Die prognostische Bedeutung von Makrophagen des M1 und M2

Die prognostische Bedeutung von Makrophagen des M1 und M2
Phänotyps sowie von zytotoxischen und regulatorischen TLymphozyten bei strahlentherapeutisch behandelten Patienten
mit einem Adenokarzinom des Pankreas
Aus der Strahlenklinik
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Hanno Zoske
aus
Salzgitter
Als Dissertation genehmigt von der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
PD. Dr. L. Distel
Gutachter:
Prof. Dr. R. Fietkau
Tag der mündlichen Prüfung:
26. Juli 2016
2
3
Für meine Eltern
4
2.
3.
Zusammenfassung ..................................................................................................... 3
2.1.
Hintergründe und Ziele ..................................................................................... 3
2.2.
Methoden ............................................................................................................ 3
2.3.
Ergebnisse und Beobachtung ............................................................................ 4
2.4.
Schlussfolgerung ................................................................................................. 5
Abstract ...................................................................................................................... 6
4. Einleitung ....................................................................................................................... 7
4.1.
Pankreaskarzinom ............................................................................................. 7
4.1.1.
Epidemiologie ............................................................................................... 7
4.1.2.
Ätiologie ....................................................................................................... 8
4.1.3.
Klassifikation ................................................................................................ 8
4.1.4.
Klinik .......................................................................................................... 10
4.1.5.
Diagnostik ................................................................................................... 11
4.1.6.
Therapie und Prognose ............................................................................... 13
4.1.7. Die Rolle der Strahlentherapie beim Pankreaskarzinom ................................ 14
4.2.
5.
Immunsystem.................................................................................................... 15
4.2.1.
Aufbau des Immunsystems ......................................................................... 15
4.2.2.
Tumor - assoziierte - Makrophagen (TAM) ............................................... 16
4.2.3.
Tumor - infiltrierende - Lymphozyten (TIL) .............................................. 17
Methoden .................................................................................................................. 18
5.1.
Kollektiv ............................................................................................................ 18
5.2.
Herstellung der Tissue - Microarrays (TMA) ............................................... 19
5.3.
Immunhistologische Färbung.......................................................................... 20
5.3.1. E-Cadherin ..................................................................................................... 20
5.3.2. CD68 und CD163 ........................................................................................... 21
5.3.3. FoxP3 und CD8 .............................................................................................. 22
6.
5.4.
Auswertung ....................................................................................................... 23
5.5.
Statistik.............................................................................................................. 24
Ergebnisse ................................................................................................................ 24
6.1. Zellverteilung und Anzahl .................................................................................. 25
6.1.1. CD68 .............................................................................................................. 25
6.1.2. CD163 ............................................................................................................ 26
6.1.3. FoxP3 ............................................................................................................. 27
6.1.4. CD8 ................................................................................................................ 28
6.2. Die Zellverteilung und Anzahl als prognostischer Faktor ............................... 29
6.2.1. CD68+ Zelldichte im Verhältnis zum rezidivfreien Überleben ...................... 29
6.2.2 Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben ..... 30
6.2.3. Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben . 31
6.2.4. Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben .................... 32
6.2.5. Dichte der CD163+ Zellen im Verhältnis zum frühzeitigen Tumortod .......... 34
6.2.6. Dichte der CD163+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben .................. 36
6.2.7. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben ... 38
6.2.8. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben 39
6.2.9. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod............. 40
6.2.10. Dichte von FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben ................ 42
6.2.11. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben .... 44
6.2.12. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben . 46
6.2.13. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod ............. 48
6.2.14. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben .................... 51
6.2.15. Der prognostische Wert von Kombinationen verschiedener Zelltypen aus
verschiedenen Gewebslokalisationen ....................................................................... 55
6.3. Das Tumorstadium als prognostischer Faktor ................................................. 59
6.4. Therapieform und Prognose ............................................................................... 62
7.
Diskussion ................................................................................................................. 64
7.1. TAMs als prognostischer Faktor ........................................................................ 64
7.1.1. CD68+ Zellen als prognostischer Faktor ........................................................ 64
7.1.2. CD163+ Zellen als prognostischer Faktor ...................................................... 66
7.2. TIL als prognostischer Faktor............................................................................ 67
7.2.1. FoxP3+ Zellen als prognostischer Faktor ........................................................ 67
7.2.2. CD8+ Zellen als prognostischer Faktor ........................................................... 69
7.3. Immunmodulatorischer Therapieansatz ........................................................... 71
7.4. Die Therapieentscheidung anhand der Klassifikation ..................................... 73
7.5. Die Implementierung immunologischer Faktoren ins TNM - System ............ 74
8.
Literaturverzeichnis ................................................................................................ 76
9.
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... 85
10. Danksagung............................................................................................................. 86
11. Lebenslauf ................................................................................................................ 87
2
2.
Zusammenfassung
2.1.
Hintergründe und Ziele
Die Therapie des Pankreaskarzinoms ist eine große Herausforderung. Trotz der
Fortschritte in der Tumortherapie ist die Prognose für Patienten mit Pankreaskarzinom
nach wie vor schlecht. Die derzeit einzige Option auf eine Heilung stellt die operative
Entfernung des Tumors dar, welche oft nur noch schwer zu erreichen ist, da der
Bauchspeicheldrüsenkrebs aufgrund fehlender Frühsymptome in der Regel erst spät
diagnostiziert wird.
Die Dichten der vorhandenen Tumor - assoziierten - Makrophagen (TAM) und der
Tumor - infiltrierenden - Lymphozyten (TIL) im Tumorgewebe oder in dem den Tumor
umgebenen Stroma wurden bereits von verschiedenen Autoren bei unterschiedlichen
Malignomen als prognostische Faktoren beschrieben. In dieser Arbeit soll der
prognostische Wert von TILs und TAMs hinsichtlich des Adenokarzinoms des Pankreas
untersucht werden. Bei den oft schwierigen Entscheidungen zwischen den vorhandenen
Behandlungsoptionen wäre eine Ergänzung der aktuell verwendeten TNM-Klassifikation
und der darauf basierenden Stadieneinteilung nach UICC (Union internationale contre le
cancer) wünschenswert, um für den Patienten das optimale Therapiekonzept besser
finden zu können. Auch um zwischen einzelnen Optionen zukünftiger Therapiestrategien
wie dem immunmodulatorischen Ansatz abwägen zu können, könnte eine Klassifikation
des individuellen inflammatorischen Milieus des Karzinoms sinnvoll sein. Die
Implementierung von immunologischen Faktoren in das etablierte TNM-System bedarf
jedoch sicherlich noch viel weiterer Forschung.
2.2.
Methoden
In dieser Arbeit wurden Gewebeproben von 63 Patienten mit einem Adenokarzinom des
Pankreas untersucht, die im Zeitraum von 1996 bis 2012 an der Strahlenklinik der
Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg behandelt wurden.
Neben Gewebe des Primärtumors konnte bei 28 Patienten zusätzlich Gewebe der
Invasionsfront des Primärtumors und bei 32 Patienten Pankreasnormalgewebe gewonnen
werden. Von diesen 123 Gewebeproben wurden Tissue-Microarrays (TMA) angefertigt.
Ein Schnitt wurde einfach immunhistologisch mit Antikörpern gegen Cadherin-E gefärbt,
bei zwei Schnitten erfolgte eine immunhistologische Doppelfärbung, es entstanden
3
insgesamt 369 unterschiedliche Stanzzylinder von Gewebeproben. Mit Antikörpern
gegen CD68 (Cluster of differentiation) wurden proinflammatorische und mit
Antikörpern gegen CD163 antiinflammatorische Makrophagen identifiziert. Zur
Identifizierung von regulatorischen T-Lymphozyten (Treg) dienten Antikörpern gegen
das Forkhead Box Protein P3 (FoxP3). Antikörper gegen CD8 wurden zur Identifizierung
von zytotoxischen Lymphozyten verwendet.
Nach der Digitalisierung der TMA-Schnitte erfolgte die Auswertung mit Hilfe des
Bildanalyseprogramms Biomas (PD Dr. Distel, Strahlenklinik Erlangen, Deutschland). Es
wurde bei allen drei Gewebslokalisationen zwischen stromalem und intraepithelialem
Gewebe differenziert und die jeweilige Zellzahl pro Quadratmillimeter ermittelt. Jedes
Merkmal wurde bezüglich seiner Zellzahl am Median getrennt und in zwei Gruppen
unterteilt. Für beide Gruppen wurden die Kaplan-Meier-Kurven berechnet, der
Unterschied zwischen beiden Überlebenskurven wurde mit Hilfe des Log-Rank Testes
auf seine Signifikanz untersucht. Die Berechnung der Kaplan-Meier-Kurve und des
Signifikanzniveaus
mittels
Log-Rank-Tests
erfolgte
mit
der
Statistik-
und
Analysesoftware SSPS (IBM Deutschland GmbH, Nürnberg, Deutschland).
2.3.
Ergebnisse und Beobachtung
Die Auswertung der durchschnittlichen Zellzahl zeigt stromal eine ähnliche Verteilung
der CD68+, der CD163+, der FoxP3+ und der CD8+ Zellen. Es liegen von den vier
Zelltypen jeweils am meisten Zellen im stromalen Bereich um den Tumor und tendenziell
am wenigsten Zellen stromal um das normale Pankreasdrüsengewebe. Das Muster der
intraepithelialen Zellverteilung ist inhomogener als die stromale. Während sie sich für die
CD163+ Zellen in allen drei Lokalisationen ähnelt, sind von den FoxP3+ Zellen im
zentralen Tumor und in seiner Invasionsfront tendenziell gleich viele Zellen vorhanden
und im Normalgewebe weniger. Die Verteilung der CD68+ Zellen, von denen im
zentralen Tumor am meisten und im Normalgewebe am wenigsten Zellen sind, und der
CD8+ Zellen, bei denen das Vorkommen umgekehrt aufgeteilt ist, verhält sich genau
gegensinnig.
Ein signifikanter prognostischer Wert kann für die Anzahl der verschiedenen Zelltypen
im
Bezug
auf
klinische
Faktoren
gezeigt
werden.
Eine
Zellzahl
von
proinflammatorischen Makrophagen im intraepithelialen Bereich des zentralen Tumors,
die oberhalb des Medians liegt, beeinflusst das progressionsfreie Überleben positiv. Beim
Gesamtüberleben zeigt die Untersuchung des prognostischen Wertes von Zellzahlen
einzelner Gewebslokalisationen nur Tendenzen. Jedoch zeigt die Gruppe, deren Zellzahl
4
sowohl im stromalen als auch im intraepithelialen Bereich des Normalgewebes unterhalb
des Medians liegt, gegenüber den restlichen Patienten einen signifikanten Vorteil im
Gesamtüberleben. Bei den antiinflammatorischen Makrophagen wirkt sich eine oberhalb
des Medians liegende Zellzahl im stromalen Gewebe der Invasionsfront positiv auf das
Gesamtüberleben aus. Eine Zellzahl im stromalen Gewebe des Pankreasnormalgewebes,
die unterhalb des Medians liegt, wirkt sich positiv auf den frühzeitigen Tumortod aus. Bei
den Treg ist eine oberhalb des Medians liegende Zellzahl im intraepithelialen Bereich der
Invasionsfront im Bezug auf den frühzeitigen Tumortod vorteilhaft. Hohe Treg Zellzahlen wirken sich tendenziell positiv auf verschiedene klinische Parameter aus. Bei
den zytotoxischen T-Lymphozyten kann die Beobachtung gemacht werden, dass sich
intraepitheliale Zellzahlen oberhalb des Medians durchweg als positives prognostisches
Kriterium zeigen. Das progressionsfreie und metastasenfreie Überleben wird bei
entsprechenden Zellzahlen im stromalen wie intraepithelialen Bereich des zentralen
Tumors positiv beeinflusst. Im Bezug auf den frühzeitigen Tumortod und das
Gesamtüberleben können bei der Betrachtung der Zellzahl in den einzelnen
Lokalisationen nur Tendenzen festgestellt werden. Erst die Kombination der Zellzahl im
intraepithelialen Bereich des zentralen Tumors und seiner Invasionsfront erbringt
signifikante Ergebnisse bei den beiden klinischen Parametern. Eine in beiden
Lokalisationen gleichzeitig oberhalb des Medians liegende Zellzahl beeinflusst sie
positiv, während eine in beiden Lokalisationen gleichzeitig unterhalb des Medians
liegende Zellzahl sich negativ auf die Parameter auswirkt. Auch die Kombination aus
Verteilung verschiedener Zelltypen kann eine signifikante prognostische Aussagekraft
haben.
2.4.
Schlussfolgerung
Die Dichten der hier untersuchten Subgruppen von TIL (CD8+ zytotoxischen TLymphozyten und FoxP3+ regulatorischen T-Lymphozyten) und TAM (CD68+
proinflammatorische und CD163+ antiinflammatorischen Makrophagen) sind beim
Pankreaskarzinom von prognostischer Signifikanz. Während bei den TIL durchweg hohe
Dichten positiven Einfluss auf die Prognose haben, haben bei den TAM hohe Dichten im
tumerösen und niedrige Dichten im Normalgewebe einen positiven Einfluss. Die
prognostische Aussagekraft des individuellen inflammatorischen Tumormilieus kann
weiter erhöht werden, wenn das Auftreten verschiedener Zelltypen in verschiedenen
Gewebslokalisationen kombiniert wird. Eine Implementierung von immunologischen
Faktoren ins TNM-System könnte in Zukunft sinnvoll sein. Bis dahin sollte die Wirkung
5
und das Zusammenspiel der einzelnen Zellgruppen in inflammatorischen Tumormilieu
besser erforscht werden.
3. Abstract
Pancreatic ductal adenocarcinoma is characterized by late detection and poor prognosis.
With some other types of cancer for example colorectal cancer the microenviroment of
inflammation is proven to influence the development and progression of the disease.
This survey analyses the influence of tumor-associated macrophages (TAM) and tumorinfiltrating lymphcyts (TIL) on the prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. The
prognostic significance of the density of two subtypes of both immunologic cell types is
evalueted. We differentiated between proinflammatory (M1) and antiinflammatory (M2)
macrophages as well as regulatory (Treg) and cytotoxic (CTL) T-Cells.
A total of 63 patients has been examined for the survey. They had all been treated for
pancreatic ductal adenocarcinoma ranging from Stage I to IV in `Strahlenklinik Erlangen`
between 1996 an 2012. We performed a immunohistological staining of tissue from the
primary tumor site, invasive margin and normal tissue (if available) with antibodies to
FoxP3 (Treg), CD8 (cytoxic T-Cells), CD68 (antiinflammatory macrophages) and CD163
(proinflammatory macrophages). The stained cells were counted by the semi-automatic
programme `Biomas Count´ (PD Dr. Distel, Erlangen). In each region we differencitiated
between the intraepithelial and stromal cell density. For each localisation we divided
patients in two groups: one with a higher, the other with a lower cell density than the
median.
The stromal density of immunological cells around the tumor side is higher than in the
normal pancreatic tissue. A high density of proinflammatory macrophages in the central
tumor seems to be associated with a better progression-free survival rate. The group of
patients with a low density of proinflammatory macrophages in the intraepithelial as well
as stromal area of the normal pancreatic tissue has a better overall survival rate.
Antiinflammatory macrophages have a positive influence on overall survival, if their
density is in the stromal areas of the invasion margin is high. A high density of Treg in
the intraepithelial area of the invasion margin has a positive influence on the remaining
time until cancer death. The group of patients with a high level of cytotoxic T-Cells in the
6
different intraepitelial and stromal localisations has a consistently better outcome in the
evaluated clinical parameters.
In conclusion the density of proinflammatory (M1) and antiinflammatory (M2)
macrophages as well as regulatory T-Cells (Treg) and cytotoxic T-Cells (CTL) is of
prognostic significance for pancreatic ductal adenocarcinoma. Particulary the density of
CTL seems to be a good indicator for a patient´s prognoses. In future local immune
response could be a new component in the classification of cancer.
4. Einleitung
4.1.
Pankreaskarzinom
4.1.1. Epidemiologie
In Deutschland sind im Jahr 2010 ca. 16000 Menschen an einem Pankreaskarzinom
erkrankt. Männer und Frauen sind etwa gleichhäufig betroffen, die Inzidenz liegt im Jahr
2010 bei 20 Erkrankungen je 100000 Personen. Bei dem prozentualen Anteil von
Krebsneuerkrankungen in Deutschland im Jahr 2010 nimmt das Pankreaskarzinom bei
Männern den zehnten Rang mit einem Anteil von 3,2% ein, bei Frauen den sechsten Rang
mit einem Anteil von 3,6%. Das Lebenszeitrisiko an Bauchspeicheldrüsenkrebs zu
erkranken, berechnet anhand der Daten aus dem Jahr 2010, beträgt 1,6% für beide
Geschlechter. Das durchschnittliche Erkrankungsalter betrug 2010 in Deutschland für
Männer 71 Jahre und für Frauen 75 Jahre.
Die relative Fünfjahres-Überlebensrate von 2009 bis 2010 ermittelt betrug lediglich 8%
für beide Geschlechter, was besonders im Hinblick auf die Fünfjahres-Überlebensrate
anderer Tumorlokalisationen sehr schlecht erscheint. Dies erklärt auch den höheren
prozentualen Anteil des Pankreaskarzinoms an den Krebssterbefällen im Vergleich zu
dem prozentualen Anteil an den Krebsneuerkrankungen in Deutschland im Jahr 2010,
denn der Bauchspeicheldrüsenkrebs nimmt bei den Krebssterbefällen bei beiden
Geschlechtern den vierten Rang ein und verursacht bei den Männern 6,4% und bei den
Frauen 7,9% der Krebssterbefälle. Im Zusammenhang hiermit steht, dass das
Pankreaskarzinom oft erst in fortgeschrittenen Stadien erstdiagnostiziert wird (RobertKoch-Institut et al. 2013).
7
4.1.2. Ätiologie
Die Ätiologie des Pankreaskarzinoms ist nicht abschließend geklärt und Gegenstand
aktueller Forschung. Es kommen verschiedene Risikofaktoren in Betracht, die zur
Entstehung eines Pankreaskarzinoms führen, wie überhöhter Alkoholkonsum (Talamini
et al. 2010) sowie Tabakkonsum (Nilsen et al. 2000). Bei Patienten mit chronischer
Pankreatitis, die nicht selten alkoholbedingt ist, ist die Erkrankungswahrscheinlichkeit
gegenüber der Normalbevölkerung genauso erhöht (Malka et al. 2002). Personen, die an
Übergewicht oder Diabetes leiden, haben ebenfalls ein erhöhtes Risiko an
Bauchspeichelkrebs zu erkranken (Larsson et al. 2005). Bezüglich der Ernährung wird
gegrilltes Fleisch (Anderson et al. 2002) bei übermäßigem Konsum als Risikofaktor
gesehen.
Neben diesen im Wesentlichen durch den Lebensstil zu beeinflussenden Faktoren scheint
beim Pankreaskarzinom auch eine genetische Komponente zu bestehen. So haben
Verwandte ersten Grades eines Pankreaskarzinomerkrankten das doppelte Risiko selber
zu erkranken. Wenn der Pankreaskarzinomerkrankte unter sechzig Jahre alt ist, besteht
bei den Verwandten ersten Grades ein sogar annähernd dreifach erhöhtes Risiko selbst zu
erkranken (McWilliams et al. 2005). Genetisch bedingte Syndrome wie das PeutzJeghers-Syndrom (Giardiello et al. 2000), die Familiäre-Adenomatöse-Polyposis
(Giardiello et al. 1993) oder die hereditäre Pankreatitis (Lowenfels et al. 1997) erhöhen
ebenso das Risiko an einem Pankreaskarzinom zu erkranken. Scheinbar hat auch das
ABO-Blutgruppensystem
Einfluss
auf
die
Wahrscheinlichkeit
an
einem
Pankreaskarzinom zu erkranken. So haben Träger der Blutgruppe 0 ein niedrigeres Risiko
an Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erkranken als die Träger der restlichen Blutgruppen,
wobei dieser Mechanismus noch nicht abschließend geklärt ist (Pelzer et al. 2013).
4.1.3. Klassifikation
Das Pankreaskarzinom gliedert sich entsprechend des in der Bauchspeicheldrüse
vorhandenen Gewebes in Malignome der endokrinen und der exokrinen Anteile. Die
folgenden Ausführungen beschränken sich auf die Klassifikation der Pankreastumore, die
ihren
Ursprung
in
den
Zellen
des
exokrinen
(epithelialen)
Gewebes
der
Bauchspeicheldrüse haben.
Maligne Tumore der exokrinen Pankreasanteile werden anhand histologischer Kriterien
in das duktale Adenokarzinom (75-90%), das adenosquamöse Karzinom (4%), das
8
intraduktale papillär muzinöse Karzinom (3%), das muzinöse Zystadenokarzinom (1%),
das Adenokarzinom der azinären Zellen (1%), das seröse Zystadenokarzinom (<1%) und
das Pankreatikoblastom (<1%) unterteilt. Benigne Tumore des exokrinen Pankreas sind
das seröse Zystadenom, das muzinöse Zystadenom, das intraduktale papillär-muzinöse
Adenom und das reife Teratom (Grenacher et al. 2009).
Die Ausbreitung von Tumorerkrankungen wird anhand der TNM-Klassifikation
eingeteilt. Das TNM-System beruht auf drei verschiedenen Eigenschaften, wobei sich T
auf die Tumorgröße, N auf den Befall von Lymphknoten und M auf den Nachweis von
Metastasen bezieht. Diese Klassifikation wurde maßgeblich von dem Franzosen Pierre
Denoix in den 40er Jahren des 20. Jahrhunderts entwickelt (Brierley et al. 2006). Die
Ideen von Denoix wurden von der UICC aufgegriffen, wodurch 1968 eine erste Ausgabe
eines zusammenfassenden Werkes zur Tumorklassifikation herausgegeben wurde (Sobin
2003). Seitdem wurde das Klassifikationssystem konstant weiter entwickelt bis zur
aktuellen 7. Auflage, wobei bezüglich des Pankreaskarzinoms im Vergleich zur 6.
Auflage keine Änderungen stattgefunden haben (Wittekind 2010).
Im Folgenden werden in Tabelle 1 und 2 die aktuelle TNM-Klassifikation und
Stadieneinteilung für das Pankreaskarzinom dargestellt.
9
Tabelle 1: 6. Auflage des TNM Systems für das Pankreaskarzinom des American
Joint Committee on Cancer (AJCC) (Bilimoria et al. 2007)
TNM - Nomenklatur für das Pankreaskarzinom
TX
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0
Kein Primärtumor nachweisbar
Tis
Karzinoma in situ
T1
Tumor auf Pankreas begrenzt; Größter Durchmesser des Primärtumors ≤ 2 cm
T2
Tumor auf Pankreas begrenzt; Größter Durchmesser >2cm
T3
Der Tumor hat die Organgrenze überschritten, aber der Truncus coeliacus
oder die Arteria mesenterica superior sind nicht infiltriert
T4
NX
N0
N1
MX
M0
M1
Tumor infiltriert den Truncus coeliacus oder die Arteria mesenterica superior
Die regionären Lymphknoten können nicht beurteilt werden
Keine regionären Lymphknotenmetastasen
Regionäre Lymphknotenmetastasen vorhanden
Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
Keine Fernmetastasen
Fernmetastasen
Tabelle 2: 6. Auflage der Stadieneinteilung des Pankreaskarzinoms basierend auf
der TNM Klassifikation des AJCC (Bilimoria 2007)
Stadieneinteilung
Stadium 0
Tis
N0
M0
Tumor innerhalb des Pankreas
Stadium IA
T1
N0
M0
Tumor innerhalb des Pankreas
Stadium IB
T2
N0
M0
Tumor innerhalb des Pankreas
Stadium IIA
T3
N0
M0
Lokal invasiv, resektabel
Stadium IIB
T1,2 oder 3
N1
M0
Lokal invasiv, resektabel
Stadium III
T4
jedes N
M0
lokal
fortgeschritten,
resektabel
Stadium IV
jedes T
jedes N
M1
Fernmetastasen
nicht
4.1.4. Klinik
Die Symptome des Pankreaskarzinoms treten meist erst in fortgeschrittenen Stadien auf.
So ist zu erklären, dass die meisten Patienten zum Diagnosezeitpunkt bereits an einer
fortgeschrittenen Tumorerkrankung leiden (Bilimoria 2007).
Die Symptome des Pankreaskarzinoms, die auch im Frühstadium auftreten, erscheinen
eher unspezifisch. Am häufigsten treten im Frühstadium der Erkrankung Schwäche,
10
Appetitlosigkeit
und
Gewichtsverlust
auf.
Symptome
wie
ein
Ikterus
oder
Oberbauchschmerzen treten meist erst danach auf. Das Auftreten eines Ikterus hängt
allerdings von der Lage des Karzinoms ab. Er tritt bei Pankreaskopfkarzinomen häufiger
auf (Porta et al. 2005). Ein nicht unerheblicher Anteil älterer Patienten mit einem neu
aufgetretenen Ikterus ist an einem Pankreas- oder Gallengangskarzinom erkrankt
(Reisman et al. 1996). Als weiteres, häufiger auftretendes Symptom ist Rückenschmerz
zu nennen, der ein fortgeschrittenes Tumorleiden anzeigen kann (Ridder et al. 1995).
4.1.5. Diagnostik
Da das Pankreaskarzinom wenig spezifische Symptome hat, ist eine Aussage zu einem
diagnostischen Algorithmus zum Ausschluss eines Pankreastumors schwierig.
Die aktuelle S3 - Leitlinie „Exokrines Pankreaskarzinom“ schlägt bei dem relativ
unspezifischen Symptom des nicht durch Veränderungen des Bewegungsapparates
erklärbaren alleinigen Rückenschmerz ein nach Alter und Verdachtslevel aufgeteiltes
Vorgehen vor. Bei einem niedrigen Verdachtslevel und einem Alter unter 50 Jahren sollte
bei alleinigem Rückenschmerz eine Sonographie des Pankreas durchgeführt werden,
wenn eine Symptompersistenz besteht. Eine sonographische Untersuchung sowie
gegebenenfalls eine Computertomographie der Bauchspeicheldrüse sollten bei Patienten
mittleren Verdachtslevels unter 50 Jahren stattfinden, wenn neben den Rückenschmerzen
auch Symptome wie Inappetenz, Gewichtsverlust oder Schwäche bestehen. Das gleiche
Vorgehen wird für Patienten empfohlen, die sich ebenfalls im mittleren Verdachtslevel
befinden und älter als 50 Jahre sind sowie Rückenschmerzen alleine oder mit den oben
genannten Symptomen zusammen haben. Bei einem hohen Verdachtslevel, einem Alter
über 50 Jahren sowie Schmerzen mit anderen Symptomen kann neben der Sonographie
und der Computertomographie auch eine Endosonographie als diagnostische Möglichkeit
angeboten
werden.
Es
Rückenschmerzcharakter
wird
auch
jedoch
schon
betont,
früher
dass
eine
individuell
je
nach
Computertomographie
oder
Endosonographie vorgenommen werden können. Der diagnostische Algorithmus sollte
also mit einer Oberbauchsonographie beginnen. Bei konkretem Tumorverdacht sollte
neben
der
perkutanen
Computertomographie
Sonographie
(CT),
eine
auch
eine
Endosonographie,
Magnetresonanztomographie
Magnetresonanz-Cholangiopankreatikographie
(MRCP)
oder
(MRT)
eine
mit
Endoskopische
Cholangiopankreatikographie (ERCP) erfolgen. Die sensitivsten Verfahren, um ein
Pankreaskarzinom zu diagnostizieren, sind die CT und die MRT in Kombination mit der
11
MRCP sowie die Endosonographie. Im Rahmen des Tumorstagings sollte mindestens
eine Sonographie des Abdomens, eine Röntgenaufnahme des Thorax sowie eine CT des
Abdomens stattfinden (Seufferlein et al. 2013). Die MRT spielt hier eine untergeordnete
Rolle. Sie kann eingesetzt werden, um fragliche kleine hepatische Raumforderungen oder
zystische Läsionen des Pankreas komplementär zur CT abzuklären (Kinney 2010).
Vor einer Operation ist die CT unverzichtbar, um einzuschätzen, ob der Tumor resektabel
ist (Bipat et al. 2005). Eine zytologische oder histologische Diagnosesicherung ist
präoperativ
nicht
notwendig,
da
potentiell
resektable
Raumforderungen
der
Bauchspeicheldrüse mit unklarer Dignität operativ entfernt werden sollten (Seufferlein
2013).
Bevor ein Pankreaskarzinom anderweitig therapiert wird, ist eine bioptische
Diagnosesicherung
aufgrund
der
vielen
möglichen
Differentialdiagnosen
einer
Raumforderung des Pankreas unabdingbar, um Fehlbehandlungen zu vermeiden (David
et al. 1998). In dieser Situation bietet die endosonographisch gestützte Feinnadelbiopsie
eine sichere und genaue Möglichkeit zur Sicherung der Diagnose (Varadarajulu et al.
2005).
Die Rolle verschiedener Biomarker wie CA19-9, Cancer-Antigen 125 (CA125) und
Carcinoembryonales Antigen (CEA) in der Diagnostik des duktalen Adenokarzinoms des
Pankreas ist Gegenstand der aktuellen Forschung und wird kontrovers diskutiert. In der
heutigen klinischen Routine wird die Bestimmung der Serumkonzentration des CA19-9
angewandt. CA19-9 ist ein Antigen, das von Zellen exokriner Epithelien produziert und
normalerweise auf der Oberfläche von Erythrozyten absorbiert wird. Die Zellen des
Bauchspeicheldrüsenkrebses sezernieren eben dieses Oliogosaccharid (Winter et al.
2013). Zur Früherkennung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist die Bestimmung des
Serumspiegels von CA19-9 als Screening - Untersuchung in der asymptomatischen
Bevölkerung nach einer japanischen Studie nicht sinnvoll (Homma et al. 1991). Auch in
einer koreanischen Studie an über 70.000 asymptomatischen Personen konnte festgestellt
werden, dass aufgrund des sehr niedrigen positiven prädiktiven Wertes der
Serumspiegelbestimmung von CA19-9 bezüglich des Pankreaskarzinoms eine Screening
- Untersuchung nicht effizient ist (Kim et al. 2004). Eine andere Studie kommt zu dem
Ergebnis, dass CA19-9 bereits erhöht ist, bevor sich erste Symptome zeigen, und schlägt
eine Screeninguntersuchung für Risikopersonen vor. Es ist jedoch anzumerken, dass es
sich bei den untersuchten Personen nur um postmenopausale Frauen gehandelt hat und
die Fallzahl mit 154 Personen eher gering ist. Hervorzuheben ist jedoch, dass eine CA19-
12
9 Serumspiegelbestimmung keine diagnostische Sicherheit bietet und eher als ergänzende
Maßnahme zu den bereits erläuterten Möglichkeiten anzusehen ist (Baghbanian et al.
2013).
4.1.6. Therapie und Prognose
Das Pankreaskarzinom wird meistens erst in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert, was
bei 80 – 85% der Patienten eine chirurgische Resektion unmöglich macht. Aktuell ist aber
eben diese chirurgische Resektion der einzige kurative Heilungsansatz. Erschwerend
kommt noch hinzu, dass der Bauchspeicheldrüsenkrebs auf viele Chemotherapeutika nur
schlecht anspricht (Vincent et al. 2011).
Bei Patienten mit resktablen Pankreaskarzinom sollte, wenn möglich, eine Resektion
durchgeführt
werden,
da
eine
alleinige
Chemotherapie,
Radiotherapie
oder
Radiochemotherapie schlechtere Überlebensraten erzielt (Doi et al. 2008). Bezüglich der
Resektabilität werden in der Literatur unterschiedliche Angaben gemacht. Das National
Comprehensive Cancer Network (NCCN) definiert lokalisierte und resektable
Pankreastumoren anhand dreier Kriterien. Es sollten keine Fernmetastasen bestehen und
es sollte keine Infiltration, Distorsion oder Umhüllung sowie kein Tumorthrombus der
Vena mesenterica superior oder der Pfortader radiologisch nachweisbar sein. Auch
sollten deutliche Fettflächen um den Truncus coeliacus, die Arteria hepatica sowie die
Arteria mesenterica superior bestehen (Callery et al. 2009). Die aktuelle S3-Leitlinie zum
exokrinen Pankreaskarzinom verweist bezüglich der Kriterien von grenzwertig
resektablen Tumoren ebenfalls auf die NCCN Guidelines (Seufferlein 2013). Die
Standardoperation beim Pankreaskopfkarzinom ist die partielle Doudenopankreatektomie
(klassische
Operation
nach
Whipple)
oder
die
Pylorus
erhaltende
Duodenopankreatektomie. Beide Operationen sind gleichwertige Alternativen (Diener et
al. 2014). Bei Karzinomen des linksseitigen Pankreas ist die Pankreaslinksresektion mit
einer Splenektomie die Therapie der Wahl (Gebhardt et al. 2000). Bei allen Resektionen
sollte ein Sicherheitsabstand zum gesunden Gewebe von mindestens einem Millimeter
eingehalten werden. Patienten, bei denen der Sicherheitsabstand unterschritten wurde,
haben die gleiche Prognose wie Patienten ohne vorhandenen Sicherheitsabstand
(Campbell et al. 2009).
Wenn es möglich ist, sollte nach einer kurativen Resektion eine adiuvante Chemotherapie
durchgeführt werden. Es wurde gezeigt, dass eine adiuvante Chemotherapie mit
Gemcitabin (Ueno et al. 2009) oder Floururacil in Kombination mit Folinsäure
(Neoptolemos et al. 2010) der alleinigen Operation überlegen ist. Auch Patienten mit
13
inkompletter Resektion profitieren von einer postoperativen Chemotherapie mit
Gemcitabin (Oettle et al. 2007).
Aufgrund der fehlenden Frühsymptome und der damit einhergehenden späten Diagnose
präsentiert sich das Tumorleiden häufig in einem schon fortgeschrittenen Stadium, das
einen palliativen Therapieansatz erfordert. In dieser Situation sollte, soweit möglich, eine
die Symptomlast der Patienten reduzierende, palliative Chemotherapie durchgeführt
werden.
Patienten
mit
metastasiertem
Bachspeicheldrüsenkrebs
in
gutem
Allgemeinzustand können von einer Kombinationschemotherapie aus 5-Floururacil,
Folinsäure, Irinotecan und Oxaliplatin profitieren (Conroy et al. 2011). Wenn dieses
Therapieregime nicht möglich sein sollte, stellt die Kombination von nab-Paclitaxel mit
Gemcitabine eine Alternative dar. Die Kombination beider Wirkstoffe ist der alleinigen
Therapie mit Gemcitabin überlegen (Von Hoff et al. 2013)
Insgesamt ist die Prognose des Pankreaskarzinoms schlecht. Die FünfjahresÜberlebensrate beträgt durchschnittlich für alle Patienten im Stadium IA 13,6%, IB
11,7%, IIA 6,5%, IIB 5,1%, III 2,7% und im Stadium IV nur 0,7%. Wenn eine Resektion
des Tumors durchgeführt wurde, ist die Prognose besser als bei nicht resezierten
Tumoren. Bei pankreatektomierten Patienten im Stadium IA beträgt die FünfjahresÜberlebensrate 33,4%, wohingegen sie bei Patienten im gleichen Stadium, deren Tumor
nicht reseziert werden konnte, nur bei 3,8% liegt (Bilimoria 2007).
4.1.7. Die Rolle der Strahlentherapie beim Pankreaskarzinom
Die Rolle der Strahlentherapie beim Pankreaskarzinom ist nicht abschließend geklärt und
Gegenstand von aktuellen Studien. Eine adiuvante Radio-Chemo-Therapie (RCT) nach
einer vollständigen Resektion mit ausreichendem Sicherheitssaum um den Tumor oder
eine postoperative RCT nach einer unvollständigen Resektion oder ungenügendem
Sicherheitssaum um den Tumor sollte nur im Rahmen von Studien stattfinden, da die
bisherige Studienlage kontrovers ist. Die adiuvante RCT nach einer kompletten Resektion
oder die postoperative RCT nach inkompletter Resektion scheint der alleinigen
Chemotherapie nicht überlegen (Stocken et al. 2005), wobei die in der Metaanalyse
eingeschlossenen Studien von älterem Datum sind und nicht den aktuellen
technologischen Stand der Radioonkologie repräsentieren. Diese unklare Situation ist
jedoch Gegenstand aktueller Studien.
Die neoadiuvante RCT sollte bei resektabelen Adenokarzinomen des Pankreas ebenfalls
nicht außerhalb von Studien durchgeführt werden, da, obwohl die lokale Kontrolle
verbessert
wird,
kein
Überlebensvorteil
14
gegenüber
der
sofortigen
Operation
nachgewiesen werden konnte (Barbier et al. 2011). Bei dem lokal fortgeschrittenen
inoperablen Pankreaskarzinom kann durch eine neoadiuvant intendierte RCT in einigen
Fällen eine Resektabilität erreicht werden, wodurch die betroffenen Patienten eine
bessere Prognose haben als solche Patienten, bei denen keine Resektion durchgeführt
werden kann (Seufferlein 2013). Aktuelle Studien versuchen auch hier die Rolle der
Strahlentherapie in der neoadiuvanten Therapie des Pankreaskarzinoms zu klären.
In der palliativen Situation erzeugt die RCT gegenüber der alleinigen Chemotherapie
einen signifikanten
Überlebensvorteil
beim lokal fortgeschrittenen inoperablen
Pankreaskarzinom (Huguet et al. 2007; Loehrer et al. 2011). Es wird ein sequenzielles
Vorgehen empfohlen, bei dem vor der RCT eine Induktionschemotherapie durchgeführt
wird. Diejenigen Patienten, deren Tumorleiden während der Induktionschemotherapie
nicht progredient ist, können am ehesten von der folgenden RCT profitieren (Krishnan et
al. 2007). Dieses Therapiekonzept wird im Rahmen der CONKO-007 Studie aktuell auch
auf seinen Stellenwert in der neoadiuvanten Therapie des Bauchspeicheldrüsenkrebses
untersucht.
4.2.
Immunsystem
4.2.1. Aufbau des Immunsystems
Das Immunsystem kann in das spezifische und unspezifische System unterteilt werden,
die zusammen arbeiten. Die unspezifische oder angeborene Immunität reagiert
unmittelbar auf Pathogene und besteht aus humoralen und zellulären Bestandteilen. Die
spezifische oder erworbene Immunität ist in jedem Individuum einzigartig und wird erst
durch Kontakt mit einem Antigen aktiviert. Sie besitzt die Fähigkeit extrem langlebige
Zellen zu produzieren, die das immunologische Gedächtnis des Organismus bilden.
Im unspezifische System gehören die neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, das
Monozyten-Makrophagen-System, dendritische Zellen und die natürliche Killerzellen zu
den zellulären Bestandteilen. Humorale Bestandteile sind Zytokine, Akute-PhaseProteine, Defensine und das Komplentsystem. Diese Bestandteile hängen eng zusammen.
Das spezifische System besteht im Wesentlichen aus antigenspezifisch arbeitenden Tund B-Lymphozyten sowie den von ihnen produzierten Immunglobulinen und Zytokinen.
Um einen T-Lymphozyten zu aktivieren, muss diesem das passende und aufgearbeitete
Antigen auf einem humanen-Leukozyten-Antigen (HLA) präsentiert werden. Alle
kernhaltigen Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche Klasse-I-HLA-Moleküle, die CD8+
15
zytotoxische T -Zellen aktivieren können. Zytotoxische T-Zellen können die gebundenen
Zellen töten. Antigen präsentierenden Zellen wie B-Lymphozyten, Monozyten,
Makrophagen oder dendritische Zellen präsentieren Antigene auf Klasse-II-HLAMolekülen, die ausschließlich von CD4+ T-Helferzellen erkannt werden. CD4+ T-Zellen
können die Immunantwort entweder verstärken (TH1- /TH2-Zellen) oder dämpfen (Treg).
Die B-Lymphozyten werden durch CD4+ T-Zellen über ihre MHC-Moleküle oder durch
Zytokine aktiviert, wenn sie das passende Antigen auf ihrem B-Zell-Rezeptor gebunden
haben. Daraufhin vermehrt sich die aktivierte B-Zelle und differenziert sich zur
antikörperproduzierenden
Plasmazelle
und
zur
B-Gedächtniszelle,
die
das
immunologische Gedächtnis des Organismus darstellt. Wenn die gebildeten Antikörper
das passende Antigen binden, so inaktivieren sie diese und erleichtern deren Phagozytose.
Zudem aktivieren sie das Komplementsystem (Angstwurm et al. 2012).
4.2.2. Tumor - assoziierte - Makrophagen (TAM)
Monozyten entstammen der myeloischen Zellreihe und differenzieren sich zu
Makrophagen, wenn sie in das periphere Gewebe übertreten. Dort übernehmen sie
Aufgaben wie die Phagozytose oder die Antigenpräsentation (Chaplin 2010).
Makrophagen können sich in verschiedene Subgruppen differenzieren. Über Interferon-γ
(IFN-γ) werden sie von TH1-Zellen angeregt, sich zu einem proinflammatorischen
Makrophagen zu differenzieren. TH2-Zellen können über die Zytokine Interleukin 4,
Interleukin 5 und Interleukin 13 eine Differenzierung zu einem antiinflammatorischen
Makrophagen auslösen (Gordon 2003). Entsprechend ihrer Aktivierung durch TH1-Zellen
wird diese Makrophagenantwort als M1-Antwort bezeichnet, wohingegen die durch TH2Zellen ausgelöste Makrophagenantwort als M2-Antwort bezeichnet wird (Mills et al.
2000).
Aktivierte Makrophagen des M1-Phänotyps sind in der Lage, Mikroorganismen und
Tumorzellen zu töten sowie proinflammatorische Zytokine auszuschütten. Die
Makrophagen des M2-Phänotyps hingegen beeinflussen die Entzündungsreaktion,
entfernen Detritus, fördern die Angiogenese sowie die Gewebeheilung. Die Monozyten
werden durch verschiedene Zytokine wie den Colony-Stimulating-Factor-1 (CSF-1), den
Vascular-Endothelial-Growth-Factor (VEGF) oder Chemokine zur Migration in das
Tumorgebiet und zur Differenzierung angeregt. Teilweise werden ebendiese Botenstoffe
vom Tumor selbst produziert (Murdoch et al. 2004). Es wird angenommen, dass durch
die vom Tumor selbst oder die von den T-Zellen ausgeschütteten Zytokine die meisten
TAM den M2-Phänotyp annehmen (Mantovani et al. 2002). Schon frühe, nicht invasive
16
Tumore scheinen Makrophagen und andere inflammatorische Zellen in das sie
umgebende Stroma zu locken. Dort fördern sie die Tumorinvasion, indem sie mit ihren
verschiedenen Proteasen die Basalmembran schädigen und den Tumorzellen das
Wachstum in das umgebende Stroma erleichtern. Auch fördern sie durch die Abgabe
verschiedener Stoffe gerade in den hypoxischen Bereichen um den Tumor die
Angiogenese. In den hypoxischen Arealen unterdrücken sie außerdem die antitumeröse
Wirkung der anderen Zellen des Immunsystems. Die Metastasierung fördern sie zudem
dadurch, dass sie die Mobilität der Tumorzellen erhöhen und sie in Richtung der
Blutgefäße anziehen (Lewis et al. 2006).
4.2.3. Tumor - infiltrierende - Lymphozyten (TIL)
In Studien wurde bereits ein Zusammenhang zwischen TIL und der Prognose von
Malignomerkrankungen gefunden. Zytotoxische CD8+ TIL sind dabei mit einem besseren
Überleben assoziiert, während sich die Situation bei den regulatorischen FoxP3+-Zellen
schwieriger darstellt. Man geht davon aus, dass sie die Funktion des Immunsystems
unterdrücken und damit vorteilhaft für den Tumorprogress sein würden. Aktuell
verbreitet sich jedoch auch die Meinung, dass FoxP3+-Zellen mit einer besseren Prognose
verbunden sein können (deLeeuw et al. 2012).
CD8+ T-Zellen können die von Tumorzellen auf MHC-I Molekülen präsentierten
tumorspezifischen Antigene erkennen. Von den tumorspezifischen Antigenen aktiviert
können CD8+-Zellen die als körperfremd erkannte Zelle entweder zytolytisch oder durch
die Sekretion von Zytokinen wie TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) oder IFN-γ zerstören
(Savage et al. 2014). Die Annahme, dass zytotoxische T - Zellen Tumorzellen angreifen
und zerstören können, ist dadurch bestätigt worden, dass eine hohe Dichte von CD8+ bei
vielen Tumorentitäten ein unabhängiger und positiver prognostischer Faktor ist (Kim et
al. 2007).
Treg spielen eine wichtige Rolle in der Selbsttoleranz sowie in der Regulation von
Immunreaktionen und das FoxP3 ist ein Treg spezifischer Transkriptionsfaktor
(Sakaguchi et al. 2008). Das seltene IPEX-Syndrom (Immune dysregulation,
polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked) ist durch eine angeborene Mutation in eben
diesem FoxP3-Gen verursacht und durch Autoimmunprozesse in mehreren Organen
charakterisiert (Barzaghi et al. 2012), was die wichtige Rolle dieses Transkriptionsfaktors
verdeutlicht.
17
5.
Methoden
5.1.
Kollektiv
Diese Arbeit basiert auf einem Kollektiv von 63 Patienten mit einem Adenokarzinom des
Pankreas, die im Zeitraum von 1996 bis 2012 an der Strahlenklinik der Universitätsklinik
Erlangen-Nürnberg behandelt wurden. Patienten mit Tumoren anderer histologischer
Subgruppen wurden ausgeschlossen. Von diesen 63 Patienten sind 31 weiblichen und 32
männlichen Geschlechts. Das Durchschnittsalter bei der Diagnosestellung beträgt 63,6
Jahre, wobei der jüngste Patient 44,7 Jahre alt ist und der älteste 78,6 Jahre.
Der Tumor der Mehrzahl der 63 Patienten wurde nach den Kriterien der UICC genauer
klassifiziert. Nach der zum jeweiligen Diagnosezeitpunkt gültigen UICC Klassifikation
befanden sich 8 Patienten im Stadium I, 32 Patienten im Stadium II, 12 Patienten im
Stadium III und 8 Patienten im Stadium IV (Abbildung 1). Der Primärtumor war bei 6
Patienten im T1 Stadium, bei 7 Patienten im T2 Stadium, bei 36 Patienten im T3 Stadium
sowie bei 11 Patienten im T4 Stadium. 31 Patienten wiesen zum Diagnosezeitpunkt
bereits Lymphknotenmetastasen (N1) auf, bei 10 Patienten waren Fernmetastasen (M2)
nachweisbar (Tabelle 3).
UICC Stadien
35
30
25
20
15
Anzahl
10
5
0
I
II
III
IV
Abbildung 1: Aufteilung der Kollektivs nach UICC Klassifikation
Tabelle 3: Aufteilung des Kollektivs nach TNM - Klassifikation
18
TNM - Klassifikation
Anzahl Patienten
T1
6
T2
7
T3
36
T4
10
N0
27
N1
31
M0
53
M1
10
33 Patienten wurden neoadiuvant einer kombinierten Radio-Chemotherapie unterzogen. 4
von diesen Patienten konnten nicht operiert werden, während bei 9 Patienten eine
Pankreaslinksresektion und bei 20 Patienten eine Doudenopankreatektomie nach Whipple
durchgeführt werden konnte. 7 Patienten wurden adiuvant und weitere 18 Patienten im
palliativen Sinne bestrahlt.
Die Daten wurden beim Erlanger Tumorzentrum abgefragt und mithilfe des Archives des
Pathologischen Institutes der Universitätsklinik so weit wie möglich vervollständigt. Die
fehlenden Daten waren nicht zu ermitteln.
5.2.
Herstellung der Tissue - Microarrays (TMA)
Insgesamt wurde von 63 Patienten Gewebe des Primärtumors gewonnen. Von diesen
konnte bei 28 Patienten zusätzlich Gewebe der Invasionsfront des Primärtumors und bei
32 Patienten Gewebe vom Normalgewebe des Pankreas gewonnen werden. Von diesen
123 Gewebeproben wurden TMAs angefertigt.
Um diese TMAs anzufertigen wurden die entsprechenden, in Paraffinblöcken
eingebetteten Gewebeproben und die dazugehörigen feingeweblichen Schnitte aus dem
Archiv des Pathologischen Institutes der Universitätsklinik Erlangen entnommen. Die mit
Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Schnitte dienten als Schablone für ihre dazugehörigen
Paraffinblöcke, auf den Schnitten wurden die jeweiligen Gebiete mithilfe eines
Lichtmikroskops eingezeichnet. Mit Hilfe dieser Schablone wurden die markierten Areale
19
durch eine Hohlnadel aus dem Paraffinblock entnommen. Bis zu 60 entnommene
Stanzzylinder wurden in einem TMA Block zusammen neu eingebettet.
5.3.
Immunhistologische Färbung
Von den TMA - Paraffinblöcken wurden drei feingewebliche Schnitte angefertigt. Ein
Schnitt wurde einfach immunhistologisch gefärbt, bei den zwei anderen Schnitten
erfolgte
eine
immunhistologische
Doppelfärbung.
Es
entstanden
also
369
unterschiedliche Gewebeproben.
5.3.1. E-Cadherin
Um zwischen Tumorgewebe und stromalen Gewebe differenzieren zu können, wurde
eine immunhistologische Färbung mit einem Antikörper gegen E-Cadherin vorgenommen
(Abbildung 2). Das Molekül E-Cadherin dient der Zell - Zell - Adhäsion und kommt in
menschlichen Epithelien vor (Geiger et al. 1992).
Die immunhistologische Färbung mit dem Antikörper gegen E-Cadherin (BD,
Heidelberg, Germany) wurde mit dem vollautomatischen Ventana BenchMark Ultra
Färbesystem (Roche, Grenzach-Wyhlen, Germany) durchgeführt. Zur Antigenerkennung
wurde ein CCL Puffer (Benchmark ULTRACC1, Roche, Germany) verwendet und die
Zellkerne wurden mit Hämatoyxlin angefärbt.
Abbildung 2: Tumorgewebe (bräunlich) umgeben von stromalem Gewebe
(Vergrößerung 20:1)
20
5.3.2. CD68 und CD163
Um zwischen Makrophagen des M-1 und des M-2 Phänotyps differenzieren zu können
wurde eine immunhistologische Doppelfärbung mit Antikörpern gegen CD68 und CD163
Moleküle vorgenommen (Abbildung 3). CD68 ist ein Pan-Makrophagen Marker,
wohingegen CD163 ein spezifischer Marker für Makrophagen vom M-2 Phänotyp ist
(Brown et al. 2009).
Für die Färbung wurde zunächst ein Feingewebsschnitt von dem TMA Paraffinblock
angefertigt. Der Schnitt wurde mittels Xylol und Ethanollösung entparaffiniert. Der im
TRIS-Puffer gelagerte Schnitt wurde nun im Dampftopf zur Antigendemaskierung
gekocht. Nach der Antigendemaskierung fand eine Spülung mit TRIS-Puffer statt. Im
Folgenden wurde der Schnitt für eine Nacht in einer Lösung mit dem Primärantikörper
gegen CD163 (Novocastra, NCL - CD 163) und Humanalbumin im Verhältnis 1:500
gelagert. Anschließend wurde der Schnitt mit einem AP-Polymer-Kit (Zytomed, Berlin,
Germany) und Fast Red angefärbt. Nachdem der Schnitt erneut mit TRIS-Puffer gespült
wurde, musste er für eine Stunde zusammen mit einer Lösung aus dem
Sekundärantikörper gegen CD68 (Dako, Code M 0876) und Humanalbumin im
Verhältnis 1:200 gelagert werden. Die Färbung wurde mittels eines AP-Polymer-Kits
(Zytomed, Berlin, Germany) und Fast Blue durchgeführt. Nach einer Spülung mit TRISPuffer erfolgte die Eindeckelung mit einem wässrigen Eindeckmedium.
Abbildung 3: Immunhistologische Färbung mit Antikörpern gegen CD163 (rot) und
CD68 (blau) (Vergrößerung 20:1)
21
5.3.3. FoxP3 und CD8
Die immunhistologische Doppelfärbung mit Antikörpern gegen das FoxP3 und das CD8
Molekül dient der Identifikation von Treg und zytotoxischen CD8+ T - Zellen (Abbildung
4). Das FoxP3 ist ein für Treg spezifischer Transkriptionsfaktor (Sakaguchi 2008). Adulte
Lymphozyten exprimieren entweder das CD4 oder das CD8 Molekül, wobei das CD8
Molekül die Identifikation von zytotoxischen T - Zellen erlaubt (Andersen et al. 2006).
Für die Färbung wurde zunächst ein Feingewebsschnitt von dem TMA Paraffinblock
angefertigt. Für die FoxP3 - Färbung wurde die Biotin - Streptavidin - Komplex-Methode
mit einer Verstärkung durch Tyramin angewandt. Die gleiche Methode ohne Verstärkung
wurde für die CD8 - Färbung verwendet. Um den Schnitt zu entparaffinieren, musste er in
Xylol- und Ethanol - Lösungen in verschiedenen Konzentrationen gebadet werden. Im
nächsten Schritt wurde der Schnitt in einer Zitronensäurepufferlösung bestehend aus 2,1
Gramm Zitronensäure auf 1 Liter Aqua mit einem pH-Wert von 6 gelagert. Zur
Antigendemaskierung wurde das Gefäß mit dem Schnitt für fünf Minuten in einem
Wasserbad im Dampftopf bei 120° Celsius gekocht. Anschließend wurde der
Objektträger mit dem Schnitt auf der Unterseite auf eine Cuverplatte gelegt, auf die
vorher 1 L TRIS - Puffer zusammen mit 1ml TWEEN gegeben wurden. Die dann in einen
Ständerkasten gestellte Cuverplatte wurde mit TRIS/TWEEN - Puffer aufgefüllt. Der
TRIS/TWEEN - Puffer wurde abgelassen und fünf Tropfen Blocking Sol. 1 wurde in die
Kammer gegeben. Nach fünf Minuten fand eine erneute Spülung mit TRISS/TWEEN Pufferlösung statt. Anschließend wurde die Lösung bestehend aus dem FoxP3 Antikörper
(abcam, Code 20034) und Humanalbumin im Verhältnis 1:100 über Nacht zu dem
Objektträger gegeben. Nach der Einwirkzeit wurde die Kammer erneut mit
TRISS/TWEEN - Lösung gespült und nach seinem Ablaufen fünf Tropfen Post Block
Reagent 2 in die Kammern geträufelt. Die Kammer wurde nach 20 Minuten wiederum
mit TRISS/TWEEN Lösung gespült und dann mit fünf Tropfen AP-Polymer-Kit
(Zytomed, Berlin, Germany) beträufelt, der eine halbe Stunde einwirken musste. Nach
erneuter Spülung mit TRISS/TWEEN Lösung wurden drei Tropfen Fast Red Lösung auf
den Objektträger geträufelt, der für 20 Minuten bei Raumtemperatur zugedeckt
verbleiben musste. Danach wurde der Objektträger unter fließendem Wasser abgespült
und in einem Gefäß wieder mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Für die zweite Färbung
muss der Schnitt für eine Minute im Zitronensäurepuffer (pH=6) in einer Mikrowelle
zum kochen gebracht werden. Daraufhin musste er für eine Stunde in einer Lösung
einwirken, in der sich CD8-Antikörper (Dako, Code M7103) und Humanalbumin im
Verhältnis 1:50 befanden, worauf eine Spülung mit TRISS/TWEEN Lösung folgte.
22
Nachdem ein Tropfen Brij (Polyalkylenglycolether) aufgebracht wurde, wirkte der
Antikörper in Lösung von 1:50 erneut eine halbe Stunde ein. Nach wiederholtem Spülen
mit TRISS/TWEEN Lösung wurde der Objektträger für 30 min in einem Strept -AB Komplex (Dako, Code K 391) eingelegt. Die Färbung durch eine Fast-Blue-Farbreaktion
erfolgte nach erneutem Spülen mit TRISS/TWEEN Lösung. Bevor die Gegenfärbung
mittels Hämalaun erfolgen konnte, musste der Objektträger unter fließendem Wasser
abgespült werden und in destilliertem Wasser eingelegt werden. Im letzten Schritt
erfolgte die Eindeckelung mit einem wässrigen Eindeckmedium.
Abbildung 4: Immunhistologische Färbung mit Antikörpern gegen FoxP3 (rot) und
CD8 (blau) (Vergrößerung 20:1)
5.4.
Auswertung
Für die Auswertung wurden die TMAs im ersten Schritt digitalisiert. Dies erfolgte mittels
eines hochauflösenden Scanners (MIRAX-Scanner, Zeiss, Oberkochen, Deutschland).
Die nun digitalisierten TMAs wurden mittels des Programms Pannoramic Viewer (3D
Histech,
Budapest,
Ungarn)
in
kleinere
Untereinheiten
zugeschnitten.
Die
zugeschnittenen Bildteile wurden mit dem Programm Irfan View (Irfan Skiljan, Wien,
Österreich) überspeichert, damit sie im nächsten Schritt weiter bearbeitet werden
konnten. Mit Hilfe des Bildanalyseprogramms Biomas (PD Dr. Distel, Strahlenklinik
Erlangen, Deutschland) wurden die Untereinheiten der TMAs in die einzelnen runden
Gewebsstanzen zugeschnitten.
Es lagen nun von jedem ausgestanzten Gewebszylinder drei übereinanderliegende
unterschiedlich gefärbte Schnitte vor. Damit eine präzise Auswertung möglich war,
mussten die drei übereinanderliegenden Schnitte nun genau aufeinander ausgerichtet
23
werden. Als Grundlage dazu dienten die Cadherin-E-Färbung bzw. die FoxP3/CD8 Färbung, auf die die anderen Schnitte mithilfe des Programms Biomas ausgerichtet
wurden. Ebenfalls mithilfe des Biomas-Programms wurden nun in allen Gewebszylindern
in der Cadherin-E-Färbung die intraepithelialen Gebiete und das sie umgebene stromale
Gebiet definiert. Die in der Cadherin-E-Färbung definierten Gebiete konnten vom
Biomas - Programm auf Grund der bereits erfolgten Ausrichtung der anderen Schnitte auf
eben diese übertragen werden. Nachdem die intraepithelialen und stromalen Gebiete
definiert waren, zählte das Biomas-Programm halbautomatisch in Einzelschritten die
vorhandenen Zellen. Nach dem automatischen Zählen und Markieren eines Merkmals
konnten noch manuell Änderungen vorgenommen werden. Die jeweilige Häufigkeit der
Merkmale in einer Stanzzylinderserie schrieb das Biomas-Programm in eine Exel-Tabelle
(Microsoft Office, Microsoft, USA).
5.5.
Statistik
Das Biomas - Programm errechnete aus der absoluten Zellzahl und der betrachteten
Fläche die relative Zelldichte pro mm2. Die relative Zelldichte pro mm2 wurde für alle
Färbungen der Stanzzylinder für das stromale und intraepitheliale Gebiet errechnet. Es
lagen nun für jedes Merkmal in dem zentralen Tumorgewebe, der Invasionsfront des
Tumors und dem Pankreasnormalgewebe jeweils im intraepithelialen und stromalen
Gebiet die Zellzahlen pro mm2 vor. Alle diese Gruppen wurden an ihrem Median in
kleiner als der Median „0“ und größer als der Median „1“ aufgeteilt.
Beim Erlanger Tumorzentrum wurden bezüglich der 63 Patienten des Kollektivs die
Daten zum rezidivfreien Überleben, metastasenfreien Überleben, Gesamtüberleben sowie
zur Komplettremission und dem tumorbedingten Tod abgefragt. Anhand dieser Daten
wurden für die beiden am Median getrennten Gruppen die Kaplan-Meier-Kurven
berechnet. Mithilfe des Log-Rank Testes wurden die Überlebenszeiten der beiden
Gruppen untersucht und festgestellt, ob sie signifikant verschieden sind. Die Berechnung
der Kaplan-Meier-Kurve und des Signifikanzniveaus mittels Log-Rank-Tests erfolgte mit
der Statistik- und Analysesoftware SSPS (IBM Deutschland GmbH, Nürnberg,
Deutschland).
6.
Ergebnisse
24
6.1. Zellverteilung und Anzahl
6.1.1. CD68
25
Zellzahl / mm2
CD68 intraepithelial
20
CD68 stromal
15
10
5
0
Central
Invasionsfront
Normalgewebe
Abbildung 5: Durchschnittliche Anzahl CD68+ Zellen in den verschiedenen
Geweben
Die Anzahl der CD68+ Zellen ist intraepithelial durchweg höher als stromal.
Durchschnittlich finden sich pro mm2 intraepithelial im zentralen Tumor 20,6 Zellen, in
seiner Invasionsfront 18,3 und im normalen Pankreasgewebe 12,2 Zellen. Die
durchschnittliche Anzahl der stromal gelegenen CD68+ Zellen ist geringer und weist die
gleiche Tendenz auf. Im zentralen Tumor befinden sich stromal mehr Zellen (9,0 pro
mm2) als in der Invasionsfront (7,0 pro mm2) und im Pankreasnormalgewebe (5,2 pro
mm2) (Abbildung 5).
25
6.1.2. CD163
350
CD163 Intraepithelial
CD163 stromal
Zellzahl / mm2
300
250
200
150
100
50
0
Central
Invasionsfront
Normalgewebe
Abbildung 6: Durchschnittliche Anzahl CD163+ Zellen in den verschiedenen
Geweben
Stromal sind durchweg mehr CD163+ Zellen gelegen als intraepithelial. Am meisten
Zellen sind stromal beim zentralen Tumor gelegen (304,6 pro mm2), während an der
Invasionsfront (271,8 pro mm2) und im Normalgewebe (263,8 pro mm2) weniger Zellen
vorhanden sind. Intraepithelial sind die CD163+ Zellen zwischen den verschiedenen
Gewebslokalisationen recht homogen verteilt (Tumor zentral: 220 pro mm2,
Invasionsfront: 240 pro mm2, Normalgewebe: 215,5 pro mm2) (Abbildung 6).
26
6.1.3. FoxP3
Zellzahl / mm2
60
FoxP3 Intraepithelial
FoxP3 stromal
50
40
30
20
10
0
Central
Invasionsfront
Normalgewebe
Abbildung 7: Durchschnittliche Anzahl FoxP3+ Zellen in den verschiedenen
Geweben
Stromal sind erneut durchweg mehr FoxP3+ Zellen vorhanden als intraepithelial. Im
Stroma des zentralen Tumors sind die meisten FoxP3+ Zellen lokalisiert (50,6 pro mm2).
Im Stroma der Invasionsfront sind durchschnittlich 41,0 Zellen pro mm2 vorhanden,
während sich im Normalgewebe nur 21,5 Zellen pro mm2 befinden. Intraepithelial liegen
im zentralen Tumor (25,88 pro mm2) und in der Invasionsfront (27,5 pro mm2) etwa
gleich viele Zellen, wohingegen im Normalgewebe weniger vorhanden sind (9,3 pro
mm2) (Abbildung 7).
27
6.1.4. CD8
180
CD8 Intraepithelial
CD8 stromal
Zellzahl / mm2
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Central
Invasionsfront
Normalgewebe
Abbildung 8: Durchschnittliche Anzahl CD8+ Zellen in den verschiedenen Geweben
Die durchschnittliche Verteilung der CD8+ Zellen ist sehr unterschiedlich. Die meisten
Zellen liegen stromal im zentralen Tumor (161,2 pro mm2), während sich in der
Invasionsfront (143,3 pro mm2) und im Normalgewebe (139,8 pro mm2) weniger Zellen
befinden. Intraepithelial liegen im normalen Pankreasgewebe die größte Anzahl CD8+
Zellen (119,8 pro mm2), wohingegen sich im zentralen Tumor (83,1 pro mm2) und in der
Invasionsfront (108,6 pro mm2) weniger Zellen befinden (Abbildung 8).
28
6.2. Die Zellverteilung und Anzahl als prognostischer Faktor
6.2.1. CD68+ Zelldichte im Verhältnis zum rezidivfreien Überleben
Abbildung 9: Dichte der stromalen CD68+ Zellen pro mm2 des
Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum rezidivfreien Überleben in Monaten
(p=0,181)
Es besteht die Tendenz, dass diejenigen Patienten, deren stromale CD68+ Zellzahl im
Pankreasnormalgewebe kleiner als der Median ist, länger rezidivfrei überleben als
Patienten, deren Zellzahl größer als der Median ist (Abbildung 9). Die gleiche Tendenz
besteht bei der intraepithelialen Zellzahl.
29
6.2.2 Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben
Abbildung 10: Dichte der intraepithelialen CD68+ Zellen pro mm2 des zentralen
Tumors im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben in Monaten (p=0,085)
Bei Patienten, deren intraepitheliale CD68+ Zellzahl im zentralen Tumor größer als der
Median ist, besteht eine Tendenz zu einem längeren metastasenfreien Überleben als bei
Patienten, deren Zellzahl geringer als der Median ist (Abbildung 10). Die gleiche
Tendenz ließ sich für die intraepitheliale und stromale CD68+ Zellzahl in der
Invasionsfront des Tumors beobachten.
30
6.2.3. Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben
Abbildung 11: Dichte der intraepithelialen CD68+ Zellen pro mm2 des
zentralen Tumors im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben in Monaten
(p=0,049)
Es besteht ein Unterschied bezüglich des progressionsfreien Überlebens bei der
intraepithelialen Zellzahl im zentralen Tumor. Patienten, deren CD68+ Zellzahl größer als
der Median ist, haben ein längeres progressionsfreies Überleben als Patienten, deren
Zellzahl kleiner ist (Abbildung 11). Eine Tendenz in die gleiche Richtung besteht bei der
stromale Zellzahl der Invasionsfront.
31
6.2.4. Dichte der CD68+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben
Abbildung 12: Dichte der stromalen CD68+ Zellen pro mm2 des
Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum Gesamtüberleben in Monaten (p=0,082)
Bei dem Gesamtüberleben besteht die Tendenz, dass Patienten mit einer CD68+ Zellzahl,
die kleiner als der Median ist, länger überleben als Patienten, deren Zellzahl größer als
der Median ist (Abbildung 12). Diese Beobachtung wurde bei dem Stroma des zentralen
Tumors und des Pankreasnormalgewebes sowie bei dem intraepithelialen Bereich der
Invasionsfront und des Pankreasnormalgewebes gemacht.
32
Abbildung 13: Einfluss von CD68+ Zellen auf das Gesamtüberleben, wenn sowohl
ihre intraepitheliale als auch ihre stromale Zellzahl bei einem Patienten im
Normalgewebe des Pankreas unterhalb des Medians liegt (p=0,026)
Aus der Abbildung 13 geht hervor, dass die Patienten, deren intraepitheliale sowie
stromale CD68+ Zellzahl innerhalb des Pankreas Normalgewebes unterhalb des Medians
liegt, ein längeres Gesamtüberleben vorweisen als die restlichen Patienten. Patienten mit
niedrigen CD68+ Zellzahlen sind gegenüber denen im Vorteil, deren Zellzahl in beiden
Gewebslokalisationen oberhalb des Medians liegt (Abbildung 13).
33
6.2.5. Dichte der CD163+ Zellen im Verhältnis zum frühzeitigen Tumortod
Abbildung 14: Dichte der stromalen CD163+ Zellen pro mm2 der Invasionsfront des
Tumors im Verhältnis zum frühzeitigen Tumortod in Monaten
(p=0,075)
Bei der Invasionsfront des Tumors zeigt sich intraepithelial wie stromal die Tendenz,
dass Patienten mit CD163+ Zellzahlen, die kleiner als der Median sind, eher einen
frühzeitigen Tumortod erleiden als Patienten, deren Zellzahl größer als der Median ist
(Abbildung 14).
34
Abbildung 15: Dichte der stromalen CD163+ Zellen pro mm2 des
Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum frühzeitigen Tumortod in Monaten
(p=0,026)
Im stromalen Pankreasnormalgewebe zeigt sich ein gegensätzlicher Unterschied im
Vergleich zu der Invasionsfront. Hier erleiden Patienten mit einer CD163+ Zellzahl, die
größer als der Median ist, eher einen frühzeitigen Tumortod als Patienten mit einer
Zellzahl, die kleiner als der Median ist (Abbildung 15). Im intraepithelialen
Pankreasgewebe zeigt sich nicht der gleiche Unterschied, jedoch besteht eine Tendenz in
die gleiche Richtung.
35
6.2.6. Dichte der CD163+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben
Abbildung 16: Dichte der stromalen CD163+ Zellen pro mm2 der Invasionsfront des
Tumors im Verhältnis zum Gesamtüberleben in Monaten (p=0,018)
Es zeigt sich im Gesamtüberleben ein Unterschied bezüglich der stromalen CD163+
Zellzahl der Invasionsfront. Patienten mit einer Zellzahl, die größer als der Median ist,
überleben länger als Patienten, deren Zellzahl kleiner als der Median ist (Abbildung 16).
Eine Tendenz in die gleiche Richtung zeigt sich intraepithelial im zentralen Tumor.
36
Abbildung 17: Dichte der stromalen CD163+ Zellen pro mm2
Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum Gesamtüberleben in Monaten
(p=0,099)
des
Beim stromalen und intraepithelialen Pankreasnormalgewebe zeigt sich wiederum eine
gegensätzliche Tendenz zu der Invasionsfront. Patienten mit einer kleineren CD163 +
Zellzahl als der Median überleben länger als die mit einer höheren Zellzahl (Abbildung
17). Die gleiche Tendenz zeigt sich für die intraepithelialen Gebiete des Normalgewebes.
37
6.2.7. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben
Abbildung 18: Dichte der intraepithelialen FoxP3+ Zellen pro mm2 des zentralen
Tumors im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben in Monaten (p=0,111)
Patienten, deren FoxP3+ Zellzahl pro mm2 im zentralen Tumor intraepithelial größer als
der Median ist, überleben tendenziell länger metastasenfrei als Patienten, die dort eine
geringere FoxP3+ Zelldichte als der Median haben (Abbildung 18).
38
6.2.8. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben
Abbildung 19: Dichte der intraepithelialen FoxP3+ Zellen pro mm2 der
Invasionsfront des Tumors im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben
(p=0,113)
Sowohl im zentralen Tumor als auch in seiner Invasionsfront zeigt sich intraepithelial die
gleiche Tendenz. Patienten mit einer FoxP3+ Zellzahl oberhalb des Medians haben ein
längeres progressionsfreies Überleben, als Patienten, deren Zellzahl darunter liegt
(Abbildung 19). Für das intraepithelial gelegene Gewebe des zentralen Tumors zeigt sich
die gleiche Tendenz.
39
6.2.9. Dichte der FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod
Abbildung 20: Dichte der intraepithelialen FoxP3+ Zellen pro mm2 der
Invasionsfront des Tumors im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod
(p=0,05)
40
Abbildung 21: Dichte der intraepithelialen FoxP3+ Zellen pro mm2 des
Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod (p=0,065)
Patienten mit einer größeren oder kleineren FoxP3+ Zellzahl als der Median im
intraepithelialen Gewebe der Invasionsfront erleiden unterschiedlich schnell den
vorzeitigen Tumortod, wobei diejenigen mit größeren Zellzahl als der Median im Vorteil
sind (Abbildung 20). Kein Unterschied, jedoch dieselbe Tendenz besteht bei der
intraepithelialen FoxP3+ Zellzahl des Pankreasnormalgewebes (Abbildung 21).
41
6.2.10. Dichte von FoxP3+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben
Abbildung 22: Dichte der intraepithelialen FoxP3+ Zellen pro mm2 der
Invasionsfront des Tumors im Verhältnis zum Gesamtüberleben (p=0,101)
Es zeigt sich die Tendenz, dass Patienten mit einer höheren FoxP3+ Zellzahl als der
Median im intraepithelialen Gewebe der Invasionsfront und des Pankreasnormalgewebes
länger überleben als diejenigen, deren Zellzahl unterhalb des Medians liegt (Abbildung
22, Abbildung 23).
42
Abbildung 23: Dichte der intraepithelialen FoxP3+ Zellen pro mm2 des
Pankreasnormalgewebes im Verhältnis zum Gesamtüberleben (p=0,135)
43
6.2.11. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben
Abbildung 24: Dichte der intraepithelialen CD8+ Zellen pro mm2 des zentralen
Tumors im Verhältnis zum metastasenfreien Überleben (p=0,016)
44
Abbildung 25: Dichte der stromalen CD8+ Zellen pro mm2 des zentralen Tumors im
Verhältnis zum metastasenfreien Überleben (p=0,024)
Das metastasenfreie Überleben für das am Median getrennte Kollektiv weist sowohl
bezüglich der intraepithelialen als auch der stromalen Zellzahl beim zentralen
Tumorgewebe Unterschiede auf. Für beide Gewebslokalisationen gilt, dass eine CD8+
Zellzahl, die größer als der Median ist, mit einem längeren metastasenfreien Überleben
einhergeht als eine kleinere Zellzahl (Abbildung 24, Abbildung 25).
45
6.2.12. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben
Abbildung 26: Dichte der intraepithelialen CD8+ Zellen pro mm2 des zentralen
Tumors im Verhältnis zum progressionsfreien Überleben (p=0,026)
46
Abbildung 27: Dichte der stromalen CD8+ Zellen pro mm2 des zentralen Tumors im
Verhältnis zum progressionsfreien Überleben (p=0,038)
Bezüglich des progressionsfreien Überlebens gilt der Unterschied, dass diejenigen
Patienten ein längeres progressionsfreies Überleben haben, deren CD8+ Zellzahl oberhalb
des Medians liegt. Dies gilt für die stromale (Abbildung 27) als auch intraepitheliale
(Abbildung 26) Zellzahl des zentralen Tumors.
47
6.2.13. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod
Abbildung 28: Dichte der intraepithelialen CD8+ Zellen pro mm2 der Invasionsfront
des Tumors im Verhältnis zum vorzeitigen Tumortod (p=0,206)
Es besteht die Tendenz, dass Patienten mit einer CD8+ Zellzahl, die größer als der
Median des Kollektivs ist, im Verhältnis zu denen, die eine geringere Zellzahl aufweisen,
später einen tumorbedingten Tod sterben (Abbildung 28). Diese Tendenz besteht
ebenfalls bei der intraepithelialen Zellzahl des zentralen Tumors.
48
Abbildung 29: Einfluss von CD8+ Zellen auf den frühzeitigen Tumortod, wenn ihre
intraepitheliale Zellzahl bei einem Patienten sowohl im zentralen Tumor als auch in
seiner Invasionsfront oberhalb des Medians liegt (p=0,008)
Aus der Abbildung 29 ist zu erkennen, dass die Patienten, deren intraepitheliale CD8+
Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als auch in seiner Invasionsfront oberhalb des
Medians liegt, später einen frühzeitigen tumorbedingten Tod erleiden, als die restlichen
Patienten.
Deutlich
im
Vorteil
sind
diejenigen,
Gewebslokalisationen oberhalb des Medians liegt.
49
deren
Zellzahl
in
beiden
Abbildung 30: Einfluss von CD8+ Zellen auf den frühzeitigen Tumortod, wenn ihre
intraepitheliale Zellzahl bei einem Patienten sowohl im zentralen Tumor als auch in
seiner Invasionsfront unterhalb des Medians liegt (p=0,004)
In der Abbildung 30 wird das umgekehrte Auftreten der bereits in Abbildung 29
beschrieben Faktoren untersucht. Aus der Abbildung 30 ist zu erkennen, dass zwischen
den Patienten, deren intraepitheliale CD8+ Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als auch
in seiner Invasionsfront unterhalb des Medians liegt, und den restlichen Patienten ein
Unterschied bezüglich des tumorbedingten Todes besteht. Die Patienten, deren Zellzahl
in beiden Gewebslokalisationen unterhalb des Medians liegt, sterben eher einen
frühzeitigen Tumortod als Patienten mit einer Zellzahl oberhalb des Medians.
50
6.2.14. Dichte der CD8+ Zellen im Verhältnis zum Gesamtüberleben
Abbildung 31: Dichte der intraepithelialen CD8+ Zellen pro mm2 des zentralen
Tumors im Verhältnis zum Gesamtüberleben (p=0,185)
51
Abbildung 32: Dichte der intraepithelialen CD8+ Zellen pro mm2 der Invasionsfront
des Tumors im Verhältnis zum Gesamtüberleben
(p=0,088)
Es besteht bei der intraepithelialen CD8+ Zellzahl sowohl beim zentralen Tumor
(Abbildung 31) als auch bei seiner Invasionsfront (Abbildung 32) die Tendenz, dass
diejenigen Patienten mit einer Zellzahl, die größer als der Median ist, länger überleben als
diejenigen mit einer geringeren Zellzahl.
52
Abbildung 33: Einfluss von CD8+ Zellen auf das Gesamtüberleben, wenn ihre
intraepitheliale Zellzahl bei einem Patienten sowohl im zentralen Tumor als auch in
seiner Invasionsfront oberhalb des Medians liegt
(p=0,021)
Aus der Abbildung 33 ist ersichtlich, dass zwischen den Patienten, deren intraepitheliale
CD8+ Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als auch in seiner Invasionsfront oberhalb des
Medians liegt und den restlichen Patienten ein Unterschied im Gesamtüberleben besteht.
Eindeutig
im
Vorteil
sind
diejenigen
mit
Gewebslokalisationen oberhalb des Medians liegt.
53
einer
Zellzahl,
die
in
beiden
Abbildung 34: Einfluss von CD8+ Zellen auf das Gesamtüberleben, wenn ihre
intraepitheliale Zellzahl bei einem Patienten sowohl im zentralen Tumor als auch in
seiner Invasionsfront unterhalb des Medians liegt (p=0,008)
In der Abbildung 34 wird das umgekehrte Auftreten der bereits in Abbildung 33
beschrieben Faktoren untersucht. Aus der Abbildung 34 ist ersichtlich, dass zwischen den
Patienten, deren intraepitheliale CD8+ Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als auch in
seiner Invasionsfront unterhalb des Medians liegt, und den restlichen Patienten ein
Unterschied im Gesamtüberleben besteht. Die Patienten, deren Zellzahl in beiden
Gewebslokalisationen unterhalb des Medians liegt, haben ein eindeutig geringeres
Gesamtüberleben als Patienten mit einer Zellzahl oberhalb des Medians.
54
6.2.15. Der prognostische Wert von Kombinationen verschiedener Zelltypen aus
verschiedenen Gewebslokalisationen
Abbildung 35: Der Einfluss einer unterhalb des Medians liegenden CD163+ Zellzahl
im stromalen Normalgewebe und einer oberhalb des Medians liegenden FoxP3+
Zellzahl im intraepithelialen Gebiet der Invasionsfront bei gemeinsamen Auftreten
auf den frühzeitigen tumorbedingten Tod (p=0,075)
Aus der Abbildung 35 ist zu erkennen, dass zwischen den Patienten, deren stromale
CD163+ Zellzahl im Normalgewebe unterhalb des Medians liegt und deren
intraepitheliale FoxP3+ Zellzahl der Invasionsfront oberhalb des Medians liegt, und den
restlichen Patienten eine unterschiedliche Tendenz bezüglich des Auftretens eines
tumorbedingten
Todes
besteht.
Die
Patienten
mit
dem
beschriebenen
Zellverteilungsmuster sterben später als die restlichen Patienten einen frühzeitigen
Tumortod.
55
Abbildung 36: Der Einfluss einer oberhalb des Medians liegenden CD163+ Zellzahl
im stromalen Normalgewebe und einer unterhalb des Medians liegenden FoxP3+
Zellzahl im intraepithelialen Gebiet der Invasionsfront bei gemeinsamen Auftreten
auf den frühzeitigen tumorbedingten Tod. (p=0,023)
In der Abbildung 36 wird das umgekehrte Auftreten der bereits in Abbildung 35
beschrieben Faktoren untersucht. Aus der Abbildung 36 ist zu erkennen, dass zwischen
den Patienten, deren stromale CD163+ Zellzahl im Normalgewebe oberhalb des Medians
liegt und deren intraepitheliale FoxP3+ Zellzahl der Invasionsfront unterhalb des Medians
liegt, und den restlichen Patienten ein Unterschied bezüglich des Auftretens eines
tumorbedingten
Todes
besteht.
Die
Patienten
mit
dem
beschriebenen
Zellverteilungsmuster sterben früher als die restlichen Patienten einen frühzeitigen
Tumortod.
56
Abbildung 37: Der Einfluss einer unterhalb des Medians liegenden CD68+ Zellzahl
im stromalen Normalgewebe und einer oberhalb des Medians liegenden CD163+
Zellzahl im stromalen Gebiet der Invasionsfront bei gemeinsamen Auftreten auf das
Gesamtüberleben.
(p=0,047)
Aus der Abbildung 37 ist zu erkennen, dass zwischen den Patienten, deren stromale
CD68+ Zellzahl im Normalgewebe unterhalb des Medians liegt und deren CD163+
Zellzahl im stromalen Gebiet der Invasionsfront oberhalb des Medians liegt, und den
restlichen Patienten ein unterschiedlich langes Gesamtüberleben besteht. Die Patienten
mit dem beschriebenen Zellverteilungsmuster leben länger als die restlichen Patienten.
57
Abbildung 38: Der Einfluss von unterhalb des Medians liegenden CD68+ und CD8+
Zellzahlen im stromalen Gebiet der Invasionsfront des Tumors auf das
Gesamtüberleben in Monaten
(p=0,027)
Aus der Abbildung 38 ist zu erkennen, dass im Gesamtüberleben zwischen den Patienten,
deren CD68+ und CD8+ Zellzahlen im stromalen Gebiet der Invasionsfront des Tumors
unterhalb des Medians liegen, und den restlichen Patienten ein Unterschied besteht. Die
Patienten mit dem beschriebenen Zellverteilungsmuster leben kürzer als die restlichen
Patienten.
58
6.3. Das Tumorstadium als prognostischer Faktor
Abbildung 39: Der Einfluss des Tumorstadiums nach UICC auf das
progressionsfreie Überleben von Pankreaskarzinom Patienten in Monaten p=0,088
Es zeigt sich eine starke Tendenz, dass eine höhere Klassifikation des Tumors einen
negativen Einfluss auf das progressionsfreie Überleben hat (Abbildung 39). Außerdem ist
festzustellen, dass von den verschiedenen Parametern der UICC Klassifikation der
Lymphknotenstatus den stärksten Einfluss auf die Prognose des Patienten hat. Besonders
starken negativen Einfluss hat ein positiver Lymphknotenstatus auf das progressionsfreie
Überleben (Abbildung 40) und auf das metastasenfreie Überleben (Abbildung 41). Die
gleiche Tendenz zeigt sich bei dem Gesamtüberleben (Abbildung 42).
59
Abbildung 40: Der Einfluss des Lymphknotenstatus auf das progressionsfreie
Überleben in Monaten p=0,007
Abbildung 41: Der Einfluss des Lymphknotenstatus auf die metastasenfreie
Überleben in Monaten p=0,014
60
Abbildung 42: Der Einfluss des Lymphknotenstatus auf das Gesamtüberleben in
Monaten p=0,062
61
6.4. Therapieform und Prognose
Abbildung 43: Die neoadiuvante Strahlentherapie sowie andere Therapieformen im
Zusammenhang mit dem Gesamtüberleben (p=0,05)
In allen drei Kaplan - Meier - Kurven ist zu sehen, dass diejenigen Patienten, die eine
neoadiuvante RCT erhielten, gegenüber den Patienten im Vorteil sind, die sich einer
anderen strahlentherapeutischen Behandlungsform unterzogen. Es bestehen Unterschiede
bei dem Gesamtüberleben (Abbildung 43), dem metastasenfreien Überleben (Abbildung
44) und dem progressionsfreien Überleben (Abbildung 45).
62
Abbildung 44: Die neoadiuvante Strahlentherapie sowie andere Therapieformen im
Zusammenhang mit dem metastasenfreien Überleben
(p=0,007)
Abbildung 45: Die neoadiuvante Strahlentherapie sowie andere Therapieformen im
Zusammenhang mit dem progressionsfreien Überleben (p=0,003)
63
7.
Diskussion
7.1. TAMs als prognostischer Faktor
Der Einfluss von TAM auf verschiedene Entitäten von Malignomen ist sehr
unterschiedlich. Beim Prostatakarzinom konnte gezeigt werden, dass TAMs mit
Lympknotenmetastasen assoziiert sind
(Lissbrant et al. 2000). Eine erhöhte
Tumorangiogenese konnte beim Brustkrebs (Tsutsui et al. 2005) und beim
Plattenepithelkarzinom des Oesophagus (Koide et al. 2004) mit einer verstärkten TAMInfiltration in Verbindung gebracht werden. Beim Magenkarzinom wurde auf der einen
Seite gezeigt, dass eine hohe Infiltrationsdichte von TAMs mit einer schlechteren
Prognose einhergeht (Ishigami et al. 2003). Auf der anderen Seite wurde gezeigt, dass
eine hohe Anzahl von TAMs das Überleben positiv beeinflusst (Ohno et al. 2003). Beim
Kolorektalkarzinom wurde eine hohe peritumorale Makrophagendichte als prognostisch
günstig angesehen (Funada et al. 2003). Keine Korrelation zwischen Makropagendichte
und Überleben konnte beim Astrozytom (Rossi et al. 1989) festgestellt werden. Es wurde
jedoch bei diesen Studien anscheinend nicht zwischen Makrophagen des M1 und M2
Phänotyps differenziert.
7.1.1. CD68+ Zellen als prognostischer Faktor
In allen drei untersuchten Gewebsformen traten mehr M2 polarisierte als M1 polarisierte
Makrophagen auf. Damit stimmen die Ergebnisse mit denen anderer Autoren überein
(Mantovani et al. 2010). Die Anzahl von M1 polarisierten Makrophagen pro mm2 ist
intraepithelial in den drei verschiedenen Lokalisationen stets höher als stromal. Die
höchste Anzahl CD68+-Zellen ist intraepithelial im zentralen Tumor zu finden, was dafür
spricht, dass das Pankreaskarzinom zu einer Anreicherung dieser Zellen führt (Abbildung
5). Auch in einer anderen Arbeit konnte gezeigt werden, dass im Bereich des Tumors eine
höhere Zahl von CD68+-Zellen vorhanden ist als im gesunden Gewebe. Ihre höchste
Anzahl wurde jedoch im Stroma der Invasionsfront nachgewiesen (Kurahara et al. 2011).
Die untersuchten Patienten wurden nicht strahlentherapeutisch behandelt, was einen
direkten Vergleich erschwert.
Bei der Betrachtung des prognostischen Wertes von CD68+ Zellen ist zwischen dem
gesunden Pankreasnormalgewebe und dem Tumorgewebe zu unterscheiden. Im
Pankreasnormalgewebe wirkt sich eine Dichte von CD68+-Zellen, die größer ist als der
64
Median, nachteilhaft auf das rezidivfreie und das Gesamtüberleben aus. Dies gilt in
beiden Fällen sowohl für das intraepitheliale normale Pankreasdrüsengewebe als auch für
das es umgebende Stroma (Abbildungen 9 und 12). Die beobachteten Unterschiede
wiesen jedoch keine Signifikanz auf. Da bezüglich des Gesamtüberlebens eine Tendenz
in die gleiche Richtung für das stromale wie das intraepitheliale Gebiet des
Normalgewebes
besteht,
wurden
die
beiden
Faktoren
im
folgenden
Schritt
zusammengeführt. Das Gesamtüberleben der Patienten, die sowohl im intraepithelialen
als auch im stromalen Gebiet des Normalgewebes eine M1 Makrophagendichte unterhalb
des Medians haben, ist signifikant besser (Abbildung 13). Makrophagen des M1
Phänotyps entfalten ihre zytotoxische Wirkung unter anderem durch reaktive
Sauerstoffradikale (ROI) und reaktive Stickstoffintermediate (RNI) (Mantovani et al.
2005). Diese bei chronischen Entzündungen auftretenden Verbindungen bewirken
Schädigungen in der Desoxyribonukleotidsäure (DNS) und sind damit potenziell
mutagen.
Die
dadurch
hervorgerufenen
Mutationen
fördern
die
Ent-
und
Weiterentwicklung von Neoplasien (Farrow et al. 2002), was die negative Auswirkung
von hohen Makrophagendichten des M1 Phänotyps im Normalgewebe erklären könnte.
Bei an Colitis ulcerosa erkrankten Patienten konnte gezeigt werden, dass das
Tumorsuppressorgen p53 schon in Kolonnormalgewebe signifikant öfter mutiert ist als in
Kolonnormalgewebe von nicht erkrankten Personen. Es konnte ein Zusammenhang zu
dem oxidativen Stress hergestellt werden, dem die Zellen bei chronischen Entzündungen
durch die dabei entstehenden reaktiven Radikalen ausgesetzt sind (Hussain et al. 2000).
Eben diese Mutation im Tumorsuppressorgen p53 zählt zu den beim Pankreaskarzinom
am häufigsten vorkommenden Mutationen. In 75% - 90% der Fälle ist sie nachweisbar
(Chiorean et al. 2015).
Im intraepithelialen Bereich des zentralen Tumors (Abbildung 10) und im
intraepithelialen Bereich sowie im stromalen Bereich der Invasionsfront haben CD68+Zellen einen positiven Einfluss auf das metastasenfreie Überleben, wenn die Häufigkeit
ihres Auftretens oberhalb des Medians liegt. Für das progressionsfreie Überleben kann
dieselbe Beobachtung des positiven Einflusses einer hohen Zellzahl für den
intraepithelialen (Abbildung 11) wie für den stromalen Bereich des zentralen Tumors
gemacht werden. Ähnliche Beobachtungen konnten schon in vorangegangenen Arbeiten
bezüglich
des
Gesamtüberlebens
und
des
progressionsfreien
Überleben
beim
Pankreaskarzinom gemacht werden (Ino et al. 2013). Der positive Effekt von M1
Makrophagen lässt sich durch ihre proinflammatorische und zytotoxische Wirkung
65
erklären, die es ihnen ermöglicht den Körper gegen Pathogene und Tumorzellen zu
verteidigen (Allavena et al. 2008)
7.1.2. CD163+ Zellen als prognostischer Faktor
Die Anzahl von CD163+-Zellen ist in allen Gewebslokalisationen durchweg höher als die
der CD68+-Zellen, was sich mit den von Ino et al. gemachten Beobachtungen deckt (Ino
2013). Stromal sind durchweg mehr CD163+-Zellen vorhanden als intraepithelial.
Während intraepithelial in den drei Gebieten jeweils eine ähnliche Zellzahl vorliegt,
liegen im stromalen Bereich des zentralen Tumors mehr CD163+-Zellen als in seiner
Invasionsfront und im Normalgewebe des Pankreas (Abbildung 6). Die Beobachtung,
dass im stromalen Gewebe mehr M2 polarisierte Makrophagen liegen als im
intraepithelialen Gebiet, konnte schon von anderen Autoren gezeigt werden (Yoshikawa
et al. 2012).
Bei der Betrachtung des prognostischen Wertes von Makrophagen des M2 Phänotyps ist
wie schon bei dem M1 Phänotyp zwischen gesundem und erkranktem Gewebe zu
unterscheiden. Im Stroma des gesunden Pankreasgewebes wirkt sich eine Zellzahl, die
kleiner als der Median ist, signifikant positiv auf den tumorbedingten Tod aus (Abbildung
15). Das Gesamtüberleben wird in gleicher Weise beeinflusst, wenn die Zellzahl im
stromalen oder intraepithelialen Gebiet des Normalgewebes unterhalb des Medians liegt
(Abbildung 17). Der für den frühzeitigen Tumortod und das Gesamtüberleben
beschriebene Zusammenhang im Pankreasnormalgewebe gilt für das stromale wie
intraepitheliale Gewebe der Invasionsfront des Tumors in umgekehrter Richtung. Hier
wird der frühzeitige Tumortod (Abbildung 14) und das Gesamtüberleben (Abbildung 16)
von einer CD163+-Zellzahl positiv beeinflusst, die größer als der Median ist. Die
Wirkung auf das Gesamtüberleben ist dabei signifikant. Die hier gewonnenen Ergebnisse
widersprechen demnach denen einiger anderer Autoren. In diesen Studien zum
Pankreaskarzinom konnte gezeigt werden, dass eine hohe Zahl von Makrophagen des M2
Phänotyps
die
Tumorprogression,
die
Lymphangiogenese
und
lymphogene
Metastasierung fördern (Kurahara 2011) und das krankheitsfreie Überleben sowie das
Gesamtüberleben negativ beeinflussen (Yoshikawa 2012). Im Hinblick auf diese
Ergebnisse ist jedoch zu beachten, dass weder die von Kurahara et al. noch die von
Yoshikawa et al. untersuchten Patienten eine neoadiuvante Therapie erhielten, sondern
primär einer Resektion unterzogen wurden.
66
Beim Kolorektalkarzinom kam Edin et al. zu ähnlichen Ergebnissen wie in dieser Arbeit.
Auch hier waren M1 polarisierte Makrophagen mit einer verbesserten Prognose
verbunden. Bemerkenswert ist, dass hohe Infiltrationsdichten von M1 polarisierten
Makrophagen mit ebenfalls erhöhten Infiltrationsdichten von M2 polarisierten
Makrophagen assoziiert waren. Das Verhältnis zwischen M1 und M2 Makrophagen hatte
jedoch keinen Einfluss auf die Prognose der Patienten. Edin et al. gehen deshalb davon
aus, dass zumindestens beim Kolorektalkarzinom die M1 Makrophagen die M2
Makrophagen funktionell dominieren (Edin et al. 2013). Über die Gründe für den
positiven Einfluss der M2 polarisierten Makrophagen beim Pankreaskarzinom lässt sich
nur spekulieren. Als wahrscheinlich gilt jedoch, dass sich die verschiedenen Karzinome
in ihrem inflammatorischen Milieu unterscheiden und allgemeingültige Aussagen
hinsichtlich M2 polarisierten Makrophagen im Bezug auf ihre Rolle bei Karzinomen
vorsichtiger gemacht werden sollten. Im Bezug auf das M1/M2-Makrophagenkonzept
scheint eine stärkere Differenzierung zwischen den einzelnen Karzinomentitäten sinnvoll
zu sein.
Abschließend ist anzumerken, dass sich die M1 und M2 Phänotypen der Makrophagen in
weitere Subgruppen aufgliedern, deren Funktion nicht endgültig geklärt ist. Durch die
Verwendung einzelner immunhistologischer Marker lassen sich diese Untergruppen nur
unzureichend differenzieren, auch wenn sich das reine M1/M2-Konzept bei
verschiedenen Karzinomen als plausibel erwiesen hat (Niedobitek et al. 2015).
7.2. TIL als prognostischer Faktor
7.2.1. FoxP3+ Zellen als prognostischer Faktor
Die Bedeutung von Treg bei Malignomerkrankungen ist nicht genau geklärt, da sich die
Ergebnisse verschiedener Arbeiten stark unterscheiden. Beim Brustkrebs wird berichtet,
dass eine hohe Treg-Dichte die Prognose verschlechtern (Yan et al. 2011), nicht
beeinflussen (Mahmoud et al. 2011) oder verbessern (Ladoire et al. 2011) kann. Auch
beim Magenkarzinom zeigen Ergebnisse, dass eine hohe intratumorale Treg-Dichte die
Prognose ungünstig beeinflusst (Shen et al. 2010), wohingegen eine hohe stromale TregDichte die Prognose günstig beeinflusst (Haas et al. 2009). Beim analen
Plattenepithelkarzinom wurde beobachtet, dass Tregs keinen Einfluss auf die Prognose
haben (Grabenbauer et al. 2006).
67
Die Zellverteilung der Tregs beim Pankreaskarzinom zwischen dem intraepithelialen und
stromalen Gebiet weist bei allen drei Lokalisationen einen klaren Unterschied zugunsten
des stromalen Gebietes auf, denn stromal sind die Zellzahlen durchweg höher. Die
höchste stromale Dichte von FoxP3+-Zellen liegt im zentralen Tumor vor, während im
Normalgewebe am wenigsten Zellen vorhanden sind. Im intraepithelialen Bereich sind
die Zelldichten vom zentralen Tumor und der Invasionsfront etwa gleich hoch, im
Normalgewebe sind deutlich weniger Tregs vorhanden (Abbildung 7). Die Zellverteilung
lässt den Rückschluss zu, dass das Tumorgeschehen zu einer erhöhten Dichte von
FoxP3+-Tregs führt. Die Ergebnisse dieser Arbeit bezüglich des prognostischen Wertes
von Tregs haben gezeigt, dass eine Dichte von FoxP3+-Zellen, die größer als der Median
ist, durchweg einen positiven Einfluss auf die verschiedenen klinischen Faktoren hat. Die
Rolle der stromal gelegenen Treg scheint dabei von untergeordneter Bedeutung zu sein,
da sich alle Ergebnisse nur bei den intraepithelialen Gebieten zeigen. Eine Zellzahl im
zentralen Tumor, die größer als der Median ist, hat positiven Einfluss auf das
metastasenfreie (Abbildung 18) und das progressionsfreie Überleben. Wenn die
Zelldichte im Gebiet der Invasionsfront oberhalb des Medians liegt, beeinflusst sie das
progressionsfreie Überleben (Abbildung 19), den frühzeitigen Tumortod signifikant
(Abbildung 20) und das Gesamtüberleben positiv (Abbildung 22). Der frühzeitige
Tumortod (Abbildung 21) und das Gesamtüberleben (Abbildung 23) werden von der
gleichen Zellverteilung im Normalgewebe positiv beeinflusst.
In andern Studien zum Pankreaskarzinom wurde der entgegengesetzte Effekt gezeigt,
hohe
Treg-Dichten
waren
mit
einem
vermindertem
Überleben,
mehr
Lymphknotenmetastasen und einem hohem Entdifferenzierungsgrad des Tumors
verbunden (Hiraoka et al. 2006). Auch Zhang et al. konnten zeigen, dass hohe FoxP3+Zelldichten mit einer schlechten Differenzierung des Tumors und einem vermindertem
Überleben der Patienten assoziiert waren (Zhang et al. 2015). Eine Erklärung für diesen
negativen Einfluss der Treg auf die Prognose von Tumoren ist ihre das Immunsystem
supprimierende Wirkung. Sie unterdrücken die Antwort der Effektorzellen auf die von
den Tumorzellen präsentierten tumorspezifischen Antigenen und helfen dem Tumor so
vom Immunsystem unerkannt zu bleiben (Oleinika et al. 2013).
Wie schon bei den CD163+-Makrophagen gibt es auch beim kolorektalen Karzinom
bezüglich der Treg Ergebnisse, die sich mit denen dieser Arbeit decken. Hohe Dichten
von FoxP3+-Zellen waren ebenfalls mit einer besseren Prognose verbunden (Hanke et al.
2015; Salama et al. 2009). Ein möglicher Erklärungsansatz von Correale et al. ist, dass
eine erhöhte Treg Infiltration ein indirekter Indikator für eine starke lokale Immunantwort
68
auf den Tumor sein könnte (Correale et al. 2010). Die antitumorös wirksamen
Bestandteile des Immunsystems würden somit durch ihre erhöhte Aktivität, die die
bessere Prognose der Patienten bedingt, gleichzeitig zu einer höheren Treg Dichte führen.
Bei den in dieser Arbeit betrachteten Patienten hatten 65% eine gleichsinnige Dichte von
Treg - und zytotoxischen T-Zellen, das heißt beide Zellreihen waren entweder größer
oder kleiner als der Median. Bei 35% der Patienten traten beide Zelltypen nicht
gleichsinnig häufig auf. Ein anderer möglicher Erklärungsansatz für diese Beobachtungen
ist die antiinflammatorische Wirkung von Tregs. Ein exzessiver Entzündungsprozess ist
potenziell karzinogen und die normale physiologische Kontrollfunktion der Treg kann
unter diesen Umständen ihren positiven Einfluss erklären. Zu beachten ist jedoch, dass
dieses Erklärungsmodell eher auf die frühen Stadien der Karzinogenese anzuwenden ist
(Whiteside 2012). Eventuell erklärt dieses Modell den positiven Einfluss der Treg beim
Pankreaskarzinom, scheint doch die Inflammation in Form der chronischen Pankreatitis
keine unerhebliche Rolle in der Pathogenese dieses Karzinoms zu spielen (Pinho et al.
2014). Es ist also anzunehmen, dass die chronische Entzündung ein Faktor ist, der zu
Mutationen führt, welche letztendlich eine gesunde Zelle in eine maligne Gründungszelle
des Karzinoms transformieren. Danach setzt sich die genetische Evolution der malignen
Zellen jedoch fort, weitere Progressormutationen befähigen die betreffende Zelle
beispielsweise zur Metastasierung oder Immunsuppression (Yachida et al. 2013).
Vielleicht reduzieren die Treg den inflammatorischen Prozess auch im späterem Stadium
des Tumors und damit ebenso die potenziell mutagenen Wirkung der chronischen
Entzündung, was das Auftreten von Progressormutationen verzögern könnte.
Bei der Interpretation der Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass der Transkriptionsfaktor
FoxP3 zwar spezifisch für Treg ist, aber nicht der Komplexität der vielen verschiedenen
Subphänotypen der FoxP3+ Zellen gerecht wird, die unterschiedliche Funktionen haben
können (Feuerer et al. 2009). Deleeuw et al. schlägt deshalb vor, dass zur besseren
Identifizierung der verschiedenen funktionalen Subgruppen der Treg und deren
prognostischer Relevanz mehrere immunhistologische Marker eingesetzt werden sollten
(deLeeuw 2012).
7.2.2. CD8+ Zellen als prognostischer Faktor
In zahlreichen Studien konnte der positive Einfluss von zytotoxischen CD8+ Zellen auf
die Prognose von Karzinomerkrankungen gezeigt werden, wie bei NichtkleinzelligemLungenkrebs
(Zhuang
et
al.
2010),
Ovarialkarzinom
69
(Sato
et
al.
2005),
Oesophagealkarzinom (Schumacher et al. 2001), Plattenepithelkarzinom des Analkanals
(Grabenbauer 2006) oder Magenkrebs (Lee et al. 2008).
Die Zellverteilung der CD8+ Zellen beim Pankreaskarzinom weist klare Tendenzen auf.
In dem stromalen Bereich der Invasionsfront, dem des Pankreasnormalgewebes und dem
des zentralen Tumors sind mehr Zellen als intraepithelial gelegen. Während um den
zentralen Tumor stromal die insgesamt höchste Anzahl von Zellen vorhanden ist, liegen
intraepithelial im zentralen Tumor am wenigsten Zellen von allen untersuchten
Gewebslokalitäten (Abbildung 9). Diese Beobachtungen stützen die Hypothese von
Bernstorff et al., dass sich der Tumor der Immunüberwachung durch die CD8+ Zellen zu
entziehen scheint. Von Bernstorrf et al. beschreiben, dass sich TIL weniger in dem
Tumorgewebe selbst als in dem ihn umgebenden Gewebe befanden. Als Gründe für diese
Beobachtung wurde die Sekretion von immunsuppressiven Zytokinen wie Interleukin-10
und transforming-groth-factor beta 1/2 sowie der Verlust der CD3-ζ - Kette der TLymphozyten genannt. Dies verhindert den Kontakt zwischen der zytotoxischer T- Zelle
und der Tumorzelle und unterbindet die zytotoxische Funktion der T-Lymphozyten (von
Bernstorff et al. 2001). Ademmer et al. haben ebenfalls die Verteilung von TLymphozyten zwischen den verschiedenen Gewebslokalisationen untersucht und kamen
ebenso zu dem Ergebnis, dass sich die meisten T-Zellen in dem den Tumor umgebenden
Gewebe befinden und wenige im intraepithelialen Bereich (Ademmer et al. 1998)
Der Einfluss von CD8+Lymphozyten auf die verschiedenen klinischen Parameter ist
durchweg positiv, wenn ihre Anzahl in den entsprechenden Gewebslokalisationen
oberhalb des Medians liegt. Eine hohe intraepitheliale (Abbildungen 24; 26) als auch
stromale (Abbildungen 25; 27) Zellzahl im zentralen Tumor beeinflusst das
progressionsfreie und metastasenfreie Überleben signifikant positiv. Eine Tendenz in die
gleiche Richtung lässt sich für den intraepithelialen Bereich des zentralen Tumors und
seiner Invasionsfront im Bezug auf den frühzeitigen Tumortod (Abbildung 28) und das
Gesamtüberleben (Abbildungen 31; 32) beobachten. Um die prognostische Aussagekraft
für den frühzeitigen Tumortod und das Gesamtüberleben zu verbessern, wurden nun
Gruppen von Patienten gebildet, die im intraepithelialen Bereich sowohl im zentralen
Tumor als auch in seiner Invasionsfront die gleiche Zellverteilung vorweisen. Dadurch
konnte ein signifikanter Vorteil gegenüber den restlichen Patienten beim frühzeitigen
Tumortod (Abbildung 29) und dem Gesamtüberleben (Abbildung 30) für diejenigen
Patienten gezeigt werden, deren intraepitheliale Zellzahl sowohl im zentralen Tumor als
auch in seiner Invasionsfront oberhalb des Medians liegt. Von noch stärkerem
prognostischen Wert ist das umgekehrte Auftreten dieser beiden Merkmale. Patienten, die
70
intraepithelial sowohl im zentralen Tumor (Abbildung 30) als auch in seiner
Invasionsfront (Abbildung 34) eine unterhalb des Medians liegende Zellzahl von
zytotoxischen Lymphozyten vorweisen, sind im besonderem Maße im Nachteil. Sie
erleiden signifikant früher einen tumorbedingten Tod und haben ein signifikant kürzeres
Gesamtüberleben. Zwischen der CD8+ zytotoxischen T-Zellzahl im Normalgewebe und
einem der klinischen Parameter ist kein Zusammenhang nachweisbar.
Eine Erklärung für den offensichtlich positiven Einfluss der zytotoxischen T-Zellen ist
deren Fähigkeit Tumorzellen zu töten. Antigen-präsentierende-Zellen präsentieren den TZellen tumorspezifische Antigene. Die entsprechenden CD8+ T-Zellen differenzieren zu
zytotoxischen T-Zellen, die die Tumorzellen angreifen können (Smyth et al. 2001). Die
Beobachtung, dass CD8+-Zellen einen positiven Einfluss auf die Prognose vom
Pankreaskarzinom haben, wurde von verschieden Autoren nachgewiesen. Kim et al.
sowie Fukunaga et al. konnten einen positiven Zusammenhang zwischen CD8+-Zellen
und dem Gesamtüberleben feststellen (Fukunaga et al. 2004; Kim 2007).
7.3. Immunmodulatorischer Therapieansatz
Die Wirkung der verschiedenen Subgruppen von TIL und TAM auf das
Pankreaskarzinom
haben
zu
vielen
Hypothesen
und
Untersuchungen
zu
immunmodulatorischen Therapieansätzen geführt.
Die mögliche Rolle von TAM als Ziel einer immunmodulatorischen Therapie ist aktuell
weitestgehend unklar. Vonderheide et al. konnten in einem Mausmodell zeigen, dass die
Aktivierung von TAM des Pankreaskarzinoms mit einem agonistisch wirkenden
Antikörper gegen CD40 eine Tumorregression förderte. Er begründet diese Beobachtung
damit, der agonistische CD40 Antikörper eine Umwandlung von tumorfördernden
Makrophagen zu M1 Makrophagen gefördert haben könnte (Vonderheide et al. 2013).
Beatty et al. konnten zeigen, dass CD40 aktivierte Makrophagen das Pankreaskarzinom
schnell infiltrieren und in der Maus wie im Menschen antitumorös wirkten (Beatty et al.
2011). Die hier gemachten Ergebnisse stützen einerseits die Theorie, dass sich eine
erhöhte Dichte von proinflammatorischen M1 Makrophagen im Tumorgewebe positiv
auswirken könnte, andererseits haben hier die antiinflammatorischen Makrophagen des
M2-Phänotyps auch einen positiven Einfluss auf die Prognose. Ein Wechsel des
Phänotyps könnte also nicht nur positive Folgen haben. Bei den systemisch wirkenden
Antikörpern ist außerdem zu beachten, dass hohe Dichten von M1 Makrophagen nach
71
den Ergebnissen dieser Arbeit im Normalgewebe des Pankreas ein negativer
prognostischer Faktor für das Gesamtüberleben sind. Somit könnte eine starke
Aktivierung der proinflammatorischen Makrophagen auch nachteilhafte Auswirkungen
haben.
Die immunsupprimierende Wirkung von Treg begründet die Überlegung, dass sie eine
den Tumorprogress fördernde Wirkung hätten. Diese Hypothese wird auch von den
bisherigen Ergebnissen zu der Rolle von Treg beim Pankreaskarzinom unterstützt
(Hiraoka 2006; Zhang 2015). Im Mausmodell konnte nachgewiesen werden, dass eine
Depletion von CD4+CD25+-Treg die tumorspezifische Immunantwort verstärkt hat und
damit ein therapeutischer Ansatz sein könnte (Viehl et al. 2006). Im Hinblick auf die hier
gewonnen Ergebnisse wirft dieser Ansatz jedoch Fragen auf. Ghansah et al. haben die
Depletion von Treg ebenfalls im Mausmodell untersucht. Sie konnten keinen
signifikanten Effekt auf das Tumorwachstum oder das Überleben nachweisen (Ghansah
et al. 2013). Die genaue Wechselwirkung von Treg, den anderen TIL und TAM und dem
Karzinom muss noch weiter erforscht werden, um hier sichere Aussagen treffen zu
können.
Der mehrfach bewiesene positive Einfluss von CD8+ zytotoxischen Zellen hat auch diese
in den Fokus neuer immunmodulatorischer Therapien gerückt. Ein möglicher Ansatz zur
Verstärkung der Wirkung der zytotoxischen T-Lymphozyten ist die Impfung mit
Pankreaskarzinom-spezifischen Antigenen. Als diese Antigene können Peptide oder
deren Fragmente, DNS und RNS (Ribonukleotidsäure) fungieren (Sideras et al. 2014).
Eine Impfung bei resezierten Pankreaskarzinompatienten gegen das mutierte K-ras
Protein hat zu einer Verbesserung des Langzeit-Überlebens geführt und könnte in
Zukunft eine Rolle als adiuvante Therapie spielen (Weden et al. 2011). Ein anderer
Ansatz
ist
die
adoptive
Immuntherapie.
Kawaoka
et
al.
haben
dabei
an
Bauchspeicheldrüsenkrebs erkrankten Patienten mononukleäre Zellen des peripheren
Blutes entnommen und diese zu zytotoxischen T-Lymphozyten kultiviert, die spezifisch
gegen ein vom Karzinom exprimiertes Antigen gerichtet waren. Diese autologen
zytotoxischen T-Lymphozyten wurden nach der Resektion des Pankreaskarzinoms in den
Kreislauf des jeweiligen Patienten zurückgegeben. Die Häufigkeit des Auftretens von
hepatischen Metastasen konnte so signifikant verringert werden (Kawaoka et al. 2008).
72
7.4. Die Therapieentscheidung anhand der Klassifikation
Ein wichtiger Faktor um das richtige Therapieregime für jeden einzelnen Patienten finden
zu können ist die Einstufung seiner Krankheit in das TNM- und das UICC-System. Das
TNM- und das UICC-System bieten die Möglichkeit die Ausdehnung des
Pankreaskarzinoms in vergleichbare Gruppen einzuteilen und sind somit wichtige
prognostische Faktoren für viele verschiedene klinische Parameter (Bilimoria 2007; Buc
et al. 2014; Katz et al. 2008a). Auch die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen den hohen
prognostischen Wert der beiden aufeinander basierenden Klassifikationen. Für das
Tumorstadium nach UICC kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass ein höheres
Stadium mit einem verringerten progressionsfreien Überleben verbunden ist (Abbildung
39). Als stärkster prognostischer Faktor in der TNM-Klassifikation hat sich der
Lymphknotenstatus erwiesen. Lympfknotenmetastasen wirken sich tendenziell negativ
auf das Gesamtüberleben aus (Abbildung 42) und haben einen signifikant negativen
Einfluss auf das progressionsfreie (Abbildung 40) und das metastasenfreie Überleben
(Abbildung 41). Der positive prognostische Wert einer niedrigen Einstufung der
Krankheit in der TNM Klassifikation wird durch die sich dadurch ergebenen
Therapieoptionen noch verstärkt. So haben die Patienten, die einer neoadiuvanten RCT
und einer erfolgreichen Resektion des Tumors unterzogen wurden, ein signifikant
besseres Gesamtüberleben (Abbildung 43), metastasenfreies (Abbildung 44) und
progressionsfreies
Überleben
(Abbildung
45)
gegenüber
den
restlichen
strahlentherapeutisch behandelten Patienten.
Die TNM-Klassifikation bildet also die Prognose wie auch die Ausdehnung des
Pankreaskarzinoms des Patienten optimal ab und ermöglicht es, dem Patienten das für ihn
beste Therapieregime anbieten zu können. Es gibt jedoch auch Situationen, in denen das
TNM - System wie bei borderline-resektablen Pankreaskarzinomen an seine Grenzen
stößt. Für diese Patientengruppe existiert noch kein festgelegtes Therapieschema (Katz et
al. 2008b). Hier wäre es im klinischen Alltag wünschenswert, weitere prognostische
Faktoren in die Überlegung bezüglich der optimalen individuellen Therapie mit
einbeziehen zu können.
73
7.5. Die Implementierung immunologischer Faktoren ins TNM - System
Der
hohe
prognostische
Wert
von
immunologischen
Faktoren
hat
beim
Kolorektalkarzinom bereits zu der Überlegung geführt, das TNM-System um einen so
genannten „Immonoscore“ zu erweitern. Es wird vorgeschlagen, dass zwei lymphozytäre
Zelltypen jeweils im zentralen Tumor und in der Invasionsfront in einer vierstufigen
Skala aufgeteilt werden sollten. Ein „Immunoscore 0“ würde bedeuten, dass in beiden
Gewebslokalisationen beide Zelltypen in niedrigen Dichten vorliegen würden, bei einem
„Immunoscore 4“ würden von beiden Zelltypen eine hohe Dichten vorliegen (Galon et al.
2014). Ein ähnliches Modell wäre auch für das Pankreaskarzinom denkbar, weil auch hier
die Kombination von verschiedenen Immunzelltypen oder Gewebslokalisationen den
höchsten prognostischen Wert hat. Bei der isolierten Betrachtung des prognostischen
Wertes der CD8+ zytotoxischen Lymphozytenzahl im intraepithelialen Bereich des
zentralen Tumors und seiner Invasionsfront bezüglich des frühzeitigen Tumortodes
(Abbildung 28) und des Gesamtüberlebens (Abbildungen 31; 32) können nur Tendenzen
festgestellt werden. Die kombinierte Betrachtung dieses Zelltyps in den gleichen
Gewebslokalisationen hingegen zeigt eine Signifikanz des „Immunosore 0“ (Abbildungen
30; 34), bei dem die Zellzahl in beiden Gewebslokalisationen unterhalb des Medians
liegt, und dem „Immunoscore 4“, bei dem die Zellzahl in beiden Lokalisationen oberhalb
des Medians liegt (Abbildungen 29; 30).
Das „Immunoscore“ Modell von Galon et al. verwendet zwei unterschiedliche Typen von
Lymphozyten, in dem vorangegangenen Beispiel wird jedoch nur ein Zelltyp
berücksichtigt. Die Berücksichtigung eines zweiten lymphozytären Zelltyps im Rahmen
des Modells könnte die prognostische Aussagekraft auch beim Pankreaskarzinom weiter
verbessern. Die Möglichkeit dies zu untersuchen wird jedoch durch die geringe Größe
des hier untersuchten Kollektivs limitiert. Die Kombination der Häufigkeit zweier
verschiedener Zelltypen zur Erhöhung ihres prognostischen Wertes scheint jedoch auch
beim Pankreaskarzinom sinnvoll. Hinsichtlich des frühzeitigen Tumortodes erweist sich
die Kombination aus der Zellzahl von M1 Makrophagen im stromalen Normalgewebe
und von Tregs im intraepithelialen Bereich der Invasionsfront als sinnvoll. Wenn sich die
Anzahl der M1 Makrophagen unterhalb des Medians befindet und die Treg Zahl oberhalb
des Medians, so wirkt sich dies tendenziell positiv auf den frühzeitigen Tumortod aus
(Abbildung 35). Ist das Verhältnis umgekehrt, erleiden die entsprechenden Patienten
signifikant später einen frühzeitigen Tumortod (Abbildung 36). Auch im Hinblick auf das
Gesamtüberleben
sind
Kombinationen
verschiedener
Zelltypen
und
Gewebe-
lokalisationen sinnvoll. Eine hohe Zellzahl von M1 Makrophagen in der Invasionsfront
74
und eine niedrige von M2 Makrophagen im Normalgewebe im jeweiligen stromalen
Bereich haben einen signifikant positiven Einfluss (Abbildung 37). Einen signifikant
negativen Einfluss hat eine hohe M1 Makrophagendichte im stromalen Normalgewebe in
Kombination
mit
einer
niedrigen
Dichte
von
zytotoxischen
T-Lymphozyten
intraepithelialen Bereich der Invasionsfront (Abbildung 38).
Das
„Immunoscore“ Modell
wird ebenfalls der
wachsenden
Bedeutung
der
immunmodulatorischen Karzinomtherapie gerecht. Das komplexe System der TIL und
TAM bietet viele unterschiedliche Möglichkeiten zum Eingreifen. Es wird sich in
Zukunft die Frage stellen, von welchem der immunmodulatorischen Therapieansätzen der
einzelne Patient am meisten profitiert, weil sich die Infiltrationsmuster von TIL und TAM
individuell stark unterschieden können. So könnte der „Immunoscore“ gegebenenfalls die
Wirksamkeit von verschiedenen immunmodulatorischen Therapien vorhersagen (Angell
et al. 2013).
Unter Berücksichtigung der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse und dem aktuellen
wissenschaftlichen Kenntnisstand scheint es prinzipiell sinnvoll, das etablierte TNMSystem um immunologische Faktoren zu erweitern. In Zukunft könnte diesen Faktoren
eine wachsende Bedeutung zu Teil werden, da sie, ähnlich wie es heute mit dem TNMSystem praktiziert wird, als prognostische Faktoren und Therapieentscheidungshilfen
fungieren könnten. Gleichzeitig demonstrieren die oft widersprüchlichen Ergebnisse zum
prognostischen Wert der verschiedenen immunologischen Faktoren, dass bis zur
klinischen Anwendung noch viel Forschung zu betreiben ist. Die beste zukünftige Lösung
könnte die Kombination des TNM - Systems mit immunologischen Faktoren sein.
75
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.
84
9.
Abkürzungsverzeichnis
TIL
-
Tumor - infiltrierenden - Lymphozyten
TAM
-
Tumor - assoziierten - Makrophagen
FoxP3
-
Forkhead Box Protein P3
UICC
-
Union internationale contre le cancer
TMA
-
Tissue-Microarrays
CD
-
Cluster of differentiation
Treg
-
Regulatorische T-Lymphozyten
CT
-
Computertomographie
MRT
-
Magnetresonanztomographie
MRCP
-
Magnetresonanz – Cholangiopankreatikographie
ERCP
-
Endoskopische Cholangiopankreatikographie
CA19-9
-
Carboanhydrat 19-9
CA125
-
Cancer-Antigen 125
CEA
-
Carcinoembryonales Antigen
NCCN
-
National Comprehensive Cancer Network
EGFR
-
epidermal groth factor receptor
RCT
-
Radio-Chemo-Therapie
HLA
-
humanen Leukozyten Antigen
IFN-γ
-
Interferon-γ
CSF-1
-
Colony - Stimulating - Factor - 1
VEGF
-
Vascular - Endothelial - Groth - Factor
TNF
-
Tumornekrosefaktor
HE
-
Hämatoxylin-Eosin
ROI
-
Reaktive Sauerstoffradikale
RNI
-
Reaktive Stickstoffradikale
DNS
-
Desoxyribonukleotidsäure
RNS
-
Ribonukleotidsäure
85
10.
Danksagung
Ich möchte an dieser Stelle allen meinen Dank aussprechen, die durch ihre Hilfe zur
Fertigstellung dieser Arbeit beigetragen haben.
Herrn Prof. Dr. med. Rainer Fietkau danke ich, da er mir ermöglichte, an seiner Klinik
meine Dissertation zu schreiben.
Meinen beiden persönlichen Betreuern Herrn PD Dr. Luitpold Distel sowie Herrn Dr.
Markus Hecht möchte ich ebenso meinen Dank aussprechen, da sie bei allen meinen
Fragen stets ausgesprochen hilfsbereit und geduldig waren.
Frau Dr. Katharina Erlenbach-Wünsch (Pathologisches Institut der Universität ErlangenNürnberg) hat mir bei Fragen bezüglich der Pathologie geholfen, weswegen ich mich
auch bei ihr bedanken möchte.
Außerdem möchte ich mich bei meiner Freundin Nadine für ihre Geduld und Hilfe
bedanken, genauso wie bei meiner Schwester Anna, die die formale Korrektur meiner
Arbeit vorgenommen hat.
Im besonderen Maße möchte ich meinen Eltern meinen Dank aussprechen, da Sie mich
während der Höhen und Tiefen meins Studiums in jeder Form begleitet und unterstützt
haben und mich damit erst in die Situation gebracht haben diese Arbeit zu schreiben und
erfolgreich abschließen zu können. Ihnen ist diese Arbeit gewidmet.
86
11.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Hanno Zoske
Geburtsdatum/ –ort:
08.06.1988, Salzgitter
Familienstand:
ledig
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Schulische Ausbildung
1995 – 1999
Adolf Reichwein Grundschule Göttingen
1999 – 1998
Bertolt - Brecht Orientierungsschule Göttingen
1997 – 2007
Hainberggymnasium Göttingen
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Akademische Ausbildung
04/2008 – 05/2015
Studium der Humanmedizin an der
Friedrich Alexander Universität (FAU) Erlangen-Nürnberg
29.05.2015
Approbation als Arzt
Praktische Erfahrungen
2007 – 2008
Zivildienst an der Universitätsmedizin Göttingen
11/2011 – 12/2013
Studentische Hilfskraft an der Strahlenklinik Erlangen
12/2014 – 04/2015
Strahlenklinik, FAU Erlangen-Nürnberg
seit 11/2015
Assistenzarzt in der Strahlenklinik des Universitätsklinikums
Erlangen-Nürnberg
87