E.-coli

„It has not escaped our notice
that the specific pairing we have
postulated immediately suggests
a possible copying mechanism
for the genetic material.“
„Es ist uns nicht entgangen,
dass die spezifische Paarung,
die wir vorgeschlagen haben,
direkt auf einen möglichen
Mechanismus der
Vervielfältigung des genetischen
Materials hinweist.“
(James D. Watson und Francis H. C.
Crick (1953)
Wie ist das Zitat von Watson und
Crick gemeint?
Entwickelt eine
Hypothese wie die DNA verdoppelt
werden kann.
 Versuchsbeschreibung

Meselson und Stahl überprüften 1958 die drei
Hypothesen bezüglich der Reduplikation der DNA
experimentell

Escherichia-coli-Bakterien (E.-coli) wurden über 14
Generationen in zwei Nährlösungen gezüchtet

In einer der Nährlösungen enthält das Ammoniumchlorid
(NH4Cl) ein „schweres“ Stickstoffisotop (relative Atommasse
15; 15N).

In der zweiten Nährlösungen enthält das Ammoniumchlorid
(NH4Cl) ein „leichteres“ Stickstoffisotop (relative Atommasse
14; 14N).

1
Nach drei Tagen wird die DNA aus den Bakterien
extrahiert und einer Dichtegradientenzentrifugation
unterzogen.
Dichtegradientenzentrifugation

Die Dichtegradientenzentrifugation gehört zu den
physikalischen Trennverfahren.

Verschiedene gelöste Makromoleküle werden in einer
Ultrazentrifuge anhand ihrer Bewegungsgeschwindigkeit
(s.a. Sedimentationsgeschwindigkeit) unter dem Einfluss
starker Zentrifugalkräfte sortiert.

Die zu untersuchende Probe wird auf die Oberfläche des
Zentrifugenröhrchens gegeben.

Während der mehrstündigen Trennung sedimentieren die
Moleküle mit unterschiedlicher Geschwindigkeit im
Lösungsmittel, und zwar solange die Dichte der Probe
größer ist als die Dichte des Lösungsmittels und um so
schneller, je größer der Dichteunterschied ist.
Dichtegradientenzentrifugation

Bricht man die Zentrifugation zu einem geeigneten
Zeitpunkt ab, erhält man unterschiedliche Banden der
Bestandteile der Probe.
 Versuchsdurchführung
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
Einbau des
„schweren“
N
N
Stickstoffes
in die Nucleotide
N
(Base, Zucker, Phosphat)
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
2
 Versuchsdurchführung / Phase I
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
Probenentnahme nach 3 Tagen & DNA-Extraktion
48h Dichtegradientenzentrifugation
 Versuchsdurchführung / Phase I
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
48h Dichtegradientenzentrifugation
?
3
?
 Versuchsdurchführung / Phase I
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
48h Dichtegradientenzentrifugation
„leichte“ DNA
„schwere“ DNA
 Versuchsdurchführung / Phase II
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
Überführung in 14NH4Cl Medium („leichten“ Stickstoff)
Nach 20 Minuten Dichtegradientenzentrifugation
 Versuchsdurchführung / Phase II
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
Nach 20 Minuten Dichtegradientenzentrifugation
?
4
 Versuchsdurchführung / Phase II
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
Nach 20 Minuten Dichtegradientenzentrifugation
 Transfer auf die molekulare Ebene
 Transfer auf die molekulare Ebene
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
Nach 20 Minuten Dichtegradientenzentrifugation
5
 Transfer auf die molekulare Ebene
 Transfer auf die molekulare Ebene
Generation I
Phase I
Generation II
Phase II
 Transfer auf die molekulare Ebene
Generation I
Phase I
Generation II
Phase II
 Transfer auf die molekulare Ebene
Generation I
Phase I
Generation II
Phase II
6
 Transfer auf die molekulare Ebene
E. coli – Bakterien in
15NH Cl Medium
4
E. coli – Bakterien in
14NH Cl Medium
4
Nach 40 Minuten Dichtegradientenzentrifugation
Generation I
Phase I
… nach 20 Minuten
Generation II
… nach 40 Minuten
Generation III
 Transfer auf die molekulare Ebene