiinflammatorischen Zytokine im septischen
Schock beschrieben ist [16, 11, 42]. Außerdem wurden die Konzentrationen von humanem und
murinem PTX3 im Plasma der Tiere gemessen, da frühere Studien vermuten lassen, dass PTX3 im
septischen Geschehen Wirkung zeigt [24, 43]. Zusätzlich wurde die Immunantwort mittels
Durchflusszytometrie charakterisiert. Hierbei wurde die Zusammensetzung der immunologischen
20
Zellpopulationen in Blut, Knochenmark und Milz untersucht. Darüber hinaus wurde die
Exprimierung von Aktivierungsmarkern von Monozyten, mDCs und pDCs untersucht. Dabei wurden
Marker genutzt, die in der Literatur zur Charakterisierung der Aktivierung der Zellpopulationen
verwendet werden [42, 44]. Im Falle der Makrophagen handelt es sich hier um das Molekül HLADR und CD86 [45, 46]. HLA-DR ist ein Molekül der Klasse der MHCII-Rezeptoren, die sich
ausschließlich auf den antigenpräsentierenden Zellen des Immunsystems befinden. Der MHCIIRezeptor vermittelt die Kopplung an den T-Zell-Rezeptor von CD4-T-Zellen. Durch diese Verbindung
bewirken die Makrophagen eine Aktivierung der T-Zellen und sind auf diese Weise in der Lage,
eine Immunantwort in Gang zu setzen. Es wurde eine Erhöhung der MHCII-Rezeptoren bei
inflammatorischen Geschehen beobachtet [47, 48]. CD86 wird bei dem durch LPS über die TLR2
und TLR4 ausgelösten Signalweg ebenfalls verstärkt an der Oberfläche exprimiert. Es fungiert
bezüglich des HLA-DR-Moleküls als kostimulatorisches Molekül. Bei einer durch LPS induzierten
Sepsis in Mäusen ist CD86 erhöht [49]. Die zytochemischen und zytometrischen Kriterien wurden
genutzt, um das Ausmaß der Sepsis sowie die Reaktion der humanen Immunzellen in der
humanisierten Maus besser zu charakterisieren und Aufschluss über die Entwicklung eines
neuartigen Tiermodells in der Sepsisforschung zu gewinnen.
21
Zielstellung
Der Forschungsschwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag daher in der Etablierung eines neuen
Tiermodells für Sepsis am Institut für klinische Immunologie der Universität Leipzig. Als Grundlage
diente hierbei die Humanisierung von Mäusen mit humanen hämatopoetische CD34 +-Zellen aus
Nabelschnurblut.
Der erste Teil der Arbeit bestand aus der Humanisierung von NOD/Scid-IL2Rγ 0 mit humanen
CD34+- Zellen und der Beobachtung der Entwicklung von humanen Leukozyten, B-Zellen, T-Zellen,
Monozyten, Granulozyten und NK-Zellen über einen Zeitraum von 8-24 Wochen.
Der zweite Teil bestand in der Charakterisierung der Sepsis in der humanisierten Maus. Dafür
wurden die Tiere in zwei Altersgruppen eingeteilt. Es ergab sich eine Gruppe jüngerer und eine
Gruppe älterer Tiere. Die jüngeren Tiere wurden im Alter von 8-10 Wochen und die älteren Tiere
im Alter von 15-20 Wochen in den Versuch aufgenommen. Es erfolgte eine randomisierte
Zuordnung der entsprechenden Altersgruppen in eine Kontroll- oder Versuchsgruppe. Den Tieren
der Versuchsgruppe wurde 5mg/kg Körpergewicht LPS appliziert. Nach 6 h wurden Blut, Milz und
Knochenmark entnommen und der FACS-Analyse zugeführt. Hierbei wurde sich auf die
Untersuchung der Zusammensetzung der humanen immunologischen Zellpopulationen
(Leukozyten, B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten, CD34+-Zellen) sowie deren
Aktivierung konzentriert. Im Plasma wurden die humanen Zytokine IL-6, IL-10, IFN,TNFund
IL1die murine Zytokine IL-6, IL-10, IL-12/IL23p40 und MCP sowie humanes un murines PTX3
bestimmt.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten folgende Fragen beantwortet werden:
1.
Wie verhalten sich immunologische Zellsubpopulationen in der humanisierten Maus nach
LPS-Gabe?
2.
Werden humane Monozyten, mDCs und pDCs durch LPS-Gabe aktiviert?
3.
Werden humane pro- und antiinflammatorische Zytokine nach LPS-Gabe produziert?
4.
Bilden humanisierte Mäuse murine pro- und antiinflammatorische Zytokine nach LPSGabe?
22
5.
Produzieren humanisierte Mäuse nach LPS-Gabe vermehrt humanes PTX3? Wird nach LPSGabe murines PTX3 produziert?
6.
Gibt es Unterschiede in der Reaktion auf LPS in Abhängigkeit vom Alter nach
Transplantation?
Durch die Beantwortung dieser Fragen sollte geklärt werden, ob die humanisierte Maus als
Tiermodell für das Krankheitsbild Sepsis geeignet ist. Dabei war es wichtig die Funktionalität der
Immunzellen über die Produktion von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen zu
charakterisieren, da das Ausmaß der Produktion und das Verhältnis unterschiedlicher Zytokine
einen Schwerpunkt in der Sepsisforschung darstellen. Weiterhin wurde auf die Veränderung der
Zusammensetzung der immunologischen Zellpopulation wert gelegt, da für die Erforschung der
Pathomechanismen das Verständnis der Reaktion der Zellen nützlich ist. Hierbei war es wichtig zu
klären, ob die Reaktion der Zellpopulationen im Bezug auf ihren Gehalt in immunologisch
wichtigen Organen der Maus und der Exprimierung von Aktivierungsmarkern, die Situation im
Patienten widerspiegelt und einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Tiermodellen besteht.
23
Material und Methoden
Verwendete Materialien
Die im folgenden aufgeführten Materialien, Geräte und Software fanden in den unten
aufgeführten Methoden Anwendung.
Materialien
24-Well-Platte „Cellstar 662160“
greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland
96-Well-Platte „Zellkultur Testplatte 92096“
TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen,
Schweiz
CO2-Gas „CO2 medicAL“
AIR LIQUIDE Deutschland GmbH , Düsseldorf,
Deutschland
Cryoröhrchen „E 308.1“
Roth, Karlsruhe, Deutschland
Bestrahlungsgerät „D3-225“
Ds Gulmay, ByFleet, Großbritannien
Deckgläschen
Gerhard Menzel GmbH , Braunschweig,
Deutschland
EDTA-Monovetten „S-Monovette 9ml K3E“
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland
Einfrierbox „Cryo 1°C Freezing Container“
Nalgene Thermo Fisher Scientific, Waltham,
USA
FACS-Röhrchen „Polysterne Round-Bottom
Tube 5ml“
Becton Dickinson Falcon, San Jose, USA
Feinsieb „Cell strainer, 70µm Nylon, REF
352350“
Becton Dickinson Falcon, San Jose, USA
Gefrierschrank (-80°C) „Forma 900 Series“
Thermo Scientific, Waltham, USA
Glaskapillare „75mm,75µl, ISO 12772“
Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH,
Hamburg, Deutschland
Inkubator „Forma Scientific“
Thermo Life Sciences, Egelsbach,
Deutschland
Insulinspritze „Omnican F“
Braun, Melsungen, Deutschland
Isofluran-Gas „Forene 100% (V/V)
Abbott, Ludwigshafen, Deutschland
Kanülen „Sterican Gr.14, 23 G, 0,6x30mm“
Braun, Melsungen, Deutschland
Kolbenhubpipette
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Kryotom „Leica CM3050“
Leica, Nussloch, Deutschland
Kühlschrank (4°C)
Libherr gastroline, Biberach, Deutschland
Laminarbox „Clean Air, DIN 12950, BS 5720,
NSF 49“
Telstar Laboratory Equipment , Woerden,
Niederlande
Laminarbox „BZ-70“
BDK Luft-und Reinraumtechnik GmbH,
24
Sonnebühl-Genkingen, Deutschland
Magnet „Octo MACS Seperator“
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach,
Deutschland
Magnethalter „MACS Multistand“
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach,
Deutschland
Mikroskop „Olympus CK30-F200“
Olympus Optical Co. LTD, Hamburg,
Deutschland
Mikroskop „Laborlux S“
Leitz, Wetzlar, Deutschland
Mikrotom „JUNG SM 2000 R“
Leica, Nussloch, Deutschland
Neubauer Zählkammer
Labor Optik, Lancing, Großbritannien
Pasteurpipetten
greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland
Pipettierhilfe „Accu-jet pro“
Brand, Wertheim, Deutschland
Pipettierhilfe „Multipipette plus“
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Pipettenspitzen (1000µl)
greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland
Pipettenspitzen (100µl)
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland
Pipettenspitzen (10µl)
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland
Ph-Meter „ph 540 GLP MultiCal“
Wissenschaftlich-Technische-Werkstätten,
Weilheim, Deutschland
Objektträger „Superfrost Plus“
Menzel-Gläser, Thermo Scientific, Waltham,
USA
Schüttler „PMS 1000, Mini-shaker“
Grant-Bio, Cambridgeshire, Großbritannien
Seperationsfilter „Pre-Seperation Filters, 30
µm“
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach,
Deutschland
Seperationssäulen „MACS Seperation
Columns MS“
Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach,
Deutschland
Serumpipetten „Cellstar“ (10ml, 20 ml, 50
ml)
greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland
Spritzen „Omnifix-F, 1ml“
Braun, Melsungen, Deutschland
Spritzenkolben „Discardit II“ (10ml)
Becton Dickinson, San Jose, USA
Zentrifuge „Centrifuge 5415 D“
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Zentrifuge „Varifuge 3.ORS“
Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland
Messgeräte
FACSArray
Becton Dickinson, San Jose, USA
ELISA-Reader „sunrise“
TECAN, Männerdorf, Schweiz
FACS Canto II
Becton Dickinson, San Jose, USA
25
Feinwaage „BP 221S“
Sartorius Weighing Technologies GmbH,
Göttingen, Deutschland
Waage „Viper SW“
Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland
Software
FCAP Array v1.0.1
Soft Flow GmbH, Fredersdorf, Deutschland
Magellan 6
Stüber Systems, Berlin, Deutschland
FACS Diva Software
Becton Dickinson, San Jose, USA
Sigma Plot 11.0
Systat Software Inc., San Jose, USA
26
Methodisches Vorgehen
Im Folgenden soll das grundlegende methodisches Vorgehen der Arbeit erläutert werden. Auf die
genaue Ausführung der einzelnen Punkte der Arbeit wird in den weiteren Abschnitten in Material
und Methoden genauer eingegangen.
Zur Humanisierung der Maus wurde 24h-altes Nabelschnurblut von Spenderinnen aus dem
Krankenhaus St. Elisabeth in Leipzig verwendet. Aus diesem Nabelschnurblut wurden mit Hilfe von
Dichtegradientenzentrifugation mononukleäre Zellen gewonnen. Aus diesen Zellen wurden mittels
magnetischer Separation humane CD34+-Zellen isoliert und in maximal 48h-alte NOD/SCID Mäuse
transplantiert. Nach der Transplantation erfolgte die Untersuchung der humanen
immunologischen Subpopulationen mit Hilfe von Durchflusszytometrie in zweichwöchigem
Abstand in einem Zeitraum von 8-24 Wochen. Diese Langzeitbeobachtung sollte dem Überblick
über die Entwicklickung des humanen Immunsystems in der Maus Rechnung tragen. Aufgrund der
Ergebnisse dieser Verlaufskontrolle erfolgte die Aufteilung der Tiere in zwei verschiedene
Altersgruppen von 8-10 und von 15-20 Wochen. Ausgangsbedingung für die Aufnahme in den
Versuch stellte dabei eine Humanisierungsrate von mindestens 15% dar. Die Humanisierungsrate
ergab sich aus dem prozentualen Anteil von humanen Leukozyten an lebenden Zellen in der FACSAnalyse. Die Tiere im Alter von 8-10 Wochen wurden randomisiert einer Kontrollgruppe (A-0) und
einer Versuchsgruppe (A) zugeteilt. Mit den Tieren im Alter von 15-20 Wochen wurde ebenso
verfahren (Gruppe B-0 und Gruppe B). Den Tieren der Versuchsgruppen wurde LPS appliziert um
ein septisches Geschehen zu simulieren, wobei die Tiere der Kontrollgruppe ausschließlich NaCl
erhielten. Nach 6 h wurden die Tiere euthanasiert und es wurden Blut, Milz und Knochenmark
gewonnen. Anschließend erfolgte eine Charakterisierung der Sepsis in der humanisierten Maus.
Hierbei wurdendie Zusammensetzung der einzelnen immunologischen Zellpopulationen und deren
Aktivierung in den einzelnen Organen, sowie diehumanen und murinen pro- und
antiinflammatorischen Zytokinen und PTX3 gemessen.
Tierhaltung
Das Tierversuchsvorhaben wurde durch die Landesdirektion Sachsen unter dem Namen „Induktion
einer Sepsis in humanisierten NSG Mäusen – TVV36/12“ gemäß § 8 des Tierschutzgesetzes
genehmigt. Die Tierhaltung erfolgte im Medizinisch-Experimentellen-Zentrum (MEZ) der
Universität Leipzig. Pflege und Versorgung wurden dabei durch Frau Vet.-Ing. Hannelore Scholz
27
vorgenommen. Die medizinische Versorgung der Tiere übernahm Frau Dr. vet. med. Petra FinkSterba. Die Züchtung der Tiere des Stamms NOD.Cg-Prkd scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, im weiteren bezeichnet
als NSG, stellte The Jackson Laboratory, USA, sicher. Es wurden 24-48 h alte NSG Mäuse beiderlei
Geschlechts bei 23°C unter apathogenen Bedingungen gehalten. Nach spätestens 48 h nach der
Geburt erfolgte eine Bestrahlung der Mäuse mit einer Dosis von 1 Gy/min radioaktiver Strahlung
für 3-5 Minuten an einem 200kV-Bestrahlungsgerät. Nach 3-5 h erfolgte die Transplantation der
CD34+-Zellen mittels intrahepatischer Injektion. Im Alter von 3-5 Wochen erfolgte die Absetzung
von der Mutter nach getrenntem Geschlecht. Zu Beginn des Versuchs betrug das Gewicht der Tiere
ca. 14-23 g. Es wurden Tiere beider Geschlechter in den Versuch aufgenommen wurden. Innerhalb
des Tierversuchsvorhabens wurde das Wohlbefinden der Tiere regelmäßig anhand des in Tab. 1
aufgeführten Scores überprüft. Lag die Scoresumme über 6 wurden die Tiere mittels CO 2
euthanasiert, um unnötiges Leiden zu verhindern.
Parameter
Grad
0
1
2
3
Körperhaltung Kein Buckel
Gebuckelte
Laufhaltung
Keine
Streckhaltung
Hochgradige
Buckelung
Mobilität
Mobil und
lebendig
Mittelgradig
Erzwungene
verminderte
Lokomotion
Spontanlokomotio
n
Keine erzwungene
Lokomotion möglich
Haut
Ohne
besonderen
Befund
Exantheme und
Akanthose
Schuppen und Ulzera
Fell
Keine
Auffälligkeiten
Nacken und Bauch Mäßig multifokal
leicht zerzaust
zerzaust und
verfilzt
Erytheme und
vermehrte
Schuppung
Multifokal, diffus
stark zerzaust und
verfilzt
Tab. 1 : Scoringsystem zur Beurteilung des Allgemeinzustandes der NSG Mäuse.
Die Tiere werden im Bezug auf die Parameter Körperhaltung, Mobilität, Haut und Fell beurteilt. Dabei werden je nach
Befund entsprechende Scoringpunkte vergeben. Die einzelnen Punkte werden addiert. Liegt die Summe über 6 dann
werden die Tiere frühzeitig vom Versuch ausgeschlossen und mittels CO 2 euthanasiert.
Aufbereitung des frischen Nabelschnurblutes
Reagenzien
Pancoll
Pan Biotech GmbH
28
PBS/EDTA
PBS/0,3 mM EDTA
PAA Laboratories GmbH
Einfriermedium
20% DMSO
10% FKS
25% Dextran-Lösung
5% ACD-A
In RPMI
AppliChem GmbH
PAA Laboratories
Dextran-Lösung
50 g Dextran
9 g NaCl
In 500 ml Wasser
Sigma
Roth
Braun
RPMI
1640 with stable Glutamin
PAA Laboratories GmbH
DMEM
Low Glucose (1g/l), with LGlutamine, with 25 mM
HEPES
PAA Laboratories GmbH
Türk’sche Lösung
Sigma
Merck KGaA
Durchführung
Die Spende des Nabelschnurblutes wurde durch das Ethikkomitee der Universität Leipzig unter der
Nummer 121-11-18042011 genehmigt. Das Nabelschnurblut wurde durch die Hebammen des
Krankenhauses St. Elisabeth in Leipzig in EDTA-Monovetten abgenommen. Die Aufarbeitung
erfolgte steril unter einer Laminar Flow Box mit sterilen Materialien. Maximal 24 h altes
Nabelschnurblut wurde 1:1 mit PBS/EDTA verdünnt. Dazu wurde das PBS/EDTA auf
Raumtemperatur erwärmt. Zur Dichtegradientenzentrifugation wurden 10 ml Pancoll mit 25-35 ml
verdünntem Vollblut mit Hilfe einer Serumpipette überschichtet und für 25 min, 600 g, bei
Raumtemperatur mit niedriger Bremse zentrifugiert. Danach wurden die MNCs aus der
Interphaseschicht mit Hilfe einer Pasteurpipette abgenommen und in ein neues Röhrchen
überführt. Die Zellsuspension wurde 1:2 mit PBS/EDTA aufgefüllt und erneut zentrifugiert (10 min,
500g, 4°C). Nach dem folgenden Waschschritt mit PBS/EDTA (8 min, 300g, 4°C) wurden die Zellen
in Türk’scher Lösung aufgenommen und gezählt. Es wurden maximal 5x107 Zellen in 1 ml
DMEM/Einfriermedium (1:1) mittels eines Cryoröhrchens eingefroren. Dafür wurde eine
Einfrierbox genutzt, um die Zellen schrittweise auf -80°C abzukühlen. Nachdem die Zellen diese
Temperatur erreicht hatten, wurden sie in flüssigem Stickstoff gelagert.
29
Auftauen der Mononukleären Zellen und Transplantation der CD34 +-Zellen
Methodische Grundlagen der magnetischen Seperation
Bei der magnetischen Separation (auch: Magnetic labeling) handelt es sich um eine gängige
Methode um bestimmte Zellpopulationen aus einer Mischpopulation an Zellen zu isolieren. Hierbei
macht man sich, wie bei vielen immunologischen Techniken, zunutze, dass die meisten
Zellpopulationen ein spezifisches Oberflächenmolekül besitzen, was sie von anderen
Zellpopulationen unterscheidet. Im Falle von Immunzellen handelt es sich um den sogenannten
Cluster of Differtiation (CD). Die HSCs, bei denen in der vorliegenden Arbeit die magnetische
Seperation genutzt wurde, tragen den spezifischen CD34. Bei der magnetischen Separation wird
die Mischpopulation verschiedener Zellen mit einem Antikörper (AK) inkubiert, der gegen das
spezielle Oberflächenmolekül gerichtet ist. Zusätzlich ist dieser AK an einen sogenannten
MagnetBead gekoppelt. Versieht man also die HSCs mit dem entsprechenden MagnetBead, der
gegen CD34 gerichtet ist, so binden die magnetisch markierten AK an die Zellen. Wird das
Zellgemisch nun in ein Magnetfeld gebracht, so verbleiben nur die Zellen mit dem magnetischen
AK im Magnetfeld, da diese magnetisch angezogen werden. Unerwünschte Zellen wandern durch
das magnetische Feld hindurch und können verworfen werden. Die gewünschte isolierte
Population kann weiter verwendet werden. Der Vorteil der Methode gegenüber anderen
Methoden zur Zellisolation, wie dem Elutrieren, besteht in seiner vergleichsweise einfachen
Durchfürbarkeit und seiner Unanfälligkeit gegenüber äußeren Einflüssen.
Reagenzien
DMEM
Low Glucose (1g/l), with LGlutamine, with 25 mM
HEPES
PAA Laboratories GmbH
DNAse-Puffer
0,5% FKS
2mM MgCl2
10µg/ml DNAse
in PBS
PAA Laboratories GmbH
Sigma-Aldrich
Appli Chem
PAA Laboratories GmbH
PBS
PAA Laboratories GmbH
CD34 MicroBead Kit
FcR Blocking Reagent human
CD34 MicroBeads human
Miltenyi Biotec GmbH
Macs-Puffer
Macs-Puffer
Miltenyi Biotec GmbH
30
5% FKS
PAA Laboratories
Türk’sche Lösung
Merck KGaA
Trypanblau
VWR
Durchführung
Dei Separation der CD34-Zellen erfolgte unter sterilen Bedingungen in einer Laminar Flow Box mit
sterilen Materialien. Die eingefrorenen MNCs wurden zügig bei 37°C im Wasserbad aufgetaut. Die
Zellen wurden mit 40 ml warmen (37°C) DMEM gewaschen (8 min, 300g, RT). Danach wurde der
Überstand verworfen und ein weiterer Waschschritt mit DNAse-Puffer durchgeführt. Es wurde die
Zellzahl mit Türk’scher Lösung in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Zellen wurden auf
300l Macs-Puffer pro 1x 108 Zellen eingestellt. Es folgte die Zugabe von 100l Blocking Reagenz
und 100l CD34-Magnet Beads pro 1x 108 Zellen. Nach 30 minütiger Inkubationszeit bei 4°C wurde
die Zellsuspension mit 10 ml Macs-Puffer aufgefüllt und bei 300g, 8 min und 4°C zentrifugiert.
Danach wurde der Überstand restlos abgenommen. Es erfolgte die Einstellung der Zellsuspension
vor dem Separieren auf 500l Macs-Puffer je 1x108 Zellen. Zur Vorbereitung der Separation
wurden MS-Macs-Säulen mit Hilfe des Magneten im Magentfeld platziert und jeweils mit 500l
Macs-Puffer gespült um toxische Substanzen aus der Säule zu entfernen. Danach schloss sich die
Gabe der Zellsuspensionen über die MS-Säulen an. Hierbei wurden durch einen Seperationsfilter
pro Säule 500l der Zellsuspension mit maximal 1x108 Zellen über eine Säule gegeben. Der
Durchfluss wurde aufgefangen und erneut über die Säule gegeben. Danach erfolgte ein dreimaliges
Spülen der Säule mit jeweils 500l Macs-Puffer. Die Zellen wurden mit 1 ml Macs-Puffer eluiert. Im
Anschluss wurden die Zellen eines Nabelschnurblutes vereinigt und nach einem zusätzlichen
Zentrifugationsschritt (300g, 8min, 4°C) in 500l Macs-Puffer aufgenommen. Die zweite Säule, die
im Vorhinein ebenfalls mit 500l Macs-Puffer gespült wurde, wurde im Magnetfeld platziert. Die
Zellsuspension sowie der entstandene Durchfluss wurden nacheinander über die selbe Säule
gegeben. Es folgte ein dreimaliges Spülen der Säule mit 500l Macs-Puffer. Das Eluieren der Zellen
erfolgte mit 1 ml Macs-Puffer. Danach wurden die Zellen mit Trypanblau gezählt. Pro zu
humanisierender Maus wurden 2-4x105 Zellen in jeweils 50 µl Medium gelöst und in eine
Insulinspritze aufgezogen. Die Transplantation der HSCs erfolgte mittels Injektion in die Leber der
31
bestrahlten Mäuse unter sterilen Bedingungen.
Durchflusszytometrie
Methodische Grundlagen des Durchflusszytometers
Die Durchflusszytometrie ist eine Technik, mit der mehrere verschiedene Zellpopulationen
innerhalb einer Probe identifiziert werden können. Die Probe wird mit verschiedenen AK versehen,
die erstens gegen ein spezifisches CD gerichtet sind zweitens eine Fluoreszenz in einem
bestimmten Farbbereich aufweisen. Auf diese Art und Weise wird jede Zellpopulation mit einem
AK unterschiedlicher Farbe markiert. Dadurch können später die Zellpopulationen im
Durchflusszytometer unterschieden werden. Zu Beginn wird die Probe, die mit den verschiedenen
AK markiert ist, in das Durchflusszytometer eingebracht. Dort wird die Zellsuspension durch eine
dünne Kapillare gesaugt. Dadurch ist es möglich, jede Zelle einzeln an einem Laserstrahl
vorbeizuführen. Der Laserstrahl wird nun zum Einen an der Zelle gestreut. Durch diesen Effekt kann
mittels des Forward Light Scatter die Größe und mittels des Sideward Light Scatter die Granularität
der Zelle bestimmt werden. So sind erste Aussagen über die Morphologie der Zelle möglich. Zum
Anderen führt das Auftreffen des Laserstrahls auf die Zelle dazu, dass die fluoreszierenden AK, mit
denen die Zelle markiert ist, beginnen Licht in einer spezifischen Wellenlänge auszusenden. Dieses
Licht kann mit Hilfe von Detektoren registriert werden. Die Probe wird Stück für Stück durch die
Kapillare gesaugt, so dass jede Zelle gemessen werden kann. Die empfangenen Daten können dann
in einem charakteristischen Dot-Plot dargestellt und zur Auswertung herangezogen werden. Dabei
ist es möglich die prozentuale Zusammensetzung der Zellsuspension aus den einzelnen
Zellpopulationen zu bestimmen. Dabei können mehrerer Zellpopulationen pro Probe bestimmt
werden, sodass wenig Probenmaterial ausreicht um eine Identifikation durchzuführen.
Reagenzien
PBS/FKS
Lyse-Puffer
PBS
2% FKS
Aqua B. Braun
10 % BD FACS Lysing
Solution
PAA Laboratories GmbH
PAA Laboratories GmbH
Braun Melsungen AG
BD Biosciences
Heparin
Heparin Natrium-25000
Ratiopharm
Formaldehyd
1% ig in PBS gelöst
Merck
32
Antihuman
CD3 Fitc
CD4 Amcyan
CD8 PerCP
CD11c PE
CD14 APC-Cy7
CD16 PE-Cy7
CD19 PE
CD45 APC
CD56 V450
CD80 Fitc
CD86 V450
CD123 Per-CP-Cy5.5
HLA-DR PE-Cy7
Lineage Coctail Fitc
CD34 PE
Mouse IgG1 Fitc Isotype Control
Mouse IgG1 PE Isotype Control
Mouse IgG1 PerCP Isotype Control
Mouse IgG1 PE-Cy7 Isotype Control
Mouse IgG2b APC-Cy7 Isotype
Control
Mouse IgG1 V450 Isotype Control
Mouse IgG1 Amcyan Isotype
Control
Mouse IgG1 APC Isotype Control
Mouse IgG2a PE Isotype Control
Klon UCHT1
Klon SK3
Klon SK1
Klon Bly6
Klon MPhiP9
Klon 3G8
Klon HIB19
Klon HI30
Klon B159
Klon L307.4
Klon 2331(FUN-1)
Klon 7G3
Klon L243
Klon SK7 (CD3), 3G8
(CD16), SJ25C1 (CD19),
L27 (CD20), MP9
(CD14), NCAM16.2
(CD56)
Klon AC136
Klon MOPC-21
Klon MOPC-21
Klon MOPC-21
Klon MOPC-21
Klon 27-35
BD Bioscience
Miltenyi Biotec
BD Bioscience
Klon MOPC-21
Klon X40
Klon MOPC-21
Klon S43.10
Miltenyi Biotec
Durchführung
Je nach Versuchszeitpunkt wurden verschiedene Antikörper zur FACS-Analyse genutzt, wobei die
Herstellung des FACS-Ansatzes gleich durchgeführt wurde. Zu jedem Ansatz wurden die
entsprechenden Isotyp-Kontrollen nach dem selben Protokoll mitgeführt. Die Analyse der FACSProben erfolgte am Gerät FACS Canto II von BD. Die Daten wurden mit Hilfe der FACS Diva Software
ausgewertet.
FACS-Ansatz nach Humanisierung
Die Mäuse wurden mittels Inhalationsnarkose durch Isofluran betäubt. Durch retrobulbäre
33
Punktion mit einer heparinisierten Glaskapillare wurde ca. 75 µl Augenblut abgenommen. Dieses
wurde mit 10µl Heparin antikoaguliert. Das Blut wurde 10 min bei Raumtemperatur (RT) und 300g
zentrifugiert. Das Plasma wurde abgenommen und bei -80°C eingefroren. Es wurden 50 µl des
verbleibenden Blutes mit 100 µl PBS/FKS und den entsprechenden Mengen der AK für 30 min bei
4°C inkubiert. Bei diesen Antikörpern handelte es sich um anti-human CD3 Fitc [4µl], anti-human
CD19 PE [5µl], anti-human CD8 PerCP [4µl], anti-human CD16 PE-Cy7 [5µl], anti-human CD45 APC
[5µl], anti-human CD14 APC-Cy7 [2µl], anti-human CD56 V450 [2,5µl] und anti-human CD4 Amcyan
[2,5µl]. Danach wurde mit Hilfe des Lyse-Puffers eine Lyse der Erythrozyten durchgeführt um eine
Verunreinigung der späteren FACS-Analyse zu vermeiden. Dazu wurde jede Probe mit 2 ml LysePuffer versetzt und 15 min bei RT im Dunklen inkubiert. Nach dem Lyse-Schritt wurden 2ml
PBS/FKS zu der Probe gegeben. Die Probe wurde bei 300g, 8 min, 4°C zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen. Es folgte ein zweimaliger Waschschritt mit je 2 ml PBS/FKS bei 300g, 8 min, 4°C.
Im letzten Schritt wurde der Überstand ebenfalls verworfen und die Probe mit 200µl PBS/FKS
aufgefüllt und im Durchflusszytometer gemessen.
FACS-Ansatz nach Sepsisinduktion
Nachdem die Sepsisinduziert wurde, wurde den Mäusen Herzblut entnommen und mit 10µl
Heparin antikoaguliert. Das Blut wurde 10 min bei RT und 300g zentrifugiert. Das Plasma wurde
abgenommen und nochmals für 10 min bei RT und 16 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde
abgenommen und bei -80°C eingefroren. Zusätzlich wurde den Mäusen zum Versuchsende Milz
und Knochenmark entnommen. Bis zur Weiterverarbeitung wurden die Organe in 1 ml PBS in je
einer Kavität einer 24-Well-Platte gelagert. Danach erfolgte die Gewinnung einer Zellsuspension
der Milz durch das Durchdrücken durch ein Feinsieb mit Hilfe eines Spritzenkolbens. Die Siebe
wurden mit PBS gespült, bis der Durchfluss klar erschien. Danach wurden die Zellsuspensionen von
Milz und Knochenmark 8 min bei 300g und 4°C zentrifugiert. Die Zellen wurden in 1 ml
(Knochenmark) bzw. 5 ml (Milz) PBS aufgenommen und es schloss sich ein Zählschritt mit
Türk'scher Lösung an. Für den FACS-Ansatz wurden die Zellsuspensionen der verschiedenen
Organe mit PBS/FKS auf je 5x105 Zellen pro FACS-Ansatz eingestellt. Außerdem wurden jeweils
50µl der Blutzellen je FACS-Ansatz verwendet. Pro Organ wurden zwei FACS-Ansätze durchgeführt.
Im ersten Ansatz wurden folgende AK in entsprechenden Mengen zugegeben: anti-human CD3 Fitc
[4µl], anti-human CD19 PE [5µl], anti-human CD16 PE-Cy7 [5µl], anti-human CD45 APC [5µl], antihuman CD56 V450 [2,5µl]. Im zweiten Ansatz wurden folgende AK in entsprechenden Mengen
34
zugegeben: anti-human Linaege Coctail Fitc [10µl], anti-human CD11c PE[10µl], anti-human CD123
PerCP-Cy5.5 [10µl] , anti-human HLA-DR PE-Cy7 [1µl], anti-human CD86 V450 [1,5µl], anti-human
CD14 APC-Cy7 [2µl], anti-human CD45 APC [5µl].
Nach 30minütiger Inkubation im Dunkeln bei 4°C schloss sich ein 15 minütiger Lyseschritt mit 2ml
Lyse-Puffer bei RT im Dunklen an. Nach der Inkubation wurde zu jedem FACS-Ansatz jeweils 2ml
PBS/FKS gegeben. Die Proben wurden bei 300g und 4°C 8min zentrifugiert. Danach wurde zweimal
mit jeweils 2 ml PBS/FKS bei 300g und 4 °C für 8 min gewaschen. Im letzten Schritt wurde der
Überstand verworfen und jede Probe mit 200µl PBS/FKS aufgefüllt und im Durchflusszytometer
gemessen.
Sepsisinduktion
Reagenzien
LPS
NaCl
Escherichia coli 0111:B4
9%-physiologische NaCl
Sigma-Aldrich
VWR
Durchführung
Es wurden in den Versuch der Sepsisinduktion alle Tiere aufgenommen, deren Humanisierungsgrad
nach der FACS-Analyse über 15% lag. Dieser ergab sich dabei aus dem prozentualen Anteil der
CD45-positiven Zellen im Life Gate. Die Tiere wurden randomisiert einer Versuchsgruppe und in
einer Kontrollgruppe zugeteilt. Die Sepsisinduktion wurde unter sterilen Bedingungen mit sterilen
Instrumenten durchgeführt. Die Tiere der Versuchsgruppe erhielten 5 mg/kg Körpergewicht LPS
i.p. gelöst in 200µl NaCl. Die Tiere der Kontrollgruppe erhielten ausschließlich 200µl NaCl. Nach der
Injektion wurden die Tiere stündlich überwacht. Nach 6 h wurden die Tiere mit CO2 euthanasiert
und Organe für die Histologie sowie für den FACS-Ansatz entnommen. Herzblut wurde mit Hilfe
einer Spritze entnommen.
Enzym-linked Immunosorbentassay
Methodische Grundlagen des capture Enzym-linked Immunosorbentassays
Der Enzym-linked Immunosorbentassay (ELISA) dient zur quantitativen Bestimmung von
Substanzmengen in einer Probe. Hierbei wird diese Substanzmenge photometrisch über die
Kopplung an eine Enzymreaktion gemessen. Für einen sogenannten capture-ELISA wird zu Beginn
35
eine Platte mit dem Antikörper beschichtet, der spezifisch gegen die Substanz aus der Probe
gerichtet ist. Danach wird die Probe dazu gegeben. Sobald die Substanz vorhanden ist, bindet sie
an den AK mit dem die Platte beschichtet wurde.Ein zugegebener Detektions-AK bindet ebenfalls
an die Substanz. Die Zugabe eines weiteren AK, der an den Detektions-AK bindet, bewirkt, dass
durch die Kopplung an ein Enzym die Umsetzung eines spezifischen Substrats katalysiert wird.
Durch die Zugabe des Substrats kommt es zu einer enzymatischen Spaltung, die mit einem
Farbumschlag einhergeht. Dieser Farbumschlag kann photometrisch gemessen werden und steht
in positiver Korrelation mit der Konzentration der zu messenden Substanz. Der Vorteil eines
capture-ELISAs im Gegensatz zu einem herkömmlichen ELISA ist vor Allem die Signalverstärkung
durch den Einsatz eines Sekundär-AK. Dadurch ist es möglich, geringste Mengen der gesuchten
Substanz in einer Probe nachzuweisen.
Reagenzien
Humaner PTX3 ELISA
RD Systems, Minneapolis,
USA
RD Systems, Minneapolis,
USA
Cusabio, Wuhan, China
Cusabio, Wuhan, China
Muriner PTX3 ELISA
Humaner PCT ELISA
Muriner PCT ELISA
Durchführung
Nach erfolgter Sepsisinduktion wurde den Tieren Herzblut entnommen. Dieses wurde mit 10µl
antikoaguliert. Das Plasma wurde durch zweimalige Zentrifugation bei 300g bzw. 16 000g, 8 min,
RT gewonnen. Es wurde humanes sowie murines Pentraxin 3 (PTX3) in den Plasmaproben der Tiere
bestimmt. Jede Bestimmung sowie die Standardverdünnungsreihe wurden doppelt durchgeführt.
Außerdem wurde das Plasma eines nicht humanisierten Tieres, das ebenfalls LPS erhielt,
mitgeführt um eine Kreuzreaktivität der Antikörper des ELISAs auszuschließen. Die Durchführung
des ELISAs erfolgte nach Angaben des Herstellers. Dabei wurden alle Schritte, sofern nicht anders
aufgeführt, bei RT durchgeführt. Die Plasmaproben wurden aufgetaut und für die Bestimmung des
humanen PTX3 entweder 1:2 (Versuchsgruppe) vorverdünnt bzw. unverdünnt (Kontrollgruppe)
eingesetzt. Für die Bestimmung des murinen PTX3 wurden bei der NaCl-Gruppe die Proben 1:50
und in der der LPS-Gruppe 1:100 vorverdünnt. Es wurde eine Standardverdünnungsreihe angelegt.
Zur Bestimmung des humanen PTX3 wurde eine 96-Well-Platte mit dem biotinilierten PTX336
Antikörper beschichtet. Die Platte für das murine PTX3 wurde bereits beschichtet geliefert. Nach
mehrmaligem Waschen der Platte für humanes PTX3 erfolgte, sowohl für die Bestimmung von
humanem als auch von murinem PTX3 die Zugabe von Assay Diluent in jedes Well der
unterschiedlichen 96-Well-Platten. Die im Vorhinein mit Calibrator Diluent verdünnten Proben und
Standards wurden in die Wells pipettiert und 2 h auf einem Schüttler inkubiert. Danach wurde die
Platte zur Bestimmung von humanem PTX3 viermal und die Platte zur Bestimmung von murinem
PTX3 fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Es wurde Konjugat zu jedem Well dazu gegeben. Die
Platten wurden erneut 2h auf dem Schüttler inkubiert. Danach wurden die Platten nochmals vierbzw. fünfmal gewaschen. Es erfolgte die Zugabe des Substrates und eine 30minütige Inkubation im
Dunkeln. Danach wurde in jedes Well eine Stop Solution gegeben und die Platten wurden
innerhalb der nächsten 20 min am ELISA-Reader TECAN sunrise gemessen. Die Auswertung der
Platten erfolgte mit dem Programm Magellan 6. Der Mittelwert der Konzentration der
Doppelbestimmungen wurde zur Auswertung herangezogen.
Cytometric Bead Array
Methodische Grundlagen des Cytometric Bead Arrays
Bei dem Cytometric Bead Array (CBA) handelt es sich um eine Methode, quantitativ
Konzentrationen bestimmter Substanzen in einer Probe zu bestimmen. Der Vorteil zum ELISA
besteht in der Möglichkeit der simultanen Messung mehrer Substanzen innerhalb einer Probe. Das
Verfahren wird über die Kopplung von spezifischen AK an unterschiedlich große Magnetkugeln
(Beads) ermöglicht. Jedes Zytokin wird hierbei über die AK-Bindung an einen definiert großen Bead
gekoppelt. Durch die Nutzung unterschiedelicher großer Beads je Zytokin ist somit eine
kombinierte Messung verschiedener Zytokine je Probe möglich. Ist die Bindung des Zytokin an der
Bead erfolgt, wird ein zweiter fluoreszenmarkierter AK hinzugegeben, der die Messung im FACSGerät ermöglicht. Durch das Mitführen einer Standardverdünnungsreihe kann über die
Fluroeszenrate die Konzentration des Zytokins in der Probe ermittelt werden.
Reagenzien
CBA-Kit
BD CBA Human IL-1 Flex Set
BD CBA Human IL-6 Flex Set
BD CBA Human IL-10 Flex Set
BD CBA Human INFγ Flex Set
BD CBA Human TNF Flex Set
37
BD Bioscience
CBA-Kit
BD CBA Mouse IL-6 Flex Set
BD CBA Mouse IL-10 Flex Set
BD CBA Mouse IL-12/IL23p40 Flex Set
BD CBA Mouse MCP Flex Set
BD CBA Mouse TNF Flex Set
BD Bioscience
Durchführung
Das bei -80°C gelagerte Plasma wurde bei RT aufgetaut. Danach erfolgte die Zytokinbestimmung
der Proben mittels des CBA-Kit für die humanen Zytokine IL-1, IL-6, IL-10. TNF und die murinen
Zytokine IL-6, IL-10, IL12/IL23p40, MCP, TNF laut Angaben des Herstellers. Außerdem wurde das
Plasma eines nicht humanisierten Tieres, das ebenfalls LPS erhielt, mitgeführt, um eine
Kreuzreaktivität der Antikörper des CBAs auszuschließen. Der Standard wurde in dem bereit
gestellten Assay Diluent gelöst und eine Standardverdünnungsreihe erstellt. Die Plasmaproben
wurden unverdünnt mit den CaptureBeads in einer 96-Well-Platte 1h inkubiert. Danach wurde das
Detektionsreagenz dazu gegeben. Die Konzentration der Zytokine wurde im BD FACS Array mit Hlfe
der FACS Array System Software gemessen und mit Hilfe der FCAP Array Software 1.0 ausgewertet.
Statistik
Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit Hilfe SigmaPlot 11.0. Hierbei wurde für den
Vergleich von zwei ungepaarten Gruppen mit normalverteilte Daten der einfache t-Test genutzt.
Bei dem Vergleich von zwei ungepaarten Gruppen mit nicht normalverteilten Daten wurde der
Mann-Withney-Rank-Sum-Test genutzt. Bei dem Vergleich von zwei gepaarten Gruppen mit
normalverteilten Daten wurde der gepaarte t-Test genutzt. Bei dem Vergleich von zwei gepaarten
Gruppen mit nicht normalverteilten Daten fand der Mann-Withney-Rank-Sum-Test Anwendung.
Um mehrere Gruppen mit einem bestimmten Merkmal zu vergleichen, wurde eine One Way
ANOVA on Ranks durchgeführt, sofern es sich um nicht normalverteilte Daten handelte. In diesem
Fall wurde als posthoc Test der Dunn's test genutzt. Waren die Daten normalverteilt, wurde eine
One Way ANOVA genutzt um die Daten zu vergleichen. Als posthoc Test diente dann der TukeyTest. Die Ermittlung der Normalverteilung erfolgte entweder mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test
oder mit dem Shapiro-Wilk-Test.
38
Ergebnisse
Charakterisierung der humanisierten Maus
Charakterisierung vor Sepsisinduktion
Mit Hilfe von Dichtegradientenzentrifugation wurden mononukleäre Zellen aus maximal 24 h alten
Nabelschnurblut (NSB) isoliert. Nach für die Lagerung notwendigem, schonenden Einfrieren,
wurden die mononukleäre Zellen aufgetaut und durch magnetische Separation CD34 + -Zellen
isoliert. Die humanen Stammzellen wurden 24-48 h alten NOD/SCID-IL2R0-Mäusen intrahepatisch
Injiziert. Im Zeitraum von 8-24 Wochen nach Stammzelltransplantation erfolgten Blutentnahmen
von 6 Tieren mittels retrobulbärer Punktion unter Narkose mit Isofluran. Der Gehalt humaner
Lukozyten, humaner B-Zellen, humaner T-Zellen, humaner Granulozyten, humaner NK-Zellen und
39
humaner Monozyten der Blutproben wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Über diesen
Zeitraum zeigte sich ein Anstieg der Leukozytenpopulation (One way ANOVA p=0,014) (Abb. 2).
Weiterhin gab es einen deutlichen prozentualen Anstieg an T-Zellen (One way ANOVA p< 0,001)
(Abb. 2) und einen Abfall von B-Zellen (One way ANOVA p=0,021) (Abb. 2) über den Zeitraum von
24 Wochen. Bei Granulozyten zeigte sich ein signifikanter Anstieg in Woche 12 im Vergleich zu
Woche 8-22 (Tukey test p<0,05). NK-Zellen verzeichneten einen signifikanten Abfall in Woche 12
im Vergleich zu Woche 24 (Dunn's test p< 0,05). Im Vergleich des Gehaltes von NK-Zellen zwischen
Woche 12 und Woche 8-22 ergab sich ein Trend im Abfall der NK-Zellen in Woche 12. Monozyten
zeigten weder Abfall noch Ansteig der prozentualen Verteilung über diesen Zeitraum.
40
a
CD45 [%life gate]
100
80
60
40
20
0
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Wochen nach Transplantation
b
B-Zellen [%CD45+]
100
80
60
40
20
0
8
10
14
16
18
20
22
24
Wochen nach Transplantation
c
T-Zellen [%CD45+]
100
80
60
40
20
0
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Wochen nach Transplantation
Abb. 2: Darstellung der prozentualen Anteile von CD45-Zellen an lebenden Zellen (a), B-Zellen an CD45-Zellen (b) und TZellen an CD45-Zellen (c) im zweiwöchigen Zeitintervall 8-24 Wochen nach Transplantation von humanen CD34-Zellen
im Blut der NSG Mäuse.
Dargestellt sind der Median der einzelnen Gruppen. Jeder Punkt spiegelt ein Individuum wieder.
Darüber wurden 3 Tiere vor Ablauf der 24-Wochen mit CO2 euthanasiert, da der Wert der Summe
des in Tab. 1 aufgführten Scores über 6 lag. Der Score diente zur Bestimmung des
41
Allgemeinzustandes der Mäuse und sollte unnötiges Leiden der Tiere vermeiden. Der
Zusammenhang zwischen dem Beobachtungszeitraum und der Anzahl der überlebenden Tiere ist
in Abb.3 dargestellt.
7
Anzahl der Tiere
6
5
4
humanisierte Mäuse nach
CD34+-Transplantation
3
2
1
0
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Wochen nach Transplantation
Abb.3: Kaplan-Maier-Kurve der humanisierten Mäuse im Zeitraum von 0-24 Wochen nach Transplantation von
humanen CD34-Zellen.
Die Ordinatenachse zeigt die Anzahl der Tiere und auf der Abszissenachse ist der Zeitpunkt in Wochen nach der
Transplanation angegeben. Nach 24 Wochen wurde der Versuch beendet.
42
Charakterisierung nach Sepsisinduktion
Aufgrund der starken Änderung der Zusammensetzung der humanen Leukozyten in Abhängigkeit
vom Alter nach der Transplantation ergaben sich vier unterschiedliche Versuchsgruppen zur
Sepsisinduktion. Hierbei wurden Tiere im Alter von 8-10 Wochen entweder der Versuchsgruppe A
oder der Kontrollgruppe A-0 zugewiesen. Tiere im Alter von 15-20 Wochen wurden der
Versuchsgrupe B oder der Kontrollgruppe B-0 zugeteilt. Die Aufteilung in Versuchs- oder
Kontrollgruppe erfolgte randomisiert.
0 mg/kg LPS
8-10 Wochen
Gruppe A-0
Gruppe Aa
Gruppe A
5 mg/kg LPS
Humanisierte
NSG Mäuse
0 mg/kg LPS
Gruppe B-0
Gruppe Bb
15 -20 Wochen
5 mg/kg LPS
Gruppe B
Abb. 4: Zuordnung der Tiere in die jeweiligen Versuchsgruppen.
Tiere, deren Humanisierungsgrad [%huCD45/lebenden Zellen] über 15% lag, wurden in den Versuch aufgenommen. Es
erfolgte die Einteilung nach Alter. Dabei bildeten Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation die Gruppe Aa.
Tiere im Alter von 15-20 Wochen wurden der Gruppe Bb zugeteilt. Es wurde jeweils entweder 5 mg/kg Körpergewicht
LPS in 200 µl NaCl oder 0 mg/kg Körpergewicht LPS in 200 µl NaCl appliziert. Die Tiere, die 5 mg/kg Körpergewicht LPS
erhielten, wurden je nach Ausgangsgruppe entweder mit A oder B bezeichnet und stellen die Versuchsgruppen dar. Die
Tiere der Kontrollgruppen erhielten 0 mg/kg Körpergewicht LPS und wurden je nach Ausgangsgruppe mit A-0 bzw. B-0
bezeichnet.
Die Tiere der Gruppen A und B erhielten 5mg LPS/kg Körpergewicht gelöst in 200 µl NaCl. Die Tiere
der Gruppe A-0 und B-0 erhielten dieselbe Menge NaCl ohne LPS. Nach einem Zeitintervall von 6 h
43
wurden die Tiere euthanasiert und es erfolgte die Aufbereitung von Blut, Milz und Knochenmark
zur FACS-Analyse. Hierbei wurde auf die Betrachtung des prozentualen Anteils der humanen
Leukozyten an der Gesamtzahl der Zellen sowie des prozentuale Anteils von B-Zellen, T-Zellen,
Monozyten, Granulozyten, myeloid-dendritischen Zellen, plasmazytoid-dendritischen Zellen und
hämatopoetischen Vorläuferzellen in den entnommenen Organen wert gelegt. Zusätzlich wurden
die Aktivierungsmarker CD86 und HLA-DR auf Monozyten, mDCs und pDCs im Blut, in der Milz und
im Knochenmark gemessen. Es wurden die entsprechenden Messwerte der Gruppe A und A-0 und
der Gruppe B und B-0 separat verglichen. Zusätzlich wurde das Plasma der Tiere mittels CBA auf
das Vorhandensein von humanen und murinen Zytokinen getestet. Hierbei wurden humanes IL-1,
IL-6, IL-10, INFγ, TNF sowie murines Il-6, IL-10, IL-12/IL-23p40, MCP und TNF betrachtet.
Außerdem wurde in den Gruppen A und A-0 sowie B und B-0 im Plasma der Tiere nach dem
Versuchsende mittels ELISA humanes und murines PTX3 bestimmt.
Charakterisierung der immunologischen Subpopulationen
Aus dem Vergleich der Gruppe A und A-0 ergab sich ein signifikanter Anstieg der B-Zellen im Blut
der Tiere der Gruppe A wie in Abb. 5 dargestellt. Außerdem wurde ein signifikanter Abfall der
Monozyten im Blut der Tiere aus Gruppe A im Vergleich zur Kontrollgruppe A-0 festgestellt (Abb.
5). Andere Zellpopulationen zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen A
und A-0. In Milz oder Knochenmark wurden keine Unterschiede der Zellpopulationen zwischen
Versuchs- und Kontrollgruppe beobachtet.
Blut
a
b
*
10
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
80
60
40
Monozyten [%CD45+]
B Zellen [%CD45+ ]
100
20
0
*
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
8
6
4
2
0
A-0
A-0
A
A
Abb. 5: Darstellung der prozentualen Anteile der B-Zellen (a) und Monozyten (b) im peripheren Blut der Tiere im Alter
von 8-10 Wochen nach Transplantation.
44
Die Abbildung zeigt den prozentualen Anteil der B-Zellen an humanen Leukozyten in Abhängigkeit von der Gruppe (A-0
und A) im Blut der humanisierten NSG Mäuse. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und
untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die
Gabe von LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=17 und in Gruppe A n=22. Das Signifikanzniveau
betrug p=0,02. (b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=17 und in Gruppe A n=22. Das Signifikanzniveau betrug
p< 0,001.
Im Vergleich der Gruppen B und B-0 konnte ein Trend im Anstieg der B-Zellen sowie im Abfall der
Monozyten in Gruppe B registriert werden (Abb. 6). Weiterhin zeigte der Vergleich dieser Gruppen
ein signifikanter Anstieg von CD34+- Zellen in Gruppe B (Abb. 6). Außerdem wurde kein Anstieg
anderer Zellpopulationen in Gruppe B gemessen. Milz und Knochenmark zeigten ebenfalls keine
Veränderung ihrer Zusammensetzung in Gruppe B-0 und Gruppe B.
Blut
a
b
80
60
40
20
0
*
10
5
B
*
4
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
3
2
1
0
0
B-0
5
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
CD34+ [%CD45+]
*
c
15
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
Monozyten [%CD45+]
B Zellen [%CD45+ ]
100
B-0
B
B-0
B
Abb. 6: Darstellung der prozentualen Anteile der B-Zellen (a) , Monozyten (b) und CD34+-Zellen (c) im peripheren Blut
der Tiere im Alter von 15-20 Wochen nach Transplantation.
Die Abbildung zeigt den prozentualen Anteil der B-Zellen an humanen Leukozyten in Abhängigkeit zur Gruppe (B-0 und
B) im Blut der humanisierten NSG Mäuse. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und
untere Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die
Gabe von LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=11 und in Gruppe B n=12. Das Signifikanzniveau
betrug p=0,07. (b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=12 und in Gruppe B n=12. Das Signifikanzniveau betrug
p=0,06. (c) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=11 und in Gruppe B n=12. Das Signifikanzniveau betrug p=0,05.
Charakterisierung der Aktivierung der Subpopulationen
Gruppe A zeigt einen signifikanten Anstieg der Exprimierung des Oberflächenmarkers CD86 auf
Monozyten und mDCs im Blut im Vergleich zur Gruppe A-0, wie in Abb. 7 dargestellt. Es konnte ein
45
Trend in der erhöhten Exprimierung von CD86 auf pDCs im Blut der Tiere aus Gruppe A relativ zur
Gruppe A-0 fesgestellt werden (Abb. 7). Weiterhin wurde eine verstärkte Exprimierung von CD86
auf Monozyten im Knochenmark in Gruppe A im Vergleich zur der Gruppe A-0 gemessen. Es
zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Präsentation weitere Oberflächenmarker in
Blut, Milz und Knochenmark.
Blut
6000
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
*
5000
3000
2000
1000
c
2000
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
*
1500
1000
500
20000
CD86 pDC [Mean Fluoreszenz]
b
CD86 mDC [Mean Fluoreszenz]
CD86 Monozyten [Mean Fluoreszenz]
a
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
0
A-0
A
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
A-0
A
A-0
A
Abb. 7: Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität [Mean Fluoreszenz] von CD86 auf Monozyten (a) , mDCs (b)
und pDCs (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation.
Die Abbildung zeigt die Mean Fluoreszenz Intensität (Mean Fluoreszenz) in Abhängigkeit zur Gruppe (A-0 und A) im
Blut der humanisierten NSG Mäuse. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere
Quartil (box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von
LPS wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=17 und in Gruppe A n=21. Das Signifikanzniveau betrug
p=0,01. (b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=6 und in Gruppe A n=7. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001.
(c) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=6 und in Gruppe A n=7. Das Signifikanzniveau betrug p=0,10.
In den Gruppen der älteren Tiere besteht ein signifikanter Anstieg von CD86 auf pDCs im Blut der
Tiere mit der Versuchsgruppe im Kontrast zu den Tieren der Gruppe B-0 (Abb. 8). CD86 auf mDCs
und Monozyten im Blut zeigen einen Trend in der vermehrten Exprimierung in Gruppe B relativ zur
Kontrollgruppe (Abb. 8). In der Milz wird CD86 auf mDCs der Gruppe B signifikant stärker
präsentiert als in der Gruppe B-0. Dies gilt auch für den Oberflächenmarker HLA-DR auf pDCs im
Knochenmark.
46
Blut
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
3000
2000
1000
0
c
40000
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
30000
20000
10000
8000
6000
4000
2000
0
B-0
B
5000
CD86 pDC [Mean Fluoreszenz]
b
4000
CD86 mDC [Mean Fluoreszenz]
CD86 Monozyten [Mean Fluoreszenz]
a
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
*
4000
3000
2000
1000
0
B-0
B
B-0
B
Abb. 8: Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität [Mean Fluoreszenz] von CD86 auf Monozyten (a) , mDCs (b)
und pDCs (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 15-20 Wochen nach Transplantation.
Die Abbildung zeigt die Mean Fluoreszenz Intensität (Mean Fluoreszenz) in Abhängigkeit zur Gruppe (B-0 und B) im Blut
der humanisierten NSG Mäuse. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil
(box) sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS
wider. (a) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=10 und in Gruppe B n=10. Das Signifikanzniveau betrug p=0,13.
(b) Die Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=9 und in Gruppe B n=10. Das Signifikanzniveau betrug p=0,08. (c) Die
Gruppengröße betrug in Gruppe B-0 n=8 und in Gruppe B n=10. Das Signifikanzniveau betrug p=0,05.
Charakterisierung der Zytokinproduktion
Sowohl in Gruppe A als auch in Gruppe B kam es zu einem signifikanten Anstieg der humanen
Zytokine IL-1, IL-6, IL-10, INFγ und TNF im Kontrast zur jeweiligen Kontrollgruppe A-0 bzw. B-0
(Abb. 9).
47
b
60
*
50
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
6
4
*
400
huIL-1b [pg/ml]
huTNFa [pg/ml]
40
8
c
500
200
100
0
0
*
2000
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
1500
300
2
2500
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
huIFNg [pg/ml]
a
1000
800
600
400
200
A-0
0
A-0
A
d
e40
12000
*
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
6000
A
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
*
30
huIL-10 [pg/ml]
9000
huIL-6 [pg/ml]
A-0
A
20
10
3000
0
0
A-0
A
A-0
A
Abb. 9: Darstellung der Konzentration von humanem TNFα (a) , IL-1β (b) , INFγ (c) , IL-6 (d) und IL-10 (e) im Plasma der
Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation.
Die Abbildung zeigt die Konzentration in pg/ml der jeweiligen Zytokine in Abhängigkeit zur Gruppe (A-0 und A) im
Plasma der humanisierten NSG Mäuse. Es wurden die Daten von Gruppe A-0 und A reprästentativ für beide
Altersgruppen dargestellt. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box)
sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (a)
Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=21. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. (b,d,e) Die
Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=22. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. (c) Die
Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=22. Das Signifikanzniveau betrug p=0,016.
48
Darüberhinaus wurde ein signifikanter Anstieg der murinen Zytokine Il-6, IL-10, MCP und TNF
verzeichnet (Abb. 10). Der Anstieg von murinem IL-12/IL-23p40 nach LPS-Gabe war in beiden
Altersgruppen nicht signifikant.
a
b
*
*
12000
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
9000
1000
muIL-6 [pg/ml]
muTNFa [pg/ml]
1500
500
6000
3000
0
0
A-0
A
A-0
d
c
800
*
200000
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
600
muMCP [pg/ml]
muIL-10 [pg/ml]
A
400
200
*
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
150000
100000
50000
0
0
A-0
A-0
A
A
Abb. 10:Darstellung der Konzentration von murinem TNFα (a) , IL-6 (b) , IL-10 (c) und MCP (d) im Plasma der Tiere im
Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation.
Die Abbildung zeigt die Konzentration in pg/ml der jeweiligen Zytokine in Abhängigkeit von der Gruppe (A-0 und A) im
Plasma der humanisierten NSG Mäuse. Es wurden die Daten von Gruppe A-0 und A reprästentativ für beide
Altersgruppen dargestellt. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box)
sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (ad) Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=23. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001.
Charakterisierung der Produktion von Pentraxin 3
Es stellte sich ein signifikanter Anstieg sowohl von humanem als auch von murinem PTX3 in den
Gruppen A und B bezüglich ihrer entsprechenden Kontrollgruppen A-0 und B-0 heraus. In Abb. 11
49
ist der Anstieg von humanem und murinem PTX3 stellvertretend durch die Tiere der Gruppe A und
A-0 dargestellt.
a
b
1500
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
*
muPTX3 [ng/ml]
huPTX3 [ng/ml]
15
10
5
*
0 mg/kg LPS
5 mg/kg LPS
1000
500
0
0
A-0
A-0
A
A
Abb. 11: Darstellung der Konzentration von humanem PTX3 (a) und murinem PTX3 (b) im Plasma der Tiere im Alter von
8-10 Wochen nach Transplantation.
Die Abbildung zeigt die Konzentration in ng/ml des entsprechenden PTX3 in Abhängigkeit zur Gruppe (A-0 und A) im
Plasma der humanisierten NSG-Mäuse. Es wurden die Daten von Gruppe A-0 und A reprästentativ für beide
Altersgruppen dargestellt. Die Boxplots geben den Median (schwarzer Querbalken), das obere und untere Quartil (box)
sowie die 5. - 95. Perzentile (whiskers) der entsprechenden Gruppe an. Die Legende spiegelt die Gabe von LPS wider. (a)
Die Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=11 und in Gruppe A n=17. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001. (b) Die
Gruppengröße betrug in Gruppe A-0 n=18 und in Gruppe A n=23. Das Signifikanzniveau betrug p<0,001.
50
Diskussion
Die Sepsis sowie der damit verbundene septische Schock stellen in der modernen Medizin noch
immer ein großes Problem dar. Trotz des Einsatzes umfangreicher technischer Hilfsmittel auf
Intensivstationen sowie vorangeschrittener pharmazeutischer Möglichkeiten, ist die schwere
Sepsis ein schlecht zu beherrschendes Problem, was sich in einer hohen Mortalitätsrate
niederschlägt [50]. Hauptursache für die unzureichende Therapie sind die mangelnde Kenntnis der
grundlegenden pathologischen Mechanismen im septischen Geschehen. Tiermodelle eröffnen
dabei den Weg zum Verständnis der Grundlagen. In der Sepsisforschung besteht seit Jahrzehnten
der Wunsch, ein Tiermodell zu entwickeln, das die Verhältnisse im septischen Patienten
widerspiegelt und es darüber hinaus ermöglicht, die gewonnen Ergebnisse vom Tier auf den
Patienten zu übertragen. Es wurden zahlreiche Modelle etabliert, die jedoch bisher nicht in der
Lage waren alle Anforderungen an ein adäquates Tiermodell zu erfüllen [27, 51]. Gerade für die
mangelhafte Übertragung der gewonnen Daten aus Tiermodellen kommt eine große Bedeutung
zu, da im Laufe der Zeit viele neue Therapiemethoden versagten. Die Ergebnisse der
Tierexperimente hielten hierbei dem klinischen Kontext nicht stand [3]. Es ist wichtig, die
Übertragung von Daten aus Tierversuchen zu verbessern, da auf diese Art und Weise potentieller
Schaden von Patienten abgewendet werden kann. Diese Arbeit widmet sich deshalb einer neuen
Form eines Tiermodells, dem der humanisierten Maus. Durch die Transplantation von humanen
CD34-Zellen aus Nabelschnurblut in neugeborene Mäuse des immundefizienten NOD.Cg-Prkd scid
Il2rg tm1Wjl/SzJ – Stammes entwickelt sich in diesen Tieren in einem Zeitraum von 8-20 Wochen ein
menschliches Immunsystem. Da es sich bei der Sepsis um ein vornehmlich immunologisch
vermitteltes Krankheitsbild handelt, stellen diese Tiere verbesserte Ausgangsbedingungen dar.
Unteschiede zwischen Mensch und Maus in der Vermittlung der Immunantwort durch Zytokine
und deren Wirkung auf die Immunzellen, spielen somit eine untergeordnete Rolle. Aufgrund des
unterschiedlichen Anwachsens der humanen Stammzellen kommt es jedoch zwischen den Tieren
zu interindividuellen Unterschieden in der Ausprägung und Funktionalität des humanen
Immunssystems [31]. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung der Reaktion
der einzelnen Immunzellen auf eine Stimulation mit LPS und untersucht, inwieweit die
Immunzellen in der Lage sind, Zytokine und PTX3 zu produzieren. Es wurden dabei Tiere in zwei
verschiedenen Altersgruppen (8-10 Wochen und 15-20 Wochen) untersucht, um einer möglichen
unabgeschlossenen Entwicklung des humanen Immunsystems nach Transplantation Rechnung zu
51
tragen. Damit soll die Arbeit Aufschluss darüber geben, inwieweit sich die humanisierte Maus als
neuartiges Tiermodell zur Erforschung von Sepsis eignet.
Altersunterschiede in der Reaktion auf LPS
Das humane Immunsystem befindet sich im Menschen nicht in einem unveränderlichen Zustand,
sondern unterliegt der ständigen Entwicklung. Zum einen verändert sich die Zusammensetzung
des adaptiven Immunsystem im hohen Alter [52], zum anderem erfolgt nach der Geburt eine
kontinuierliche Entwicklung und Reifung des Immunsystems, die für das Überleben von
entscheidender Bedeutung sind [53–55]. Auch im Kontext der humanisierten Maus, in dem
Stammzellen die Entwicklung eines Immunsystems in einem neugeborenen Individuum bewirken,
liegt der Gedanke an einen progredienten Reifeprozess nahe.
Aufgrund von Vorversuchen und der in der Literatur [39, 56] beschriebenen altersabhängigen
Zusammensetzung der Subpopulationen des humanen Immunsystems in der Maus und der
vergleichbaren Situation der Knochenmarktransplantation im klinischen Alltag [57] wurde in der
vorliegenden Arbeit daher eine Unterteilung der Versuche in zwei Altersgruppen vorgenommen.
Die Einteilung der Altersgruppen stützte sich dabei ebenfalls auf die in Vorversuchen entdeckten
Veränderungen der Zusammensetzung der einzelnen immunologischen Subpopulationen über
einen Zeitraum von 8-24 Wochen. Im klinischen Alltag [57] findet nach der Transplantation von
Knochenmark eine kontinuierliche Reifung des Immunsystems statt. Dazu gehören ein rascher
Anstieg von Granulozyten, NK-Zellen und Monozyten, der zeitnah nach der Transplantation
einsetzt [57]. Die Untersuchung der Entwicklung humanen Lymphozytenpopulationen in
humanisierten Mäusen von Lang et al. [58] beschreiben einen raschen Anstieg der B-Zelllinie sowie
ein verspätetes Auftreten von T-Zellen. Dieses Verhältnis verschiebt sich zu Gunsten der T-Zellen,
sodass im Alter von 20 Wochen vor Allem T-Zellen im Blut zu finden sind. Diese Beschreibung deckt
sich mit den in dieser Arbeit gefundenen Daten.
Da die adaptive Immunantwort einen großen Teil der Immunantwort des Individuums darstellt und
demzufolge keinen bloß unerheblichen Einfluss auf die Immunreaktion auf exogene Reize besitzt,
wurde eine Experimentansatz gewählt, der diese Entwicklung berücksichtigt.
Um dem diffizilen Geschehen der Entwicklung des adaptiven Immunsystems Rechnung zu tragen,
wurde in den folgenden Experimenten die Tiere in zwei unterschiedliche Altersgruppen eingeteilt.
Dabei wurde sich für die Einteilung in eine Gruppe junger Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach
52
Transplantation (Gruppe A und A-0), sowie für eine Gruppe alter Tiere im Alter von 15-20 Wochen
nach Transplantation (Gruppe B und B-0) entschieden. Die Aufstellung der Gruppe A und A-0 ergab
sich aus dem zeitigsten Zeitpunkt einer anzunehmenden Funktionalität der Immunzellen, wie er
auch bei Gille et al. [39] angenommen wurde. Gruppe B und B-0 ergaben sich aus der Annahme
einer Funktionalität von T-Zellen ab 15 Wochen nach Transplantation wie sie Ernst et al. [56]
vornahmen. Das Maximalalter von 20 Wochen ergab sich aus der Verlaufsbeobachtung der sechs
Tiere im Zeitraum von 8-24 Wochen, bei der sich mit steigendem Alter ein zunehmend schlechterer
Allgemeinzustand der Tiere einstellte. Dieser wurde mit Hilfe eines Scoringsystems erfasst. Im Alter
von 20 Wochen musste die Mehrheit der Tiere aufgrund des schlechten Allgemeinzustandes
euthanasiert werden. Aufgrund der im TVV 36/12 deklarierten human endpoints und einer
möglichen Verfälschung künftiger Ergebnisse durch eine nicht repräsentative Ausgangssituation
wurde ein Maximalalter von 20 Wochen festgelegt.
Die differenzierte Betrachtung der Reaktion der humanen Zellpopulationen auf LPS im Bezug auf
das Alter nach Transplantation ergab hierbei einen signifikanten Anstieg (p=0,05; Tab. 5 ) von
CD34-Zellen nach LPS-Gabe im Blut der alten Tiere, der sich in der jungen Population nicht
wiederfindet (Tab. 2). Der Anstieg der CD34-Zellen in der Gruppe der älteren Tiere legt die
Hypothese einer fortlaufende Entwicklung nahe, bei der die Tiere im Alter von 15-20 Wochen
bereits in der Lage sind, CD34-Zellen aus dem Knochenmark als Reaktion auf ein infektiöses
Geschehen freizusetzen. Diese Freisetzung geschieht möglicherweise im Sinne einer Rekrutierung
von Immunzellen, die durch das septische Geschehen vermindert sind [59, 60].
Diese Hypothese wird durch die Ergebnisse von Parravicini [61] gestützt. Dort wird eine verringerte
Bildung verschiedenster Chemokine im Nabelschnurblut Neugeborener im Vergleich zu
peripherem Blut Erwachsener beschreiben. Bei diesen Chemokinen handelt es sich um
Mediatoren, die die Hämatopoese unterstützen.
Bei der altersabhängigen Betrachtung der Exprimierung von Oberflächenmarkern nach LPS-Gabe
wurde ein Trend einer vermehrten Exprimierung von CD86 auf Monozyten, mDCs und pDCs im Blut
in beiden Altersgruppen erkannt (Abb. 7 und Abb. 8). Lediglich die Exprimierung der
Aktivierungsmarker in Milz und Knochenmark divergiert in den Altersgruppen. So zeigten die
jungen Tiere eine verstärktes Auftreten von CD86 auf Monozyten im Knochenmark, wohingegen
die älteren Tiere signifikant mehr CD86 auf mDCs in der Milz und HLA-DR auf pDCs im
Knochenmark präsentierten. Die Unterschiede bezüglich der Oberflächenmarker lassen sich
53
vermutlich vorrangig durch eine unzureichende Entwicklung des humanen Immunsystems zum
Versuchszeitpunkt erklären. Ergebnisse anderer Arbeiten, die sich mit der Exprimierung von
Aktivierungsmarkern nach LPS-Gabe beschäftigen [62], legen in Zusammenschau mit Abreiten an
humanisierten Mäusen [39] nahe, dass die inhomogene Reaktion der Oberflächenmarker in Blut,
Milz und Knochenmark vorrangig Ausdruck der unzureichenden Reifung des humanen
Immunsystems in der Maus darstellt. Ähnlich wie die verringerte Exprimierung von HLA-DR auf
fetalen Monozyten im Blut [63] ist ein Mangel an Aktivierung in Milz und Knochenmark sowohl auf
Monozyten als auch auf mDCs und pDCs denkbar, die sich teilweise aus Monozyten ableiten.Da die
Gruppe der alten Tiere (15-20 Wochen) ebenfalls ein inhomogenes Reaktionsmuster zeigen, ist
davon auszugehen, dass auch zu diesem späteren Zeitpunkt noch nicht von einem vollständig
funktionstüchtigen humanem Immunssystem ausgegangen werden kann. Die in der Arbeit
gewonnen Ergebnisse lassen jedoch diesen Zusammenhang nur vermuten, weshalb eine genauerer
Abklärung mittels verändertem Experimentansatz nötig wäre.
Neben der relativen Zusammensetzung der immunologischen Subpopualationen und der
Aktivierung dieser durch LPS, kann die Produktion von Zytokinen Aufschluss über die Funktionalität
der Immunzellen geben, weshalb zusätzlich der Produktion von humanem IL-1, IL-6, IL-10, INFγ
und TNF und murinem TNF, IL-6, IL-10 und MCP nach LPS-Administration Aufmerksamkeit
geschenkt wurde. Hierbei ergab sich ein Anstieg der Konzentration von humanem IL-1, IL-6, IL10, INFγ und TNF (Abb. 9) sowie von murinem TNF, IL-6, IL-10 und MCP (Abb. 10) nach LPSGabe, der sich in beiden Altersgruppen zeigte. Aufgrund dieser Ergebnisse ist davon auszugehen,
dass die Zellen bereits im Alter von 8-10 Wochen funktionell in der Lage sind, als Antwort auf einen
bestimmten immunologischen Reiz Zytokine zu bilden und dass diese Fähigkeit bis zum Alter von
15-20 Wochen bestehen bleibt.
Da PTX3 als Teil der Pentraxinfamilie [64] in der aktuellen Sepsisforschung als Surrogatmarker zur
Prognose der Sepsis im Patienten Anwendung findet [43](usitaloo-seppälä 2013), wurde sich
neben der Zytokinproduktion auf die altersabhängige Produktion von humanem und murinem
PTX3 konzentriert. Es konnte sowohl bei den jungen als auch bei den alten Tieren ein signifikanter
Anstieg (p< 0,002) der Konzentration von humanem und murinem PTX3 nach LPS-Gabe im
Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet werden (Abb. 11). Die Ergebnisse legen nahe, dass die
humanen Immunzellen bereits im Alter von 8-10 Wochen in der Lage sind, PTX3 zu produzieren
und diese Eigenschaft auch im Alter von 15-20 Wochen ausgeprägt ist.
54
Die Unterschiede zwischen den Altersgruppen beziehen sich demzufolge vor Allem auf die
sepzifische Zellpopulation der CD34-Zellen und die Aktivierung von Monozyten, mDCs und pDCs in
Milz und Knochenmark.
Veränderungen nach LPS-Gabe
Veränderungen des Gehalts der immunologischen Subpopulationen
Wie bereits aus klinischen Studien [65] bekannt und ebenfalls im tierexperimentellen
Zusammenhang festgestellt [28], kommt es während des septischen Geschehens zu einem
extremen Anstieg von Zytokinen, die die Entzündungsreaktion vermitteln. Außerdem ändert sich
die Zusammensetzung der immunologischen Subpopulationen, vorrangig von Monozyten und
Granulozyten [15]. Aber auch andere Subpopulationen, wie B-Zellen, T-Zellen und dendritische
Zellen sind für die Sepsisforschung immer mehr von Interesse [66–69]. Da sich das humane
Immunsystem in der humanisierten Maus zum Teil recht stark in der Vermittlung von
Zytokinreaktionen unterscheidet und eine Funktionalität vor Allem des adaptiven Weges weiterhin
in Frage gestellt wird [56, 70], wurde bei der vorliegenden Arbeit auf die Betrachtung der Reaktion
sowohl der adaptiven als auch angeborenen Subpopulationen Wert gelegt.
Veränderungen der B-Zellen und T-Zellen
Obwohl in der Sepsisforschung seit langem der Schwerpunkt auf der Erforschung des angeborenen
Immunsystems liegt, rückt auch die Betrachtung der Rolle der B- und T-Zellen immer mehr in den
Fokus. Die bisherige Datenlage liefert Ergebnisse bezüglich der Prognoseeinschätzung der Sepsis im
Bezug auf den Abfall von B-Zellen in Patienten mit Sepsis [71]. Das Fehlen von B-Zellen wird dabei
für ein schlechteres Überleben nach Sepsis verantwortlich gemacht [71]. Es wird davon
ausgegangen, dass die Reduktion der B-Zellen unter anderem durch Apoptose zustande kommt
[72]. Experimente an humanisierten Mäusen zeigen jedoch gegensätzliche Ergebnisse. Hier kommt
es nach Stimulation des Immunsystems zu einem Anstieg von B-Zellen [56]. In der vorliegenden
Arbeit wurde ebenfalls ein Anstieg der B-Zellen nach LPS-Stimulation beobachtet, was die
bisherigen Ergebnisse mit Blick auf humanisierte Mäuse unterstützt, jedoch im Kontrast zur klinisch
beschriebenen Datenlage steht. Um diese Spezifität des humanisierten Immunsystems zu erklären,
kommt eine Konstellation der Immunantwort in der humanisierten Maus in Frage, die
möglicherweise eine relative Resistenz der B-Zellen gegenüber LPS bewirkt. Denkbar wäre, dass die
in anderen Arbeiten beschriebene mangelnde Funktionalität der B-Zellen [56, 70] Grund für diese
55
Resistenz sein könnte. Um genaueren Aufschluss über die Situation der B-Zellen in humanisierten
Mäusen und deren Reaktion auf LPS zu gewinnen, wäre ein experimenteller Ansatz denkbar, der
die genauere Charakterisierung der humanen B-Zellen nach LPS-Gabe bezüglich ihres
Reifezustandes mittels Durchflusszytometrie verwirklicht. Ein solcher Ansatz würde den Rahmen
der Arbeit jedoch überschreiten und wurde deshalb nicht weiter verfolgt.
Ähhnlich der B-Zellen [71], eine Verringerung des Gehaltes der T-Zellen während der Sepsis
beschrieben und als ursächlich für die Immunsupression angesehen [73]. Zudem steht in der
Literatur zum einen eine Dysregulation der regulatorischen T-Zellen sowie der CD4 + - und CD8+ -TZellen im Vordergrund [74]. Dabei wird unter anderem eine Erhöhung des Gehalts an
regulatorischen T-Zellen beschrieben, die mit einer Prognoseverschlechterung der Sepsis
einhergeht [75]. Das in der vorliegenden Arbeit dargestellte Ergebnis, welches keine
Veränderungen der T-Zell-Population nach LPS-Gabe im Blut oder anderen Organen erkennen lässt,
muss dabei jedoch im speziellen Kontext der humanisierten Maus betrachtet werden. Durch die
gewünschte fehlende Entwicklung muriner B- und T-Zellen in der NSG-Maus, kommt es zur
inadäquaten Ausbildung sekundärer lymphatischer Organe wie Thymus oder Lymphknoten [31].
Die sekundär lymphatischen Organe stellen jedoch eine essentielle Rolle für die Reifung der TZellen dar, da es hier unter anderem zur Selektion autoreaktiver T-Zellen sowie doppelt positiver
oder doppelt negativer T-Zellen kommt. Von dieser Fehlanlage des Thymus sind nach der
Transplantation ebenfalls die humanen T-Zellen betroffen, weshalb eine unzureichende Reifung
der humanen T-Zellen in einer ungenügenden Repräsentation der T-Zell-Antwort im septischen
Geschehen in der humanisierten Maus mündet. Durch die in der vorliegenden Arbeit
durchgeführten Versuche zur Entwicklung des Gehaltes der T-Zellen in Abhängigkeit vom Alter der
humanisierten Mäuse (Abb. 2) ist ebenfalls eine Unterentwicklung der T-Zellen, wie sie bei
Neugeborenen beschrieben wird [76] auch im Kontext der humanisierten Maus wahrscheinlich.
Veränderungen der CD34-Zellen
CD34-Zellen stellen aufgrund ihrer Eigenschaft als hämatopoetische Vorläuferzelle eine für die
Forschung extrem vielfältige und damit interessante Zellpopulation dar. Durch die mittlerweile im
klinischen Alltag angewandte Knochenmarktransplantation [77], bei der diese Zellgruppe
transplantiert wird, ist das Interesse der Forschung direkt mit dem medizinischen Alltag verknüpft.
Als Ursache für Sepsis wird momentan ein komplexes Netzwerk aus Überreaktion des
Immunsystems durch extreme Zytokinproduktion und damit verbundene Schwächung durch
56
zytokininduzierten Zellverlust beschrieben [15, 72, 16]. Der Gedanke, diesen Zellverlust durch die
Bereitstellung von CD34-Zellen zu beeinflussen und damit eine Stärkung des Immunsystems
hinsichtlich Zellpräsenz zu schaffen, wurde dabei von Brudecki 2011 aufgenommen. In dieser
Arbeit ließ sich durch den Transfer von CD34-Zellen bei Mäusen mit schwerer Sepsis die
Überlebensrate verbessern. Da verschiedene Subpopulationen der Immunzellen im septischen
Geschehen vermindert sind, kann es für den Organismus nützlich sein hämatopoetische
Vorläuferzellen freizusetzen. Diese CD34-Zellen sind in der Lage sich in jede Zelle des
Immunsystems zu entwickeln, weshalb sie einen Zellverlust ausgleichen können. Dies legt den
Gedanken nahe, dass ein vermehrtes Vorhandensein von CD34-Zellen das Überleben verbessert.
Neue Therapieansätze, wie die ex-vivo-Kultivierung und Rücktransplantation von Granulozyten, die
aus CD34-Zellen des Knochenmarks von betroffenen Patienten gewonnen wurden, spiegeln die
allgemeine Auffassung der unterstützenden Wirkung von CD34-Zellen im septischen Geschehen
wider [60]. Der in der vorliegenden Arbeit beschriebene Anstieg von CD34-Zellen nach LPS-Gabe
im Blut der Gruppe der alten Tiere spricht daher für das Freisetzen von CD34-Zellen aus dem
Knochenmark als Reaktion auf ein massives Immungeschehen. Eine ähnliche Reaktion wird bei
starken Entzündungen beobachtet, bei denen sich eine sogenannte Linksverschiebung im Blutbild
von Neutrophilen hin zu Vorläuferzellen manifestieren kann [78].
Veränderung der Granulozyten
Granulozyten wurden bislang als eine der Hauptvermittler des sepsisspezifischen Geschehens
gesehen [16]. Ihnen kommt dabei vor Allem die Aufgabe der Aktivierung der Immunantwort zu, da
sie durch die Detektion und die Einwanderung zum infektiösen Fokus eine Zytokinkaskade in Gang
setzten, die wiederrum andere Zellen des Immunsystems aktiviert [79, 72]. In diesem
Zusammenhang wird im septischen Geschehen eine verstärkte Freisetzung von Granulozyten aus
dem Knochenmark beschrieben [78]. Die vorliegende Arbeit sollte klären, ob der Effekt des
Anstieges der Granulozytenzahl ebenfalls in der humanisierten Maus zu beobachten ist. Der
fehlende Anstieg humaner Granulozyten im peripheren Blut nach LPS-Gabe kann unterschiedliche
Ursachen haben. Am wahrscheinlichsten ist hierbei die für die humanisierte Maus typische
Koexistenz von humanen und murinen Granulozyten Aufschluss zu liefern. Durch die NOD.Cg-Prkd
scid
Il2rg tm1Wjl/SzJ- Mutation wird vor allem die Bildung und Funktion des adaptiven Immunsystems
sowie von NK-Zellen verringert, nicht jedoch die Bildung von Granulozyten. Die Mäuse sind daher
in der Lage, weiterhin Granulozyten zu bilden [80]. Begleitende Versuche, deren Daten in dieser
57
Arbeit nicht aufgeführt sind, liefern hierbei Anhaltspunkte für ein Übergewicht der murinen
Granulozyten. Dieser Sachverhalt wirkt sich nun bei der Reaktion auf einen immunologischen Reiz
aus: Es reagieren nicht auschließlich humane Granulozyten, sondern zusätzlich murine
Granulozyten, da LPS einen relativ unspezifischen Reiz darstellt. Es ist daher vorstellbar, dass die
murinen Granulozyten aufgrund ihrer Überzahl den Großteil der Reaktion übernehmen und die
Reaktion der humanen Granulozyten in diesem Fall in den Hintergrund tritt. Ein anderes
Forschungsgebiet, das sich mit dem angeborenen Teil der Immunantwort beschäftigt, ist die
Allergieforschung. Da Granulozyten zum Teil der angeborenen Immunabwehr zählen, stellt sich
hier dieser Sachverhalt ebenfalls problematisch dar. Aus diesem Grund wird versucht, Modelle
humanisierter Mäuse zu entwickeln, die in der Lage sind funktionale humane Granulozyten zu
bilden [81].
Veränderungen der Monozyten, mDCs und pDCs
Bei der Sepsis handelt es sich um ein Krankheitsbild, dass vorallem durch die angeborene
Immunantwort vermittelt wird. Monozyten gelten neben Granulozyten als wichtigster Vermittler
der Immunreaktion während der Sepsis [8]. Durch das Vorhandensein von TLRs auf ihrer
Oberfläche ermöglichen sie das Erkennen von LPS und anderer pathogen-assozierter molekularer
Muster (PAMPs) [9]. Durch die Aktivierung der Monozyten über TLRs kommt es über verschiedene
Signalwege zur Ausschüttung von Zytokinen, die andere Immunzellen aktivieren und in das Bild
einer Sepsis münden können. In Anbetracht dieser vorrangigen Bedeutung der Monozyten im
septischen Geschehen wurde sich in der vorliegenden Arbeit mit der Veränderung des Gehalts der
Monozyten nach LPS-Applikation beschäftigt. Hierbei wurde ein Abfall der Monozyten
beschrieben, der sich durch die vermehrte Apoptose von Monozyten während der Sepsis erklären
lässt, wie sie sowohl im septischen Patienten [82, 16] als auch in Tiermodellen beschrieben ist [39,
41].
Neben Granulozyten und Monozyten stellen dendritische Zellen einen besonderen Teil der
angeborenen Immunabwehr dar, da im Gegensatz zu diesen in der Lage sind Erreger zu opsonieren
und somit eine direkte Verbindung zur adaptiven Immunantwort darstellen. Im septischen
Geschehen macht sich dieses Zusammenspiel vor Allem im Bezug auf die Supression der
bestehenden Immunreaktion als Teil der Regulation der Immunantwort bemerkbar [83, 67]. Aus
diesem Grund war es von Bedeutung, das Verhalten der dendritischen Zellen in der humanisierten
Maus nach LPS-Gabe zu betrachten.
58
Die beobachtete Stagnation des Gehalts von mDCs und pDCs in beiden Altersgruppen nach LPSGabe im Blut kann verschiedene Ursachen haben. Zum Einen wird ein Anstieg von mDCs durch die
Stimulation mit LPS beschrieben [40], zum Anderen scheint sich diese Expansion laut Riccardi [84],
deren Arbeit sich dendritischen Zellen in septischen Patienten widmet, erst nach einigen Tagen, d.
h. in der antiinflammatorischen Phase des Sepsisgeschehens zu ereignen. Da die
antiinflammatorische Phase unter Anderem durch dendritische Zellen vermitteln wird, ist eine
Expansion der dendritischen Zellen in dieser Phase plausibel [83]. Das in der vorliegenden Arbeit
gewählte Versuchsende 6 h nach LPS-Administration spiegelt jedoch vorrangig die
proinflammatorische Phase wieder, da vor Allem proinflammatorische Zytokine wie u.A. TNFα und
INFγ gebildet werden. Die Kenntnis über die Dominanz der proinflammatorischen Zytokine erklärt
somit die Stagnation des Gehalts der dendritischen Zellpopulation. Eine fehlende Reaktion der
dendritischen Zellen aufgrund Unreife kommt ebenfalls als mögliche Ursache in Betracht, da
beispielsweise zur Reifung von pDCs der Kontakt mit naiven T-Zellen in sekundär lymphatischen
Organen notwendig ist [84], der in der humanisierten Maus aufgrund unzureichender Anlage
erschwert ist [80, 85].
59
Aktivierung der immunologischen Subpopulationen
Einen wichtigen Punkt in der Vermittlung des Immungeschehens stellt unter Anderem die
Kommunikation der Immunzellen untereinander dar. Diese Kommunikation ist Ausgangspunkt für
die gezielte Reaktion des Organismus auf einen bestimmten pathogenen Keim und spielt im
weiteren Verlauf eine Rolle in der Hinabregulation der Immunreaktion nach stattgehabter Infektion
[15]. Als wichtiger Kommunikationspfad dienen hierbei vor Allem Zytokine und Chemokine, die von
den Immunzellen ausgeschüttet werden. Als Zeichen oder Vorraussetzung des Freisetzens der
Zytokine wird eine Zelle aktiviert. Dieser Aktivierungszustand drückt sich in der Expression
spezieller Oberflächenmoleküle aus, die für die Familie einer Zellpopulation spezifisch sind [86].
Die Präsentation dieser Oberflächenmoleküle ist dabei nicht bloßer Ausdruck der Aktivierung,
sondern dient wiederum der Vernetzung und Kommunikation der Zellen unterschiedlicher
immunologischer Zelltypen. Daraufhin regulieren Immunzellen letztendlich nicht nur durch die
Produktion von Zytokinen, sondern auch durch die Exprimierung der Oberflächenmarker das
immunologische Geschehen [62]. In der Sepsisforschung wurde bereits versucht, spezifische
Oberflächenmarker vor Allem auf Monozyten in Kombination mit anderen Surrogatmarkern für die
Differentialdiagnose der Sepsis einzusetzen [45]. Da die Bestimmung von Oberflächenmarkern
mittels Durchflusszytometrie ein relativ gängiges und im klinischen Alltag anwendbares Konzept
darstellt, lag eine Fragestellung der Arbeit ebenfalls auf der Charakterisierung der Exprimierung
spezieller Oberflächenmarker auf Monozyten und dendritischen Zellen. Hierbei wurde die Reaktion
in der humanisierten Maus mit der im menschlichen Organismus beschriebenen Rekation
verglichen:
Die Untersuchung der Aktivierung von Monozyten, mDCs, pDCs in Blut, Milz und Knochenmark
durch Messung der Exprimierung der Oberflächenmoleküle HLA-DR und CD86 (Monozyten, mDcs
und pDCs) im Durchflusszytometer ergaben einen Trend bzw. signifikante Unterschiede in der
verstärkten Präsentation von CD86 auf Monozyten, mDCs und pDCs im Blut nach LPS-Gabe. Dieser
Effekt konnte in beiden Altersgruppen beobachtet werden. In der Literatur wurde das vermehrte
Auftreten von CD86 sowohl auf Monozyten als auch auf dendritischen Zellen beschrieben [67].
Zusätzlich wird während einer Endotoxämie jedoch auch ein Anstieg von HLA-DR beschrieben, der
durch die kostimulatorischen Wirkung von CD86 bedingt ist . Dieser Effekt konnte in dieser Arbeit
nicht gezeigt werden. Ein Ausbleiben des Anstieges von HLA-DR lässt sich jedoch mit den von Jones
2002 beschriebenen Ergebnissen begründen, bei der die Untersuchung von fetalen Monozyten ein
60
grundsätzlich verringertes Vorhandensein von HLA-DR beschreibt. Im Gegenzug wird eine mit
adulten Zellen vergleichbar adäquate Exprimierung von CD86 beschrieben. In Anbetracht der
Tatsache, dass es sich bei der Entstehung des humanen Immunsystems in der Maus um einen
Entwicklungsprozess handelt, liegt der Vergleich mit der Entwicklung in Neugeborenen nahe [56].
Da sich mDCs aus Monozyten entwickeln, wäre es möglich, dass sich die Entwicklung der HLA-DR
und CD86-Expression vergleichbar vollzieht. Eine ähnliche Erklärung ergibt sich für das Verhalten
der pDCs in der vorliegenden Arbeit, die zum Teil monozytäre und zum Teil B- und T-Zell-assozierte
Entwicklungsschritte aufweisen [87, 88].
Die erhöhte Exprimierung von CD86 auf Monozyten im Knochenmark der jüngeren Tiere nach LPSAdministration und die verstärkte Exprimierung von CD86 auf mDCs in der Milz bzw. von HLA-DR
auf pDCs im Knochenmark der älteren Tiere nach LPS-Gabe entsprechen einer Aktivierung der
jeweiligen Zellen in den entsprechenden Organen. Da wenig Material zur Beurteilung der
Aktivierung von Monozyten, mDCs und pDCs in Milz und Knochenmark nach LPS-Gabe vorliegt,
stellt sich eine Interpretation als schwierig dar. Betrachtet man jedoch die Ergebnisse [89, 48, 86],
die sich zur Aktivierung von mDCs, pDCs und Monozyten im peripheren Blut finden und nimmt an,
dass diese sich auch auf die Zellpopulationen in der Milz und im Knochenmark übertragen lassen,
scheint in der humanisierten Maus ein Defizit bezüglich der Aktivierung der Zellpopulationen
vorzuliegen, was im oberen Abschnitt bereits für die Reaktion der Zellen im peripheren Blut
genauer erläutert wurde. Da nur wenig Daten über eine explizite Aufschlüsselung des Verhaltens
von Aktivierungsmarkern nach LPS-Gabe in der humanisierten Maus existiert, können nur
hypothetische Schlüsse gezogen werden, die eine Unreife des humanen Immunsystems und damit
eine inadäquate und inhomogene Reaktion der Monozyten, mDCs und pDCs einschließen [39].
Eine genaue Klärung des Geschehens ist mit den angewandten Methoden nicht möglich, jedoch
würde möglicherweise ein Versuchsansatz, der die Differenzierbarkeit und Aktivierung von
humanen Monozyten, mDCs und pDCs aus humanisierten Mäusen ex vivo einschließt einen
zusätzlichen Erkenntnisgewinn bringen.
61
Produktion von Surrogatmarkern
Produktion humaner Zytokine
Das heutige Verständnis der Sepsis drückt sich in dem typischen Bild einer Überreaktion des
Immunsystems aus. Diese Überreaktion ist zum Eeinen gekennzeichnet durch den Verlust von
Zellen die für die Immunabwehr und die Gerinnung von Bedeutung sind. Als Komplikation einer
Sepsis kann es deshalb unter anderen zur Störung des Gerinnungsprozesses, zur Bildung von
Mikrothromben und einem damit verbundenen Multiorganversagen kommen [13, 14]. Der Verlust
der Immunzellen und die Störung in der Gerinnung sind nach heutiger Aufassung vor Allem einem
enormen Ausmaß an Zytokinfreisetzung zuzuschreiben [15]. Durch die Überproduktion von
Zytokinen, wie TNFα, IL-1β oder INFγ, kommen die regulatorischen Prozesse des Immunsystems,
die die Abwehr des Erregers auf lokaler Ebene steuern sollen, ins Ungleichgewicht, weshalb die
systemische Inflammationsreaktion letztendlich bei dem Auftreten eines Erregers in eine Sepsis
mündet.
Um die Funktionalität der humanen Immunzellen zu überprüfen und den in der Sepsis bekannten
Zytokinsturm darzustellen, erfolgte die Messung der Konzentrationen humaner Zytokine im Plasma
mittels CBA. Sie ergab einen signifikanten Anstieg von IL-1, IL-6, IL-10, INFγ und TNF nach LPSAdministration sowohl in der Gruppe junger als auch in der Gruppe alter Tiere. Die Produktion
proinflammatorischer Zytokine, wie IL-1, IL-6, INFγ und TNF sind sowohl in Tiermodellen [41,
39] als auch im klinischen Kontext [12, 15] bekannt. Der Anstieg von IL-10, welches ein
antiinflammatorisches Zytokin ist, kann den Übergang der endotoxämischen Vorgänge in den
Tieren von dem Zustand der pro- zur antiinflammatorischen Phase widerspiegeln [12]. Die
vergleichsweise niedrige mittlere Konzentration von IL-10 von 7 pg/ml (Gruppe A) bzw. 13,8 pg/ml
(Gruppe B) nach LPS-Gabe im Gegensatz zu den mittleren Konzentrationen der
proinflammatorischen Zytokine (IL-6: 2926 pg/ml [Gruppe A] und 2304 pg/ml [Gruppe B]) legen
die Vermutung nahe, dass es sich jedoch um den Beginn der antiinflammatorischen Phase handelt.
Produktion muriner Zytokine
Durch die residualen Anlagen von murinen Granulozyten und Monozyten [80], die vorrangig für die
Produktion der Zytokine im Entzündungsgeschehen verantwortlich sind, erschien die Frage nach
der Produktion muriner Zytokine als interessanter Teilaspekt der Arbeit. Um einen möglichen
Einfluss des murinen Immunsystems auf die Veränderung der Zytokinproduktion in den Tieren zu
62
untersuchen, wurden die Konzentrationen murinen Zytokine TNF, IL-6, IL-10, MCP und IL-12/IL23p40 mittels CBA im Plasma der Tiere bestimmt. Überraschend war hierbei nicht nur der
signifikante Anstieg von TNF, IL-6, IL-10 und MCP, sondern die zugleich um eine bis zu dreifach
höhere mittlere Konzentration der murinen Zytokine im Vergleich zu entsprechenden humanen
Zytokinen (Tab. 14,Tab. 15) nach LPS-Gabe.
In der Literatur ist die Bildung muriner Zytokine in humanisierten Mäusen noch nicht bekannt. Wie
bereits beschrieben, ist die humanisierte Maus zusätzlich zu humanen Granulozyten und humanen
Monozyten ebenfalls mit murinen Äquivalenten dieser Zellpopulationen ausgestattet. Es ist daher
vorstellbar, dass diese murinen Zellen ebenfalls durch LPS aktiviert werden und eine Auschüttung
muriner Zytokine bewirken. Zu klären bleibt die Frage, ob es sich bei der Reaktion um eine
vornehmlich vom murinen Immunsystem gesteuerte Pathogenese handelt, die anschließend eine
Reaktion der humanen Immunzellen nach sich zieht, oder ob beide Immunsysteme parallel
agieren. Eine Klärung dieser Frage würde die Inkubation humaner Zellen mit murinen Zytokinen
und die anschließende Messung von Aktivierungsmarkern per Durchflusszytometerie ermöglichen.
Die Prüfung der Abhängigkeit der humanen Zytokinproduktion von dem residualen murinen
Immunsystem wäre von Nutzen um optimaleres Tiermodell zu schaffen.
Produktion von humanem und murinem Pentraxin 3
PTX3 gehört gemeinsam mit CRP zur Gruppe der Akut-Phase-Proteine und ermöglicht als
sogenannter löslicher pathogen-pattern-recognition-receptor die Identifikation von pathogenem
Material [90, 91]. Im Gegensatz zu dem in der Medizin seit langer Zeit bekannten CRP ist es nicht
ausschließlich von der Syntheseleistung der Leber abhängig [92], da es von unter Anderem von
den Immunzellen gebildet wird, die sich im Fokus der Infektion befinden. Die damit verbundene
Korrelation zwischen PTX3 und dem infektiösen Fokus hat PTX3 als diagnostischen und vor Allem
prognostischen Marker für Sepsis interessant gemacht. Aufgrund vielversprechender Ergebnisse im
Tierversuch [25] fand PTX3 auch im klinischen Kontext als prognostischer Marker Anwendung.
PTX3 kommt in der Sepsisforschung eine vermehrte Bedeutung zu, da bisherige Ergebnisse aus
klinischen Studien PTX3 als prognostischen Marker nutzen [43, 24]. Um diesen Studien eine
verbesserte tierexperimentelle Grundlage liefern zu können, wurde die Konzentration von
humanem und murinem PTX3 im Plasma der Tiere nach Sepsisinduktion in den Altersgruppen 8-10
Wochen und 15-20 Wochen nach Transplantation bestimmt. Hierbei wurde ein signifikanter
Anstieg von humanem PTX3 in beiden Altersgruppen sowie ebenfalls von murinem PTX3
63
festgestellt. Wie im vorangegangen Abschnitt (murine Ztyokinproduktion nach LPS) beschrieben,
handelt es sich im Vergleich der mittleren Konzentrationen von humanem und murinem PTX3 nach
LPS-Gabe um eine deutlich stärkeren Anstieg von murinem PTX3 nach LPS-Gabe bei ähnlichen
Ausgangskonzentrationen ohne LPS-Gabe (Tab. 18,Tab. 19).
Da PTX3 nach dem heutigen Stand der Wissenschaft vorrangig durch Monozyten und Granulozyten
produziert wird [92], ist ein Anstieg des murinen PTX3 vorallem durch die residuale Anlage muriner
Granulozyten zu vermuten. Nichtsdestotrotz stellt der Nachweis von humanem PTX3 in
humanisierten Mäusen einen Fortschritt dar, mit dem es möglich wird, die Rolle von PTX3 im
septischen Geschehen weiter zu beleuchten und mögliche Therapien von Entzündungen, die sich
auf die Beeinflussung von PTX3 stützen, zu testen. Der Nachweis von murinem PTX3 wiederum
ermöglicht es in der Zusammenschau mit den gemessenen murinen Zytokinen, die residuale
Reaktion des murinen Immunsystems auf LPS einzuschätzen.
64
Zusammenfassung
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
„Induktion einer Endotoxämie in der humanisierten Maus“
eingereicht von:
Johanna Scholbach
angefertigt am:
Institut für Klinische Immunologie, Medizinische Fakultät der Universität Leipzig
betreut von:
Prof. Dr. Ulrich Sack
Dr. Franziska Lange
November 2014
Der Forschungsschwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Charakterisierung des Tiermodelles
der Endotoxämie in der humanisierten Maus. Dabei wurde sich auf die Betrachtung der humanen
immunologischen Subpopulationen der B-Zellen, T-Zellen, Monozyten, dendritischen Zellen und
CD34-Zellen, sowie der Aktivierung von Monozyten und dendritischen Zellen konzentriert.
Weiterhin stand die Produktion humaner und muriner proinflammatorischer und
antiinflammatorischer Zytokine, sowie die Bildung von humanem und murinem Pentraxin 3 im
Fokus. Darüberhinaus wurden die Beobachtungen getrennt nach Altersgruppen vollzogen, im
Sinne des Alters nach Transplantation der CD34-Zellen. Dabei wurde eine Gruppe junger (8-10
Wochen) und alter (15-20 Wochen) Tiere definiert, um eine mögliche Reifung des Immunsystems
im Bezug auf die Endotoxämiereaktion verifizieren zu können. Die Ergebnisse gaben Aufschluss
darüber inwieweit sich die humanisierte Maus als Tiermodell zur Sepsisforschung eignet.
Dabei wurden die gefundenen Ergebnisse der aktuellen Studienlage gegenüber gestellt. Es wurde
sich dabei auf den Vergleich der gefundenen Ergebnisse mit Ergebnissen aus Tiermodellen und
klinischen Studien konzentriert. Aus der Betrachtung ergab sich, dass die humanisierte Maus ein
gutes Modell für die Widerspiegelung des humanes Zytokinprofils darstellt, wie es sich im
septischen Patienten findet. Damit ist ein vereinfachter Transfer von Ergebnissen auf die klinische
65
Situation möglich. Dies unterstützt, zukünftige therapeutische Strategien vor der klinischen
Prüfung besser zu evaluieren, da unerwünschte Nebenwirkungen von Medikamenten im
Tiermodell eher sichtbar wären. Bezüglich der Produktion von humanem Pentraxin 3, das zur
Diskriminierung der Prognosen von septischen Patienten bereits in klinischen Studien Anwendung
findet, dient die humanisierte Maus dazu die Situation im Patienten zu simulieren und eröffnet
damit den Weg zur eingehenden Forschung des Pentraxin 3 in Bezug auf seine Wirkung während
der Sepsis und möglicher therapeutischer Beeinflussbarkeit. Außerdem konnte festgestellt werden,
dass nur in vereinzelten Punkten Unterschiede in der Reaktion der humanisierten Mäuse auf LPS
zwischen den Altersgruppen bestehen. Damit sind kürzere Versuchszeiträume möglich, da die Tiere
schon mit jüngerem Alter in die Experimente aufgenommen werden können.
Nachteile der humanisierten Maus im Bezug auf die Nutzung in der Sepsisforschung liegen vor
Allem in der residualen Anlage muriner Bestandteile des Immunsystems, vornehmlich der
Monozyten und Granulozyten. Durch die Persitenz dieser Zellen, die hauptverantwortlich für das
septische Geschehen zu sein scheinen, ist es schwierig, typische zelluläre Reaktionen, wie die
Aktivierung von Monozyten zu simulieren. Außerdem bleibt die Frage offen, inwieweit das murine
und das humane Immunsystem unabhängig voneinader agieren, was sich in der massiven
Produktion von murinen Zytokinen niederschlägt. Weiterhin sind Komplikationen bei der
Betrachtung der Interaktion von angeborenem und erworbenem Immunsystem bezüglich der
Reaktion auf LPS zu erwarten, da sowohl B- als auch T-Zellen unreif erscheinen. Außerdem bleibt
die Frage zu klären, inwieweit das humane Immunsystems reif entwickelt ist um die sepsistypische
Aktivierung von Monozyten und dendritischen Zellen darzustellen.
Die humanisierte Maus ist zwar nicht in der Lage zelluläre Spezifitäten während der Sepsis optimal
zu repräsentieren. Letztendlich besteht jedoch gegenüber herkömmlichen Tiermodellen ein Vorteil
in der Betrachtung humaner Zytokine und Pentraxin 3. Die humanisierte Maus kann zum besseren
Verständnis der zytokinvermittelten Reaktionen eingesetzt werden, da sie die Reaktion im
Patienten gut widerspiegelt. Außerdem können therapeutische Strategien bezüglich der
Beeinflussung der Zytokinproduktion sowie diagnostische Kriterien aufgrund zytochemischer
Veränderungen mit der humanisierten Maus besser erforscht werden.
66
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 : Vereinfachte Darstellung des Zusammenspiels von Entzündungsreaktion und
Gerinnungskaskade während Sepsis. ................................................................................................11
Abb. 2: Darstellung der prozentualen Anteile von CD45-Zellen an lebenden Zellen (a), B-Zellen an
CD45-Zellen (b) und T-Zellen an CD45-Zellen (c) im zweiwöchigen Zeitintervall 8-24 Wochen nach
Transplantation von humanen CD34-Zellen im Blut der NSG Mäuse. ...............................................40
Abb.3: Kaplan-Maier-Kurve der humanisierten Mäuse im Zeitraum von 0-24 Wochen nach
Transplantation von humanen CD34-Zellen. .....................................................................................41
Abb. 4: Zuordnung der Tiere in die jeweiligen Versuchsgruppen. ....................................................42
Abb. 5: Darstellung der prozentualen Anteile der B-Zellen (a) und Monozyten (b) im peripheren
Blut der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. ......................................................43
Abb. 6: Darstellung der prozentualen Anteile der B-Zellen (a) , Monozyten (b) und CD34+-Zellen (c)
im peripheren Blut der Tiere im Alter von 15-20 Wochen nach Transplantation. ............................44
Abb. 7: Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität [Mean Fluoreszenz] von CD86 auf
Monozyten (a) , mDCs (b) und pDCs (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 8-10 Wochen
nach Transplantation. ........................................................................................................................45
Abb. 8: Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität [Mean Fluoreszenz] von CD86 auf
Monozyten (a) , mDCs (b) und pDCs (c) im peripheren Blut der Tiere im Alter von 15-20 Wochen
nach Transplantation. ........................................................................................................................46
Abb. 9: Darstellung der Konzentration von humanem TNFα (a) , IL-1β (b) , INFγ (c) , IL-6 (d) und IL10 (e) im Plasma der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. ..................................47
Abb. 10: Darstellung der Konzentration von murinem TNFα (a) , IL-6 (b) , IL-10 (c) und MCP (d) im
Plasma der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. .................................................48
Abb. 11: Darstellung der Konzentration von humanem PTX3 (a) und murinem PTX3 (b) im Plasma
der Tiere im Alter von 8-10 Wochen nach Transplantation. ..............................................................49
67
Tabellenverzeichnis
Tab. 1 : Scoringsystem zur Beurteilung des Allgemeinzustandes der NSG Mäuse. ...........................28
Tab. 2 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Blut junger Tiere ............................74
Tab. 3 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen in der Milz junger Tiere......................74
Tab. 4 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Knochenmark junger Tiere ............74
Tab. 5 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Blut alter Tiere...............................75
Tab. 6 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen in der Milz alter Tiere..........................75
Tab. 7 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Knochenmark alter Tiere................76
Tab. 8 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Blut junger Tiere...............................................77
Tab. 9 : Exprimierung von Oberflächenmarkern in der Milz junger Tiere .........................................78
Tab. 10 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Knochenmark junger Tiere.............................79
Tab. 11 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Blut alter Tiere................................................80
Tab. 12 : Exprimierung von Oberflächenmarkern in der Milz alter Tiere...........................................81
Tab. 13 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Knochenmark alter Tiere................................82
Tab. 14 : Konzentration humaner Zytokine im Plasma junger Tiere..................................................83
Tab. 15 : Konzentration muriner Zytokine im Plasma junger Tiere....................................................83
Tab. 16 : Konzentration humaner Zytokine im Plasma alter Tiere.....................................................83
Tab. 17 : Konzentration muriner Zytokine im Plasma junger Tiere....................................................83
Tab. 18 : Konzentration von PTX3 im Plasma junger Tiere.................................................................84
Tab. 19 : Konzentration von PTX3 im Plasma alter Tiere....................................................................84
68
Literaturverzeichnis
[1] Bone R. C.: Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative
therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of
Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. CHEST Journal 101, 1644 (1992).
[2] Engel C., Brunkhorst F. M., Bone H.-G., Brunkhorst R., Gerlach H., Grond S., Gruendling M.,
Huhle G., Jaschinski U., John S., Mayer K., Oppert M., Olthoff D., Quintel M., Ragaller M.,
Rossaint R., Stuber F., Weiler N., Welte T., Bogatsch H., Hartog C., Loeffler M., Reinhart K.:
Epidemiology of sepsis in Germany: results from a national prospective multicenter study.
Intensive Care Medicine 33, 606–618 (2007).
[3] Riedemann N. C., Guo R.-F., Ward P. A.: The enigma of sepsis. The Journal of clinical
investigation 112, 460–467 (2003).
[4] Remick D. G., Ward P. A.: EVALUATION OF ENDOTOXIN MODELS FOR THE STUDY OF SEPSIS.
Shock 24, 7–11 (2005).
[5] Mestas J., Hughes, Christopher C W: Of mice and not men: differences between mouse and
human immunology. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 172, 2731–2738 (2004).
[6] Dyson A., Singer M.: Animal models of sepsis: Why does preclinical efficacy fail to translate to
the clinical setting? Critical Care Medicine 37, S30 (2009).
[7] Ulloa L., Brunner M., Ramos L., Deitch E. A.: Scientific and clinical challenges in sepsis. Current
pharmaceutical design 15, 1918–1935 (2009).
[8] Huang X., Venet F., Wang Y. L., Lepape A., Yuan Z., Chen Y., Swan R., Kherouf H., Monneret G.,
Chung C.-S., Ayala A.: PD-1 expression by macrophages plays a pathologic role in altering
microbial clearance and the innate inflammatory response to sepsis. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 106, 6303–6308 (2009).
[9] Wittebole X., Castanares-Zapatero D., Laterre P. F.: Toll-like Receptor 4 Modulation as a
Strategy to Treat Sepsis. Mediators of Inflammation 2010, 1–9 (2010).
[10]Weighardt H., Holzmann B.: Role of Toll-like receptor responses for sepsis pathogenesis.
Immunobiology 212, 715–722 (2008).
[11]Heine H., Rietschel E. T., Ulmer A. J.: The biology of endotoxin. Molecular biotechnology 19,
279–296 (2001).
[12]Faix J. D.: Biomarkers of sepsis*. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 50, 23–36
(2013).
[13]Opitz B., Eitel J., Meixenberger K., Suttorp N.: Role of Toll-like receptors, NOD-like receptors and
RIG-I-like receptors in endothelial cells and systemic infections. Thrombosis and Haemostasis
(2009).
[14]Ahamed J., Niessen F., Kurokawa T., Lee Y. K., Bhattacharjee G., Morrissey J. H., Ruf W.:
Regulation of macrophage procoagulant responses by the tissue factor cytoplasmic domain in
endotoxemia. Blood 109, 5251–5259 (2007).
[15]Cinel I., Opal S. M.: Molecular biology of inflammation and sepsis: A primer*. Critical Care
Medicine 37, 291–304 (2009).
[16]Annane D., Bellissant E., Cavaillon J.-M.: Septic shock. The Lancet 365, 63–78 (2005).
[17]Markiewski M. M., DeAngelis R. A., Lambris J. D.: Complexity of complement activation in
sepsis. Journal of Cellular and Molecular Medicine 12, 2245–2254 (2008).
[18]Westh H., Lisby G., Breysse F., Böddinghaus B., Chomarat M., Gant V., Goglio A., Raglio A.,
Schuster H., Stuber F., Wissing H., Hoeft A.: Multiplex real-time PCR and blood culture for
identification of bloodstream pathogens in patients with suspected sepsis. Clinical
69
Microbiology and Infection 15, 544–551 (2009).
[19]Schmitz R. P., Keller P. M., Baier M., Hagel S., Pletz M. W., Brunkhorst F. M.: Quality of blood
culture testing - a survey in intensive care units and microbiological laboratories across four
European countries. Critical care (London, England) 17, R248 (2013).
[20]Silvestre J., Póvoa P., Coelho L., Almeida E., Moreira P., Fernandes A., Mealha R., Sabino H.: Is Creactive protein a good prognostic marker in septic patients? Intensive Care Medicine 35, 909–
913 (2009).
[21]Müller B., Becker K. L.: Procalcitonin: how a hormone became a marker and mediator of sepsis.
Swiss medical weekly 131, 595–602 (2001).
[22]Kretzschmar M., Krüger A., Schirrmeister W.: Procalcitonin following elective partial liver
resection--origin from the liver? Acta anaesthesiologica Scandinavica 45, 1162–1167 (2001).
[23]Zhang H., Damas P., Preiser J.-C.: The long way of biomarkers: from bench to bedside. Intensive
Care Medicine 36, 565–566 (2010).
[24]Bastrup-Birk S., Skjoedt M.-O., Munthe-Fog L., Strom J. J., Ma Y. J., Garred P., Caldwell C. C.:
Pentraxin-3 Serum Levels Are Associated with Disease Severity and Mortality in Patients with
Systemic Inflammatory Response Syndrome. PLoS ONE 8, e73119 (2013).
[25]He X., Han B., Bai X., Zhang Y., Cypel M., Mura M., Keshavjee S., Liu M.: PTX3 as a potential
biomarker of acute lung injury: supporting evidence from animal experimentation. Intensive
Care Medicine 36, 356–364 (2010).
[26]Poli-de-Figueiredo L. F., Garrido A. G., Nakagawa N., Sannomiya P.: Experimental models of
sepsis and their clinical relevance. Shock (Augusta, Ga.) 30 Suppl 1, 53–59 (2008).
[27]Buras J. A., Holzmann B., Sitkovsky M.: Model organisms: Animal Models of sepsis: setting the
stage. Nature Reviews Drug Discovery 4, 854–865 (2005).
[28]Fink M. P.: Animal models of sepsis and its complications. Kidney International 74, 991–993
(2008).
[29]Seok J., Warren H. S., Cuenca A. G., Mindrinos M. N., Baker H. V., Xu W., Richards D. R.,
McDonald-Smith G. P., Gao H., Hennessy L., Finnerty C. C., Lopez C. M., Honari S., Moore E. E.,
Minei J. P., Cuschieri J., Bankey P. E., Johnson J. L., Sperry J., Nathens A. B., Billiar T. R., West M.
A., Jeschke M. G., Klein M. B., Gamelli R. L., Gibran N. S., Brownstein B. H., Miller-Graziano C.,
Calvano S. E., Mason P. H., Cobb J. P., Rahme L. G., Lowry S. F., Maier R. V., Moldawer L. L.,
Herndon D. N., Davis R. W., Xiao W., Tompkins R. G., Abouhamze A., Balis U. G. J., Camp D. G.,
De A. K., Harbrecht B. G., Hayden D. L., Kaushal A., O'Keefe G. E., Kotz K. T., Qian W., Schoenfeld
D. A., Shapiro M. B., Silver G. M., Smith R. D., Storey J. D., Tibshirani R., Toner M., Wilhelmy J.,
Wispelwey B., Wong W. H.: Genomic responses in mouse models poorly mimic human
inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences 110, 3507–3512
(2013).
[30]Macchiarini F., Manz M. G., Palucka A. K., Shultz L. D.: Humanized mice: are we there yet? The
Journal of experimental medicine 202, 1307–1311 (2005).
[31]Shultz L. D., Brehm M. A., Bavari S., Greiner D. L.: Humanized mice as a preclinical tool for
infectious disease and biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences 1245,
50–54 (2011).
[32]Wege A. K., Ernst W., Eckl J., Frankenberger B., Vollmann-Zwerenz A., Männel D. N., Ortmann
O., Kroemer A., Brockhoff G.: Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate
the immune response in advanced cancer therapy. International journal of cancer. Journal
international du cancer 129, 2194–2206 (2011).
[33]Zhang L., Meissner E., Chen J., Su L.: Current humanized mouse models for studying human
immunology and HIV-1 immuno-pathogenesis. Science China Life Sciences 53, 195–203 (2010).
70
[34]King M., Pearson T., Rossini A. A., Shultz L. D., Greiner D. L.: Humanized Mice for the Study of
Type 1 Diabetes and Beta Cell Function. Annals of the New York Academy of Sciences 1150,
46–53 (2008).
[35]Shultz L. D., Ishikawa F., Greiner D. L.: Humanized mice in translational biomedical research.
Nature Reviews Immunology 7, 118–130 (2007).
[36]Pearson T., Greiner D. L., Shultz L. D.: Creation of "humanized" mice to study human immunity.
Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan … [et al.] Chapter 15, Unit 15.21
(2008).
[37]Bility M. T., Cheng L., Zhang Z., Luan Y., Li F., Chi L., Zhang L., Tu Z., Gao Y., Fu Y., Niu J., Wang F.,
Su L., Walker C. M.: Hepatitis B Virus Infection and Immunopathogenesis in a Humanized
Mouse Model: Induction of Human-Specific Liver Fibrosis and M2-Like Macrophages. PLoS
Pathogens 10, e1004032 (2014).
[38]Terahara K., Ishige M., Ikeno S., Mitsuki Y.-y., Okada S., Kobayashi K., Tsunetsugu-Yokota Y.,
Speck R. F.: Expansion of Activated Memory CD4+ T Cells Affects Infectivity of CCR5-Tropic HIV1 in Humanized NOD/SCID/JAK3null Mice. PLoS ONE 8, e53495 (2013).
[39]Gille C., Orlikowsky T. W., Spring B., Hartwig U. F., Wilhelm A., Wirth A., Goecke B.,
Handgretinger R., Poets C. F., André M. C.: Monocytes derived from humanized neonatal
NOD/SCID/IL2Rγnull mice are phenotypically immature and exhibit functional impairments.
Human Immunology 73, 346–354 (2012).
[40]Cravens P. D., Melkus M. W., Padgett-Thomas A., Islas-Ohlmayer M., del P. Martin M., Garcia J.
V.: Development and Activation of Human Dendritic Cells In Vivo in a Xenograft Model of
Human Hematopoiesis. Stem Cells 23, 264–278 (2005).
[41]Unsinger J., McDonough J. S., Shultz L. D., Ferguson T. A., Hotchkiss R. S.: Sepsis-induced human
lymphocyte apoptosis and cytokine production in "humanized" mice. Journal of Leukocyte
Biology 86, 219–227 (2009).
[42]Aalto H., Takala A., Kautiainen H., Repo H.: Laboratory markers of systemic inflammation as
predictors of bloodstream infection in acutely ill patients admitted to hospital in medical
emergency. European journal of clinical microbiology & infectious diseases : official publication
of the European Society of Clinical Microbiology 23, 699–704 (2004).
[43]Uusitalo-Seppälä R., Huttunen R., Aittoniemi J., Koskinen P., Leino A., Vahlberg T., Rintala E. M.,
Rottman M.: Pentraxin 3 (PTX3) Is Associated with Severe Sepsis and Fatal Disease in
Emergency Room Patients with Suspected Infection: A Prospective Cohort Study. PLoS ONE 8,
e53661 (2013).
[44]Tanaka S., Saito Y., Kunisawa J., Kurashima Y., Wake T., Suzuki N., Shultz L. D., Kiyono H.,
Ishikawa F.: Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic
Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology 188, 6145–6155
(2012).
[45]Christaki E., Giamarellos-Bourboulis E.: The beginning of personalized medicine in sepsis: small
steps to a bright future. Clinical Genetics, n/a (2014).
[46]Gomez H. G., Gonzalez S. M., Londoño J. M., Hoyos N. A., Niño C. D., Leon A. L., Velilla P. A.,
Rugeles M. T., Jaimes F. A.: Immunological Characterization of Compensatory AntiInflammatory Response Syndrome in Patients With Severe Sepsis. Critical Care Medicine 42,
771–780 (2014).
[47]Gordon S.: Alternative activation of macrophages. Nature Reviews Immunology 3, 23–35
(2003).
[48]Frei R., Steinle J., Birchler T., Loeliger S., Roduit C., Steinhoff D., Seibl R., Büchner K., Seger R.,
Reith W., Lauener R. P., Means T.: MHC Class II Molecules Enhance Toll-Like Receptor Mediated
71
Innate Immune Responses. PLoS ONE 5, e8808 (2010).
[49]Nolan A., Kobayashi H., Naveed B., Kelly A., Hoshino Y., Hoshino S., Karulf M. R., Rom W. N.,
Weiden M. D., Gold J. A., Unutmaz D.: Differential Role for CD80 and CD86 in the Regulation of
the Innate Immune Response in Murine Polymicrobial Sepsis. PLoS ONE 4, e6600 (2009).
[50]Angus D. C., Linde-Zwirble W. T., Lidicker J., Clermont G., Carcillo J., Pinsky M. R.: Epidemiology
of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of
care. Critical care medicine 29, 1303–1310 (2001).
[51]Fink M. P.: Animal models of sepsis. Virulence 5, 143–153 (2014).
[52]Sansoni P., Vescovini R., Fagnoni F., Biasini C., Zanni F., Zanlari L., Telera A., Lucchini G., Passeri
G., Monti D., Franceschi C., Passeri M.: The immune system in extreme longevity. Experimental
gerontology 43, 61–65 (2008).
[53]Marshall-Clarke S., Reen D., Tasker L., Hassan J.: Neonatal immunity: how well has it grown up?
Immunology today 21, 35–41 (2000).
[54]Bui, Kim Chi T., Weems M., Biniwale M., George A. A., Zielinska E., Azen C. G., Durand M.,
Abdel-Azim H.: Circulating hematopoietic and endothelial progenitor cells in newborn infants:
Effects of gestational age, postnatal age and clinical stress in the first 3weeks of life. Early
Human Development 89, 411–418 (2013).
[55]Lipstein E. A., Vorono S., Browning M. F., Green N. S., Kemper A. R., Knapp A. A., Prosser L. A.,
Perrin J. M.: Systematic Evidence Review of Newborn Screening and Treatment of Severe
Combined Immunodeficiency. PEDIATRICS 125, e1226 (2010).
[56]Ernst W., Zimara N., Hanses F., Mannel D. N., Seelbach-Gobel B., Wege A. K.: Humanized Mice,
a New Model To Study the Influence of Drug Treatment on Neonatal Sepsis. Infection and
Immunity 81, 1520–1531 (2013).
[57]Storek J., Geddes M., Khan F., Huard B., Helg C., Chalandon Y., Passweg J., Roosnek E.:
Reconstitution of the immune system after hematopoietic stem cell transplantation in humans.
Seminars in immunopathology 30, 425–437 (2008).
[58]Lang J., Kelly M., Freed B. M., McCarter M. D., Kedl R. M., Torres R. M., Pelanda R.: Studies of
Lymphocyte Reconstitution in a Humanized Mouse Model Reveal a Requirement of T Cells for
Human B Cell Maturation. The Journal of Immunology 190, 2090–2101 (2013).
[59]Brudecki L., Ferguson D. A., Yin D., Lesage G. D., McCall C. E., El Gazzar M.: Hematopoietic
Stem-Progenitor Cells Restore Immunoreactivity and Improve Survival in Late Sepsis. Infection
and Immunity 80, 602–611 (2012).
[60]Dick E. P., Prince L. R., Sabroe I.: Ex Vivo-Expanded Bone Marrow CD34 + Derived Neutrophils
Have Limited Bactericidal Ability. STEM CELLS 26, 2552–2563 (2008).
[61]Parravicini E., van de Ven, Carmella, Anderson L., Cairo M. S.: Myeloid hematopoietic growth
factors and their role in prevention and/or treatment of neonatal sepsis. Transfusion medicine
reviews 16, 11–24 (2002).
[62]Rutkowski R., Moniuszko T., Stasiak-Barmuta A., Kosztyła-Hojna B., Alifier M., Rutkowski K.,
Tatarczuk-Krawiel A.: CD80 and CD86 expression on LPS-stimulated monocytes and the effect
of CD80 and CD86 blockade on IL-4 and IFN-gamma production in nonatopic bronchial asthma.
Archivum immunologiae et therapiae experimentalis 51, 421–428 (2003).
[63]Jones C. A., Holloway J. A., Warner J. O.: Phenotype of fetal monocytes and B lymphocytes
during the third trimester of pregnancy. Journal of reproductive immunology 56, 45–60 (2002).
[64]Bottazzi B., Doni A., Garlanda C., Mantovani A.: An Integrated View of Humoral Innate
Immunity: Pentraxins as a Paradigm. Annual Review of Immunology 28, 157–183 (2010).
[65]Cavaillon J.-M., Adib-conquy M., Fitting C., Adrie C., Payen D.: Cytokine Cascade in Sepsis.
Scandinavian Journal of Infectious Diseases 35, 535–544 (2003).
72
[66]Faivre V., Lukaszewicz A. C., Alves A., Charron D., Payen D., Haziot A., Appel S.: Human
Monocytes Differentiate into Dendritic Cells Subsets that Induce Anergic and Regulatory T Cells
in Sepsis. PLoS ONE 7, e47209 (2012).
[67]Flohe S. B.: Dendritic cells during polymicrobial sepsis rapidly mature but fail to initiate a
protective Th1-type immune response. Journal of Leukocyte Biology 79, 473–481 (2005).
[68]Musie E., Moore C. C., Martin E. N., Scheld W. M., Caldwell C. C.: Toll-Like Receptor 4
Stimulation before or after Streptococcus pneumoniae Induced Sepsis Improves Survival and Is
Dependent on T-Cells. PLoS ONE 9, e86015 (2014).
[69]Iwasaki A., Medzhitov R.: Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nature
Immunology 5, 987–995 (2004).
[70]McDermott S. P., Eppert K., Lechman E. R., Doedens M., Dick J. E.: Comparison of human cord
blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood 116, 193–200 (2010).
[71]Park S. H., Park B. G., Park C.-J., Kim S., Kim D.-H., Jang S., Hong S.-K., Chi H.-S.: An extended
leukocyte differential count (16 types of circulating leukocytes) using the cytodiff flow
cytometric system can provide information for the discrimination of sepsis severity and
prediction of outcome in sepsis patients. Cytometry Part B: Clinical Cytometry 86, 244–256
(2014).
[72]Fullerton J. N., O'Brien A. J., Gilroy D. W.: Pathways mediating resolution of inflammation: when
enough is too much. The Journal of Pathology 231, 8–20 (2013).
[73]Condotta S. A., Cabrera-Perez J., Badovinac V. P., Griffith T. S.: T-cell-mediated immunity and
the role of TRAIL in sepsis-induced immunosuppression. Critical reviews in immunology 33,
23–40 (2013).
[74]Yang X., Hu B., Sun R., Chen J.: Deregulation of T cell response in sepsis. Frontiers in bioscience
(Landmark edition) 19, 1370–1376 (2014).
[75]Huang L.-f., Yao Y.-m., Dong N., Yu Y., He L.-x., Sheng Z.-y.: Association between regulatory T
cell activity and sepsis and outcome of severely burned patients: a prospective, observational
study. Critical Care 14, R3 (2010).
[76]Hodge G., Hodge S., Han P., Haslam R.: Multiple leucocyte activation markers to detect
neonatal infection. Clinical and experimental immunology 135, 125–129 (2004).
[77]Bemark M., Holmqvist J., Abrahamsson J., Mellgren K.: Translational Mini-Review Series on B
cell subsets in disease. Reconstitution after haematopoietic stem cell transplantation revelation of B cell developmental pathways and lineage phenotypes. Clinical & Experimental
Immunology 167, 15–25 (2012).
[78]Delano M. J., Kelly-Scumpia K. M., Thayer T. C., Winfield R. D., Scumpia P. O., Cuenca A. G.,
Harrington P. B., O'Malley K. A., Warner E., Gabrilovich S., Mathews C. E., Laface D., Heyworth
P. G., Ramphal R., Strieter R. M., Moldawer L. L., Efron P. A.: Neutrophil Mobilization from the
Bone Marrow during Polymicrobial Sepsis Is Dependent on CXCL12 Signaling. The Journal of
Immunology 187, 911–918 (2011).
[79]Alves-Filho J. C., Freitas A. de, Spiller F., Souto F. O., Cunha F. Q.: THE ROLE OF NEUTROPHILS IN
SEVERE SEPSIS. Shock 30, 3–9 (2008).
[80]Manz M. G.: Human-Hemato-Lymphoid-System Mice: Opportunities and Challenges. Immunity
26, 537–541 (2007).
[81]Ito R., Takahashi T., Katano I., Kawai K., Kamisako T., Ogura T., Ida-Tanaka M., Suemizu H.,
Nunomura S., Ra C., Mori A., Aiso S., Ito M.: Establishment of a Human Allergy Model Using
Human IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. The Journal of Immunology 191, 2890–2899
(2013).
[82]de Werra I: 2001 03 CD14 expression on monocytes and TNFa production in patients with
73
septic shock, cardiogenic shock or bacterial pneumonia.
[83]Kushwah R., Wu J., Oliver J. R., Jiang G., Zhang J., Siminovitch K. A., Hu J.: Uptake of apoptotic
DC converts immature DC into tolerogenic DC that induce differentiation of Foxp3+ Treg.
European Journal of Immunology 40, 1022–1035 (2010).
[84]Riccardi F., Della Porta, Matteo G., Rovati B., Casazza A., Radolovich D., Amici M. de, Danova
M., Langer M.: Flow cytometric analysis of peripheral blood dendritic cells in patients with
severe sepsis. Cytometry Part B: Clinical Cytometry 80B, 14–21 (2011).
[85]Legrand N., Weijer K., Spits H.: Experimental Models to Study Development and Function of
the Human Immune System In Vivo. The Journal of Immunology 176, 2053–2058 (2006).
[86]Janols H., Wullt M., Bergenfelz C., Björnsson S., Lickei H., Janciauskiene S., Leandersson K.,
Bredberg A.: Heterogeneity among septic shock patients in a set of immunoregulatory
markers. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 33, 313–324 (2014).
[87]Cao W.: Molecular Characterization of Human Plasmacytoid Dendritic Cells. Journal of Clinical
Immunology 29, 257–264 (2009).
[88]Jegalian A. G., Facchetti F., Jaffe E. S.: Plasmacytoid dendritic cells: physiologic roles and
pathologic states. Advances in anatomic pathology 16, 392–404 (2009).
[89]Haveman J. W., Muller Kobold, A C, Tervaert J. W., van den Berg, A P, Tulleken J. E., Kallenberg
C. G., The T. H.: The central role of monocytes in the pathogenesis of sepsis: consequences for
immunomonitoring and treatment. The Netherlands journal of medicine 55, 132–141 (1999).
[90]Inforzato A., Jaillon S., Moalli F., Barbati E., Bonavita E., Bottazzi B., Mantovani A., Garlanda C.:
The long pentraxin PTX3 at the crossroads between innate immunity and tissue remodelling.
Tissue Antigens 77, 271–282 (2011).
[91]Huttunen R., Hurme M., Aittoniemi J., Huhtala H., Vuento R., Laine J., Jylhävä J., Syrjänen J.:
High plasma level of long pentraxin 3 (PTX3) is associated with fatal disease in bacteremic
patients: a prospective cohort study. PLoS ONE 6, e17653 (2011).
[92]Deban L., Jaillon S., Garlanda C., Bottazzi B., Mantovani A.: Pentraxins in innate immunity:
lessons from PTX3. Cell and tissue research 343, 237–249 (2011).
74
Anlagen
Blut
CD45+-Zellen
B-Zellen
T-Zellen
Monozyten
mDCs
pDCs
Granulozyten
CD34+-Zellen
n
17
17
17
17
6
6
18
4
Gruppe A-0
Mean [%]
34.11
62.09
12.30
4.93
2.83
0.96
5.34
2.93
StDev [%]
14.28
12.26
10.26
2.26
4.23
1.06
7.08
3.27
n
22
22
22
22
8
8
22
5
Gruppe A
Mean [%]
43.90
75.53
7.52
1.04
1.24
0.28
4.67
5.36
StDev [%]
18.59
13.04
7.35
1.33
2.18
0.39
4.98
3.16
p
0.08
0.02
0.13
<0.001
0.49
0.2
0.99
0.19
Tab. 2 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Blut junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im
Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen,
Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse des Blutes der
Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0
und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Milz
CD45+-Zellen
B-Zellen
T-Zellen
Monozyten
mDCs
pDCs
Granulozyten
CD34+-Zellen
n
14
14
14
13
6
6
13
4
Gruppe A-0
Mean [%]
65.11
68.14
8.35
3.15
1.40
0.78
5.11
2.25
StDev [%]
13.31
22.75
8.28
2.50
0.83
0.29
6.63
1.95
n
16
16
16
15
8
8
16
5
Gruppe A
Mean [%]
58.73
68.88
8.74
3.56
1.93
0.90
5.99
3.24
StDev [%]
20.35
14.88
9.35
3.51
1.55
0.56
11.32
1.64
p
0.326
0.603
0.835
0.835
0.468
0.468
0.895
0.435
Tab. 3 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen in der Milz junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im
Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen,
Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse der Milz der
Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0
und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
75
76
Knochenmark
CD45+-Zellen
B-Zellen
T-Zellen
Monozyten
mDCs
pDCs
Granulozyten
CD34+-Zellen
n
14
12
12
13
5
5
12
4
Gruppe A-0
Mean [%]
64.21
74.31
0.43
3.78
0.66
1.58
4.03
6.43
StDev [%]
13.74
10.51
0.87
2.22
0.46
1.35
5.86
4.37
Gruppe A
Mean [%]
69.35
73.87
1.53
3.94
1.05
1.22
4.88
7.68
n
16
16
16
16
8
8
16
5
StDev [%]
13.06
8.64
3.56
2.44
1.11
1.29
6.61
3.55
p
0.289
0.904
0.98
0.85
0.482
0.435
0.926
0.648
Tab. 4 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Knochenmark junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im
Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen,
Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse des Knochenmarks
der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Blut
CD45+-Zellen
B-Zellen
T-Zellen
Monozyten
mDCs
pDCs
Granulozyten
CD34+-Zellen
n
12
11
11
12
12
12
10
11
Gruppe B-0
Mean [%]
49.07
40.31
37.47
4.36
2.24
1.82
7.21
1.12
StDev [%]
21.78
23.14
19.78
2.82
2.16
2.09
9.74
1.43
n
10
12
12
12
12
12
11
12
Gruppe B
Mean [%]
39.10
56.58
24.06
2.44
1.07
1.21
8.38
2.17
StDev [%]
12.72
11.75
11.97
3.11
0.76
1.45
7.23
1.57
p
0.22
0.07
0.06
0.057
0.28
0.56
0.42
0.05
Tab. 5 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Blut alter Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im
Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen,
Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse des Blutes der
Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0
und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Milz
CD45+-Zellen
B-Zellen
T-Zellen
Monozyten
mDCs
pDCs
Granulozyten
CD34+-Zellen
n
12
12
12
12
12
12
12
12
Gruppe B-0
Mean [%]
73.74
58.36
28.20
3.74
0.61
0.33
3.27
1.85
StDev [%]
17.99
20.47
19.99
4.94
0.58
0.32
3.92
1.59
n
14
12
13
12
11
12
11
12
Gruppe B
Mean [%]
63.69
61.08
20.58
3.83
0.32
0.38
2.33
1.92
StDev [%]
16.68
14.93
12.03
4.90
0.15
0.27
2.42
1.50
p
0.106
0.714
0.255
0.977
0.249
0.69
0.781
0.862
Tab. 6 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen in der Milz alter Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im
Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen,
77
Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse der Milz der
Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0
und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Knochenmark
CD45+-Zellen
B-Zellen
T-Zellen
Monozyten
mDCs
pDCs
Granulozyten
CD34+-Zellen
n
12
12
12
12
12
12
12
12
Gruppe B-0
Mean [%]
58.72
57.20
9.06
3.01
2.34
2.79
6.05
6.92
StDev [%]
23.15
15.94
9.56
1.77
2.13
2.97
5.76
3.86
n
12
11
11
10
12
12
11
12
Gruppe B
Mean [%]
46.59
60.71
5.55
5.33
1.62
1.34
6.89
5.46
StDev [%]
27.07
20.51
10.86
4.77
1.59
1.19
9.22
3.68
p
0.251
0.65
0.196
0.07
0.272
0.355
0.518
0.354
Tab. 7 : Verteilung der immunologischen Subpopulationen im Knochenmark alter Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im
Bezug auf den prozentualen Anteil der humanen CD45+- Zellen an lebenden Zellen bzw. der humanen B-Zellen, T-Zellen,
Monozyten, mDCs, pDCs, Granulozyten und CD34+-Zellen an humanen Leukozyten der FACS-Analyse des Knochenmarks
der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
78
Blut
n
Gruppe A-0
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
n
Gruppe A
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
p
HLA-DR
Monozyten
17
42164
43218
22
71216
55988
0.074
CD86
Monozyten
17
773
488
21
1516
1063
0,011
HLA-DR
mDCs
6
90150
42390
8
77314
28776
0.511
CD86
mDCs
6
484
134
7
1060
267
<0.001
HLA-DR
pDCs
6
27739
10008
8
37063
17678
0.271
CD86
pDCs
6
426
120
7
2639
5266
0.101
Tab. 8 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Blut junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR
und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse des Blutes der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit
der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Milz
n
Gruppe A-0
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
n
Gruppe A
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
p
HLA-DR
Monozyten
23
30909
10975
15
39580
28982
0.963
CD86
Monozyten
23
1083
771
14
1316
736
0.428
HLA-DR
mDCs
5
58577
24068
8
52331
37193
0.354
CD86
mDCs
5
446
316
7
831
422
0.117
HLA-DR
pDCs
5
15966
4528
8
23396
16297
0.348
CD86
pDCs
5
282
317
7
1003
1181
0.073
Tab. 9 : Exprimierung von Oberflächenmarkern in der Milz junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR
und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse der Milz der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit
der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Knochenmark
n
Gruppe A-0
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
n
Gruppe A
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
p
HLA-DR
Monozyten
13
21087
17722
15
36644
33526
0.08
CD86
Monozyten
13
574
273
15
1262
786
0.019
HLA-DR
mDCs
5
85144
33005
8
79814
51657
CD86
mDCs
5
575
359
8
1574
1403
HLA-DR
pDCs
5
15727
4444
8
22105
9130
CD86
pDCs
5
208
160
7
286
256
0.435
0.724
0.177
0.53
Tab. 10 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Knochenmark junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR
und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse des Knochenmarks der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p]
angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Blut
n
Gruppe B-0
Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz]
n
Gruppe B
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
p
HLA-DR
Monozyten
12
58149
49196
10
71273
62948
0.621
CD86
Monozyten
10
613
494
10
1171
996
0.13
HLA-DR
mDCs
10
100052
49727
10
156899
85830
0.087
CD86
mDCs
9
4503
12097
10
2047
1615
0.079
HLA-DR
pDCs
9
48730
24921
10
88951
80290
0.54
CD86
pDCs
8
491
428
10
1429
1198
0.052
Tab. 11 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Blut alter Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR
und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse des Blutes der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit
der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Milz
n
Gruppe B-0
Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz]
n
Gruppe B
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
p
HLA-DR
Monozyten
10
59021,7
57909,959
10
76444,3
54644,28
0.345
CD86
Monozyten
10
584,1
912,399
10
719,7
840,747
0.345
HLA-DR
mDCs
8
85566,875
36372,472
10
122711
48155,387
0.09
CD86
mDCs
7
575,714
229,318
10
2002,7
1257,288
0.022
HLA-DR
pDCs
8
25037,625
14238,107
11
42326,909
27904,496
0.148
CD86
pDCs
7
111,286
61,988
11
5008,909
15909,458
0.341
Tab. 12: Exprimierung von Oberflächenmarkern in der Milz alter Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR
und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse der Milz der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der
sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
Knochenmark
n
Gruppe B-0
Mean [Fluoreszenz] StDev [Fluoreszenz]
n
Gruppe B
Mean [Fluoreszenz]
StDev [Fluoreszenz]
p
HLA-DR
Monozyten
11
47374
44720
11
45749
43810
0.844
CD86
Monozyten
10
656
912
9
488
368
0.967
HLA-DR
mDCs
12
87346
39613
11
114084
50301
0.169
CD86
mDCs
12
410
275
11
1208
1523
0.186
HLA-DR
pDCs
11
24116
13047
10
41396
23549
0.049
CD86
pDCs
10
103
71
10
217
227
0.186
Tab. 13 : Exprimierung von Oberflächenmarkern im Knochenmark alter Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im Bezug auf die Mean-Fluoreszenz der Obeflächenmarker HLA-DR
und CD86 auf humanen Monozyten, mDCs und pDCs in der FACS-Analyse des Knochenmarks der Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p]
angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf das entsprechende Merkmal signifikant unterscheiden.
humane Zytokine
TNFα
IL-1β
IL-6
IL-10
IFN γ
n
18
18
18
18
18
Gruppe A-0
Mean [pg/ml]
2.823
11.028
2.114
0
7.986
StDev [pg/ml]
11.341
46.787
5.422
0
11.023
n
21
22
22
22
22
Gruppe A
Mean [pg/ml]
291.535
95.931
2925.902
7.007
281.878
StDev [pg/ml]
865.751
119.581
3381.637
8.467
593.343
p
< 0.001
< 0.001
< 0.001
< 0.001
0.016
Tab. 14 : Konzentration humaner Zytokine im Plasma junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im
Bezug auf die Konzentration der humanen Zytokine TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 und INFγ im Plasma der Versuchstiere nach
Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0 und A im Bezug auf
die Produktion des entsprechenden Zytokins signifikant unterscheiden.
murine Zytokine
TNFα
IL-6
IL-10
MCP
IL-12/IL-23p40
n
18
18
18
18
18
Gruppe A-0
Mean [pg/ml]
6.292
15.617
3.251
100.911
11.533
StDev [pg/ml]
13.408
29.429
9.358
99.123
30.041
n
23
23
23
23
23
Gruppe A
Mean [pg/ml]
314.082
6663.157
153.828
30012.311
43.949
StDev [pg/ml]
289.166
4282.71
177.086
44155.56
100.871
p
< 0.001
< 0.001
< 0.001
< 0.001
0.256
Tab. 15 : Konzentration muriner Zytokine im Plasma junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] A-0 und A im
Bezug auf die Konzentration der murinen Zytokine TNFα, IL-6, IL-10, MCP und IL-12/IL-23p40 im Plasma der
Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0
und A im Bezug auf die Produktion des entsprechenden Zytokins signifikant unterscheiden.
humane Zytokine
TNFα
IL-1β
IL-6
IL-10
IFNγ
n
12
12
12
12
12
Gruppe B-0
Mean [pg/ml]StDev [pg/ml]
0.475
1.112
0
0
30.173
30.173
1.187
2.062
39.07
102.814
n
11
11
11
11
11
Gruppe B
Mean [pg/ml] StDev [pg/ml]
196.774
523.426
112.222
93.916
2303.982
2623.226
13.782
18.744
252.76
437.707
p
0.003
<0.001
0.007
0.011
0.05
Tab. 16 : Konzentration humaner Zytokine im Plasma alter Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im
Bezug auf die Konzentration der humanen Zytokine TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 und INFγ im Plasma der Versuchstiere nach
Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0 und B im Bezug auf
die Produktion des entsprechenden Zytokins signifikant unterscheiden.
murine Zytokine
TNFα
IL-6
IL-10
MCP
IL-12/IL-23p40
n
12
12
12
12
12
Gruppe B-0
Mean [pg/ml]StDev [pg/ml]
33.048
42.01
27.189
38.433
10.415
15.742
201.149
104.015
41,043
46,705
n
12
12
12
12
12
Gruppe B
Mean [pg/ml] StDev [pg/ml]
521.323
303.326
4639.629
3286.631
190.742
191.751
420047.981
839949.462
196139
231772
p
< 0.001
< 0.001
0.002
< 0.001
0.09
Tab. 17: Konzentration muriner Zytokine im Plasma junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean], die Standardabweichung [StDev] sowie die Größe der Gruppe [n] B-0 und B im
85
Bezug auf die Konzentration der murinen Zytokine TNFα, IL-6, IL-10, MCP und IL-12/IL-23p40 im Plasma der
Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0
und B im Bezug auf die Produktion des entsprechenden Zytokins signifikant unterscheiden.
PTX3
huPTX3
muPTX3
n
11
18
Gruppe A-0
Mean [ng/ml]
0.841
74.071
StDev [ng/ml]
0.821
40.781
n
17
23
Gruppe A
Mean [ng/ml]
4.469
579.456
StDev [ng/ml]
2.502
268.596
p
< 0.001
< 0.001
Tab. 18 : Konzentration von PTX3 im Plasma junger Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean] in ng/ml, die Standardabweichung [StDev] in ng/ml sowie die Größe der Gruppe [n]
A-0 und A im Bezug auf die Konzentration von humanem PTX3 [huPTX3] und murinem PTX3 [muPTX3] im Plasma der
Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen A-0
und A im Bezug auf die Produktion von humanem bzw. murinem PTX3 signifikant unterscheiden.
PTX3
huPTX3
muPTX3
n
11
11
Gruppe B-0
Mean [ng/ml]StDev [ng/ml]
0.281
0.487
76.037
58.784
n
13
14
Gruppe B
Mean [ng/ml] StDev [ng/ml]
2.378
1.9
563.553
312.472
p
0.002
< 0.001
Tab. 19 : Konzentration von PTX3 im Plasma alter Tiere
Die Tabelle zeigt den Mean [Mean] in ng/ml, die Standardabweichung [StDev] in ng/ml sowie die Größe der Gruppe [n]
B-0 und B im Bezug auf die Konzentration von humanem PTX3 [huPTX3] und murinem PTX3 [muPTX3] im Plasma der
Versuchstiere nach Versuchsende. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit [p] angegeben, mit der sich die Gruppen B-0
und B im Bezug auf die Produktion von humanem bzw. murinem PTX3 signifikant unterscheiden.
86
Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe oder
Benutzung anderer als angegebener Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von
mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistung für Arbeiten erhalten haben, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation, und dass die vorgelegte Arbeit weder
im Innland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum
Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alle aus anderen
Quellen und von anderen Personen übernommenes Material, das in der Arbeit verwendet wurde
oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere
wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt
waren.
Datum
Unterschrift
87
Lebenslauf und wissenschaftlicher Werdegang
Name
Johanna Scholbach
Gebrtsort
Leipzig
Geburtsdatum
21.11.1990
Schulbildung
1996-2000 Grundschule August-Bebel Leipzig
2000-2008 Wilhelm-Ostwald-Schule Leipzig
2008 Allgemeine Hochschulreife
Ausbildung
seit 2008 Studium der Humanmedizin
2010 1. Teil des Staatsexamens
2010 Beginn der Doktorarbeit
Doktorarbeit
„Induktion einer Endotoxämie in der humanisierten
Maus “
Weiterbildung
2012 Tierexperimenteller Kurs im MedizinischExperimentellen Zentrum der Medizinischen
Fakultät Leipzig
88
Veröffentlichungen
Scholbach J, Köberle M, Rodewohl A, Lange F
Detektion von menschlichen Immunzellen in der humanisierten Maus
BIOspektrum, 2013, DOI: 10.1007/s12268-013-0269-1
Scholbach J, Schulz A, Westphal F, Egger D, Wege AK, Patties I, Köberle M, Sack U, Lange F.
Comparison of hematopoietic stem cells derived from fresh and cryopreserved whole cord blood
in the generation of humanized mice.
PLoS One. 2012;7(10):e46772. DOI: 10.1371/journal.pone.0046772
Impactfaktor (2012): 3,730
Kühnle S, Ludwig AA, Meuret S, Küttner C, Witte C, Scholbach J, Fuchs M, Rübsamen R.
Development of auditory localization accuracy and auditory spatial discrimination in children
and adolescents.
Audiol Neurootol. 2013;18(1):48-62. DOI: 10.1159/000342904
Impactfaktor (2013): 1,852
89
Danksagung
Hiermit möchte ich allen danken, die zum Entstehen und Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben.
Ich möchte Herrn Professor Frank Emmrich danken, der mir die Durchführung der
Promotionsarbeit am Institut für Klinische Immunologie der Universität Leipzig ermöglichte.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Sack für die Betreuung der Doktorarbeit, die gezielte
Lösungssuche bei wissenschaftlichen Problemen und die Unterstützung jeglicher
wissenschaftlicher Bemühungen.
Mein aufrichtiger Dank gilt Frau Doktor Franziska Lange, die mich auf jedem Schritt der Arbeit
begleitete. Ihre ständige Motivation und Anerkennung der Leistungen, sowie ihe kompetente
Führung der Forschungsarbeiten, schafften großes Interesse an der Arbeit und einen angenehme
Arbeitsatmosphäre.
Frau Doktor Anett Schulz möchte ich herzlich danken. Durch ihre tägliche Hilfe Im Labor, lernte ich
das Chaos der Forschungsarbeit besser zu strukturieren und die klassischen Probleme der
Laborarbeit zu meistern Ihre Organisation lernte mich den Vorteil gut geführter Laborbücher zu
schätzen.
Bei der gesamten Arbeitsgruppe Lange: Margarethe Köberle, Anja Rodewohl, Eva Kendzia, Dr. Anna
Leichsenring, Dr. Ingo Bäcker und Ramona Blaschke möchte ich für ständige Unterstützung in
Fragen jedweder Art danken.
Zusätzlich möchte ich mich bei Frau Doktor Franziska Lange und Margarethe Köberle für das
Durchführen der tierexperimentellen Arbeiten bedanken, die damit die vorliegende Arbeit erst
ermöglichten.
Für die Unterstützung der tierexperimentellen Arbeit möchte ich besonders Frau Dipl.-Ing.
Hannelore Scholz danken, die mit ihren Mitarbeitern den einwandfreien Ablauf der Versuche
gewährleistete.
Dr. Franka Kahlenberg, Katrin Bauer, Heike Knaack, Barbara Witwer, Bettina Glatte, Dr. Andreas
Boldt und Nadja Hilger möchte ich für jede amüsante Pause und jedes gemeinsame Mittagessen
90
danken, die mir immer ein wunderbarer Ausgleich waren.
Meinem Bruder Jonathan Scholbach möchte ich herzlich für umfangreiche Korrektur meiner Arbeit
im Hinblick auf Grammatik und Rechtschreibung danken.
Meinen Eltern danke ich für das Mitfiebern mit Ergebnissen und für ihre finanzielle Unterstützung
der Arbeit .
Kerstin danke ich für die emotionale Unterstützung, das Backen von Motivationsplätzchen und den
Glauben an das Gelingen der Arbeit.
91
Herunterladen
Random flashcards
Medizin

5 Karten Sophia Gunkel

Laser

2 Karten anel1973

Erstellen Lernkarten