Immunregulatorische Funktionen von γδ T-Lymphozyten
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Immunregulatorische Funktionen von
T-Lymphozyten
DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von
Christian Peters
Kiel
2013
Johann Wolfgang von Goethe (Faust I): „Blut ist ein ganz besonderer Saft”
Referent: Professor Dr. Thomas Roeder
Korreferent: PD. Dr. Daniela Wesch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.06.2013
- Inhaltsverzeichnis -
1. Inhaltsverzeichnis
1.
Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... I
2.
Abkürzungen ............................................................................................................. IV
3.
Einleitung ................................................................................................................... 1
3.1.
T-Zellen und T-Zell-Differenzierung ......................................................................... 1
3.2.
T-Zellen ............................................................................................................... 2
3.2.1.
T-Zellen zwischen angeborener und erworbener Immunität .......................... 2
3.3.
Regulatorische T-Zellen ........................................................................................... 5
3.3.1.
Verschiedene Populationen regulatorischer T-Zellen ........................................ 6
3.3.2.
Phänotypische Charakterisierung von Treg....................................................... 7
3.3.3.
Funktionsweise regulatorischer T-Zellen ..........................................................10
3.4.
T-Zellen im immunregulatorischen Geschehen ...................................................12
3.4.1.
Kostimulatorische und antigenpräsentierende Funktionen bei T-Zellen .......12
3.4.2.
Interaktionen von T-Zellen und Treg ............................................................13
3.4.3.
Induzierte regulatorische T-Zellen ................................................................14
3.4.4.
Tumor-induzierte regulatorische T-Zellen ....................................................14
3.4.5.
Intrinsische, regulatorische Funktionen von T-Zellen ...................................15
3.5.
Suppressive und kostimulatorische Oberflächenmoleküle ......................................17
3.5.1.
CTLA-4 : CD80/-86 ..........................................................................................18
3.5.2.
PD-1 : PD-L1/2 ................................................................................................19
3.6.
Toll-like Rezeptoren (TLR) ......................................................................................21
3.6.1.
TLR bei T-Zellen ..........................................................................................22
3.6.2.
Aufbau und Signaltrasduktion von TLR ............................................................23
3.7.
Fragestellung ..........................................................................................................26
4.
Material .....................................................................................................................27
4.1.
Substanzen.............................................................................................................27
4.1.1.
Zytokine und Stimulanzien ...............................................................................27
4.1.2.
Substanzen ......................................................................................................27
4.1.3.
Inhibitoren ........................................................................................................28
4.2.
Puffer und Lösungen ..............................................................................................28
4.2.1.
Für zellbiologische Arbeiten verwendete Puffer und Lösungen ........................28
4.2.2.
Für die Proteinbiochemie verwendete Puffer und Lösungen ............................29
4.3.
Kits .........................................................................................................................30
4.4.
Antikörper ...............................................................................................................30
4.4.1.
Zur Analyse von Oberflächenmolekülen verwendete mAk ...............................30
4.4.2.
Zur Analyse intrazellulärer Moleküle verwendete monoklonale Antikörper .......31
4.4.3.
Agonistische und antagonistische Antikörper ...................................................32
4.4.4.
Antagonistische Fusionsproteine .....................................................................32
4.4.5.
Zur Western blot-Analyse verwendete Antikörper ............................................32
4.5.
Geräte ....................................................................................................................33
4.6.
Verbrauchsmaterialien ............................................................................................33
4.7.
Software .................................................................................................................34
4.8.
Statistik ...................................................................................................................34
5.
Methoden ..................................................................................................................35
5.1.
Zell-basierte Methoden ...........................................................................................35
5.1.1.
Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut...............................35
5.1.2.
Magnetische Zellseparation (MACS) ................................................................35
5.1.3.
Kryokonservierung ...........................................................................................36
5.1.4.
Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität ........................................................36
5.1.5.
Kulturbedingungen ...........................................................................................36
5.1.6.
Stimulation von T-Zellen ..................................................................................37
5.1.6.1. Blockierende Antikörper und Fusionsproteine ..................................................38
5.1.6.2. TLR2-Liganden-Stimulation .............................................................................39
-I-
- Inhaltsverzeichnis 5.1.7.
Proliferationsanalyse anhand von 3H-Tymidineinbau .......................................39
5.2.
Durchflusszytometrische Methoden ........................................................................40
5.2.1.
Oberflächenantikörpermarkierung ....................................................................40
5.2.2.
Intrazelluläre Antikörpermarkierungen..............................................................40
5.2.3.
SCDA (Standard Cell Dilution Assay)...............................................................41
5.3.
Proteinbiochemische Methoden ..............................................................................43
5.3.1. Herstellung von Zelllysaten .....................................................................................43
5.3.2.
Bestimmung von Proteinkonzentrationen .........................................................44
5.3.3.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ......................................44
5.3.4.
Western blot Transfer ......................................................................................45
5.3.5.
Entfernen von Antikörpern von Western blot-Membranen („Stripping“) ............45
5.4.
Immunochemische Methoden .................................................................................46
5.4.1.
Immunodetektion von Proteinen auf einer Nitozellulosemembran ....................46
5.4.2.
ELISA ..............................................................................................................46
5.4.3.
Phosphorylierungs-Rasteranalyse (Phospho-Array-Analyse) ...........................47
6.
Ergebnisse ................................................................................................................48
6.1.
Suppressive Eigenschaften von T-Zellen ............................................................48
6.1.1.
Das suppressive Potential von Treg und T-Zellen im Vergleich ...................48
6.1.2.
Expression löslicher Mediatoren bei Kokultur von - und Responder
T-Zellen ...........................................................................................................50
6.1.3.
Die Abhängigkeit der Suppression von Zellkontakt bzw. der Kompetition
um IL-2 ............................................................................................................52
6.1.4.
Die Expression suppressiver und kostimulatorischer Oberflächenmoleküle .....53
6.1.5.
Funktionelle Analyse suppressiver Oberflächenmoleküle.................................57
6.2.
TLR(2)-Liganden-induzierte Modulationen ..............................................................60
6.2.1.
Der Einfluss von TLR2-Liganden auf die Proliferation und Suppressivität ........60
6.2.2.
TLR2 abhängige Modulation von Oberflächenmolekülen .................................61
6.2.3.
Der Einfluss von TLR2-Liganden auf die Produktion und Freisetzung
verschiedener löslicher Mediatoren ..................................................................64
6.2.4.
Einfluss von TLR2-Liganden auf verschiedene Signalwege .............................65
6.3.
Expression von Transkriptionsfaktoren und deren Korrelation mit suppressiver
Aktivität ...................................................................................................................73
6.3.1.
Helios- und Foxp3-Expression in Kokulturexperimenten ..................................74
6.3.2.
Die Expression verschiedener Transkriptionsfaktoren in T-Zellen unter
unterschiedlichen Expansionsbedingungen .....................................................76
6.3.3.
Korrelation von Helios-Expression und suppressivem Potential bei
T-Zellen ...........................................................................................................80
7.
Diskussion ................................................................................................................86
7.1.
T-Zellen besitzen suppressives Potential ............................................................86
7.2.
T-Zellen weisen weder einen klassischen Treg Phänotyp auf noch
induzieren sie diesen bei Responder T-Zellen ........................................................87
7.3.
Verschiedene mögliche Mechanismen könnten zur Suppression von
T-Zellen führen .......................................................................................................88
7.4.
Die Suppression wird durch zellkontaktabhängige Interaktionen vermittelt .............90
7.5.
TLR2-Liganden modulieren die Funktionen von T-Zellen....................................93
7.6.
Für die suppressive Rolle der CTLA-4 : CD86 und der PD-1 : PD-L1Interaktion spricht auch die Modulation der beteiligten Oberflächenmoleküle
nach TLR2-Liganden-Vorinkubation........................................................................95
7.7.
TLR2-Liganden steigern die Phosphorylierung von Signalmolekülen ......................97
7.8.
T-Zellen exprimieren Helios ..............................................................................103
7.9.
Die Expression von Helios in T-Zellen hat keinen direkten Einfluss auf ihre
regulatorische Funktion.........................................................................................104
7.10. CD28-Kostimulation induziert die Helios-Expression ............................................105
7.11. Kostimulation durch CD28 steht im Zusammenhang mit der Induktion von
regulatorischen Funktionen in T-Zellen .............................................................106
- II -
- Inhaltsverzeichnis 7.12. TGF- führt zur Induktion von Foxp3 in T-Zellen, nicht aber
notwendigerweise zu einem regulatorischen Phänotyp .........................................107
7.13. Helios und Foxp3 sind notwendig für die Differenzierung regulatorischer ()
T-Zellen ................................................................................................................110
7.14. TGF- führt zur Differenzierung von T-Zellen ...................................................111
7.15. Fazit......................................................................................................................116
8.
Zusammenfassung .................................................................................................117
8.1.
Zusammenfassung ...............................................................................................117
8.2.
Summary ..............................................................................................................119
9.
Literatur...................................................................................................................120
10.
Anhang ...................................................................................................................140
Publikationsliste..................................................................................................................140
Eidesstattliche Erklärung ....................................................................................................142
Lebenslauf..........................................................................................................................143
Danksagung .......................................................................................................................144
- III -
- Abkürzungen -
2. Abkürzungen
3
H-TdR/
H-Thymidin
AICD
AP-1
APZ
AKT
Tritium-markiertes Thymidin
3
Activation induced cell death
Activator protein 1
Antigen presenting cell
v-akt murine thymoma viral oncogene
homolog
BCG
BrHPP
CK2
CCL
CTLA-4
DN
Bromohydrin pyrophosphat
Casein kinase 2
C-C motif ligand
Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CD152)
Double negative stage (T cell development)
DP
Double positive stage (T cell development)
DZ
ELISA
ERK
Foxp3
FACS
GSK-3
GATA-3
GITR
Dendritic cells
Enzyme-linked immunosorbent assay
Extracellular signal-regulated kinases
Forkhead box protein P3
Fluorescence activated cell sorting
Glykogen synthase kinase 3
GATA binding protein 3
Glucocorticoid-induced TNFR-related protein
(TNFRSF18)
Histone deacetylase
Histone acetyltransferase
Hydroxy-Methyl-Butenyl-Pyrophosphat
Indolamin2,3-dioxygenase
Intraepithelial lymphocyte
IκB kinase
Interleukin
Interferon
Isopentenyl pyrophosphate
Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory
motif
Induced Treg
Immunoreceptor tyrosine-based switch motif
HDAC
HAT
HMB-PP
IDO
IEL
IKK
IL
IFN
IPP
ITIM
iTreg
ITSM
IB
JNK
LAP
MyD88
MSK2
MHC
mAk
MIC
MAP
Inhibitor of NF-B
c-Jun N-terminal kinases
Latency-associated peptide
Myeloid differentiation factor 88
Mitogen- and stress-activated protein kinase 2
Major histocompatibility complex
MIP-1
Macrophage inflammatory protein-1 (CCL3)
MHC class I polypeptide-related sequence
Mitogen-activated protein
- IV -
Aktivierungsinduzierter Zelltod
Antigenpräsentierende Zelle
Bacillus Calmette-Guerin; Mycobacterium bovis - Impfstoff
Bromohydrin-Pyrophosphat
Casein Kinase 2
Doppelt negatives Stadium (T-ZellEntwicklung; CD4 CD8 )
Doppelt positives Stadium (T-ZellEntwicklung; CD4+CD8+)
Dendritische Zellen
Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
Histon-Deacetylase
Histon-Acetyltransferase
Hydroxymethylbutenyl-Pyrophosphat
Indolamin-2,3-Dioxygenase
Intraepitheliale Lymphozyten
IκB Kinase
Interleukin
Interferon
Isopentenylpyrophosphat
Induzierte Treg
Inhibitor von NF-B
C-Jun-N-terminale Kinasen
Haupthistokompatibilitätskomplex
Monoklonaler Antikörper
- Abkürzungen -
PAMP
Macrophage inflammatory protein-1 (CCL4)
Nuclear factor of activated T-cells
Natural killer gene group 2, member D
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of
activated B cells
Nod-like receptors
Natural killer cell
Natural Treg
Nucleosome remodeling and deacetylase
(complex)
Pathogen-associated molecular patterns
PBMZ
Peripheral blood mononuclear cell
PBS
PD-1
PDK1
Phosphate buffered saline
Programmed death-1 (CD279)
Phosphoinositide dependent protein kinase 1
(PDPK1)
Programmed death ligand 1 (B7-H1; CD274)
Programmed death ligand 2 (B7-DC; CD273)
Phosphatidylinositol-3-kinase
Protein phosphatase 2
Pattern recognition receptor
Regulated and normal T cell expressed and
secreted (CCL5)
+
CD4 CD25 T cell
Relative Centrifugal Force
Retinoic acid receptor-related
orphan receptor
Standard cell dilution assay
Sodium dodecyl sulphate
MIP-1
NFAT
NKG2D
NF-B
NLR
NK
nTreg
NuRD
PD-L1
PD-L2
PI3K
PP2A
PRR
RANTES
Responder
rcf
ROR
SCDA
SDS
SDS-PAGE
SHP
siRNA
SE
STAT
Pathogenen assoziierte molekulare
Strukturen
Mononukleäre Zellen des peripheren
Blutes
Phosphatgepufferte Salzlösung
Phosphatidylinositol-3-Kinasen
Mustererkennungsrezeptor
+
-
CD4 CD25 T-Zellen
Relative Zentrifugalbeschleunigung
Natriumlaurylsulfat
SDS-Polyacrylamid
Gelelektrophorese
Src homology region 2 domain-containing
phosphatase
Small interfering RNA
Staphylococcus aureus Enterotoxin
TAK1
T-bet
TCM
Signal transducer and activator of
transcription
TGF- activated kinase 1
T-box expressed in T cells
Cental memory T cell
TEM
Effektormemory T cell
TEMRA
Terminally differentiated effektor memory T
cell
Transforming growth factor
T cell immunoglobulin mucin-3 (HAVCR2)
T helper cell
Toll-interleukin 1 receptor (domain)
Tumor necrosis factor
TIR domain containing adaptor protein (Mal)
Toll-like receptor
Naive T cells
TGF-
TIM-3
Th
TIR
TNF
TIRAP
TLR
TNaiv
Natürliche Killerzelle
Natürliche Treg
-V-
TGF- aktivierte Kinase 1
Zentrale Gedächtnis T-Zelle
+
(CD27 CD45RA )
Effektor-Gedächtnis T-Zelle (CD27
CD45RA )
+
(CD27 CD45RA ) terminal differenzierte Effektor-Gedächtnis T-Zelle
T-Helferzelle
Toll-IL-1 Rezeptor-(Domäne)
Tumornekrosefaktor
Toll-ähnlicher Rezeptor
+
+
Naive T-Zelle (CD27 CD45RA )
- Abkürzungen TRAF
TPA
TNF receptor-associated factor
12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
Treg
TZR
Regulatory T cell
T cell receptor
- VI -
12-O-Tetradecanoylphorbol-13acetat
Regulatorische T-Zelle
T-Zellrezeptor
- Einleitung -
3. Einleitung
Das Immunsystem lässt sich in zwei unterschiedliche Bereiche einteilen. Zum einen in die
angeborene Immunität, die unmittelbar bei Kontakt mit einem Pathogen bzw. bei
ausbleibender Selbsterkennung reagiert. Sie führt zur Produktion von Chemokinen, Zytokinen, antimikrobiellen Proteinen, zytotoxischen Effektorfunktionen (hauptsächlich vermittelt
durch natürliche Killerzellen [NK-Zellen]), zum Auslösen der Komplementkaskade, zur
Aktivierung von Phagozyten und zur Aktivierung und Reifung von dendritischen Zellen (DZ).
Zum anderen in die erworbene oder auch adaptive Immunität, die sich vor allem durch die
klonale Expansion von Lymphozyten auszeichnet, die spezifisch gegen den jeweiligen
Erreger gerichtet sind. Ein weiteres Merkmal der adaptiven Immunität ist die Ausbildung
eines immunologischen Gedächtnisses, was bei erneutem Kontakt mit dem jeweiligen
Pathogen eine beschleunigte Immunantwort ermöglicht. Lymphozyten werden in BLymphozyten, welche die humorale und T-Lymphozyten (oder auch T-Zellen), welche die
zelluläre Immunantwort vermitteln, unterteilt.
3.1.
T-Zellen und T-Zell-Differenzierung
Anhand der exprimierten T-Zellrezeptorketten lassen sich - und T-Lymphozyten
unterscheiden. Die Letzteren stellen den größten Anteil der T-Zellen des peripheren Blutes
dar und lassen sich anhand ihres Korezeptors in cluster of differentiation (CD) 8+ und CD4+
T-Zellen differenzieren.
CD8+ T-Zellen erkennen durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC: major histocompatibility complex) I präsentierte Peptide mit Hilfe ihres T-Zellrezeptors (TZR) und
benötigen dafür das CD8-Molekül als Korezeptor. Durch das MHC I-Molekül, welches auf der
Oberfläche aller kernhaltigen Zellen exprimiert wird, werden Peptide, die von in der Zelle
translatierten Proteinen stammen, präsentiert. MHC I spielt daher eine Rolle bei der Abwehr
intrazellulärer Pathogene. CD8+ T-Zellen sind in der Lage TZR spezifisch Zytotoxizität durch
Sezernierung zytotoxischer Mediatoren oder Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu vermitteln.
Ähnlich wie CD8+ können auch CD4+ T-Zellen durch ihren TZR, unter Zuhilfenahme des
Korezeptors CD4, mit einem Komplex aus MHC II und gebundenem Peptid, interagieren.
MHC II-gebundene Peptide werden vor allem von antigenpräsentierenden Zellen (APZ)
exprimiert. Die Bindung der Peptide an MHC II erfolgt nach Degradierung von Proteinen im
endolysosomalen Kompartiment, weshalb hauptsächlich Peptide endo- bzw. phagozytotischen Ursprungs präsentiert werden. CD4+ T-Zellen erkennen meist Peptide von Pathogenen, die extrazellulär oder im endosomalen Kompartiment lokalisiert sind und unterstützen
als T-Helferzellen die Immunantwort. Funktionell werden T-Zellen im Wesentlichen in
T-Helferzellen (Th) Typ 1, welche die zellvermittelte Immunität und die Beseitigung intra-
-1-
- Einleitung zellulärer Pathogene fördern und in Th2-Zellen, welche die humorale Immunität und damit
Eliminierung extrazellulärer Pathogene unterstützen, unterteilt. Die Differenzierung zu Th1Zellen wird durch Interleukin (IL) -12 und Interferon (IFN) - gesteuert, während für die zu
Th2-Zellen IL-4 notwendig ist. Für eine Th1-Antwort ist die Freisetzung proinflammatorischer
Zytokine wie IL-2, IFN- und Tumornekrosefaktor (TNF) - charakteristisch, für eine Th2Antwort dagegen Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13 und IL-25. Die für die
unterschiedlichen Differenzierungstypen notwendigen Zytokine werden von den jeweiligen
T-Helferzellen selbst hergestellt, was zu einer positiven Rückkopplung und Verstärkung der
Antwort führt. Zusätzlich können IFN-, IL-4 und IL-10 negativ regulatorisch auf die jeweils
entgegengesetzte Th-Antwort wirken. Eine weitere Differenzierungsmöglichkeit ist der Th17Phänotyp, an dessen Induzierung im Menschen IL-6, Transforming growth factor (TGF-),
IL-21 und IL-23 beteiligt sind. Dieser wird vor allem durch die Freisetzung von IL-17, IL-21,
IL-22 und IL-23 charakterisiert und spielt bei Entzündung und Gewebeverletzung eine Rolle.
IL-17 (IL-17A und IL-17F) ist stark proinflammatorisch, aktiviert neutrophile Granulozyten und
wirkt auf diese auch chemotaktisch (Manel et al. 2008; Dong 2008).
Die verschiedenen Differenzierungstypen lassen sich anhand der Expression bestimmter
Transkriptionsfaktoren charakterisieren. So sind die Transkriptionsfaktoren T-box expressed
in T cells (T-bet) für die Th1-Antwort, GATA binding protein 3 (GATA-3) für die Th2-Antwort
und retinoic acid receptor-related orphan receptor t (RORt) für Th17-Antwort kennzeichnend (Bi & Yang 2012; Wilson et al. 2009). T-Zellen können außerdem zu regulatorischen
T-Zellen (Treg) differenzieren und einer Immunantwort entgegenwirken, worauf in Kapitel 3.3
noch detaillierter eingegangen wird.
3.2.
3.2.1.
T-Zellen
T-Zellen zwischen angeborener und erworbener Immunität
T-Zellen besitzen sowohl Eigenschaften der angeborenen als auch der erworbenen
Immunität. Sie erkennen wie Zellen der angeborenen Immunität Antigene direkt, wobei dies
allerdings mit Hilfe ihres TZR geschieht. Anders als bei der Antigenerkennung durch
T-Zellen werden diese MHC unabhängig erkannt und müssen zuvor nicht prozessiert worden
sein. Daher werden für diesen Vorgang die Korezeptoren (CD4 bzw. CD8) auch nicht
benötigt, die hiermit konform, auf den meisten T-Zellen nicht vorhanden sind. Theoretisch
verfügen T-Zellen über ein ähnlich großes TZR-Repertoire wie T-Zellen, allerdings
weisen T-Zellen in vivo eine deutlich geringere Variabilität der complementarity determining region (CDR) 3 auf. Dies deutet darauf hin, dass T-Zellen in vivo eine begrenzte
Anzahl von Antigenen erkennen (Shin et al. 2005). Die meisten T-Zellen exprimieren eine
V1- oder V2-Kette zusammen mit bestimmten V-Ketten. Man kann T-Zellen anhand der
-2-
- Einleitung von ihnen exprimierten variablen Ketten in verschiedene Subpopulationen unterteilen. Diese
T-Zell-Populationen weisen unterschiedliche präferentielle Lokalisationen im Körper auf,
was auf unterschiedliche Aufgaben hinweist. V1 T-Zellen sind beim erwachsenen
Menschen eher in Epithelien zu finden und stellen nur einen kleinen Prozentsatz der
T-Zellen des peripheren Blutes dar. Im Gegensatz dazu sind V2 T-Zellen primär im
peripheren Blut zu finden und machen dort mit 50-95% den größten Anteil der T-Zellen
aus (Kabelitz & He 2012; Triebel et al. 1988). V1 T-Zellen erkennen stressinduzierte
Oberflächenmoleküle (u.a. MHC class I polypeptide-related sequence A/B [MICA/B]) (Groh
et al. 1999) und V9V2 T-Zellen phosphorylierte Antigene (Isopentenylpyrophosphat [IPP],
Hydroxymethylbutenyl-Pyrophosphat [HMB-PP]) (Jomaa et al. 1999; Altincicek et al. 2001).
Bei HMB-PP und IPP handelt es sich um phosphorylierte Nicht-Peptide mit einem geringen
Molekulargewicht, die als Phosphoantigene (pAg) bezeichnet werden. HMB-PP ist ein
Zwischenprodukt des mikrobiellen Nicht-Mevalonat- (Rohmer-) Signalweges der Isoprenoidbiosynthese und findet sich in den meisten pathogenen Bakterien. HMB-PP wird von
eukaryotischen Zellen nicht produziert. Außerdem erkennen V9V2 T-Zellen, allerdings mit
10.000-mal schwächerer Affinität, IPP, ein strukturell ähnliches Produkt des Mevalonat- und
Nicht-Mevalonat-Signalweges. Es ist in pro- und eukaryotischen Zellen zu finden und führt
aufgrund der schwächeren Affinität in physiologischen Konzentrationen nicht zur Aktivierung
von V2 T-Zellen (Burk et al. 1995). In Tumorzellen liegt häufig eine Fehlregulation des
Mevalonat-Signalweges vor, was zur Akkumulation und verstärkten Freisetzung von IPP und
somit wiederum zur Aktivierung der Zellen führen kann. Es ist auch möglich V9V2 T-Zellen
durch Bromohydrin-Pyrophosphat (BrHPP), das ein synthetisches Analogon von IPP ist und
eine höhere biologische Aktivität besitzt, zu stimulieren (Espinosa et al. 2001). Auch durch
Aminobisphosphonate, die zur Blockade der farnesylpyrophosphate synthase (FPPS)
innerhalb des Isoprenoidbiosyntheseweges und dadurch zur Akkumulation von IPP führen,
werden V2 T-Zellen aktiviert (van Beek et al. 1999). V9V2 T-Zellen benötigen keinen
Kontakt mit Peptid-MHC präsentierenden APZ in den Lymphknoten, um ihre Antigene zu
erkennen. Sie erkennen diese zellkontaktabhängig auf Phosphoantigen-präsentierenden
Zellen (z.B. Monozyten/DZ oder aktivierte T-Zellen). Zusätzlich zum TZR-Stimulus werden
für die Proliferation Zytokine wie IL-2 oder IL-15 benötigt (Pechhold et al. 1994b; Boullier et
al. 1999; Eberl et al. 2002). Bei verschiedenen mikrobiellen Infektionen kommt es zu einer
Expansion von V2 T-Zellen. Beim Menschen wurde dies unter anderem für Infektionen
mit Francisella tularensis (Tularemia), Salmonella (Salmonellose), Brucella (Brucellose),
Ehrlichia (Ehrlichiose), Anaplasma (Anaplasmose), Haemophilus influenzae, Neisseria
meningitidis, Streptococcus pneumoniae (bakterielle Meningitis), Mycobacterium avium und
Mycobacterium tuberculosis (Tuberkulose) beschrieben (Chen & Letvin 2003b). Eine weitere
wichtige Eigenschaft von T-Zellen sind direkte zytotoxische Effektorfunktionen. Diese
-3-
- Einleitung können beispielsweise durch Bindung des V1 TZR an den stressinduzierte Liganden
MICA auf der Oberfläche von Tumorzellen ausgelöst werden (Zhao et al. 2006). V2 TZellen können ebenfalls zytotoxische Effektorfunktionen gegen Tumorzellen aufweisen, die
durch (akkumuliertes) IPP und einen positiven Kostimulus z.B. infolge der Bindung von
MICA/B an natural killer gene 2D (NKG2D) ausgelöst werden (Wrobel et al. 2007; Todaro et
al. 2009). NK-Rezeptoren wie NKG2D sind typischerweise auf Zellen des angeborenen
Immunsystems wie NK-Zellen, jedoch auch auf nahezu allen T-Zellen zu finden. Die
verschiedenen Subpopulationen von T-Zellen erkennen also mit Hilfe ihres TZR
bestimmte konservierte (teilweise auch pathogen assoziierte) Strukturen. Ihre TZR weisen
somit eine gewisse Ähnlichkeit zu keimbahnkodierten Mustererkennungsrezeptoren (PRR:
pattern recognition receptors) auf. Außerdem exprimieren T-Zellen funktionelle PRR wie
z.B. Nod-like receptors (NLR) oder Toll-like receptors (TLR), aufgrund derer sie direkt auf
Pathogene reagieren können, worauf in Kapitel 3.6.1 noch genauer eingegangen wird
(Wesch et al. 2006; Pietschmann et al. 2009; Marischen et al. 2011).
T-Zellen besitzen allerdings auch einige Eigenschaften, aufgrund derer man sie eher der
erworbenen Immunität zurechnen würde. Sie können sich z.B. zu Gedächtniszellen
entwickeln und ein immunologisches Gedächtnis ausbilden. Nach einer vorangegangenen
mykobakteriellen Infektion in Makaken kommt es bei einer Reinfektion zu einer
beschleunigten Expansion von V2 T-Zellen (Shen et al. 2002). Außerdem weist ein Großteil
der V9V2 T-Zellen im Blut einen memory Phänotyp auf. Man kann T-Zellen anhand
ihres Phänotyps in verschiedene Subpopulationen einteilen, welche unterschiedlichen
Reifungsstadien entsprechen (Dieli et al. 2003). Im Menschen weisen etwa 80% der V9V2
T-Zellen eine Expression des positiv-kostimulatorischen Oberflächenmoleküls CD27 auf, das
bei Ligandenbindung die Zellen vor aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD: Activation
induced cell death) schützt (Dieli et al. 2003; DeBarros et al. 2011). Anhand der Oberflächenmarker CD27 und CD45RA ist es möglich T-Zellen in verschiedene Subpopulationen aus
naiven (TNaiv:
CD27+CD45RA+),
central
memory (TCM:
CD27+CD45RA-),
effector
memory (TEM: CD27-CD45RA-) und terminal differenzierte effector memory Zellen einzuteilen
(TEMRA: CD27-CD45RA+). TNaiv und TCM besitzen keine direkten Effektorfunktionen und
exprimieren Chemokinrezeptoren für die Migration zu sekundären lymphatische Organen.
TEM und TEMRA exprimieren Chemokinrezeptoren, die für die Migration zu Entzündungsherden
essentiell sind und üben direkte Effektorfunktionen wie Zytokinproduktion bzw. Zytotoxizität
aus (Dieli et al. 2003). Zudem können T-Zellen unterschiedlich differenziert sein, sie
weisen jedoch vorwiegend ein Th1-Profil auf. Isolierte V9V2 T-Zellen, die ex vivo durch
Phosphoantigene stimuliert wurden, setzen Th1-Zytokine wie IFN-, TNF- und GM-CSF frei
(Garcia et al. 1997). Außerdem können die proinflammatorisch wirkenden Chemokine
macrophage inflammatory protein-1C-C motif ligand 3 (MIP-1/CCL3), macrophage
-4-
- Einleitung inflammatory protein-1 (MIP-1/CCL4) und regulated and normal T cell expressed and
secreted (RANTES/CCL5) produziert werden (Poccia et al. 1999). T-Zellen sind allerdings,
wie anhand frisch isolierter T-Zellen und auch anhand polyklonal aktivierter T-Zelllinien
bzw. Klone gezeigt werden konnte, je nach verwendetem Antigenstimulus und dem
umgebenden Zytokinmilieu sowohl in der Lage Th1- als auch Th2-Zytokine zu produzieren
(Wesch et al. 2001; Ferrick et al. 1995; Sireci et al. 1997). Ebenso kann in humanen
T-Zellen analog zu T-Zellen auch eine Th17-Differenzierung induziert werden (NessSchwickerath et al. 2010).
Da T-Zellen sowohl Charakteristika der angeborenen als auch der erworbenen Immunität
aufweisen, lassen sich T-Zellen keinem der beiden eindeutig zuordnen und werden daher
oft als Bindeglied zwischen beiden Bereichen betrachtet (Wesch et al. 2011). Die
verschiedenen immunologischen Funktionen und Interaktionen von T-Zellen sind in
Abbildung 1 schematisch dargestellt.
Abb. 1: Schematische Darstellung wichtiger immunologischer Interaktionen und
Funktionen von T-Zellen.
3.3.
Regulatorische T-Zellen
Forkhead box protein 3 (Foxp3) exprimierende CD4+CD25+ Treg kontrollieren die Immunantwort in Reaktion auf Eigen- und Fremd-Antigene und sind notwendig um die Balance
zwischen Immunreaktion und Toleranz zu erhalten (Belkaid & Rouse 2005; Mottet &
Golshayan 2007; Sakaguchi 2004; Tang & Bluestone 2008). Durch Treg wird die Aktivität
von autoreaktiven T-Zellen unter Kontrolle gehalten.
Im Menschen sind verschiedene Autoimmunkrankheiten, wie z.B. Multiple Sklerose (Viglietta
et al. 2004), Rheumatoide Arthritis (Ehrenstein et al. 2004) oder Typ 1 Diabetes (Lindley et
-5-
- Einleitung al. 2005) mit Defizienzen von Treg (bezüglich deren Qualität oder Quantität) assoziiert.
Dementsprechend können im Mausmodell viele durch T-Zellen vermittelte Krankheitsbilder
wie allergische Reaktionen, graft-versus-host disease (GvHD) und Autoimmunerkrankungen
wie Typ 1 Diabetes, experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, Gastritis, Colitis,
Glomerulonephritis und Polyarthritis durch die Gabe von Treg unterdrückt werden
(Sakaguchi 2004). Die Depletion von Treg hingegen kann eine effektive anti-Tumor Antwort
induzieren oder eine Immunantwort gegen eindringende Mikroorganismen verstärken,
allerdings kann sie auch zu Autoimmunität, allergischen Reaktionen gegen harmlose
Umweltfaktoren oder zur Aufhebung der fötal-maternalen Toleranz führen (Sakaguchi 2004;
Kim et al. 2007).
Treg haben ein sehr breites Spektrum an Interaktionspartnern und können die Aktivierung,
Proliferation und/oder die Effektorfunktionen einer großen Bandbreite von Immunzellen wie
z.B. von konventionellen CD4+ und CD8+ T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen, dendritischen Zellen,
Monozyten und Makrophagen, Neutrophilen und Mastzellen supprimieren (Ralainirina et al.
2007; Lim et al. 2005; Lewkowicz et al. 2006; Taams et al. 2005; Kashyap et al. 2008; Oberg
et al. 2010; Haeryfar et al. 2005; Houot et al. 2006). Für die Homeostase benötigen Treg die
Anwesenheit eines Antigens, eines CD28-Kostimulus sowie die von IL-2 (Garza et al. 2000;
Setoguchi et al. 2005; Salomon et al. 2000; Tang et al. 2003). Für die Initiation suppressiver
Funktionen ist eine antigenspezifische Aktivierung ebenfalls notwendig (Corthay 2009).
3.3.1.
Verschiedene Populationen regulatorischer T-Zellen
Regulatorische T-Zellen unterteilt man in natürliche und induzierte Treg. Natürliche
Treg (nTreg) entstehen bereits im Thymus und exprimieren konstitutiv den Transkriptionsfaktor Foxp3. Dort sind sie als Foxp3+ T-Zellen ab einem bestimmten Zeitpunkt zwischen
dem Übergang von einem doppelt positiven (DP: CD4+CD8+) zum einfach positiven
Stadium (EP: CD4+) nachweisbar (Fontenot et al. 2005). Da Treg sich im Thymus entwickeln
und reifen, ist ihr TZR-Repertoire vor allem gegen Selbst-Antigene gerichtet (Vignali et al.
2008; Fontenot et al. 2005). nTreg proliferieren nach TZR Stimulation nur, wenn ausreichend
IL-2 zur Verfügung steht. Der konstitutiv exprimierte Transkriptionsfaktor Foxp3 kann als
Transkriptionsrepressor fungieren. Seine Interaktion mit verschiedenen Proteinen der
Promotorregionen von Zytokinen wie IL-2 und IFN- führt dazu, dass Treg selbst nicht in der
Lage sind IL-2, IFN- und verschiedene andere Zytokine zu produzieren (Chen et al. 2006;
Schubert et al. 2001; Wu et al. 2006a).
Induzierte Treg (iTreg) verlassen den Thymus als CD4+Foxp3- Zellen. Sie beginnen erst nach
Antigenerkennung in Anwesenheit tolerogener Stimuli Foxp3 zu exprimieren (Curotto de
Lafaille & Lafaille 2009). TGF- ist wichtig für die Entwicklung und den Bestand von iTreg.
Mäuse, die keinen TGF--Rezeptor II exprimieren, weisen eine reduzierte Anzahl von iTreg
-6-
- Einleitung auf und entwickeln autoimmune Entzündungsreaktionen in verschiedenen Organen (Marie et
al. 2005). In Anwesenheit von IL-2 und TGF- können iTreg in vitro aus Foxp3- T-Zellen
generiert werden (Chen et al. 2003; Rubtsov & Rudensky 2007; Fantini et al. 2004; Davidson
et al. 2007).
Neben Foxp3+ gibt es noch andere Populationen von induzierten Treg, die in der Peripherie
aus naiven T-Zellen entstehen und nicht spezifisch für im Thymus präsentierte Antigene sind
(Cottrez & Groux 2004). Zu diesen gehören Tr1 Zellen, die in vitro durch Antigenstimulation
in Anwesenheit von IL-10 induziert werden und die IL-10 und TGF- sezernieren sowie Th3
Zellen, für die eine Funktion in Zusammenhang mit oraler Toleranz und mukosaler Immunität
vermutet wird (Chen et al. 1994; Groux et al. 1997; Sun et al. 2006). Des Weiteren sind auch
regulatorische Funktionen für T-Zellen beschrieben worden (siehe auch Kap. 3.4).
3.3.2.
Treg
werden
Phänotypische Charakterisierung von Treg
anhand
der
Expression
bestimmter
Oberflächenproteine,
wie
z.B.
CD39 (ENTPD1: Ectonucleoside triphosphate diphospho-hydrolase 1), cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), glucocorticoid-induced TNFR-related protein (GITR), Lymphocyteactivation gene 3 (LAG-3), CD25 (starke Expression) und CD127 (niedrige/keine Expression)
bzw. durch Transkriptionsfaktoren wie Foxp3 oder Helios charakterisiert. Allerdings hat sich
gezeigt, dass die meisten dieser charakteristischen mit Treg assoziierten Moleküle im
Rahmen der T-Zell Aktivierung ebenfalls induziert werden können (Vignali et al. 2008). Auf
konventionellen T-Zellen wird z.B. CD25 (die -Kette des IL-2-Rezeptors) und auch das
negativ-regulatorische Molekül CTLA-4 nach Aktivierung heraufreguliert (Smith 1988; Linsley
et al. 1996; Shevach 2009). Einen Durchbruch bei der Charakterisierung von Treg brachte
daher erst die Beschreibung des für sie spezifischen Transkriptionsfaktors Foxp3. Die für
Treg charakteristischen bzw. mit diesen assoziierten Moleküle sind in Abbildung 2
schematisch zusammengefasst.
3.3.2.1.
Foxp3
Die Bedeutung des Transkriptionsfaktors Foxp3 für die Immunregulation wurde anhand von
Mäusen, welche die Mutation scurfy homozygot aufweisen, erkannt. Diese Mäuse
exprimieren ein funktionsloses Foxp3 Protein und weisen ein lymphoproliferatives Krankheitsbild auf, an dem sie innerhalb von vier Wochen nach Geburt sterben (Brunkow et al.
2001). Menschen die eine Mutation des Foxp3-Gens aufweisen, leiden an einer als immune
dysfunction/polyendocrinopathy/enteropathy/X-linked (IPEX)
bezeichneten
Autoimmun-
erkrankung, die sich durch Diarrhö, meist auch Dermatitis und Immunreaktionen gegen
verschiedene endokrine Organe (oft Typ 1 Diabetes oder Thyreoiditis) auszeichnet. Ihre
Lebenserwartung liegt bei nur etwa zwei Jahren (Ziegler 2006).
-7-
- Einleitung Foxp3 gehört zu den Forkhead-Box Proteinen, einer Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die
eine charakteristische DNA-Bindedomäne (winged helix DNA-binding domain) besitzen,
welche eine Variante des Helix-Turn-Helix-Motivs darstellt. Proteine dieser Familie sind an
Prozessen des Zellwachstums, der Differenzierung und der Proliferation beteiligt. Foxp3 ist
für die Differenzierung von Treg innerhalb des Thymus sowie für deren Bestand und
regulatorische Funktion notwendig (Zheng & Rudensky 2007; Sakaguchi et al. 2008).
Obwohl gezeigt werden konnte, dass Foxp3 mit verschiedenen Proteinen wie z.B. acute
myeloid leukemia 1 protein/runt-related transcription factor 1 (AML1/Runx1), HistonAcetyltransferasen (HAT),
Histon-Deacetylasen (HDAC),
nuclear
factor
of
activated
T-cells (NFAT) und nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-B)
interagiert (Bettelli et al. 2005; Wu et al. 2006b; Li et al. 2007; Ono et al. 2007), ist der
molekulare Mechanismus der Suppression noch weitgehend unbekannt. Von Bedeutung für
die Suppression ist möglicherweise die Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor Eos, durch
welchen die Stilllegung von Genen und Chromatinmodifikationen vermittelt werden könnte
(Pan et al. 2009). Foxp3 wird von iTreg erst nach deren Entstehung in der Peripherie
exprimiert. Eine schwache TZR-Stimulation führt oft zur Induktion von Foxp3. Bei
Anwesenheit von TGF- kommt es ebenfalls zur Foxp3-Induktion, auch wenn der TZRStimulus ansonsten hierfür aufgrund hoher Antigenstärke bzw. Dichte zu stark gewesen
wäre (Josefowicz & Rudensky 2009). In der Maus konnte gezeigt werden, dass die TGF-induzierte Foxp3-Expression in iTreg im Vergleich zu nTreg weniger stabil ist. Diese
Tatsache ist auf unterschiedliche Methylierungsmuster innerhalb von regulatorischen
Bereichen des Foxp3-Gens zurückzuführen (Baron et al. 2007; Floess et al. 2007). In
murinen T-Zellen kommt es zu keiner aktivierungsinduzierten Expression von Foxp3. Im
Menschen hingegen konnte gezeigt werden, dass Foxp3 ebenso wie viele andere für Treg
charakteristische Moleküle aktivierungsabhängig induziert und transient exprimiert wird
(Walker et al. 2003). Diese Aktivierungsinduzierbarkeit von Foxp3 im Menschen wird
allerdings kontrovers diskutiert und kann sich je nach Art des zum Nachweis von Foxp3
verwendeten Antikörpers qualitativ unterscheiden. Diese Unterschiede werden in Kapitel 7.2
genauer beleuchtet.
3.3.2.2.
Helios
Die Expression des Transkriptionsfaktors Helios (Ikzf2) in maturen, unstimulierten T-Zellen
wurde ebenfalls von mehreren Gruppen mit regulatorischen T-Zellen in Zusammenhang
gebracht (Getnet et al. 2010; Hill et al. 2007; Sugimoto et al. 2006; Thornton et al. 2010;
Zheng et al. 2007; Zheng & Rudensky 2007). Von Bedeutung ist hierbei insbesondere seine
Rolle als möglicher Differenzierungsmarker zwischen Helios-exprimierenden nTreg und
iTreg, die keine Expression aufweisen (Thornton et al. 2010). Es gibt verschiedene Hinweise
auf eine wechselseitige Regulation von Helios und Foxp3 (Sugimoto et al. 2006). Allerdings
-8-
- Einleitung konnte eine Helios-Expression auch unabhängig von einer Foxp3-Expression beobachtet
werden. Dies legt eine autonome oder Foxp3-regulierende Funktion von Helios nahe (Zheng
& Rudensky 2007). In murinen und humanen (CD4+ und CD8+) T-Zellen konnte allerdings
auch eine aktivierungsinduzierte Expression von Helios beobachtet werden (Akimova et al.
2011). Helios spielt zudem eine Rolle bei der Reifung von Thymozyten und wird in deren
frühen Entwicklungsstadien exprimiert (Kelley et al. 1998; Hahm et al. 1998).
Helios ist ein Mitglied der Ikaros Transkriptionsfaktor-Familie, zu welcher die fünf Mitglieder
Ikaros, Helios, Aiolos, Eos und Pegasus gehören (Rebollo & Schmitt 2003). Diese
Transkriptionsfaktoren besitzen zwei Regionen hochkonservierter C2H2-Zinkfingermotive.
Die vier Zinkfingermotive umfassende Region am N-Terminus ist verantwortlich für die
sequenzspezifische Bindung an die DNA, während die aus zwei Zinkfingermotiven
bestehende C-terminale Region für die Bildung von Homo- bzw. Heterodimeren mit anderen
Proteinen der Ikaros-Familie notwendig ist (Cobb & Smale 2005; Cortes et al. 1999).
Funktionell können Helios, Ikaros und Aiolos durch die Interaktion mit nucleosome
remodeling and deacetylase [complex] (NuRD) eine Rolle beim Chromatinumbau und damit
auch bei der Geneexpression spielen (Sridharan & Smale 2007; Kim et al. 1999). Ihre
Expression ist auf Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Eine Expression auf
nicht-hämatopoetischen Zellen ist hingegen für Eos (Gehirn, Skelettmuskulatur, Herz und
Milz) sowie für Pegasus (Gehirn, Herz, Skelettmuskulatur, Niere und Leber) beschrieben
(Honma et al. 1999; Kelley et al. 1998; Georgopoulos 2002). Eos kann direkt mit Foxp3
interagieren, vermittelt in Treg die transkriptionelle Stilllegung von Genen in Abhängigkeit
von Foxp3 und ist auch für deren suppressive Aktivität notwendig (Pan et al. 2009).
Abb. 2: Schematische Darstellung einer regulatorischen T-Zelle (Treg). Abgebildet sind diverse
für Treg charakteristische Moleküle.
-9-
- Einleitung Ein spezifischer bzw. exklusiver Marker für humane Treg ist bisher nicht beschrieben. Da die
Expression der meisten für Treg charakteristischen Moleküle auch bei anderen T-Zellen
(aktivierungs-) induzierbar ist, können diese Moleküle eine Unterscheidung von Treg und
aktivierten T-Zellen nicht gewährleisten. Allerdings zeigt dies auch, dass T-Zell Aktivierung
und suppressive Funktion in einem engen Zusammenhang stehen.
3.3.3.
Funktionsweise regulatorischer T-Zellen
Es sind zahlreiche Mechanismen beschrieben worden, durch welche Treg die Suppression
von Responder Zellen herbeiführen können. Hierbei lassen sich die verschiedenen Mechanismen in fünf Hauptkategorien unterteilen, nämlich die Suppression durch (1) inhibitorische
Zytokine, (2) zytotoxische Effektorfunktionen gegen Responder-Zellen, (3) inhibitorische
Moleküle
((3.1) freigesetzte
oder
(3.2)
membrangebundene),
(4) Konkurrenz um
Wachstumsfaktoren und (5) negative Beeinflussung der immunstimulatorischen Eigenschaften von DZ (Shevach 2009; Vignali et al. 2008).
Zu (1): Die im Zusammenhang mit Treg wichtigsten regulatorischen Zytokine sind IL-10 und
TGF-, welche einen wichtigen Bestandteil des suppressiven Treg-Potentials darstellen
(Belkaid & Rouse 2005; McGeachy et al. 2005). TGF- kann die Proliferation und
Differenzierung von T-Zellen direkt negativ beeinflussen, kann aber auch eine indirekte
immunsuppressive Funktion durch die Induktion von Treg ausüben (Gorelik & Flavell 2002;
Cerwenka & Swain 1999). Es kann freigesetzt oder auch membranständig exprimiert werden
und in löslicher Form oder zellkontaktabhängig wirken (Nakamura et al. 2001). Membranständiges TGF- ist an einen Komplex aus latency-associated peptide (LAP) und latent TGF-
binding protein (LTBP) gebunden (Hyytiainen et al. 2004). Murine LAP+ Treg besitzen ein
stärkeres suppressives Potential als LAP- (Chen et al. 2008).
Zu (2): Treg können möglicherweise durch zytotoxische Effektorfunktionen immunregulatorisch wirken. Bei Infektion mit Respiratorischen-Synzytial-Viren (RSV) lässt sich in Treg
eine gesteigerte Expression von Granzym B beobachten. Des Weiteren weisen Mäuse, in
deren Treg spezifisch Granzym B-Gen entfernt wurde, bei RSV-Infektion eine gesteigerte
zelluläre Infiltration der Lunge auf (Loebbermann et al. 2012). Treg aus Granzym B
defizienten Mäusen sind in ihrer regulatorischen Aktivität gegenüber CD4+ T-Zellen eingeschränkt (Gondek et al. 2005). Im Menschen konnte nach Stimulation mit anti-CD3 und antiCD46 die Expression von Granzym A bzw. eine Granzym A- und Perforin-abhängige
Zytotoxizität gegen Effektor CD4+ und CD8+ T-Zellen beobachtet werden (Grossman et al.
2004). Allerdings scheinen bei humanen Treg Granzym B-abhängige regulatorische
Funktionen keine bedeutende Rolle zu spielen. So konnten Oberg et al. zeigen, dass diese
nach anti-CD3,-28-Stimulation im Vergleich zu Responder T-Zellen nur minimale Mengen
von Granzym B freisetzen (Oberg et al. 2010).
- 10 -
- Einleitung Zu (3.1): Durch die auf der Zelloberfäche von Treg vorhandenen Ektoenzyme CD39 und
CD73 wird extrazellulär vorhandenes Adenosintriphosphat (ATP) zu Adenosin abgebaut,
welches die Funktionen von Effektor T-Zellen durch die Bindung an deren Adenosinrezeptor,
supprimieren kann (Borsellino et al. 2007; Deaglio et al. 2007; Kobie et al. 2006). Außerdem
scheint Adenosin durch Stimulation der TGF- Produktion die Induktion von Treg zusätzlich
zu stimulieren (Zarek et al. 2008). Weiterhin können Treg unter Verwendung von gap
junctions den sekundären Botenstoff (second messanger) zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), welcher ein potenter Inhibitor ist, direkt in Effektor T-Zellen transportieren
und sie auf diese Weise supprimieren (Bopp et al. 2007; Klein et al. 2012).
Zu (3.2): Treg exprimieren konstitutiv verschiedene Oberflächenmoleküle, die suppressive
Signale vermitteln können. Sie exprimieren programmed death-1 (PD-1) und CTLA-4, welche
beide von Bedeutung für die Funktion humaner Treg sind (Baecher-Allan et al. 2001;
Shevach 2006). Durch die Antikörper-vermittelte Blockade von PD-1 kann die in vitro durch
humane Treg-vermittelte Suppression von Melanom-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten aufgehoben werden (Wang et al. 2009). Weiterhin weisen Treg aus Patienten mit
rheumatischer Arthritis eine verringerte Expression von CTLA-4 auf. Durch antikörpervermittelte Blockade von CTLA-4 kann bei gesunden Spenden die durch Treg vermittelte
Suppression der IFN--Produktion von Responer T-Zellen inhibiert werden (Flores-Borja et
al. 2008). Die Interaktion von PD-1 und programmed death ligand 1 (PD-L1) bzw. CTLA-4
und CD80/-86 ist in Kapitel 3.5.1 und 3.5.2 detaillierter beschrieben.
Zu (4): Treg weisen eine starke Expression von CD25 (IL-2R) auf, welches zusammen mit
CD122 (IL-2R) und CD132 (IL-2R) den hochaffinen IL-2-Rezeptor formt. Einen weiteren
potentiellen Mechanismus der Suppression stellt daher die Kompetition um IL-2 dar (de la
Rosa et al. 2004). Durch IL-2-Kompetition ist es sogar möglich in CD4+ Effektor T-Zellen
Apoptose auszulösen (Pandiyan et al. 2007).
Zu (5): In der Maus konnte unter Verwendung von intravitaler Mikroskopie gezeigt werden,
dass es in vivo zu direkten Interaktionen zwischen DZ und Treg kommt. Diese Interaktion
verringert die Aktivierung von Effektor T-Zellen durch DZ (Tadokoro et al. 2006; Tang et al.
2006). In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass Treg modulierende Effekte auf
die DZ-Reifung und deren Funktion haben können (Shevach 2009; Vignali et al. 2008). So
wird auf DZ durch die Interaktion mit Treg, die Expression der kostimulatorischen Moleküle
CD80 und CD86 inhibiert bzw. herabreguliert (Cederbom et al. 2000; Wing et al. 2008).
Durch den Verlust kostimulatorischer Moleküle verringert sich deren Fähigkeit T-Zellen durch
die Interaktion mit CD28 zu stimulieren, was zur Suppression von Immunreaktionen führt.
Das auf Treg konstitutiv exprimierte Oberflächenprotein CTLA-4 ist, wie schon erwähnt,
wichtig für die Suppression von Effektor T-Zellen (Oderup et al. 2006; Read et al. 2000). Es
kann durch Interaktion mit denen auf DZ vorhanden B7-Molekülen CD80 und/oder CD86 DZ
- 11 -
- Einleitung zur Produktion von Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) veranlassen. IDO baut die essentielle
Aminosäure Tryptophan ab und ist u.a. an immunregulatorischen Vorgängen beteiligt. Es
kann die T-Zell-Proliferation negativ beeinflussen, indem es die Verfügbarkeit von
Tryptophan einschränkt (Munn et al. 2005). Weiterhin kommt es durch IDO zur Produktion
proapoptotischer Metabolite, die ebenfalls Effektor T-Zellen supprimieren können (Fallarino
et al. 2003; Puccetti & Grohmann 2007).
Insgesamt sind diverse Suppressionsmechanismen beschrieben worden, wobei allerdings
noch nicht vollständig geklärt wurde, welche Mechanismen in welchem Zusammenhang
relevant sind. Hauptverantwortlich für eine Suppression durch iTreg ist vermutlich die
Freisetzung der Zytokine TGF- und IL-10, während bei nTreg vor allem zellkontaktabhängige Mechanismen essentiell sind (Nizar et al. 2010).
3.4.
T-Zellen im immunregulatorischen Geschehen
Für T-Zellen sind im Kontext der Immunregulation unterschiedliche Funktionen
beschrieben worden. Sie können von Treg in ihrer Proliferation inhibiert werden (Kunzmann
et al. 2009; Li & Wu 2008), aber auch der Treg-vermittelten Suppression entgegenwirken
(Gong et al. 2009). Allerdings können T-Zellen selbst auch immunregulatorische
Funktionen ausüben. Hier sind sowohl proinflammatorische und proliferationsstimulierende
als auch die Immunantwort supprimierende Funktionen beschrieben worden (Kabelitz & He
2012; Hayday & Tigelaar 2003; Moser & Eberl 2011).
3.4.1.
Kostimulatorische und antigenpräsentierende Funktionen bei TZellen
Im Menschen sind V9V2 T-Zellen in der Lage in frühen Stadien einer Infektion oder
Krebserkrankung durch die Freisetzung zytotoxischer Effektormoleküle schnell zu reagieren.
Durch die Produktion von Zytokinen/Chemokinen und APZ-ähnliche Funktionen unterstützen
sie die Differenzierung und Proliferation antigenspezifischer T-Zellen (Girardi 2006).
T-Zellen sind sogar in der Lage Antigene zu präsentieren. Die Zugabe von exogenem IPP
oder HMB-PP zu frisch isolierten V9V2 T-Zellen resultiert in einer schnellen Hochregulation von Oberflächenmarkern, die typischerweise mit APZ assoziiert sind (MHC I, MHC II).
Dies geschieht zeitgleich mit der Hochregulation von kostimulatorischen Molekülen (CD80,
CD83, CD86) und Adhäsionsmolekülen (CD11a, CD18, CD54) (Brandes et al. 2005; Meuter
et al. 2010; Brandes et al. 2009; Landmeier et al. 2009). Nach Aktivierung über den TZR
besitzen sie das Potential lösliche Antigene potent und professionell zu präsentieren. Nur
wenige dieser -APZ werden benötigt, um eine spezifische Immunantwort von Effektor
T-Zellen auszulösen. Sie sind in der Lage die Reifung naiver CD4+ und CD8+ T-Zellen zu
Effektor T-Zellen zu induzieren (Brandes et al. 2005). Ferner können T-Zellen, wie anhand
- 12 -
- Einleitung von opsonisierten Partikeln bzw. E. coli gezeigt wurde, professionelle Phagozytose betreiben
(Wu et al. 2009). -APZ können ähnlich wie professionelle APZ Antigene gut kreuzpräsentieren (also exogene Antigene über MHC I präsentieren) (Brandes et al. 2009). Im Widerspruch zu den von Brandes et al. demonstrierten APZ-Eigenschaften konnten Himoudi et al.
zeigen, dass opsonierte Zielzellen bzw. die Bindung der Fc-Region eines Antikörpers an
CD16 für die Ausbildung von antigenpräsentierenden Funktionen notwendig ist. Auf diese
Weise aktivierte T-Zellen konnten nach direkter Interaktion mit antikörpermarkierten
Zielzellen deren spezifische Antigene kreuzpräsentieren (Himoudi et al. 2012).
3.4.2.
Interaktionen von T-Zellen und Treg
Frisch aus dem peripheren Blut isolierte T-Zellen weisen anders als induzierte bzw.
natürliche Treg keine Expression aktivierungsinduzierter Moleküle, wie z.B. CD25, auf.
Gemeinsam ist diesen Zellpopulationen allerdings, dass sie auch nach Aktivierung kaum IL-2
produzieren können (Chen et al. 2006; Schubert et al. 2001; Wu et al. 2006a; Chen & Letvin
2003a; Wesch et al. 1997). Die in der Literatur beschriebenen Interaktionen zwischen Tregund T-Zellen sind nur schwierig miteinander in Einklang zu bringen. Es ist sowohl die
Suppression von T-Zellen durch Treg als auch umgekehrt die Suppression von Treg durch
T-Zellen beschrieben worden.
Li und Wu et al. konnten zeigen, dass T-Zellen durch Treg negativ reguliert werden
können. In Anwesenheit von Treg war in vitro die Freisetzung von IFN-durch T-Zellen
nach Kontakt mit dem Mycobacterium tuberculosis Antigen 6kDa early secretory antigenic
target (ESAT-6) verringert (Li & Wu 2008). Kunzmann et al. beschrieben einen nur für
T-Zellen spezifischen Mechanismus der Suppression, bei dem Treg die Phosphoantigeninduzierte Proliferation durch einen bisher unbekannten löslichen Faktor inhibieren
(Kunzmann et al. 2009). In einem PDK1 (phosphoinositide dependent protein kinase 1)
defizienten Mausmodell, in dem der TZR-Signalweg der CD4+ T-Zellen eingeschränkt ist,
kommt es zu einer Expansion von CD8+ T-Zellen, die wiederum für die spontane
Entstehung einer Colitis verantwortlich sind. Durch adoptiven Transfer von wildtyp Treg
konnte der Colitis entgegen gewirkt werden (Park et al. 2010).
Ferner konnten Gong et al. in Makaken zeigen, dass V2 T-Zellen der Funktion und
Proliferation von Treg entgegenwirken können. Den Makaken wurde Bacillus CalmetteGuérin (BCG) intravenös appliziert (Gong et al. 2009). Bei BCG handelt es sich um einen
attenuierten Lebendimpfstoff gegen Tuberkulose, der aus Mycobacterium bovis (Erreger der
Tuberkulose des Rindes) gewonnen wurde. In ihren Studien kam es nach IL-2-Gabe zur
Expansion von CD4+CD25+Foxp3+ Treg und zur Suppression der BCG-induzierten V2 TZell-Expansion. Nach Stimulation mit einem Phosphoantigen (Picostim bzw. HMBPP), waren
die V2 T-Zellen in der Lage der IL-2-induzierten Expansion von Treg entgegenzuwirken.
- 13 -
- Einleitung Zusätzlich war die Fähigkeit der Treg, der antigenspezifischen antimykobakteriellen T-Zell
Antwort entgegenzuwirken, eingeschränkt. Bei Phosphoantigen-Stimulation war aufgrund der
eingeschränkten Treg-Funktion die Anzahl der IFN- produzierenden antigenspezifischen
CD4+ T-Zellen gesteigert. Die Phosphoantigen-induzierte Expansion der V2 T-Zellen
selbst wurde durch Zugabe von abgestuften Zellzahlen von Treg kaum beeinflusst. Die
Suppression der Treg-Expansion wurde in dieser Studie vor allem durch IFN- vermittelt
(Gong et al. 2009).
3.4.3.
Induzierte regulatorische T-Zellen
Bei T-Zellen kann analog zu iTreg (siehe Kap. 3.3.1) durch die Applikation bestimmter
Zytokine eine regulatorische Funktion induziert werden. Bei V2 T-Zellen kann es unter
Einwirkung von TGF- und IL-15 sowie eines zusätzlichen TZR-Stimulus zur Expression des
Transkriptionsfaktors Foxp3 sowie zur Induktion aktivierungsassoziierter Oberflächenmarker
(CD25, CD27, CD69, CTLA-4 und CD45RO) kommen. Nach deren Induktion inhibieren diese
V2 T-Zellen die Proliferation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMZ)
durch die Freisetzung von TGF- (Casetti et al. 2009). Unter Verwendung von TGF- und
IL-2 in Verbindung mit einem TZR-Stimulus können V1 T-Zellen ebenfalls in regulatorische
Zellen umgewandelt werden, die einen vergleichbaren Phänotyp wie regulatorische V2 TZellen besitzen. Sie exprimieren Foxp3 und weisen CD27, CTLA-4 und GITR, aber kein
CD45RA auf ihrer Oberfläche auf. Die von ihnen vermittelte Suppression anderer (CD4+ T-)
Zellen benötigt TGF- und ist zellkontaktabhängig. Darüber hinaus wies der CD27+ Anteil der
Zellen die stärkste suppressive Aktivität auf (Li et al. 2011). Dieser (induzierte)
CD25+CD27+Foxp3+ T-Zell Phänotyp spiegelt die allgemeinen Charakteristika von iTreg
wider.
3.4.4.
Tumor-induzierte regulatorische T-Zellen
Eine häufige Immunevasionsstrategie von Tumoren stellt die Induktion regulatorischer
Funktionen oder eines immunsuppressiven Mikromilieus durch die Freisetzung von z.B.
TGF- dar (Siegel & Massague 2003). Es ist bekannt, dass T-Zellen durch regulatorische
Funktionen zu einem immunsuppressiven Umfeld des Tumors beitragen können. V1
T-Zellen, die CD8 auf ihrer Oberfläche exprimieren, machen den größten Anteil der
Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) in Tumoren, die aus Epithelien hervorgegangen
sind (außer bei Melanomen), aus. Diese tumorinfiltrierenden V1 T-Zellen besitzen regulatorische Aktivität und sind in der Lage die Proliferation bzw. die Effektorfunktionen von
anderen T-Zellen zu unterdrücken. Sie sind außerdem in der Lage die Reifung von DZ sowie
deren Fähigkeit zur Stimulation naiver T-Zellen zu inhibieren. In beiden Fällen kann die
Suppression durch die Gabe von TLR8-Liganden (Poly G3 und ssRNA40) aufgehoben
- 14 -
- Einleitung werden. Vermittelt wird die Suppression anscheinend durch einen löslichen Faktor, wobei die
im Zusammenhang mit (induzierten) Treg beschriebenen Zytokine wie TGF- oder IL-10
allerdings keine Rolle spielen (Peng et al. 2007). Auch für andere Tumorarten ist eine
Infiltrierung durch sowohl V1 als auch V2 T-Zellen, die wie iTreg Foxp3 exprimieren,
beschrieben worden (Kang et al. 2009).
3.4.5.
Intrinsische, regulatorische Funktionen von T-Zellen
Außer den Funktionen, die T-Zellen nach Induktion eines regulatorischen Phänotyps
analog zu iTreg ausüben können, scheinen T-Zellen auch im Allgemeinen an der
Immunregulation beteiligt zu sein und intrinsische immunregulatorische Eigenschaften zu
besitzen.
In der Maus
So weisen T-Zell defiziente Mäuse bei Infektionen mit Listeria monocytogenes,
Mycobacterium tuberculosis oder Klebsiella Fehlregulationen in der Stärke und dem Verlauf
der T-Zell Immunantwort auf, was auf eine Funktion von T-Zellen bei der Regulation
von T-Zellen hindeutet (Hayday & Tigelaar 2003). Immunregulatorische Funktionen von
T-Zellen spielen hier vor allem in Epithelien eine Rolle, wo diese hauptsächlich die
T-Zell Antwort regulieren (Boismenu 2000; Hayday & Tigelaar 2003; Komano et al. 1995).
Das Fehlen von T-Zellen kann zu Autoimmunreaktionen führen. Bestimmte T-Zell
defiziente Mäuse neigen zu spontanen Entzündungsreaktionen der Haut (Dermatitis), wenn
sie nicht unter vollständig sterilen Bedingungen gehalten oder oberflächlich mit Irritanzien
behandelt werden. Diese Entzündungsreaktionen können durch Rekonstitution mit
T-Zellen unterbunden werden (Havran & Allison 1988). Wenn diese Mäuse zusätzliche zur
T-Zell Defizienz keine T-Zellen besitzen, ist keine Neigung zu Entzündungen vorhanden
(Girardi et al. 2002). Des Weiteren führt die T-Zell-Defizienz zu einer beschleunigten bzw.
verstärkten Immunreaktion im Lupus erythematodes-Modell und bei der experimentellen
autoimmunen Encephalomyelitis (EAE). Damit verbunden ist unter anderem eine gesteigerte
Proliferation von CD4+ T-Zellen. Durch den Transfer von T-Zellen konnten die T-Zelldefizienten Mäuse von der EAE kuriert werden (Peng et al. 1996; Ponomarev & Dittel 2005).
Ebenso kann eine Autoimmunreaktion (z.B. Diabetes) in thymektomisierten non-obese
diabetic Mäusen durch Rekonstitution mit T-Zellen, ähnlich wie dies auch durch Treg
möglich ist, verhindert werden (Hanninen & Harrison 2000). In der Epidermis vorhandene
DETC (dendritic epidermal T cells) sind in der Lage eine durch autoreaktive CD4+
T-Zellen vermittelte Immunreaktionen innerhalb der Epidermis bei wiederholter Exposition zu
unterdrücken (Shiohara et al. 1990; Shiohara et al. 1996). Eine weitere regulatorische
Funktion in Epithelien zeigen T-Zellen im Modell der chronisch-entzündlichen Darm-
- 15 -
- Einleitung erkrankungen (IBD: inflammatory bowel disease), der durch Dextran Natrium-Sulfat (DSS)
bzw. Natriumtrinitrobenzolsulfonat (TNBS: 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) induzierten
Colitis, wobei ein anti-inflammatorischer Effekt ebenfalls vor allem durch die Kontrolle von
T-Zellen bzw. deren IFN--Produktion vermittelt wird (Kühl et al. 2002; Kühl et al. 2007).
Ein möglicher Mechanismus der Regulation der Immunantwort durch T-Zellen in der Maus
ist die zytotoxische Effektorfunktion gegen APZ wie z.B. gegen aktivierte Makrophagen bzw.
gegen infizierte oder gestresste Zellen. Durch Depletion der APZ entfällt der Antigenstimulus
für andere T-Zellen und somit deren Aktivierung (Egan & Carding 2000; Hayday & Tigelaar
2003). Auch eine Beeinflussung der Zytokinproduktion von T-Zellen scheint als
Mechanismus möglich (Kühl et al. 2007).
Im Menschen bzw. Primaten
Im Menschen sind V1 T-Zellen hauptsächlich innerhalb von Geweben lokalisiert. In
Epithelien besitzen diese humanen T-Zellen vergleichbare regulatorische Funktionen wie
murine T-Zellen (Hayday & Tigelaar 2003). Im Menschen sind regulatorische T-Zellen
bei Autoimmunerkrankungen des Darms von Bedeutung. Bei der Zöleakie/Sprue findet sich
eine verminderte Anzahl intraepithelialer NKG2A- und CD8-positiverT-Zellen. Nach einer
speziellen Diät gehen die krankheitsbedingten Beschwerden zurück, was mit einer
Normalisierung der T-Zell-Anzahl korreliert. Diese NKG2A+CD8+ T-Zellen können in
Abhängigkeit von NKG2A-Ligandenbindung durch Freisetzung von TGF- die Produktion
löslicher Mediatoren (IFN- und Granzym B) in CD8+TZR+ intraepithelialen Lymphozyten (IEL) verhindern und der Entzündung entgegenwirken (Bhagat et al. 2008). Im
Zusammenhang mit anderen chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn,
Colitis ulcerosa) sind ebenfalls Defizienzen der IEL, welche zum Großteil aus T-Zellen
bestehen, beschrieben worden (Pennington et al. 2005). Die Autoimmunerkrankung
systemischer Lupus erythematodes (SLE) wird häufig mit eingeschränkter Funktion
regulatorischer T-Zellen in Zusammenhang gebracht (Lyssuk et al. 2007; Mudd et al. 2006;
Valencia et al. 2007). Bei dieser Erkrankung kommt es auch zu einem Rückgang von
T-Zellen im peripheren Blut, wobei vor allem der Anteil der CD27+CD45RA- zurückgeht.
Diese Abnahme korreliert mit dem Schweregrad der Krankheit. Die CD27+CD45RA- V1
T-Zellen exprimieren Foxp3 (Klon 259D), was eine regulatorische Funktion für sie nahelegt.
Nach Behandlung der Erkrankung normalisiert sich die Anzahl der T-Zellen, wobei der
Anteil an V1-Zellen innerhalb der T-Zellen zunimmt (Li et al. 2011).
T-Zellen, die aus dem humanen peripheren Blut isoliert wurden, können ähnlich wie
regulatorische CD4+ T-Zellen die Proliferation von CD4+ T-Zellen unterdrücken. Im Gegensatz zu Treg exprimieren diese Zellen allerdings kein Foxp3 und die Suppression kann auch
nicht durch die Supplementierung mit IL-2 aufgehoben werden. Vermutlich wird diese
- 16 -
- Einleitung regulatorische Funktion vor allem von V1 T-Zellen ausgeübt, da diese verglichen mit V2
T-Zellen größere Mengen an TGF- und IL-10 produzieren (Kühl et al. 2009). Bei Aktivierung
von V2 T-Zellen durch das Phosphoantigen IPP, innerhalb der PBMZ lässt sich in
Anwesenheit von IL-12 produzierenden reifen DZ ein suppressiver Effekt auf die Proliferation
von CD8+ und CD4+ T-Zellen beobachten, die auf ein Neo-Antigen reagieren. Die
Anwesenheit reifer DZ scheint nicht zwingend notwendig für die Entstehung der suppressiven Funktion der V2 T-Zellen zu sein. In Anwesenheit unreifer APZ sind IPP-stimulierte
V2 T-Zellen ebenfalls in der Lage, die Proliferation von T-Zellen, die mit Tetanus
Toxoid
(recall
Antigen),
Staphylococcus
aureus
Enterotoxin (SE) A
bzw.
SEB
(Superantigene) oder Daudi-Zellen (Tumorzellen) stimuliert wurden, zu hemmen (Traxlmayr
et al. 2010). Der Mechanismus dieser Suppression ist bislang unklar, er beruht allerdings
nicht auf der Kompetition um IL-2 (Traxlmayr et al. 2010).
T-Zellen mit regulatorischem Phänotyp spielen auch in der Schwangerschaft eine Rolle. In
der Dezidua (Teil der Plazenta) lokalisierte T-Zellen setzen IL-10 und TGF- frei Auf diese
Weise üben sie eine regulatorische Funktion aus und tragen zum Erhalt der maternalen
Toleranz gegenüber dem Fötus bei (Exley & Boyson 2011).
3.5.
Suppressive und kostimulatorische Oberflächenmoleküle
Für die Aktivierung von T-Zellen sind zwei Signale notwendig. Das erste Signal wird durch
Bindung des TZR an das präsentierte spezifische Antigen bereitgestellt, das zweite Signal
wird antigenunspezifisch über kostimulatorische Moleküle auf der APZ an die entsprechenden Rezeptoren auf der T-Zelle vermittelt. Das Vorhandensein eines TZR-Signals in
Abwesenheit eines kostimulatorischen Signals führt zu Anergie der T-Zelle. So wie ein
kostimulatorisches Signal die T-Zell-Aktivierung fördert, kann ein zweites, negatives Signal
die T-Zell Antwort inhibieren. Die Integration dieser negativen und positiven Signale
innerhalb der Zelle entscheidet zwischen T-Zell-Toleranz und T-Zell-Aktivierung (Nurieva et
al. 2009).
Eine wichtige Rolle bei der Immunregulation spielt die Interaktion von Molekülen der B7Familie (CD80/-86 und PD-L1) mit denen der CD28-Familie (CD28, CTLA-4 und PD-1).
CD28 ist ein wichtiger Rezeptor der T-Zell-Aktivierung, an welchen die Liganden CD80 und
CD86 binden und so ein positiv-kostimulatorisches Signal generieren. Hierbei wird durch
Tyrosinphosphorylierung eines Nicht-immunoreceptor tyrosine-based activation motif
(ITAM) -Motivs u.a. die Interaktion mit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) (Klasse 1A)
hergestellt. Nach anschließender Aktivierung der PI3K durch TZR-assoziierte Tyrosinkinasen generiert PI3K den sekundären Botenstoff Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP3), an welchen PDK1 und v-akt murine thymoma viral oncogene homolog (AKT)
binden. Dadurch kommt es zur Phosphorylierung von AKT am Threonin 308 durch PDK1.
- 17 -
- Einleitung Für die vollständige Aktivierung von AKT und die Induktion des PI3K/AKT-Signalweges ist
zusätzlich die durch mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2) (infolge von
TZR-Stimulation aktiviert) vermittelte Phosphorylierung von AKT am Serin 473 notwendig
(Sarbassov et al. 2005; Vanhaesebroeck & Alessi 2000).
Nach der CD28-Ligandenbindung können die Src-Kinase Lck und die Tec-Kinase Itk mit
Hilfe ihrer SH3-Domänen mit dem C-Terminalen Ende von CD28 interagieren, wodurch
deren Kinasefunktion aktiviert und das TZR-Signal zusätzlich verstärkt wird. Ebenso kann
nach Ligandenbindung
growth factor receptor-bound protein 2 (GRB2)
mit
dem
intrazellulären Anteil von CD28 interagieren, was daraufhin zur Aktivierung des rat
sarcoma/mitogen-activated protein kinase (Ras/MAP-Kinase) -Signalweges führt. Des
Weiteren ist das kostimulatorische CD28-Signal wichtig für die Produktion von IL-2, welches
für die Expansion von T-Zellen benötigt wird. Durch die CD28-Kostimulation werden
Transkriptionsfaktoren wie AP-1, NFAT und NF-B aktiviert, die u.a. zu einer gesteigerten
Transkription des IL-2-Gens führen. Ein zweiter, noch bedeutsamerer Effekt ist die Stabilisierung der IL-2-mRNA, wodurch die Produktion des Zytokins zusätzlich gesteigert wird.
3.5.1.
CTLA-4 : CD80/-86
CTLA-4 generiert ein negatives Signal und ist auf der Oberfläche von aktivierten, Effektorund regulatorischen T-Zellen exprimiert (Rudd 2008). Die Wichtigkeit von CTLA-4 für die
Immunregulation wurde anhand von CTLA-4 defizienten Mäusen entdeckt. Diese sterben
etwa 20 Tage nach der Geburt an massiver außerthymischer Lymphoproliferation und
pathologischer Autoimmunität (Tivol et al. 1995; Chambers et al. 1997; Waterhouse et al.
1995). CTLA-4 und dessen Interaktion mit seinen Liganden ist wichtig für die Regulation und
Aufrechterhaltung der peripheren T-Zell Toleranz. Die Blockierung von CTLA-4 führt in vivo
zu einer verstärkten anti-Tumor-Immunantwort sowie zur Entstehung von Autoimmunreaktionen (Sharpe & Freeman 2002).
In konventionellen T-Zellen hemmt ein CTLA-4 Signal die IL-2 Produktion und das Fortschreiten des Zellzyklus und somit die Proliferation. CTLA-4 kann grundsätzlich auf zwei
verschiedene Wegen die Aktivierung von Zielzellen negativ beeinflussen. Auf der einen Seite
kann dies durch Induktion von negativen Signalen, auf der anderen durch Konkurrenz um die
Bindung an CD80/-86 geschehen (Carreno et al. 2000). CTLA-4 bindet wie der positivkostimulatorische Korezeptor CD28 an CD80/-86, allerdings mit einer 20fach höheren
Affinität. Auf diese Weise wird die Ligandenbindung an CD28 und die Entstehung des damit
verbundenen positiv-kostimulatorischen Signals verhindert (Collins et al. 2002). CTLA-4
transloziert in Abhängigkeit von Ligandenbindung zu den zentralen supramolekularen
Aktivierungsclustern (cSMAC: central supramolecular activation cluster). Diese Transloktion
ist notwendig für die inhibitorische Funktion. In der Konkurrenzsituation mit CTLA-4 bleibt
- 18 -
- Einleitung CD28 aufgrund der schwächerer Bindung aus diesen Bereichen ausgeschlossen (Yokosuka
et al. 2010).
CTLA-4 ist ein Mitglied der CD28-Familie und besteht dementsprechend aus einer extrazellulären Immunglobulin (Ig) V-ähnlichen-Domäne, einer kurzen linearen Region, einer
Transmembrandomäne und einem intrazellulären Anteil. Der intrazelluläre Anteil von CTLA-4
besitzt ein immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) und kann, wenn dieses
phosphoryliert vorliegt, mit den SH2-Domänen der Tyrosin-Phosphatase Src homology
region 2 domain-containing phosphatase (SHP) -2 sowie der Serin/Threonin-Phosphatase
protein phosphatase 2 (PP2A) interagieren (Marengere et al. 1996; Chuang et al. 2000). Die
Rekrutierung von SHP-2 führt zur Dephosphorylierung der CD3-Ketten und inhibiert auf
diese Weise die Weiterleitung des TZR-Signals (Lee et al. 1998). Da die Aktivierung der
Phosphatase PP2A außerdem die AKT-Phosphorylierung verhindert, inhibiert CTLA-4 auch
den PI3K/AKT-Signalweg, der für das Zellüberleben und die Proliferation von Bedeutung ist
(Parry et al. 2005). Das CTLA-4-Signal kann aber auch dem Zelltod durch Induktion des antiapoptotischen Proteins B-cell lymphoma-extra large (Bcl-XL) entgegen wirken (Parry et al.
2005).
CD80 und CD86 werden von APZ exprimiert. CD86 weist auf diesen eine konstitutiv
schwache Expression auf und wird nach der Aktivierung schnell heraufreguliert, während die
CD80-Expression etwas später induziert wird (Hathcock et al. 1994). CD80 besitzt eine
höhere Affinität für CTLA-4 als CD86 (Collins et al. 2002) und führt dadurch eher zur
Induktion eines negativ-kostimulatorischen Signals. CD80 und CD86 gehören beide zur B7Molekül-Familie und besitzen daher extrazellulär eine IgV- und eine IgC-ähnliche Domäne
sowie einen kurzen zytoplasmatischen Anteil (Sharpe & Freeman 2002). Möglicherweise
besitzt der zytoplasmatische Anteil trotz seiner geringen Größe eine Funktion und ist an der
Entstehung eines rückwärts gerichteten (reversen) Signals beteiligt. Dafür spricht, dass die
Bindung von CD80/-86 an CTLA-4 den Tryptophanstoffwechsel in APZ beeinflusst
(Grohmann et al. 2002) (siehe Schema; Abb. 3).
3.5.2.
PD-1 : PD-L1/2
Im Gegensatz zu CTLA-4-defizienten Mäusen, entwickeln PD-1 defiziente Mäuse Autoimmunreaktionen zu späteren Zeitpunkten, was darauf hindeutet, dass CTLA-4 das
bedeutsamere negativ-kostimulatorische Signal bei der T-Zell-Expansion im Lymphknoten
darstellt und PD-1 vor allem bei der Kontrolle von Autoimmunität in der Peripherie von
Bedeutung ist (Carreno & Collins 2002). Die PD-1 : PD-L1-Interaktion führt bei chronischen
Infektionen zu der mit dieser einhergehenden T-Zell- „Erschöpfung“ (exhaustion) und somit
zu einer nicht mehr effektiven Immunabwehr gegen die Infektion. Auch bei der Entstehung
und Aufrechterhaltung des immunsuppressiven Tumormilieus ist die PD-1 : PD-L1Interaktion von Bedeutung (Francisco et al. 2010).
- 19 -
- Einleitung PD-1 ist auf der Oberfläche von aktivierten Lymphozyten, also T- und B-Zellen, vorhanden
(Agata et al. 1996). Die Interaktion zwischen PD1 und seinen Liganden PD-L1 und PD-L2
vermittelt ein negativ-kostimulatorisches Signal und reguliert auf diese Weise die T-ZellAktivierung und -Toleranz sowie Immunreaktionen in Geweben (Francisco et al. 2010).
Ligandenbindung an PD-1 kann Zellproliferation, Zytokinausschüttung oder zytotoxische
Effektorfunktionen blockieren, die Zellvitalität einschränken und wirkt der CD28-vermittelten
Kostimulation entgegen (Riley 2009; Freeman et al. 2000). Die Bindung von PD-L1 an PD-1
kann auch indirekt regulatorisch wirken, da diese in Anwesenheit von TGF- zu einer
gesteigerten Entstehung von iTreg führt (Francisco et al. 2009).
PD-1 besteht aus einer extrazellulären IgV-ähnlichen Domäne, einem darauffolgenden 20
Aminosäurereste umfassenden Bereich, der einen gewissen Abstand zur Plasmamembran
gewährleistet, einer Transmembrandomäne und einer zytoplasmatische Domäne, die ein
ITIM und ein Immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) umfasst (Francisco et al.
2010). Nach Ligandenbindung kommt es zur Tyrosinphosphorylierung von ITIM und ITSM.
Für die Funktion von PD-1 in T-Zellen ist vor allem das ITSM-Motiv wichtig, welches die
Interaktion mit den Phosphatasen SHP-1 und SHP-2 vermittelt und auf diese Weise die
Phosphorylierung von ZAP-70, CD3 und der Proteinkinase C (PKC) verhindern kann
(Chemnitz et al. 2004; Sheppard et al. 2004). Hierzu ist die räumliche Nähe zwischen PD-1
und dem TZR-Komplex notwendig (Chemnitz et al. 2004). Außerdem wird die Aktivierung
von extracellular signal-regulated kinase (ERK) und das Verlassen der G1-Phase des
Zellzyklus durch ein PD-1-Signal verhindert (Patsoukis et al. 2012). PD-1 inhibiert ebenso
wie CTLA-4 den PI3K/AKT-Signalweg, allerdings ist der Mechanismus ein anderer. PD-1
Abb. 3: Signalvermittlung und Interaktionen negativ-kostimulatorischer Oberflächenmoleküle.
- 20 -
- Einleitung blockiert den Signalweg durch Inhibition der PI3K-Aktivierung (Parry et al. 2005). Obwohl
sowohl CTLA-4 als auch PD-1 mit dem AKT-Signalweg interferieren, sind sie nicht
redundant, können aber vermutlich synergistisch wirken.
Durch Typ I und Typ II Interferone sowie durch TNF- wird die Expression von PD-L1 in
T-Zellen induziert (Keir et al. 2008). Sowohl die konstitutive als auch die induzierte Expression ist hierbei abhängig von IFN regulatory factor (IRF) -1 (Lee et al. 2006). Außerdem
bindet auch signal transducer and activator of transcription (STAT) 3 an die Promotorregion
von PD-L1 (Marzec et al. 2008). Die beiden PD-1-Liganden PD-L1 und PD-L2 besitzen wie
andere zur B7-Familie gehörende Proteine auch eine IgV- und eine IgC-ähnliche Domäne.
PD-L1 besitzt einen kurzen zytoplasmatischen Anteil (~30 Aminosäurereste), der zwar
evolutionär konserviert ist, aber keine bekannte Funktion besitzt (Dong et al. 1999; Freeman
et al. 2000). Allerdings ist beschrieben worden, dass CD80 durch Interaktion mit PD-L1 zu
einer bidirektionalen Inhibition der T-Zell Aktivierung und Zytokinproduktion führen kann
(Butte et al. 2007) (siehe Schema; Abb. 3).
3.6.
Toll-like Rezeptoren (TLR)
Bereits 1989 wurde von Janeway et al. postuliert, dass die Erkennung von (mikrobiellen)
Pathogenen essentiell für die Initiation einer Immunantwort (z.B. Entzündung) ist und dies
durch keimbahnkodierte PRR vermittelt wird, welche Pathogenen assoziierte molekulare
Strukturen (PAMP: Pathogen-associated molecular patterns) erkennen (Janeway, Jr. 1989).
TLR, welche dem Toll-Protein in Drosophila homolog sind, waren die ersten PRR, die im
Säuger identifiziert wurden (TLR4) (Medzhitov et al. 1997). Bisher sind 10 verschiedene
humane TLR bekannt.
Die Erkennung von PAMP durch TLR führt zu einer unmittelbaren Immunreaktion, die auf die
Beseitigung der Pathogene abzielt. In Zellen des angeborenen Immunsystems werden nach
TLR-Aktivierung zytotoxische Effektorfunktionen und Phagozytose gesteigert bzw. ausgelöst.
Die Freisetzung verschiedener proinflammatorischer Zytokine, Chemokine und antimikrobieller Proteine führt zur Rekrutierung bzw. Aktivierung weiterer Immunzellen. Außerdem
führt bei DZ die Erkennung von TLR-Liganden zu deren Reifung und einer verstärkten
Expression kostimulatorischer Moleküle, woraufhin diese in der Lage sind eine adaptive
Immunantwort gegen entsprechende Pathogene zu induzieren (Kawai & Akira 2010). Für die
Entdeckung und ihren Beitrag zur Aufklärung der Rolle von TLR und DZ bei der Entstehung
einer Immunantwort, wurde der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 2011 an Bruce
Beutler, Jules Hoffmann und Ralph Steinman verliehen.
TLR erkennen eine große Bandbreite von PAMP (Akira et al. 2006; Beutler 2009; Hoffmann
2003; Medzhitov 2007). Bakterielle Zellwandbestandteile werden vor allem von TLR erkannt
die auf der Zelloberfläche exprimiert sind, wohingegen Nukleinsäuren (z.B. als virale
Bestandteile) von endosomal lokalisierten TLR erkannt werden (Kawai & Akira 2011). TLR1,
- 21 -
- Einleitung -2 und -6 erkennen u.a. Lipopeptide, TLR3 doppelsträngige RNA, TLR4 Lipopolysaccharide,
TLR5 Flagellin, TLR7 und TLR8 einzelsträngige RNA und TLR9 präferentiell bakterielle DNA
(Akira et al. 2006). Durch TLR2 wird eine weite Bandbreite von PAMP wie z.B. Peptidoglykan (PGN), Zymosan, Hämagglutinin sowie verschiedene Lipopeptide, Glycolipide oder
Glycosylphosphatidylinositol (GPI) -Anker-Moleküle
(Lipoteichonsäure [LTA],
Lipoarabino-
mannan [LAM]) erkannt (Wesch et al. 2011). TLR2 ist in der Lage zusammen mit TLR1,
TLR6 oder TLR10 Heterodimere zu bilden und auch mit anderen Korezeptoren wie Dectin-1
und CD36 zu interagieren, wodurch verschiedene PAMP erkannt werden können (Akira et al.
2006; Hasan et al. 2005; Govindaraj et al. 2010). Beispielsweise erkennen TLR1/2(möglicherweise auch TLR2/10-) Heterodimere triacetylierte Lipopeptide und TLR2/6Heterodimere diacetylierte Lipopeptide aus Gram-positiven Bakterien (Akira et al. 2006;
Govindaraj et al. 2010). Als synthetische Analoga von TLR2-Liganden wurden in
vorliegender Arbeit unter anderem FSL-1 (TLR2/6), Pam2CSK4 (vermutlich TLR2/6) und
Pam3CSK4 (TLR1/2, vermutlich auch TLR2/10) verwendet (Govindaraj et al. 2010).
Der Entdeckung der TLR nachfolgend wurden verschiedene weitere PRR, wie die im Zytosol
lokalisierten RIG-I-like receptors (RLR) und NLR sowie die membranständigen C-Typ Lektin
Rezeptoren (CLR) beschrieben. Die zu den RLR gehörenden Rezeptoren RIG-I, Mda5 und
LGP2 erkennen RNA-Viren, während die 20 verschiedenen NLR auf verschiedene PAMP
und Zellstress reagieren und CLR pilzassoziierte und bakterielle PAMP erkennen (Kawai &
Akira 2010).
3.6.1.
TLR bei T-Zellen
Die Expression von TLR ist vor allem auf Zellen, die dem angeborenen Immunsystem
zugerechnet werden, verbreitet. So kann etwa die Funktion von DZ durch TLR moduliert
werden, wodurch die Qualität der von ihnen induzierten Immunantwort ebenfalls beeinflusst
wird, was wiederum zu einer verstärkten Aktivierung von T-Zellen führt (Wesch et al.
2011; Kunzmann et al. 2004). Die TLR (-3 und -7) -Liganden-Stimulation von Tumorzellen
kann ebenfalls die zytotoxischen Effektorfunktionen von T-Zellen verstärken (Shojaei et al.
2009). Inzwischen wurde allerdings die Expression verschiedener TLR auch auf Zellen des
adaptiven Immunsystems nachgewiesen, u.a. auch auf T-Zellen, deren Effektorfunktionen
durch diese direkt moduliert werden können. T-Zellen können verschiedene, funktionelle
Mustererkennenungsrezeptoren wie NLR und auch TLR exprimieren. Im Unterschied zu
Zellen der angeborenen Immunität benötigen () T-Zellen allerdings einen zusätzlichen
TZR-Stimulus um auf die TLR-Liganden-Stimulation zu reagieren (Marischen et al. 2011;
Wesch et al. 2006; Pietschmann et al. 2009). In frisch aus dem peripheren Blut isolierten V1
und V2 T-Zellen wurde die funktionelle Expression von TLR2, -3 und -5 sowie deren
- 22 -
- Einleitung verstärkender Einfluss auf die Produktion proinflammatorischer Zytokine beschrieben
(Pietschmann et al. 2009; Beetz et al. 2008).
Die Expression von TLR2 in T-Zellen wurde zuerst in der Maus beschrieben (Mokuno et
al. 2000) und konnte dann auch in expandierten humanen T-Zellen mit Hilfe eines
Affymetrix GeneChip nachgewiesen werden (Hedges et al. 2005). In frisch isolierten TZellen konnte die TLR2- sowie die TLR1- und TLR6-Expression auf mRNA-Ebene
demonstriert werden, wobei die von TLR1 und TLR2 stärker ist als die von TLR6
(Pietschmann et al. 2009). Auf Proteinebene weist TLR1 bei den meisten Spendern, im
Gegensatz zu TLR2 und TLR6, allerdings nur eine schwache Expression auf (Pietschmann
et al. 2009).
Funktionell ist für die Kostimulation von T-Zell-Linien durch den synthetischen TLR2Liganden Pam3CSK4 eine verstärkte Degranulation (gemessen anhand von CD107a [LAMP1] Oberflächenexpression) sowie eine verstärkte Freisetzung von IFN- beschrieben worden
(Deetz et al. 2006). Shrestha et al. konnten innerhalb der PBMZ bei IPP-aktivierten
T-Zellen eine verstärkte Proliferation und Zytokinexpression (IFN- und TNF-) feststellen,
wenn zusätzlich der TLR2-Ligand LTA präsent war (Shrestha et al. 2005). Die direkte, von
APZ unabhängige Reaktion frisch isolierter T-Zellen auf die Kostimulation mit TLR2Liganden konnte anhand der verstärkten Freisetzung der löslichen Mediatoren IFN-,
CCL5 (RANTES) und CXCL8 (IL-8) in frisch isolierten V1 und auch V2 T-Zellen gezeigt
werden (Pietschmann et al. 2009).
TLR2-Liganden besitzen in Bezug auf die Produktion löslicher Mediatoren durch T-Zellen
also eine kostimulatorische Funktion.
3.6.2.
Aufbau und Signaltrasduktion von TLR
TLR sind transmembrane Proteine vom Typ I. Ihre extrazelluläre Domäne besteht aus
mehreren aufeinanderfolgenden Wiederholungen des Leucine-rich repeat (LRR) -Motivs und
dient der Erkennung von PAMP. Ferner besitzen sie eine Transmembranregion und eine
zytosolische toll-interleukin 1 receptor (TIR) -Domäne. Die TIR-Domäne des TLR ist nach
Bindung eines Liganden notwendig für die Aktivierung der spezifischen Signalwege in der
Zelle. Sie dient als Basis für die Rekrutierung der jeweiligen Adaptermoleküle, die zur
Interaktion mit dieser ebenfalls eine TIR-Domäne besitzen (Kawai & Akira 2010). Als ein
solches wird myeloid differentiation factor 88 (MyD88) von allen TLR (mit Ausnahme von
TLR3) rekrutiert, was zur Aktivierung von NF-B und MAP-Kinasen führt und letztendlich in
der Produktion verschiedener proinflammatorischer Zytokine mündet. MyD88 bindet nicht
direkt an die TIR-Domänen von TLR2 und TLR4, sondern tut dies indirekt über TIR domain
containing adaptor protein (TIRAP), ein zusätzliches Adaptermolekül (Kawai & Akira 2010).
MyD88 vermittelt anschließend die Rekrutierung der IL-1-Rezeptor-assoziierten Kinasen IL-1
- 23 -
- Einleitung receptor-associated kinase (IRAK) 4, IRAK1, IRAK2 und IRAK-M, wobei initial IRAK4
aktiviert wird. Die Aktivierung der IRAK-Kinasen führt zur Interaktion mit TNF receptorassociated factor (TRAF) 6, einer E3-Ubiquitinligase, die Lysin63 (K63) -verknüpfte Polyubiquitinketten an Zielproteine u.a. auch IRAK1 und TRAF6 anfügt. An diese Polyubiquitinketten können anschließend die Zinkfinger-Ubiquitinbindedomänen von TAK binding
protein (TAB) 1 und TAB3, den regulatorischen Untereinheiten des TGF- activated kinase
1 (TAK1) Kinasekomplexes, binden. Ebenso kann die Ubiquitin-bindende Domäne von NFkappa-B essential modulator (NEMO), eine essentielle regulatorische Komponente des IκB
Kinase (IKK) -Komplexes, mit den K63-Polyubiquitinketten interagieren. Aufgrund dieser
Interaktion kommt es zur räumlichen Nähe von TAK1 und IKK wodurch es zur Phosphorylierung von IKKkommt, dies wiederum führt zur Phosphorylierung von inhibitor of
NF-B (IB) und dadurch letztlich zur Aktivierung von NF-B (Bhoj & Chen 2009). TAK1
aktiviert
durch
Phosphorylierung
außerdem die MAP-Kinasen ERK1,
ERK2,
p38
und
c-Jun
N-termi-nal
kinase (JNK), die daraufhin zahlreiche
Transkriptionsfaktoren,
u.a.
activator
protein 1 (AP-1) aktivieren (Kawai &
Akira 2010) (siehe Schema; Abb. 4).
Durch einige TLR kann zusätzlich zum
klassischen MyD88-abhängigen Signalweg der PI3K/AKT-Signalweg aktiviert
werden. Für TLR2 ist dies beispielsweise beschrieben worden, wobei die
genauen
molekularen
Mechanismen
allerdings noch unklar sind (Hazeki et
al.
2007).
In
Makrophagen
wurde
beispielsweise beobachtet, dass nach
Ligandenbindung des TLR2/6-Heterodimers, TIRAP direkt mit der regulatorischen p85 Untereinheit der PI3K interagieren und so zur PI3K-abhängigen
Phosphorylierung von AKT führen kann
(Santos-Sierra et al. 2009). Eine weitere
Möglichkeit ist die Aktivierung dieses
Abb.
4:
Signaltransduktion
von
TLR2.
Schematische Abbildung der an der TLR2-Signaltrasduktion beteiligten Moleküle
- 24 -
Signalweges
Domäne
durch
besitzende
das
eine
TIR-
Adaptermolekül
- Einleitung B-cell adapter for PI3K (BCAP) (Troutman et al. 2012). In Abbildung 4 sind die
verschiedenen am TLR2-Signalweg beteiligten Komponenten schematisch zusammengefasst.
Der TLR2-Signalweg induziert proinflammatorische Effektorfunktionen durch Aktivierung der
Transkriptionsfaktoren NF-B und AP-1. Er kann aber auch durch die Aktivierung von MAPKinasen und möglicherweise des PI3K/AKT-Signalweges die Zellproliferation bzw. das
Zellüberleben beeinflussen bzw. steigern.
- 25 -
- Einleitung -
3.7.
Fragestellung
T-Zellen können mit verschiedenen Zellpopulationen des Immunsystems interagieren und
diese auf unterschiedliche Weise beeinflussen. Im Vorfeld der vorliegenden Arbeit konnte
durch unsere Arbeitsgruppe anhand der Suppression von T-Zellen durch Phosphoantigen-aktivierte T-Zellen gezeigt werden, dass T-Zellen auch an der Vermittlung
suppressiver Funktionen beteiligt sein können. Die Entstehung und Aufrechterhaltung
regulatorischer Funktionen (vor allem in Bezug auf T-Zellen) ist jedoch noch unzureichend
verstanden. Da T-Zellen eine große Bandbreite verschiedener Funktionen aufweisen,
stellte sich grundsätzlich die Frage, ob ihr funktioneller Phänotyp festgelegt ist oder ob dieser
je nach Kontext der Antigenerkennung moduliert werden kann.
Folgende Aspekte sollten im Rahmen dieser Arbeit näher betrachtet werden:
(1) Eine phänotypische Charakterisierung suppressiver T-Zellen und deren Vergleich mit
Treg. Hierbei sollten sowohl intrinsische als auch induzierte regulatorische Funktionen in
T-Zellen in vitro untersucht werden. In diesem Zusammenhang sollte auch die Rolle
verschiedener Faktoren bei der Entstehung regulatorischer Funktionen in T-Zellen
analysiert werden.
(2) Die Aufklärung des zugrundeliegenden suppressiven Mechanismus. Es sollte untersucht
werden auf welche Weise die Suppression vermittelt wird und welche immunmodulatorischen Moleküle daran beteiligt sind.
(3) Der Effekt von TLR-Liganden auf T-Zellen und deren Einfluss auf das suppressive
Potential von T-Zellen. Es sollte geprüft werden, ob ein verändertes suppressives
Potential mit einer Modulation immunregulatorischer Moleküle einhergeht. Weiterhin
sollte die Beteiligung verschiedener Signalwege an TLR2-vermittelten Effekten genauer
beleuchtet werden.
- 26 -
- Material -
4. Material
Verwendete Abkürzungen: APS = Ammoniumperoxodisulfat (Ammoniumpersulfat); BSA = Rinderserumalbumin; DMSO= Dimethylsulfoxid; EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; FKS = Fetales
Kälberserum;
PFA
=
Paraformaldehyd;
PI = Propidiumjodid;
PHA = Phytohämagglutinin;
PMSF = Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Flourid; rh = rekombinant, human; TMB = Tetramethylbenzidin, WP =
FACS-Waschpuffer.
4.1.
Substanzen
4.1.1.
Zytokine und Stimulanzien
Substanz
Bezugsquelle
Endkonzentration
BrHPP
FSL-1
Pam2CSK4
Pam3CSK4
rh IL-15
rh IL-2
SEA-T
SEB
SEC
SED
SEE
TGF-
Innate Pharma
Invivogen
Invivogen
Invivogen
Biolegend
Novartis
Toxin Technology
Serva
Toxin Technology
Serva
Chemica & Co
R&D Systems
300 nM
1 µg/mL
2 µg/mL
2 µg/mL
10 ng/mL
10-50 U/mL
1 µg/mL
1 µg/mL
1 µg/mL
1 µg/mL
1 µg/mL
1,7 ng/mL
4.1.2.
Substanzen
Substanz
Bezugsquelle
Acrylamid/Bisacrylamid
APS
BCA Protein Assay Reagenz
BSA
Coomassie Protein Assay Reagenz
DMSO
EDTA
Eosin
Methanol
Milchpulver
NaN3
NP-40
PFA
PHA
PI
SDS (10% in Wasser)
TEMED
TMB Substrat
Tris
Triton X-100
Tween 20
Serva
Sigma
Pierce
Serva
Thermo Fisher Scientific
Calbiochem
Sigma
Serva
Roth
Frema
Serva
Fluka
Sigma
Remel
Sigma
Merck
Serva
Thermo Scientific
Roth
Merck
Sigma
- 27 -
- Material -
4.1.3.
Inhibitoren
Substanz
Bezugsquelle
Aprotinin
Leupeptin
Monensin
Natriumfluorid
Natriumorthovanadat
Natriumpyrophoshat
Pepstatin A
PMSF
Sigma
Sigma
Calbiochem
Fluka
Merck
Sigma
Sigma
Sigma
4.2.
Puffer und Lösungen
Medien/Puffer
Bezugsquelle
DMEM (Dulbecco's minimum essential medium)
®
Ficoll Hypaque Losung (1,077 g/mL)
FKS
3
Methyl- [H] Thymidin
NuPAGETM 4-12% Bis-Tris-Gel (10 well, 1.5 mm)
NuPAGETM 4-12% Bis-Tris-Gel (15 well, 1.5 mm)
NuPAGE™ MES SDS-Laufpuffer (20x)
2+
2+
PBS ohne Ca /Mg , steril
RPMI1640
X-VIVO15
PAA
Biochrom AG
Life Technologies
Amersham
Life Technologies
Life Technologies
Life Technologies
PAA, Biochrom AG
Life Technologies
Lonza
4.2.1.
Für zellbiologische Arbeiten verwendete Puffer und Lösungen
Puffer/Lösungen
Substanz
Endkonzentration
Eosinlösung
Eosin
NaN3
NaCl
FKS
0,2 % (w/v)
0,05 % (w/v)
0,9 % (w/v)
10 % (v/v)
Einfriermedium (EFM)
RPMI
FKS
DMSO
20 % (v/v)
10 % (v/v)
PBS
BSA
NaN3
1 % (w/v)
0,1 % (w/v)
PBS
BSA
EDTA
0,5 % (w/v)
2 mM
PBS
FKS
NaN3
1 % (w/v)
0,1 % (w/v)
FACS-Waschpuffer (WP)
MACS-Waschpuffer (MP)
Staining-Puffer (SP)
Standardzell-Puffer (StdZP)
WP
Standardzellen
PI
- 28 -
6
0,1*10 Zellen/mL
0,2 µg/mL
- Material -
Trypanblau
4.2.2.
PBS
Trypanblau
0,1 % (w/v)
Für die Proteinbiochemie verwendete Puffer und Lösungen
Puffer/Lösungen
Elektrophoresepuffer (Bio Rad, 10x)
Substanz
Endkonzentration
ddH2O
Tris
Glycin
SDS
Elektrophoresepuffer (NuPAGE)
3,03 % (w/v)
14,4 % (w/v)
1 % (w/v)
ddH2O
NuPAGE™ MES-Puffer
5 % (v/v)
Laufgel (Bio Rad, 10%ig)
ddH2O
30 %ig Acrylamid/Bisacrylamid
Tris-Puffer 1M, pH 8,8
10 %ig SDS
20 %ig APS
TEMED
28,7 % (v/v)
33 % (v/v)
36 % (v/v)
1 % (v/v)
0,33 % (v/v)
0,066 % (v/v)
Milchpulver-Blockierungslösung
TBS
Magermilchpulver
NaCl
5 % (w/v)
150 mM
NP-40 Lysepuffer
NP-40
Tris (pH 7,4)
NaCl
EDTA
Natriumorthovanadat
Natriumfluorid
Natriumpyrophoshat
PMSF
Aprotinin
Leupeptin
Pepstatin
1 % (v/v)
20 mM
150 mM
5 mM
1 mM
10 mM
1M
1 mM
2 µg/mL
2 µg/mL
2 µg/mL
Probenpuffer (Bio Rad)
SDS
Glycerin
Tris-Puffer 1 M, pH 6,8
Bromphenolblau
-Mercaptoethanol
6 % (w/v)
30 % (v/v)
200 mM
0,005 % (v/v)
2-5 % (v/v)
Sammelgel (Bio Rad)
ddH2O
69,5 % (v/v)
16,5 % (v/v)
12,4 % (v/v)
1 % (v/v)
0,49 % (v/v)
0,1 % (v/v)
„Stripping“-Lösung
ddH2O
30 %ig Acrylamid/Bisacrylamid
Tris-Puffer 1 M, pH 6,8
10 %ig SDS
20 %ig APS
TEMED
Tris pH 6,8
-Mercaptoethanol
10 %ig SDS
Tris buffered saline (TBS)
62,5 mM
100 mM
2 % (v/v)
ddH2O
Tris
NaCl
auf pH 7,5-8,0 einstellen
- 29 -
10 mM
150 mM
- Material -
Tris buffered saline-Tween (TBS-T)
Western-Blot-Transferpuffer
TBS
Tween 20
0,05 % (v/v)
ddH2O
Tris
Glycin
Methanol
10 %ig SDS
4.3.
25 mM
192 mM
20 % (v/v)
1 % (v/v)
Kits
Kit
Bezugsquelle
KatalogNr.
Anti-TCR MicroBead Kit
Anti-TCRMicroBead Kit
(Customizied Reagent)
™
BD Cytofix/Cytoperm
CD4+ T Cell Isolation Kit II
™
Cytofix (Phosflow )
®
Dynabeads Regulatory
CD4+CD25+ T Cell Kit
ECL Advance Western Blotting
Detection Kit
FcR Blocking Reagent, human
FoxP3 Staining Buffer Set
Human Granzyme B-ELISA
Human IFN-- ELISA, DuoSet
Human IL-2-ELISA, DuoSet
Human RANTES (CCL5) -ELISA,
DuoSet
Human TNF--ELSA, DuoSet
Lysing Solution
™
Perm Buffer III (Phosflow )
™
Proteome Profiler Array, Human
Phospho-MAPK Array Kit
T Cell Activation/ Expansion Kit,
human
Protein Marker „Precision Plus“
Miltenyi Biotec
Miltenyi Biotec
130-050-701
130-092-954
BD Biosciences
Miltenyi Biotec
BD Biosciences
Life Technologies
554 714
130-091-155
554655
11363D
GE-Healthcare
RPN2135
Miltenyi Biotec
eBioscience
BenderMed Systems
R&D Systems
R&D Systems
R&D Systems
130-059-901
00-5523
BMS2027
DY285
DY202
DY278
R&D Systems
BD Biosciences
BD Biosciences
R&D Systems
DY210
349202
558050
ARY002
Miltenyi Biotec
130091441
BioRad
161-0373
4.4.
Antikörper
Für Antikörper, deren Konzentration unbekannt war, wurde die verwendete Verdünnung
angegeben.
Verwendete Abkürzungen: AF = Alexa Fluor; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; PE = Phycoerythrin;
phos. = phosphoryliert; HRP = Meerrettichperoxidase; rh = rekombinant, human.
4.4.1.
Zur Analyse von Oberflächenmolekülen verwendete mAk
Antigen
Konjugat
Isotyp
Klon
Endkonzentration
Bezugsquelle
CD3
CD4
CD4
CD25
PE
FITC
FITC
PE
Maus IgG1,
Maus IgG2B
Maus IgG1,
Maus IgG1,
SK7
OKT4
SK3
SA3
2,5 µg/mL
25 µg/mL
2,5 µg/mL
1,25 µg/mL
BD Biosciences
ATCC
BD Biosciences
BD Biosciences
- 30 -
- Material CD27
CD28
CD39
CD45RA
CD69
CD80
CD83
CD86
PE
PE
PE
PE-Cy7
PE
PE
PE
PE
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
CD152 (CTLA4)
CD274 (PD-L1)
CD279 (PD-1)
HLA-DR
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
PE
PE-Cy7
PE
PE
PE
FITC
PE
PE
PE-Cy7
PE-Cy7
APC
Maus IgG2A,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG2A,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Kontrolle
LAP
TCR
TCR
TIM3
V1
V2
V2
APC
PE
FITC
APC
PE
FITC
PE
FITC
4.4.2.
1:2
12,5 µg/mL
25 µg/mL
25 µg/mL
40 µg/mL
1:2
1:2
1:2
BD Biosciences
BD Biosciences
Biolegend
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
Maus IgG2B,
Ratte IgG2A,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG2A,
M-T271
L293
A1
L48
L78
L307.4
HB15e
2331
(FUN-1)
BNI3
MIH1
EH12.2H7
G46-6
X40
X40
27-35
54447
X40
L48
X39
pur
50 µg/mL
12,5 µg/mL
12,5 µg/mL
entsprechend
entsprechend
entsprechend
entsprechend
entsprechend
entsprechend
entsprechend
Maus IgG2A,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Ratte IgG2A
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
eBM2a
TW4-2F8
11F2
B1
344823
T58.2
B6
IMMU 389
entsprechend
pur
17 µg/mL
50 µg/mL
5 µg/mL
30 µg/mL
50 µg/mL
1:2
BD Biosciences
BD Biosciences
Biolegend
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
R&D Systems
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
/Beckman Coulter
eBioscience
Biolegend
BD Biosciences
BD Biosciences
R&D Systems
Thermo Scientific
BD Biosciences
Beckman Coulter
Zur Analyse intrazellulärer Moleküle verwendete monoklonale
Antikörper
Antigen
Konjugat
Foxp3
Foxp3
GATA-3
Granzym B
Granzym B
Helios
PE
PE
PE
AF647
PE
APC
IFN-
IFN-
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
Kontrolle
FITC
PE
FITC
PE
PE
PE
AF647
APC
MIP-1 (CCL3)
RANTES (CCL5)
PE
PE
Isotyp
Klon
Ratte IgG2A,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Armenian
Hamster IgG
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG2A,
Ratte IgG2A,
Maus IgG1,
Armenischer
Hamster IgG
Maus IgG2A,
Maus IgG1,
Einsatzkonzentration
Bezugsquelle
PCH101
259D
IC26051P
GB11
GB11
22F6
10 µg/mL
100 µg/mL
5 µg/mL
2 µg/mL
1:100
pur
eBioscience
Biolegend
R&D Systems
BD Biosciences
BD Biosciences
Biolegend
4S.B3
4S.B3
MOPC-21
MOPC-21
G155-178
R35-95
HTK888
5 µg/mL
5 µg/mL
entsprechend
entsprechend
entsprechend
entsprechend
entsprechend
entsprechend
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
Biolegend
11A3
2D5
2 µg/mL
2 µg/mL
BD Biosciences
BD Biosciences
- 31 -
- Material T-bet
TNF-
phos. AKT (pS473)
phos. AKT (pT308)
phos. NF-B/p65
(pS529)
phos. p38 MAPK
(pT180/pY182)
phos. ERK1/2
(pT202/pY204)
4.4.3.
PE
PE
PE
PE
PE
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG2B,
AF647
PE
Biolegend
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
BD Biosciences
1:5
BD Biosciences
Maus IgG1,
20A
1:5
BD Biosciences
Agonistische und antagonistische Antikörper
Antigen
Konjugat
CD3
CD28
CD80
CD86
CD152
CD274
CD279
Kontrolle
Kontrolle
/
/
/
/
/
/
/
/
/
4.4.4.
40 µg/mL
2 µg/mL
0,3 µg/mL
0,3 µg/mL
1:5
Maus IgG1,
4B10
359-81-11
M89-61
JT-223.371
K10895.12.50
36/p38
Isotyp
Maus
Maus IgG1,
Maus IgG1,
Maus IgG2B,
Maus IgG1,
Maus IgG2B,
Maus IgG2A,
Maus IgG1,
Maus IgG2B,
Klon
Einsatzkonzentration
Bezugsquelle
OKT3
CD28.2
37711
IT2.2
L3D10
29E.2A3
EH12.2H7
11711
20116
2 µg/mL
1 µg/mL
5 µg/mL
5 µg/mL
5 µg/mL
5 µg/mL
5 µg/mL
5 µg/mL
5 µg/mL
Orthoclone
BD Biosciences
R&D Systems
Biolegend
Biolegend
Biolegend
Biolegend
R&D Systems
R&D Systems
Antagonistische Fusionsproteine
Protein
Zusammensetzung
Einsatzkonzentration
Bezugsquelle
CTLA-4/Fc
IgG/Fc
PD-1/Fc
rh CTLA-4 (Ala37-Phe162)/Fc-Fusionsprotein
rh IgG1 (Pro100Lys330)/Fc-Fusionsprotein
rh PD-1 (Leu25 Gln167)/Fc-Fusionsprotein
5 µg/mL
5 µg/mL
5 µg/mL
R&D Systems
R&D Systems
R&D Systems
4.4.5.
Antigen
Zur Western blot-Analyse verwendete Antikörper
Konjugat
ERK1/2
NF-B/p65
p38 MAP-Kinase
phos. AKT (Ser473)
phos. AKT (Thr308)
phos. ERK1/2
(Thr202/Tyr204)
phos. NF-B/p65
(Ser536)
phos. p38
(Thr180/Tyr182)
Kaninchen
Maus
-Aktin
Isotyp
Klon
Einsatzkonzentration
Bezugsquelle
Bestell-Nr.
polyklonal
polyklonal
polyklonal
587F11
C31E5E
20G11
1:1.000
1:1.000
1:1.000
1:1.000
1:1.000
1:1.000
Cell Signaling
Santa Cruz
Cell Signaling
Cell Signaling
Cell Signaling
Cell Signaling
9102
SC-372
9212
4051S
2965S
9101S
93H1
1:1.000
Cell Signaling
93H1
/
Kaninchen
Kaninchen
Kaninchen
Mouse IgG2B
Kaninchen
Kaninchen
mAb
Kaninchen
mAb
Kaninchen
3D7
1:1.000
Cell Signaling
9211S
HRP
HRP
/
Esel
Schaf
Maus
AC-15
1:7.500
1:7.500
1:10.000
GE-Healthcare
GE-Healthcare
Sigma-Aldrich
NA934V
NA931V
A1978
/
/
/
/
/
/
/
- 32 -
- Material -
4.5.
Geräte
Geräte
Bezeichnung
Hersteller
Absaugvorrichtung
Bestrahlungsgerät
Filter Mate Harvester
GammaCell40
CO2-Begasungsbrutschrank
Durchflusszytometer
Entwicklermaschine
Multistepper
Kühlzentrifuge
Kühlzentrifuge
Lichtmikroskop
Lichtmikroskop
Mehrkanalpipette 5-300 µL
Mikroplatten-Photometer
Neubauer-Zählkammer
Netzgerät
Netzgerät
Pipetierhilfen (10, 100, 200, 1000 μL)
Elektrophoresekammer
Elektrophoresekammer
Spektrophotometer
Sterilbank
Thermomixer compact
Vortex-Gerät
Western Blot Transfer-Kammer
Western Blot Transfer-Kammer
Wipptisch
Zentrifuge
Zentrifuge
Zentrifuge
Zentrifuge
Zentrifuge
-Szintillationszähler
Heracell 240i
FACS Calibur™
Perkin Elmer
Atomic Energie of
Canada
Heraeus
BD Biosciences
Agfa, Gera
Nichiryo
Thermo Scientific
Thermo Scientific
Zeiss
Zeiss
Thermo Scientific
Tecan
Fischer
Sigma
Bio Rad
Eppendorf
BioRad
BioRad
BioRad
Thermo Scientific
Eppendorf
Heidolph Reax
Bio Rad
Bio Rad
Fröbel Labortechnik
Heraeus
Heraeus
Eppendorf
Eppendorf
Heraeus
Inotech
4.6.
Nichiryo 8100
Biofuge 15R
Megafuge 16/16R
Axiovert 10
Axioskop
Finnpipette
Infinite™ M200
Power Supply 250-2
Power Pack 200/300
®
Mini-Protean 3
®
Protean II xi Cell
SmartSpec™3000
Lamin air™
Thermostat 5320
REAX 2000
Trans-blot®
Mini Trans-Blot®
Rocky
Biofuge 13
Megafuge 1.0
5417R; 5415C
Multifuge 4KR
Multifuge 3s-R
1450 Microbeta
Verbrauchsmaterialien
Material
Bezeichnung
ECL-Chemolumineszenz-Film
Hyperfilm
Einfrierröhrchen
FACS-Röhrchen (0,6 mL)
FACS-Röhrchen (5 mL)
Filterpapier
MACS-LS-Säulen
Mikrotiterplatte
Nitrozellulose-Membran
Parafilm
Pasteurpipetten ungestopft
Pipetierhilfe
Pipettenspitzen
PS-Abdeckplatten
Reaktionsgefäße (1,5 und 2 mL)
™
™
CryoTube
Round base test tube
Maxisorb
™
Hybond C Extra
Parafilm
Accu-jet™ pro
127,0/85/11MM, Standard
- 33 -
Hersteller
Amersham
Thermo Scientific
Sterilin
BD Biosciences
Whatman
Miltenyi Biotec
Nunc
Amersham
Pechiney Plastic
Packaging
Hecht
Brand, Wertheim
Sarstedt
Greiner
Sarstedt
- Material Serologische Pipetten (5, 10, 25, 50 mL)
Spektrometerküvetten
Spektrometerküvetten
Steppertips 0,6 mL
Steppertips 00,6 mL
Transwell Einsatz
Zellkulturflaschen (50, 250, 650 mL)
Zellkulturplatte, Rundboden, 96 Kavitäten
Zellkulturplatte, Spitzboden, 96 Kavitäten
Zellkulturplatten, Flachboden, (12, 24, 96
Kavitäten)
Zentrifugenröhrchen (15 mL und 50 mL,
ohne Stehrand)
4.7.
Cell Culture Insert\
Anopore, 8 Well (0,2 µm
Porengröße)
Cellstar
MicroWell™
MicroWell™
Greiner
Nunc
Nerbe plus
Nunc
Greiner
Software
Sofware
Hersteller
TM
Aida Image Analyzer 4.04
TM
Cell Quest Pro
TM
Microsoft Office 2007
Weasel 3.0.2
4.8.
Greiner
Sarstedt
Sarstedt
Süd-Laborbedarf
Süd-Laborbedarf
Nunc
Raytest
BD Biosciences
Microsoft
WEHI
Statistik
Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten wurden mit Hilfe des studentschen T-Tests
für gepaarte Daten unter Verwendung von Microsoft Exel 2007 bezüglich ihrer statistischen
Signifikanz analysiert.
- 34 -
- Methoden -
5. Methoden
5.1.
5.1.1.
Zell-basierte Methoden
Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut
Zur Isolierung mononukleärer Zellen aus dem humanen Blut wurden die unterschiedlichen
zellulären Bestandteile von Leukozytenkonzentraten (Buffy coats oder Leukozytenrückhaltesystem-Konzentrat (LRS-Konzentrat)) mit Hilfe einer Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation anhand ihrer spezifischen Dichte separiert. Die zellulären Bestandteile mit einer
relativ zum Ficoll höheren Dichte wie Granulozyten und Erythrozyten pelletierten am Boden
des verwendeten 50 mL-Zentrifugationsröhrchen, während Monozyten und Lymphozyten an
der Phasengrenze zwischen Ficoll-Lösung und PBS/Plasma sedimentierten. Thrombozyten
verblieben zusammen mit dem Plasma im Überstand.
Zur Isolation wurden 30-35 mL mit PBS verdünnten Blutes [im Verhältnis von 1:2 (Buffy coat)
bzw. 1:5 (LRS-Konzentrat)] über 15 mL Ficoll-Lösung (Dichte von 1,077 g/mL) geschichtet.
Nach einem anschließenden Zentrifugationsschritt (693 rcf, 20 min, ohne Bremse) wurden
die im Interphasering akkumulierten Zellen in neue Zentrifugenröhrchen überführt und einem
Waschschritt (444 rcf, 5 min) mit PBS unterzogen. Nach zwei weiteren Waschschritten
(174 rcf, 10 min) zur Entfernung verbliebener Ficollrückstände und Thrombozyten wurden die
Zellen in RPMI Zellkulturmedium mit 10 % FKS aufgenommen und bei 4°C gelagert.
Lymphozytenkonzentrate gesunder Spender wurden vom Institut für Transfusionsmedizin
des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein zur Verfügung gestellt.
5.1.2.
Magnetische Zellseparation (MACS)
Mit Hilfe einer magnetischen Separation können definierte T-Zell-Subpopulation aus PBMZ
isoliert werden. Hierfür wurden an magnetische Partikel gekoppelte monoklonale
Antikörper (mAk) verwendet. Diese mAk sind gegen definierte Oberflächenantigene
unterschiedlicher Zellpopulationen gerichtet. Auf diese Weise ist es möglich definierte Zellpopulationen magnetisch zu markieren und diese in einer Säule mit einem paramagnetischen (Miltenyi Biotec) bzw. ohne Füllmaterial (Life Technologies/Dynal) innerhalb
eines starken magnetischen Feldes zurückzuhalten. Um eine bestimmte Zellpopulation
spezifisch anzureichern, können sowohl die zu isolierende (positive Selektion) als auch alle
anderen Zellpopulation außer dieser (negative Selektion) markiert und zurückgehalten
werden. Ferner können durch positive und negative Selektion auch eine oder mehrere
Zellpopulationen spezifische aus dem Gemisch entfernt werden (Depletion).
- 35 -
- Methoden In dieser Arbeit wurden T-Zellen mit Hilfe eines FITC-markierten anti-TZR MicroBead Kit
oder eines sonderangefertigten, unkonjugierten anti-TZR MicroBead Kit der Firma Miltenyi
Biotec positiv selektioniert. CD4+ T-Zellen wurden negativ unter Verwendung des CD4+
T-Zell Isolierungs Kit II der Firma Miltenyi Biotec isoliert. Nach anschließender Depletion der
CD25+ T-Zellen innerhalb der CD4+ T-Zellen mit Hilfe von anti-CD25 Dynabeads der Firma
Life Technologies wurden die verbleibenden CD4+CD25- T-Zellen als „Responder“ T-Zellen
bezeichnet. Bei den mit anti-CD25 Dynabeads positiv isolierten CD4+CD25+ T-Zellen handelt
es sich um Treg. Vor deren weiteren Verwendung wurden die an die Zellen gebundenen
Dynabeads mit Hilfe der Detachabead-Reagenz (Life Technologies) entfernt. Die in dieser
Arbeit frisch isolierten Zellen wurden nur verwendet, wenn sie laut durchflusszytometrischer
Analyse einen Reinheitsgrad von > 97 % besaßen.
5.1.3.
Kryokonservierung
Zur Kryokonservierung wurde eine definierte Anzahl von Zellen per Zentrifugation (340 rcf,
5 min) pelletiert. Die Zellen wurden in eisgekühltem Einfriermedium (EFM) resuspendiert
(5-30x106 Zellen/mL). Durch das im EFM enthaltene DMSO wurde die Bildung von Kristallen
verhindert und die Integrität der Zellen gewährleistet. Die Einfrierröhrchen wurden mit jeweils
1 mL Zellsuspension befüllt und für 30 min bei -20°C und in einem darauf folgenden Schritt
bei -80°C eingefroren. Am Folgetag wurden die Zellen zur Lagerung bei -196°C in flüssigen
Stickstoff überführt.
Zum Auftauen wurden die Zellen zügig in 14 mL kaltes RPMI Zellkulturmedium mit 10 % FKS
überführt und pelletiert (340 rcf, 5 min). Da DMSO bereits bei Raumtemperatur für Zellen
toxisch ist, wurden die Zellen zum Entfernen von DMSO-Rückständen zwei weiteren Waschschritten unterzogen. Bevor die Zellen kultiviert wurden, wurde ihre Zellzahl und Vitalität
bestimmt.
5.1.4.
Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität
Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 20 µL einer zweckmäßig vorverdünnten Zellsuspension
mit 60 µL Eosinlösung vermisch. Die Anzahl vitaler und toter Zellen wurde mit Hilfe einer
Neubauer-Zählkammer bestimmt.
5.1.5.
Kulturbedingungen
Die Kultivierung humaner T-Zellen erfolgte im CO2-Begasungsbrutschrank bei wasserdampfgesättigter Atmosphäre und einem CO2-Gehalt von 5%. Zur Kultivierung von frisch aus
PBMZ isolierten bzw. expandierten T-Zellen wurde X-VIVO15 Zellkulturmedium verwendet.
Bei diesem handelt es sich um ein serumfeies Medium mit definierten Zusätzen.
Zur Untersuchung des suppressiven Potentials wurden 1-5x104 T- oder Treg-Zellen
zusammen mit einer entsprechenden Anzahl Responder T-Zellen ohne die Zugabe von
- 36 -
- Methoden Zytokinen kokultiviert. Für Untersuchungen von „solokultivierten“ T-Zellen und Treg wurde
das Zellkulturmedium mit IL-2 (50 U/mL) supplementiert.
Zur Induktion von regulatorischen T-Zellen wurden, wie von Casetti et al. beschrieben,
TGF-1, IL-2 und IL-15 verwendet (Casetti et al. 2009). Pro Kavität wurden 5x104 Zellen in
96-Kavitäten-Rundbodenplatten kultiviert. Zu Beginn der Zellkultur und darauffolgend jeweils
im Abstand von 4 Tagen wurden 1,7 ng/mL TGF-1, 10 ng/mL IL-15 und 10 U/mL IL-2 zur
Zellkultur hinzugegeben. Zur weiteren Expansion unter diesen Bedingungen wurden die
Zellen am Tag 8 der Zellkultur in 24-Kavitäten-Flachbodenplatten überführt, wobei das
Medium erneuert wurde. Nach einem Zeitraum von 16 Tagen wurde die Anzahl und Vitalität
der Zellen bestimmt. Anschließend wurden diese für weitere Experimente verwendet.
5.1.6.
Stimulation von T-Zellen
Treg können mit Hilfe anti-CD3,-28 mAk-umhüllter Partikel in Anwesenheit von IL-2
polyklonal stimuliert und expandiert werden (Oberg et al. 2010; Hoffmann et al. 2004). Zur
Untersuchung suppressiver Funktionen bei T-Zellen wurden entsprechende Partikel der
Firma Miltenyi Biotec (T Cell Activation/Expansion Beads umhüllt mit 10 µg/mL antiCD3 mAk, 10 µg/mL anti-CD28 mAk, 1 µg/mL anti-CD2 mAk (= A/E-Partikel)) verwendet.
Durch diese wurden sowohl die Responder- als auch T-Zellen über ihren TZR und einen
CD28-Kostimulus polyklonal stimuliert. Die Stimulation mit Hilfe von A/E-Partikeln wurde in
96-Kavitäten-Rundbodenplatten durchgeführt, wobei die Zellen im 1:1 Verhältnis mit A/EPartikeln eingesetzt wurden. Für die Kokultur von - und Responder T-Zellen wurden jeweils
1x104 Zellen und eine entsprechende Anzahl von A/E-Partikeln verwendet.
Eine weitere Möglichkeit der polyklonalen Stimulation stellt die Verwendung von plattengebundenem anti-CD3 mAk (2 µg/mL; Klon OKT3) zusammen mit löslichem agonistischen
anti-CD28 mAk (1 µg/mL) dar. Die Kavitäten der 96-Kavitäten-Rundbodenplatten wurden vor
Stimulationsbeginn für 4 h bei 37°C mit 100 µL anti-CD3 mAk-Antikörperlösung beschichtet.
Anschließend wurde diese entfernt und die Platten zweimal mit 200 µL PBS gewaschen. Das
PBS des zweiten Waschschritts wurde erst direkt bevor Zellen auf die Platte gegeben
wurden entfernt. Der anti-CD28 mAk wurde zusammen mit den Zellen in die jeweiligen
Kavitäten gegeben. Pro Kavität wurden jeweils 5x104 Zellen der verwendeten Zellpopulation
eingesetzt.
Alternativ wurden Responder T-Zellen mit bakteriellen Superantigenen in Form eines
Gemisches verschiedener SE [SE-Gemisch: SEA-T, SEB, SEC, SED und SEE mit einer
Konzentration von jeweils 1 µg/mL] stimuliert. Superantigene können MHC II auf APZ
außerhalb der Antigenbindungstasche direkt mit dem TZR über dessen V-Region
verbinden. Zur (parallelen) Stimulation von T-Zellen wurde BrHPP (300 nM) verwendet,
welches durch V2 T-Zellen erkannt wird. Sowohl BrHPP- als auch die SE-Gemisch-
- 37 -
- Methoden Stimulation machten das Vorhandensein von APZ notwendig, welche in Form von
bestrahlten PBMZ (2 x104 Zellen) mit in die Zellkultur gegeben wurden. Es wurden jeweils 2
x104 Zellen in 96-Kavitäten-Zellkulturplatten stimuliert.
Zur Kurzzeitstimulation von T-Zellen wurden 5x105 - 1x106 Zellen verwendet. Diese
befanden sich in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß in einem Volumen von 0,5 mL und wurden in
Zellkulturmedium ohne Zusätze oder in Anwesenheit eines TLR2-Liganden-Gemisches für
22 h vorinkubiert. Anschließend wurden diese direkt ohne einen Waschschritt auf Eis
überführt. Dort wurden agonistische gegen CD3 (2 µg/mL) und CD28 (1 µg/mL) gerichtete
mAk in einem Volumen von 10 µL hinzugegeben und mit den Zellen für 30 min auf Eis
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 500 µL eiskaltem X-VIVO15 Zellkulturmedium
gewaschen. Durch Zugabe von 200 µL vorgewärmten Kaninchen-anti-Maus-Antikörper
(10 µg/mL) in X-VIVO15 wurde die Stimulation durch Quervernetzung der anti-CD3 und
CD28 mAk begonnen. Für den Zeitraum der Stimulation verblieben die Zellen bei 37°C. Zum
Beenden der Stimulation wurde 1 mL eiskaltes PBS hinzugegeben und die Zellen auf Eis
überführt. Für die intrazelluläre, durchfusszytometrische Analyse von phosphorylierten
Signalmolekülen (Kap. 5.2.2.3) wurde die Stimulation mit der Zugabe von vorgewärmtem
Cytofix (1 Volumen) durch Fixierung der Zellen beendet.
Zum intrazellulären Nachweis löslicher Mediatoren in expandierten T-Zellen wurde
ebenfalls eine Kurzzeitstimulation vorgenommen. Die Zellen wurden in frisches Zellkulturmedium mit 10 U/mL IL-2 überführt und es wurde 12-O-Tetradecanoylphorbol-13acetat (TPA) (10 ng/mL) hinzugegeben. Nach einer Stimulationsdauer von 8 h wurden die
Zellen analysiert.
5.1.6.1.
Blockierende Antikörper und Fusionsproteine
Um die Interaktionen immunregulatorischer Oberflächenmoleküle genauer zu analysieren,
wurden folgende die Interaktion blockierende mAk oder rekombinante Fusionsproteine
verwendet: anti-CD80 (Klon 3771), CTLA-4/Fc und PD-1/Fc von R&D; CTLA-4 (Klon L3D10),
anti-CD86 (Klon IT2.2), anti-PD-1 (EH12.2H7) und anti-PD-L1 (29E.2A3) von Biolegend
(Brown et al. 2003; Rodig et al. 2003; Nakamoto et al. 2009; Radziewicz et al. 2007; Everts
et al. 2010; Kapsogeorgou et al. 2001). Zur funktionellen Analyse wurden die Konzentration
der blockierenden Entitäten (in Anlehnung an Literaturwerte) in einem Bereich zwischen
1-10 µg/mL austitriert. Vor Beginn der Zellkultur wurden die Zellkulturplatten für 4 h bei 37°C
mit 100 µL einer die blockierenden Entitäten und den agonistischen anti-CD3 mAk
enthaltenden Lösung beschichtet. Die weitere Durchführung erfolgte wie in Kapitel. 5.1.6 für
die Stimulation mit plattengebundenem anti-CD3 mAK und löslichen anti-CD28 mAk
beschrieben.
- 38 -
- Methoden -
TLR2-Liganden-Stimulation
5.1.6.2.
TLR2 kann mit TLR1 und TLR6 Heterodimere, die unterschiedliche Liganden erkennen,
bilden. Da donorspezifische Unterschiede in der Expression von TLR1 beschrieben sind
(Pietschmann et al. 2009; Oberg et al. 2010), wurde zur Vorinkubation der T-Zellen mit
TLR2-Liganden ein Gemisch aus Pam2CSK4, Pam3CSK4 und FSL-1 verwendet. Auf diese
Weise
konnte
die
Stimulation
der
verschiedenen
möglichen
TLR2-Heterodimere
sichergestellt werden. Zur Untersuchung des Einflusses von TLR2-Liganden auf T-Zellen
bzw. deren suppressive Aktivität wurden T-Zellen mit TLR2-Liganden vorinkubiert. Durch
die Vorinkubation der T-Zellen konnten direkte Effekte der TLR2-Liganden auf kokultivierte
Responder T-Zellen ausgeschlossen werden.
Frisch isolierte T-Zellen wurden in 24-Kavitäten-Flachbodenplatten in X-VIVO15 mit einer
Zelldichte von 1x106 Zellen/mL für 22 h vorinkubiert. Zu einem Teil der Zellen wurde für
diesen Zeitraum die TLR2-Liganden Pam2CSK4 (2 µg/mL), Pam3CSK4 (2 µg/mL) und FSL-1
(1 µg/mL) hinzugegeben, während der andere Teil in Zellkulturmedium ohne Zusätze
verblieb. Nach der Vorinkubation wurden die Zellen in 15 mL Zentrifugationsröhrchen
überführt, zwei Waschschritten unterzogen (340 rcf, 5 min) und für nachfolgende Versuche
verwendet.
5.1.7.
Proliferationsanalyse anhand von 3H-Tymidineinbau
Proliferierende Zellen verdoppeln vor der Zellteilung ihre DNA. Hierbei werden komplementäre
DNA-Stränge
neu
synthetisiert.
Durch
Zugabe
von
Tritium-markiertem
3
Thymidin ( H-Thymidin) in das Zellkulturmedium kann dieses von den proliferierenden Zellen
anstelle von zelleigenem Thymidin in die (neu synthetisierte) DNA integriert werden. Obwohl
der Einbau von Thymidin vor der eigentlichen Zellteilung stattfindet, ist er direkt proportional
zur Zellproliferation.
Zur Bestimmung der Proliferation wurden Zellen in 96-Kavitäten-Zellkulturplatten mit
Rundboden in jeweils 200 µL Zellkulturmedium kultiviert. Die jeweiligen Ansätze erfolgten als
experimentelle Triplikate. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden pro Kavität 20 µL
3
H-
Thymidin in RPMI Zellkulturmedium ohne FKS mit einer Aktivität von 1 µCi/Kavität
hinzugegeben. Für einen Zeitraum von 16 Stunden wurden die Zellen weiter kultiviert und im
Anschluss bei -20°C eingefroren. Zur Bestimmung der in die DNA eingebauten Radioaktivität
wurden die Proben auf eine Filtermembran übertragen. Diese wurde getrocknet und
anschließend mit einem Wachs beschichtet, welches einen Szintillator beinhaltet, der die
radioaktive Strahlung in Lichtenergie umsetzte. Diese Ereignisse wurden mit Hilfe eines Szintillationszählers in Form von cpm (counts per minute/Ereignissen pro Minute) gemessen.
- 39 -
- Methoden -
5.2.
Durchflusszytometrische Methoden
Mit Hilfe der fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS: Fluorescence activated cell sorting)
ist es möglich einzelne Zellen anhand ihrer Lichtbrechung und/oder ihrer Fluoreszenz zu
charakterisieren. Hierzu wird durch eine Trägerflüssigkeit eine laminare Strömung erzeugt
und die Zellsuspension von dieser mitgeführt. Im Bereich der Messküvette kommt es durch
die Querschnittsverringerung zur hydrodynamischen Fokussierung und Vereinzelung der
Zellen. Anschließend passieren die vereinzelten Zellen den Laserstrahl. Ein Teil des
auftreffenden Lichtes wird von den Zellen gebrochen. Das Vorwärts- (fsc) bzw. Seitwärtsstreulicht (ssc) ist jeweils proportional zu der Größe bzw. Granularität der analysierten Zelle.
Durch einen Laser ist es weiterhin möglich Fluorochrome anzuregen, die daraufhin Licht in
einem bestimmten Wellenlängenbereich emittieren, welches wiederum durch Detektoren
nachgewiesen werden kann. Durch Fluorochrom-gekoppelte Antikörper ist es möglich
bestimmte
Proteine
einer
Zelle
zu
markieren
und
diese
Zellen
anschließend
durchflusszytometrisch zu analysieren. Die Fluoreszenzintensität ist hierbei proportional zur
Anzahl der gebundenen Fluorochrommoleküle.
5.2.1.
Oberflächenantikörpermarkierung
Zur Antikörpermarkierung von Molekülen auf der Zelloberfläche wurden zwischen 1x10 4 und
1x106 Zellen in 96-Kavitäten-Spitzbodenplatten überführt. Diese wurden mit 200 µL eiskaltem
WP gewaschen, für 5 min bei 300 rcf zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Anschließend wurden 7-10 µL des spezifischen Antikörpers in angegebenen Verdünnungen/Konzentrationen (Kap. 4.4.1) zu den Zellen gegeben (auf Eis) und für 30 min bei 4°C
inkubiert. Wenn der verwendete Antikörper nicht Fluorochrom-gekoppelt war, wurde nach
einem weiteren Waschschritt ein Fluorochrom-gekoppelter Zweitantikörper zum Nachweis
des Erstantikörpers verwendet (30 min, 4°C). Im Anschluss wurden die Zellen zwei weiteren
Waschschritten unterzogen, in WP aufgenommen und direkt durchflusszytometrisch
analysiert oder optional in 1 %iger PFA-Lösung fixiert. In PFA-Lösung aufgenommen und bei
4°C gelagert, war die Fluoreszenzmarkierung für mindestens zwei Wochen stabil.
5.2.2.
Intrazelluläre Antikörpermarkierungen
Die intrazelluläre Antikörpermarkierung wurde prinzipiell wie die Oberflächenmarkierung
durchgeführt, nur wurden die Zellen zuvor fixiert und permeabilisiert. Um die Membranpermeabilität aufrechtzuerhalten wurden zudem die Kapitel 4.3 aufgelisteten speziellen
Puffer verwendet. Intrazelluläre Antikörpermarkierungen konnten auch anschließend an eine
vorhergegangene Oberflächenmarkierung vorgenommen werden. Die verwendeten Antikörper sind in Kapitel 4.4.2 aufgeführt.
- 40 -
- Methoden 5.2.2.1.
Intrazellulärer Nachweis löslicher Mediatoren
Zum intrazellulären Nachweis löslicher Mediatoren wurde die Exozytose der Zellen 4 h vor
der Analyse durch Zugabe von Monensin (3 µM) zum Zellkulturmedium blockiert. Zur intrazellulären Antikörpermarkierung wurde ein Puffersystem von BD-Biosciences verwendet.
Zwischen 1x104 und 1x105 Zellen wurden zuerst in eine 96-Kavitäten-Spitzbodenplatte
überführt und nach einem Waschschritt (200 µL Staining-Puffer (SP), 300 rcf, 5 min) mit Hilfe
von Cytofix/Cytoperm™ für 20 min bei 4°C fixiert bzw. permeabilisiert. Nach zwei anschließenden Waschschritten (200 µL eiskalter Perm/Wash™-Puffer, 300 rcf, 5 min) wurden die
Zellen zusammen mit 100 µL in Perm/Wash™-Puffer verdünnten Antikörper für 30 min bei
4°C inkubiert. Es folgten zwei weitere Waschschritte mit Perm/Wash™-Puffer. Im Anschluss
wurden die Zellen in SP aufgenommen und umgehend durchflusszytometrisch analysiert.
5.2.2.2.
Intrazellulärer Nachweis von Transkriptionsfaktoren
Zur intrazellulären Markierung von Transkriptionsfaktoren wurde das FoxP3 Staining Buffer
Set von eBioscience verwendet. Zwischen 1x104 und 5x105 Zellen wurden ebenfalls in eine
96-Kavitäten-Spitzbodenplatte überführt und einem Waschschritt unterzogen (200 µL
eiskalter SP, 300 rcf, 5 min). Anschließend wurden diese mit 100 µL Fixierungs/Permeabilisierungs-Lösung für mindestens 1 h bei 4°C inkubiert. Nach zwei Waschschritten
(200 µL Permeabilisierungs-Puffer, 300 rcf, 5 min) wurden die Zellen mit 20 µL in Permeabilisierungs-Puffer verdünntem Antikörper für 30 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden
die Zellen zwei weiteren Waschschritten mit Permeabilisierungs-Puffer unterzogen und in
100 µL SP aufgenommen und umgehend durchflusszytometrisch analysiert.
5.2.2.3.
Intrazellulärer Nachweis phosphorylierter Signalmoleküle
Zur Analyse phosphorylierter Signalmoleküle wurde das Phosflow™-Puffersystem von BDBiosciences verwendet. Pro Antikörpermarkierung wurden 2,5x105 - 1x106 Zellen verwendet.
Die Zellen wurden direkt im Zellkulturmedium durch Zugabe von einem Volumen Cytofix
fixiert. Anschließend wurden die Zellen bei 9820 rcf pelletiert und der Überstand verworfen.
Durch Zugabe von 100 µL vorgekühltem (-20°C) Perm-Puffer III wurden die Zellen für 30 min
auf Eis permeabilisiert. Nach zwei Waschschritten (200 µL SP, 300 rcf, 5 min) wurden die
Zellen mit 25 µL in SP verdünnten Antikörper für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen in 100 µL SP aufgenommen und umgehend
am Durchflusszytometer analysiert.
5.2.3.
SCDA (Standard Cell Dilution Assay)
Zur Bestimmung der Absolutzahl verschiedener Zellpopulationen in einer heterogenen
Zellkultur wurde die SCDA-Methode verwendet. Hierbei werden einzelne Zellpopulationen
durch Fluorochrom-gekoppelte Antikörper differenziert. Zum Ausschluss toter Zellen aus den
- 41 -
- Methoden Messungen wird die Zellbeschaffenheit in Form von Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht sowie
die
Markierung
durch
Propidiumjodid
verwendet.
Propidiumjodid
kann
durch
die
desintegrierte Plasmamembran toter Zellen diffundieren und dort zwischen Basen der DNA
interkalieren. Da die Fluoreszenz von interkaliertem Propidiumjodid um das 20-30fache
erhöht ist, lässt sich die Einlagerung in die DNA toter Zellen durchflusszytometrisch
nachweisen. Zu dem untersuchten Zellgemisch wird eine definierte Anzahl fixierter,
Propidiumjodid-positiver Standardzellen mit einheitlicher Größe und Fluoreszenzmarkierung
(APC) (welche sich von anderen eingesetzten Markierungen unterscheidet) hinzugegeben.
Durch die Zugabe einer definierten Anzahl APC-positiver Standardzellen ist es möglich die
Absolutzellzahl vitaler Zellen zu ermitteln. Der Quotient der relativen Anzahl untersuchter
Zellen und Standardzellen korreliert nach Ausschluss toter Zellen linear mit der Anzahl der
untersuchten Zellen und ist unabhängig von der Anwesenheit von „Fütterzellen“ (Pechhold et
al. 1994a). Durch Multiplikation des erhaltenen Quotienten mit der zugegebenen Standardzellzahl (10.000 Zellen) lässt sich die Absolutzellzahl der untersuchten Zellen bestimmen.
Dies soll anhand der in Abbildung 5 dargestellten SCDA-Messung beispielhaft gezeigt
werden. Wie im Punktwolkendiagramm oben rechts dargestellt ist, machen in diesem
Beispiel CD4+ T-Zellen 62,1 % und Standardzellen 9,9 % der vitalen Zellen aus. Daraus folgt
folgende Berechnung: 62,1 % / 9,9 % * 10000 = 62727. Es befinden sich in diesem Beispiel
also 62727 vitale CD4+ T-Zellen im Zellgemisch. Durch Verwendung der Biplot-Darstellung ist
es möglich zwei unterschiedlich markierte Zellpopulationen (FITC- und PE) gleichzeitig mit
Standardzellen zu betrachten.
Abb. 5: Beispielhafte Darstellung einer SCDA-Messung. Obere Reihe: Punktwolkendarstellung der
Analysestrategie zur Bestimmung der Absolutzellzahl. Durch die Region 1 (R1) sind lebende PI Zellen
+
+
und durch die Region 2 (R2) PI APC Standardzellen eingegrenzt. Unten links: Unterscheidung der
verschiedenen Zellpopulationen in der Biplot-Darstellung. Gate (2) = R0+R2, Gate (3) = R0+R1+R3,
Gate (4) = R0+R1+R4, FL1 = anti-CD4-FITC, FL2 = anti-V2-PE, FL3 = PI, FL4 = Standardzellen-APC.
- 42 -
- Methoden Die Bestimmung der Absolutzellzahl vitaler Zellen durch die SCDA-Methode wurde sechs bis
sieben Tage nach Beginn der Zellkultur durchgeführt. Hierfür wurden die zu untersuchenden
Zellen in eine 96-Kavitäten-Spitzbodenplatte übertragen. Anschließend wurde die Zellkulturplatte, um eventuell in der Zellkulturplatte verbliebene Zellen ebenfalls in die Spitzbodenplatte zu übertragen, mit PBS gespült. Die Zellen wurden mit 300 rcf für 5 min pelletiert und
der Überstand verworfen. Anschließend wurden diese mit jeweils 8 µL der für die jeweiligen
Zellpopulationen spezifischen Fluorochrom-gekoppelten mAk (anti-CD4-FITC und antiTZR-PE oder anti-TZRV2-PE) für 30 min bei 4°C im Dunkeln markiert. Nach einem
darauffolgenden Waschschritt (200 µL WP, 300 rcf, 5 min) wurden die Zellen in 100 µL
Standardzell-Puffer (StdZP) aufgenommen. Auf zusätzliche Waschschritte wurde verzichtet,
um den dadurch verursachten Verlust von Zellen zu minimieren. Anschließend wurden die
Proben am Durchflusszytometer analysiert.
Herstellung von Standardzellen
CD4+ T-Zellen wurden unter Verwendung eines Negativisolationskits der Firma Miltenyi
Biotec, dem Protokoll des Herstellers folgend, isoliert. Um einen möglichst starkes Fluoreszenzsignal zu generieren, wurden die Zellen in einem ersten Schritt mit einer Mischung
verschiedener spezifischer Biotin-gekoppelter mAk für 30 min bei 4°C markiert (Gesamtvolumen 200 µL/100x106 Zellen). Verwendet wurden anti-MHC I mAk (Klon W6/32,
50 µg/mL), anti-TZR(pan) mAk (Klon BMA031, 50 µg/mL), anti-CD2 mAk (Klon OKT11,
30 µg/mL), anti-CD3 mAk (Klon OKT3, 50 µg/mL) und anti-CD4 mAk (Klon OKT4.5,
20 µg/mL).
Nach einem Waschschitt (5 mL WP, 300 rcf) wurden die mAk mit Biotin-markierten Ziegeanti-Maus-Antikörper (100 µL/100x106 Zellen, 100 µg/mL) für 20 min bei 4°C markiert. Nach
zwei weiteren Waschschritten wurden die Zellen mit APC-markierten Streptavidin
(50 µL/100x106 Zellen, 100 µg/mL) für 45 min bei 4°C inkubiert. Nach einem weiteren
Waschschritt wurden die Zellen über Nacht in 10 mL 1 %iger PFA-Lösung fixiert. Nach
einem abschließenden Waschschritt wurden die Zellen bei einer Konzentration von 1x107
Zellen/mL in WP resuspendiert und konnten bis zu ihrer Verwendung im StandardzellPuffer (StdZP) für mindestens 6 Monate gelagert werden.
5.3.
Proteinbiochemische Methoden
5.3.1. Herstellung von Zelllysaten
Zur Herstellung von Zelllysaten wurden die Zellen mit PBS gewaschen, pelletiert (340 rcf,
5 min) und in NP-40-Lysepuffer mit Inhibitoren (siehe Kap. 4.2.2) aufgenommen. Mit Hilfe der
Inhibitoren konnte ein Abbau der Enzyme durch Proteasen oder eine Dephosphorylierung
durch Phosphatasen verhindert werden. Nach Lyse der Zellen für 30-60 min wurden
- 43 -
- Methoden unlösliche Zellbestandteile pelletiert (20000 rcf, 10 min, 4°C) und der Überstand wurde in ein
frisches Reaktionsgefäß überführt. Im Anschluss wurde das Lysat direkt weiterverarbeitet,
konnte aber optional auch bei -20°C gelagert werden.
5.3.2.
Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Zur photometrischen Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der Bradford-Test
verwendet. Der hierbei verwendete Farbstoff Coomassie Brillantblau kann mit basischen
Protein-Seitenketten einen Komplex bilden. Dies führt zu einer Verschiebung dessen
Absorptionsmaximums von 470 nm zu 595 nm.
Zu 995 µL Coomassie Protein Assay Reagenz wurden 5 µL des Lysates gegeben, gemischt
und für 10 min inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei 595 nm mit Hilfe eines
Spektrophotometers bestimmt. Die Proteinkonzentration der Probe konnte anschließend
anhand einer zuvor mit definierten Konzentrationen von BSA erstellten Kalibrierungsgeraden
errechnet werden.
5.3.3.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen anhand deren Molekulargewicht wurde
die SDS-PAGE verwendet. Hierzu wurden die Proteine zuerst mit 3x Probenpuffer versetzt
und für 5 min bei 95°C denaturiert. Hierbei wird die Sekundär- und Tertiärstruktur der
Proteine aufgehoben. Aufgrund des im Probenpuffer enthaltenden -Mercaptoethanols
werden Disulphidbindungen reduziert. Da auch Proteasen und Phosphatasen denaturiert
werden, konnten die Proben anschließend bei 4°C gelagert werden. Das ebenfalls
enthaltene anionische Detergenz SDS lagert sich durch hydrophobe Wechselwirkungen an
Proteine an, stabilisiert diese in einem linearisierten Zustand und maskiert gleichzeitig deren
positive Ladungen. Da die gebundenen, negativ geladenen SDS-Moleküle zur Molekülmasse
des Proteins proportional sind, ist auch die negative Ladung proportional zur Molekülmasse.
Durch die Behandlung mit SDS ist es möglich Proteine unabhängig von ihrer Eigenladung
anhand ihrer Größe im elektrischen Feld aufzutrennen, da große Proteine im Trenngel
stärker zurückgehalten werden als kleine. Die zur SDS-PAGE verwendeten Gele bestanden
aus Sammel- und Trenngel. Innerhalb des Sammelgels wurden die Proteine fokussiert, so
dass diese weitgehend gleichzeitig in das Trenngel eintraten, um dort anhand ihrer Größe
aufgetrennt zu werden.
Zur SDS-PAGE wurden in dieser Arbeit das NuPAGE-System der Firma Life Technologies
und das Protean II-System der Fima Biorad verwendet.
Bei Verwendung des Protean II-Systems war es möglich die Konzentration des Trenngels zu
variieren. Abhängig von der zu analysierenden Molekülgröße wurden Konzentrationen
zwischen 10 und 15 % verwendet. Im Anschluss an das Gießen des Trenngels wurde dies
mit 96 % Ethanol überschichtet. Nach dessen Polymerisation wurde das Ethanol entfernt und
- 44 -
- Methoden das Sammelgel auf das Trenngel gegossen. Nachdem auch dieses polymerisiert war, wurde
das Gel in die Elektrophoresekammer eingespannt und mit Laufpuffer überschichtet.
Anschließend wurden die Proben mit jeweils 10-50 µg Protein bzw. dem Lysat von 1x106
Zellen aufgetragen. Die Auftrennung der Proben erfolgte bei 55-70 V über Nacht.
Für das NuPage-System wurden Bis-Tris-Fertiggele mit 4-12 %igem Acrylamidgradienten
zusammen mit dem zugehörigen MOPS-SDS-Laufpuffer verwendet. Es wurden maximal
20 µg Protein pro Bahn bzw. das Lysat von 1x106 Zellen pro Bahn aufgetragen. Die Proben
wurden bei 25 mA für etwa 1-1,5 h aufgetrennt.
5.3.4.
Western blot Transfer
Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wurden mit Hilfe der Western blot-Technik auf eine
Nitrozellulosemembran transferiert, wodurch sie dem Nachweis durch Antikörper zugänglich
wurden. Um die Proteine auf die Nitrozellulosemembran zu übertragen, wurde eine
Spannung senkrecht zum SDS-Gel angelegt, wobei die Proteine das durch die SDS-PAGE
entstandene Verteilungsmuster beibehielten. Für den Transfer wurde eine Nitrozellulosemembran auf das SDS-Gel gelegt, beides wurde zwischen 4 Whatmann-Papiere und 2
Schwämme in eine Transferkassette eingespannt. Der Zusammenbau erfolgte in einer mit
Transferpuffer gefüllten Schale, um den Einschluss von Luftblasen zwischen SDS-Gel und
Membran bzw. Whatmann-Papieren zu verhindern. Anschließend wurde die Transferkassette in einen mit Transferpuffer gefüllten Tank gehängt, wobei die Seite des SDS-Gels,
die mit der Nitrozellulosemembran bedeckt war, zur Anode (+) hin ausgerichtet wurde. Zum
Transfer von NuPAGE-Gelen wurden kleine Transferkammern der Firma Life Technologies
mit eingehängtem Eis-Kühlakku verwendet. Der Transfer erfolgte 1 h bei 200 V. Für die bei
Nutzung des Protean II-System verwendeten SDS-Gele wurden große Transferkammern der
Firma BioRad verwendet. Der Transfer erfolgte für 2 h bei 0,8 A und 4°C. Um die Effizienz
des Transfers zu bewerten, wurde die Membran mit Ponceau S gefärbt und dokumentiert.
Anschließend wurde sie mit Wasser gespült und mit TBS-T entfärbt.
5.3.5.
Entfernen
von
Antikörpern
von
Western blot-Membranen
(„Stripping“)
Gebundene Antikörper können mit Hilfe von Detergenzien und Reduktionsmitteln von einer
Western blot-Membran entfernt werden. Bei der Entfernung durch „Stripping“-Lösung wurden
vor allem gebundene Antikörper von der Membran entfernt, während die auf die Membran
transferierten Proteine gebunden blieben.
Hierzu wurde die Membran für 25 min bei 56°C unter Schwenken mit 25 mL „Stripping“Lösung inkubiert. Anschließend wurde die Membran 4x für 10 min mit TBS-T gewaschen und
danach erneut mit Milchpulver-Blockierungslösung inkubiert. Nach der „Stripping“-Prozedur
konnte die Membran erneut mit Antikörpern inkubiert werden.
- 45 -
- Methoden -
5.4.
5.4.1.
Immunochemische Methoden
Immunodetektion von Proteinen auf einer Nitozellulosemembran
Zur Detektion von Proteinen, die mit Hilfe der Western blot-Methode auf eine Nitrozellulosemembran transferiert wurden, können diese durch spezifische ungekoppelte (Primär-)
Antikörper markiert werden. In einem zweiten Schritt ist es dann möglich diese durch einen
Meerrettichperoxidase (HRP) -gekoppelten Sekundärantikörper nachzuweisen. Durch die
Enzymaktivität der HRP wird ein Substrat (ECL-Reagenz; Luminol, Wasserstoffperoxid)
umgesetzt, was zur Entstehung von Chemolumineszenz führt. Diese kann wiederum durch
das Belichten eines Fotofilms festgehalten werden.
Um die unspezifische Bindung von Antikörpern an die Membran zu verhindern, wurde die
Membran mit Milchpulver-Blockierungslösung für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde
sie mit in Milchpulver-Blockierungslösung verdünntem Primär- (ÜN, 4°C, Rollinkubator) und
Sekundärantikörper (1 h, RT) inkubiert, wobei sie nach den einzelnen Inkubationsschritten
jeweils dreimal für 10 min mit TBS-T gewaschen wurde. Die in dieser Arbeit zur Immunodetektion von Proteinen auf einer Nitrozellulosemembran verwendeten Antikörper sind in
tabellarischer Form in Kapitel 4.4.5 aufgeführt. Zur Visualisierung der Proteine wurde die
Membran für 1 min mit ECL-Reagenz inkubiert und die entstehende Chemolumineszenz mit
Hilfe eines ECL-Chemolumineszenz-Film festgehalten.
5.4.2.
ELISA
In dieser Arbeit wurden verschiedene Sandwich-ELISA zum antikörperbasierten Nachweis
von Proteinen in Zellkulturüberständen verwendet. Hierzu wurden MaxiSorp™ 96-KavitätenFlachbodenplatten der Firma Nunc mit einem Erstantikörper zum Proteinnachweis
beschichtet. In die beschichteten Kavitäten wurde der zellfreie Zellkulturüberstand gegeben.
Anschließend wurden die gebunden Proteine mit Hilfe eines Nachweis-Antikörpers, der
gegen ein anderes Epitop als der Erste gerichtet ist, inkubiert. Dieser Zweitantikörper war
entweder direkt an das Enzym Meerrettichperoxidase gekoppelt oder das Enzym wurde in
einem weiteren Schritt mit Hilfe einer Biotin-Streptavidin-Interaktion an den Antikörper
gebunden. Die Meerettichperoxidase ist ein Enzym, welches genutzt werden kann, um die
Reaktion von Wasserstoffperoxid zu H2O zu katalysieren. Die hierbei freiwerdenden
Protonen oxidieren das farblose Chromogen Tetramethylbenzidin, welches ein blaues Endprodukt bildet. Nach Abstoppen der Reaktion durch Schwefelsäure bildet sich ein stabiler
gelber Farbkomplex, dessen Absorption bei 450 nm photometrisch analysiert werden kann.
Der entstandene Farbkomplex ist proportional zu der in den Überständen enthaltenen
Proteinmenge. Durch eine Eichreihe mit definierter Proteinmenge ist es möglich die
Proteinmenge in den Überständen exakt zu bestimmen.
- 46 -
- Methoden Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Menge von IL-2, IFN-, TNF-, Granzym B
und CCL5 (RANTES) in unverdünnten Zellkulturüberständen mit Hilfe der entsprechenden
DuoSet ELISA der Firma R&D Systems analysiert (Kap. 4.3). Die Versuchsdurchführung
erfolgte hierbei jeweils nach Angaben des Herstellers.
5.4.3.
Phosphorylierungs-Rasteranalyse (Phospho-Array-Analyse)
Dem zum Nachweis der Phosphorylierungszustände verschiedener Signalmoleküle verwendeten Proteome Profiler™ Array (Human Phospho-MAPK Array Kit) der Firma R&D Systems
liegt ein ähnliches Funktionsprinzip wie einem Sandwich-ELISA zugrunde. Auf einer
Nitrozellulosemembran befinden sich punktweise aufgetragene, für verschiedene Signalmoleküle spezifische Erstantikörper. Diese werden mit einem Zelllysat inkubiert, zu dem
phosphorylierungsspezifische Biotin-gekoppelte Antikörper hinzugegeben werden. Ungebundenes Material wird anschließend durch Waschen entfernt. Mit Hilfe von Streptavidingekoppelter HRP unter Verwendung einer wie in Kapitel 5.4.1 beschriebenen Chemolumineszenz-Reaktion kann der Grad der Phosphorylierung der verschiedenen Signalmoleküle
sichtbar gemacht werden.
Die für die Phospho-Array-Analyse verwendeten Lysate wurden aus T-Zellen gewonnen,
die entsprechend der in Kapitel 5.1.6 beschriebenen Methode zur Kurzzeitstimulation von
T-Zellen stimuliert wurden. Die Versuchsdurchführung erfolgte nach Angaben des Herstellers
(Kap. 4.3).
- 47 -
- Ergebnisse -
6. Ergebnisse
6.1.
6.1.1.
Suppressive Eigenschaften von T-Zellen
Das suppressive Potential von Treg und T-Zellen im Vergleich
In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass T-Zellen in der Lage sind die
Proliferation anderer Lymphozyten-Populationen zu supprimieren. Grundsätzlich kann die
Suppression von T-Zellen über verschiedene Mechanismen bewerkstelligt werden. Um eine
indirekte Einflussnahme durch DZ auf Responder T-Zellen (Traxlmayr et al. 2010)
auszuschließen, wurde die Interaktion von isolierten Responder- und T-Zellen untersucht.
Die solo- bzw. kokultiverten Zellpopulationen wurden in Abwesenheit von APZ polyklonal
durch anti-CD2,-3,-28 mAk-umhüllte A/E-Partikel stimuliert. Durch die A/E-Partikel wurden
die für die Aktivierung von T-Zellen notwendigen Signale in Form eines TZR-Stimulus und
eines CD28-Kostimulus vermittelt. Durch Analyse des 3H-Thymidineinbaus wurde die Proliferation bestimmt und untersucht, ob T-Zellen in der Lage sind die Proliferation von
Responder (CD4+CD25-) T-Zellen in vergleichbarer Weise wie Treg zu supprimieren. Die
Proliferation der Responder T-Zellen wurde durch Treg signifikant supprimiert, wobei die
Stärke der Suppression positiv mit der Anzahl verwendeter Treg korrelierte. Bei Kokultur von
Responder- mit T-Zellen kam es ebenfalls zu einer signifikanten Suppression der
Responder T-Zell-Proliferation, die ebenfalls positiv mit der Anzahl der T-Zellen korrelierte.
Diese Suppression war ähnlich stark ausgeprägt wie die Treg-vermittelte. Sowohl Treg als
auch T-Zellen wiesen, wenn sie in Abwesenheit anderer Zellen kultiviert wurden (ohne
Zusatz von IL-2), keine Proliferation auf (Abb. 6 A).
Bei Verwendung der
3
H-Thymidininkorporations-Methode ist eine Bestimmung der
Proliferation einzelner Populationen innerhalb eines Zellgemisches nicht möglich. Daher
wurde zusätzlich die Absolutzellzahl der kokultivierten Zellpopulationen unter Verwendung
der SCDA-Methode bestimmt. Die Bestimmung der Absolutzellzahl vitaler Zellen zeigte, dass
die Zellzahl der Responder T-Zellen in Kokultur im Vergleich zu der von Solokultivierten
signifikant verringert war (Abb. 6 B, linke Seite). Im Gegensatz zu solokultivierten T-Zellen,
wiesen T-Zellen die mit Responder T-Zellen kokultiviert wurden oder deren Zellkulturmedium mit IL-2 supplementiert wurde, eine deutliche Proliferation auf (Abb. 6 B, rechte
Seite). Lichtmikroskopisch konnte ebenfalls die Suppression von kokultivierter Responder
T-Zellen beobachtet werden. Bei Kokultur von Responder- und T-Zellen ließ sich
verglichen mit der Responder-Solokultur eine deutlich geringere Größe der Proliferationscluster erkennen (Abb. 6 C). Sowohl mit Hilfe der 3H-Thymidininkorportions-Methode, der
lichtmikroskopischen als auch der SCDA-Analyse zeigte sich, dass bei polyklonaler
- 48 -
- Ergebnisse -
Stimulation durch A/E-Partikel T-Zellen die Proliferation von Responder T-Zellen effektiv
A
% der Kontrolle (3H-TdR [cpm])
supprimieren konnten.
C
120
100
*
0,06
80
Resp
**
60
Kokultur Resp/
**
40
20
0
1:1
4:1
Treg
Resp
B
4:1
+IL-2
1:1
Resp
Resp
250
200
200
150
100
50
**
Absolutzellzahl x103 (SCDA)
Absolutzellzahl x103 (SCDA)
**
**
150
100
50
Abb. 6: Vergleich der suppressiven Aktivität von T- Zellen und Treg. Frisch isolierte T-Zellen
und Treg wurden alleine (unter Zusatz von 50 U/mL IL-2) oder zusammen mit negativ isolierten
+
Responder (CD4 CD25 ) T-Zellen kultiviert. Als Kontrolle wurden Responder T-Zellen ohne
regulatorische T-Zellen kultiviert. Sämtliche Zellen wurden mit A/E-Partikeln stimuliert. A) Die
3
Proliferation der solo- oder kokultivierten Zellen wurde nach drei Tagen anhand des H-Tymidin3
3
einbaus [ H-TdR] in die DNA in Form von experimentellen Triplikaten gemessen. Die H-Tymidininkorporation wurde in Relation zu der von Responder T-Zellen in Solokultur dargestellt (auf 100%
normalisiert). Abgebildet sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus mindestens vier
voneinander unabhängigen Experimenten. B) Die Proliferation der verschiedenen solo- und
kokultivierten Zellpopulationen 18 verschiedener Spender wurde durchflusszytometrisch durch
Bestimmung der Anzahl vitaler Zellen (Absolutzellzahl) nach sieben Tagen mit der SCDA-Methode
ermittelt. C) Lichtmikroskopische Darstellung (50x Vergrößerung) der kultivierten Zellen in den
Kavitäten der Zellkulturplatte am siebten Tag der Zellkultur. Jedes Symbol repräsentiert einen
Spender. Die einzelnen Datenpunkte entsprechen durch Vierfach- (Responder Solo- und Kokulturen)
bzw. Dreifachbestimmung ( Solokulturen) erhaltenen experimentellen Mittelwerten. Die
Gesamtmittelwerte sind durch Balken dargestellt. Sterne symbolisieren statistische Signifikanz gemäß
des studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01).
- 49 -
- Ergebnisse -
Expression löslicher Mediatoren bei Kokultur von - und Responder
6.1.2.
T-Zellen
T-Zellen können ähnlich wie Treg die Proliferation von Responder T-Zellen supprimieren.
Da Treg zudem in der Lage sind auch die Zytokinproduktion von Responder T-Zellen zu
inhibieren (Oberg et al. 2010; Shevach 2009), wurde untersucht, ob T-Zellen ebenfalls
einen suppressiven Einfluss auf deren Zytokin- bzw. Mediator-Produktion besitzen.
Unter Verwendung des multiplex Immunassays Cytometric Bead Array™ wurden die
Konzentrationen verschiedener löslicher Mediatoren in den Zellkulturüberständen von solound kokultivierten Zellen analysiert (Daten nicht gezeigt). Die Produktion relevanter
600
300
*
**
400
pg/mL
TNF-
IFN-
IL-2
500
n.s.
500
250
400
200
300
150
200
100
100
50
0
0
**
*
300
200
100
0
CCL5 (RANTES)
300
*
250
Granzym B
2500
*
*
n.s.
2000
pg/mL
200
1500
150
1000
100
50
0
500
0
Abb. 7: Freisetzung löslicher Mediatoren in Solo- und Kokulturexperimenten. Frisch isolierte
T-Zellen wurden in Medium vorinkubiert und anschließend zusammen mit Responder T-Zellen oder
alleine (in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2) kultiviert. Zur Stimulation der Zellen wurden A/E-Partikel
verwendet. Der Gehalt löslicher Mediatoren im Zellkulturmedium wurde an Tag 3 (IFN-, TNF-,
Granzym B) bzw. an Tag 4 (IL-2, CCL5) durch ELISA bestimmt. Jedes Symbol repräsentiert einen
Spender. Mittelwerte sind durch Balken dargestellt, Sterne symbolisieren statistische Signifikanz
gemäß des studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01), (n.s. = nicht signifikant).
- 50 -
- Ergebnisse -
Mediatoren wurde nachfolgend mit Hilfe eines enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
verifiziert. Hierbei wurden die proinflammatorischen Zytokine IFN- und TNF-, das
Leukozyten-attraktierende
Chemokin
CCL5 (RANTES),
die
Zytotoxizität-vermittelnde
Serinprotease Granzym B und der T-Zell-Wachstumsfaktor IL-2 analysiert. Solokultivierte
T-Zellen wiesen in Abwesenheit von IL-2 nur eine vergleichsweise schwache Produktion der
analysierten Mediatoren auf. Bei solokultivierten T-Zellen wurde diese daher im Weiteren
unter IL-2-Supplementierung untersucht. Die Menge von IFN- und TNF-, die im Überstand
mit der ELISA-Methode festgestellt wurden, waren bei solokultivierten - und Responder
T-Zellen vergleichbar hoch, bei kokultivierten Zellen waren sie insgesamt deutlich erhöht
(Abb. 7). Die Menge an Granzym B und CCL5, die von solokultivierten T-Zellen freigesetzt
wurde, lag deutlich über der von solokultivierten Responder T-Zellen. Bei Kokultur beider
Zellpopulationen war die Konzentration von IFN-, TNF-, CCL5 und Granzym B im
Zellkulturmedium höher als bei den Solokulturen (Abb. 7). Nur der im Überstand gemessene
Gehalt an IL-2 war bei Kokultur beider Zellpopulationen geringer als bei solokultivierten
Responder T-Zellen (Abb. 7).
IFN-
50
Granzym B
1200
1000
Diff. Mittel
40
800
30
600
20
400
10
200
0
0
1
2
3
4
5
-10
1
2
3
4
5
Tag
CCL3 (MIP-1)
250
Diff. Mittel
200
+ IL-2
150
100
Kokultur Resp
Resp
Kokultur
50
Resp
0
1
2
3
Tag
4
5
Abb. 8: Einfluss der Kokultivierung von - und Responder T-Zellen auf die Proteinexpression
löslicher Mediatoren. Frisch isolierte T-Zellen wurden zusammen mit Responder T-Zellen oder
alleine (in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2) kultiviert. Zur Stimulation der Zellen wurden A/E-Partikel
verwendet. Die Exozytose der Mediatoren wurde vier Stunden vor der Fixierung mit Hilfe von
Monensin blockiert. Die Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und der intrazelluläre Gehalt
verschiedener löslicher Mediatoren durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt ist der Verlauf der
Proteinexpression, repräsentiert durch die Mittelwerte der korrigierten mittleren Fluoreszenzintensität
von mindestens vier verschiedenen Spender.
- 51 -
- Ergebnisse -
Um zu untersuchen, ob beide Zellpopulationen gleichermaßen in Kokultur eine gesteigerte
Produktion der untersuchten Mediatoren aufwiesen, wurde deren intrazellulärer Gehalt unter
Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern durchflusszytometrisch bestimmt.
Anstatt von CCL5 wurde der Gehalt des Chemokins CCL3 (MIP-1) bestimmt, das wie CCL5
an den Chemokinrezeptor C-C chemokine receptor (CCR) 5 bindet. Zu Beginn der Solokultur
wiesen beide Zellpopulationen eine vergleichbare intrazelluläre Proteinexpression von CCL3
und IFN- auf, deren Menge dann im zeitlichen Verlauf abnahm. Der Gehalt von IFN- stieg
aber im Gegensatz zu dem von CCL3 ab dem zweiten Tag wieder an. Granzym B fand sich
vor allem in T-Zellen, wobei dessen intrazellulärer Gehalt im Laufe der Kultivierung
anstieg. Bei Kokultur beider Zellpopulationen war die Menge von intrazellulärem IFN- in
beiden Populationen im Vergleich zur Solokultivierung erhöht. In den kokultivierten Zellen
war der intrazelluläre Gehalt von Granzym B vor allem in T-Zellen und der von CCL3 in
Responder T-Zellen erhöht (Abb. 8).
Zusammenfassend war eine T-Zell-vermittelte Suppression der Mediator-Produktion von
Responder T-Zellen nicht festzustellen. Bei Kokultur wurde kein negativer, sondern eher ein
kostimulatorischer Einfluss auf die Menge der freigesetzten Mediatoren festgestellt. Einzig
die Menge an IL-2 im Zellkulturmedium war bei Kokultur beider Populationen verringert.
6.1.3.
Die Abhängigkeit der Suppression von Zellkontakt bzw. der
Kompetition um IL-2
T-Zellen proliferieren in Kokultur mit Responder T-Zellen (Abb. 6 C, rechte Seite). Sie
selbst produzieren allerdings, das von ihnen zur Proliferation benötigte IL-2 nicht in ausreichender Menge. Um zu untersuchen, ob sich die T-Zell-vermittelte Suppression der
Proliferation auf die Kompetition um das von den Responder T-Zellen produzierte IL-2
zurückführen lässt, wurde das Zellkulturmedium mit exogenem IL-2 supplementiert. Hierbei
proliferierten die Responder T-Zellen deutlich stärker als ohne exogenes IL-2. Wenn
zusätzlich T-Zellen präsent waren, ließ sich allerdings in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Kokultivierung (ohne Zugabe von exogenem IL-2) eine verringerte Proliferation
der Responder T-Zellen beobachten (Abb. 9 A, linke Seite). T-Zellen proliferierten in
Abwesenheit von IL-2 kaum, taten dies aber in Kokultur mit Responder T-Zellen. Nach
Zugabe von IL-2 kam es zu einer starken Proliferation der T-Zellen, die wiederum
gesteigert war, wenn diese mit Responder T-Zellen kokultiviert wurden (Abb. 9 A, rechte
Seite). Zwar war nach Supplementierung des Zellkulturmediums mit IL-2 die Proliferation
gesteigert, allerdings hatte die Supplementierung keinen Einfluss auf die T-Zell-vermittelte
Suppression.
- 52 -
- Ergebnisse -
Mit Hilfe von Doppelkammerexperimenten sollte geklärt werden, ob für die Suppression von
Responder T-Zellen der direkte Zellkontakt mit T-Zellen notwendig ist. Hierbei waren
beide Zellpopulationen durch eine für Zellen undurchlässige, jedoch für lösliche Mediatoren
permeable Membran getrennt. Bei der Mehrzahl der Spender (4/6) war die Proliferation der
Responder T-Zellen nicht beeinträchtigt, wenn sie auf diese Weise mit T-Zellen kokultiviert
wurden (Abb. 9 B). Waren die beiden Zellpopulationen durch eine semipermeable Membran
voneinander getrennt, ließ sich demzufolge also keine Suppression der Responder T-Zellen
beobachten.
B
A
Resp
350
300
100
Absolutzellzahl x103 (SCDA)
Absolutzellzahl x103 (SCDA)
50
120
250
80
200
60
150
40
100
20
50
Resp
+IL-2
40
30
20
10
Resp
Resp
Resp
Resp
+IL-2
Abb. 9: Vermittlung der Suppression. Frisch isolierte T-Zellen wurden zusammen mit Responder
T-Zellen oder alleine (in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2) kultiviert. Zur Stimulation der Zellen wurden
A/E-Partikel verwendet. Die Proliferation der einzelnen Zellpopulationen wurde nach sieben Tagen
durchflusszytometrisch durch Bestimmung der Anzahl vitaler Zellen (Absolutzellzahl) mit der SCDAMethode ermittelt. Jedes Symbol repräsentiert einen Spender. Die einzelnen Datenpunkte
entsprechen durch Vierfach- (Responder Solo- und Kokulturen) bzw. Dreifachbestimmung ( Solo
Kulturen) erhaltenen experimentellen Mittelwerten. A) Das Zellkulturmedium der Kokultur wurde
teilweise mit IL-2 (50 U/mL) supplementiert. B) Die Zellpopulationen wurden in einem Doppelkammerexperiment durch eine für lösliche Mediatoren permeable Membran (0,2 µm Porengröße) voneinander
getrennt. Bestimmt wurde die Absolutzellzahl der in der unteren Kammer kultivierten Responder TZellen.
6.1.4.
Die Expression suppressiver und kostimulatorischer Oberflächenmoleküle
Da die vorangegangen Doppelkammerexperimente den Schluss nahe legten, dass für die
T-Zell-vermittelte Suppression ein direkter Zellkontakt notwendig ist, wurde die Expression
verschiedener Oberflächenmoleküle, die bekanntermaßen an der Immunregulation beteiligt
sein können, auf solo- und kokultivierten Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Für das
Verständnis der suppressiven Interaktion ist (besonders) die Oberflächenexpression der
- 53 -
- Ergebnisse -
folgenden Oberflächenmoleküle auf kokultivierten Zellen von Bedeutung. Die B7-Moleküle
CD80 und CD86 sind sowohl Liganden des positiv-kostimulatorischen Rezeptors CD28 als
auch des negativ-kostimulatorischen Rezeptors CTLA-4 (Collins et al. 2002). CD80 und
CD86 wurden vor allem auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert. Auf mit Responder TZellen kokultivierten T-Zellen war die CD80-Expression geringer als auf solokultivierten
T-Zellen. Auf kokultivierten T-Zellen wies diese einen kurvenförmigen Verlauf mit der
höchsten Expression an Tag vier auf, während sie bei solokultivierten deutlich höher war und
nicht wieder zurückging. Die CD86-Oberflächenexpression stieg vom vierten bis zum siebten
Tag sowohl bei solo- als auch kokultivierten Zellen an (Abb. 10 A, B). CD28 wurde zwar auch
auf der Oberfläche von T-Zellen nachgewiesen, war jedoch deutlich stärker auf der von
Responder T-Zellen vorhanden. In Kokultur mit T-Zellen war die Oberflächenexpression
von CD28 auf Responder T-Zellen signifikant reduziert (Abb. 10, Abb. 14). CTLA-4 wies
einen kurvenförmigen Verlauf der Oberflächenexpression mit einem Maximum zwischen dem
dritten und vierten Tag der Solo- bzw. Kokultur sowohl auf als auch von Responder TZellen auf. Der Vergleich von kokultivierten und solokultivierten Zellpopulationen zeigte, dass
CTLA-4 in Kokultur auf beiden Populationen stärker exprimiert war (Abb. 10 A, B, Abb. 14).
Das Oberflächenmolekül PD-1 vermittelt ebenfalls ein negatives immunregulatorisches
Signal, wenn der Interaktionspartner PD-L1 an dieses bindet (Francisco et al. 2010). In
Kokultur wurde PD-1 zwar auch auf T-Zellen, aber vor allem auf Responder T-Zellen
exprimiert, während PD-L1 auf beiden Zellpopulationen gleichermaßen vorhanden war (Abb.
10 B). Bei Kokultur beider Zellpopulationen wurden PD-1 und PD-L1 im Vergleich zur
Solokultur auf T-Zellen stärker und auf Responder T-Zellen schwächer exprimiert.
Besonders deutlich ist der Anstieg der PD-L1-Expression auf kokultivierten T-Zellen (Abb.
10 A, B, Abb. 14). Der zeitliche Verlauf der Oberflächenexpression von sowohl PD-L1 als
auch PD-1 war kurvenförmig mit dem höchsten Punkt zwischen Tag drei und vier.
Die für APZ typische Expression der Moleküle HLA-DR und CD83 ließ sich bei kokultivierten
Zellen auf beiden Populationen beobachten, wobei die Expression von HLA-DR auf
T-Zellen stärker ausgeprägt war (Abb. 11 A). Die Expression von CD83 wies auf solo- und
kokultivierten Responder T-Zellen sowie auf solokultivierten T-Zellen einen kurvenförmigen Verlauf mit der höchsten Expression zwischen Tag drei und vier auf. Auf
solokultivierten T-Zellen stieg die Expression bis zum Tag sieben an und war stärker als in
der Kokultur. HLA-DR zeigte auf T-Zellen einen ähnlichen Oberflächenexpressionsverlauf
wie CD86, mit einem starken Anstieg der Expression zwischen Tag vier und sieben (Abb.
11 A, B).
- 54 -
- Ergebnisse -
A
CD152 (CTLA-4)
Diff. Median
120
1200
** **
1000
15
10
*
5
**
*
**
*
0
80
600
60
400
40
200
20
1
2
3
4
7
1
Diff. Median
**
**
1
2
3
2
3
4
7
0
2
4
7
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
3
4
7
PD-L1
CD86
*
0
*
0
0
CD80
**
**
**
100
800
0
0
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
PD-1
CD28
20
50
**
40
**
30
20
*
*
10
0
0
1
2
3
4
0
7
1
2
3
4
7
Tag
B
Diff. Median
CD152 (CTLA-4)
CD28
20
1000
15
800
*
**
*
600
400
5
1
2
3
4
20
15
10
**
5
**
**
0
0
1
2
3
4
7
0
0
7
CD80
20
-5
*
0
0
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
**
40
200
*
**
80
60
*
10
0
Diff. Median
PD-1
100
1
2
3
4
7
CD86
*
**
*
0
1
2
3
4
0
2
35
30
25
20
15
10
5
0
7
**
0
7
3
4
PD-L1
1
2
3
4
7
Tag
+ IL2
Resp
Resp
Kokultur
Kokultur
Resp
Abb. 10: Oberflächenexpression suppressiver und kostimulatorischer Moleküle der B7- bzw.
CD28-Familie auf Responder- und T-Zellen in Solo- und Kokultur. Frisch isolierte T-Zellen
wurden zusammen mit Responder T-Zellen oder alleine (in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2) kultiviert.
Die Stimulation der Zellen erfolgte mit A/E-Partikeln. Verschiedene Oberflächenmoleküle wurden durch
spezifische Fluorochrom-gekoppelte mAk markiert. Dargestellt ist der Expressionsverlauf
verschiedener Oberflächenmoleküle, repräsentiert durch die Mittelwerte der korrigierten medianen
Fluoreszenzintensität verschiedener Spender (mindestens fünf der Spender entsprechen den in Abb.
14 dargestellten). Sterne symbolisieren statistisch signifikante Unterschiede zwischen der Oberflächenexpression auf - und Responder T-Zellen gemäß des studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05),
(** = p ≤ 0,01).
- 55 -
- Ergebnisse -
A
*
Diff. Median
1000
800
*
25
*
30
10
*
0
0
1
20
5
**
10
0
0
2
3
CD39
4
7
-5
250
10
200
8
150
6
100
4
50
2
**
40
600
400
60
50
20
15
200
Diff. Median
TIM-3
CD83
HLA-DR
1200
0
1
2
3
LAP
4
0
7
2
+ IL2
3
4
7
Resp
0
0
0
2
3
4
0
7
2
3
4
7
Tag
B
HLA-DR
**
1200
Diff. Median
1000
TIM-3
CD83
20
60
800
400
0
0
1
**
*
2
3
30
20
5
**
200
10
0
4
0
0
7
1
2
-5
CD39
**
40
10
600
**
50
15
3
4
7
0
2
3
4
7
LAP
10
Diff. Median
80
8
60
Resp
Kokultur
6
40
4
20
2
0
Kokultur
Resp
0
0
2
3
4
7
0
2
3
4
7
Tag
Abb. 11: Expression weiterer mit immunregulatorischen Funktionen assoziierter Oberflächenmoleküle auf Responder- und T-Zellen in Solo- und Kokultur. Frisch isolierte T-Zellen wurden
zusammen mit Responder T-Zellen oder alleine (in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2) kultiviert. Zur
Stimulation der Zellen wurden A/E-Partikel verwendet. Die jeweiligen Oberflächenmoleküle wurden
durch spezifische Fluorochrom-gekoppelte mAk markiert. Dargestellt ist der Verlauf der Oberflächenexpression verschiedener Moleküle, repräsentiert durch die Mittelwerte der korrigierten medianen
Fluoreszenzintensität verschiedener Spender. Sterne symbolisieren statistisch signifikante Unterschiede zwischen der Oberflächenexpression auf - und Responder T-Zellen gemäß des
studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01).
Des Weiteren wurde auch die Oberflächenexpression der immunregulatorisch bedeutenden
Moleküle T cell immunoglobulin mucin-3 (TIM-3), CD39 und LAP auf T-Zellen untersucht.
TIM-3, welches vor allem mit der negativen Regulation der Th1-Antwort in Verbindung
gebracht wird (Zhu et al. 2005), war sowohl auf der Oberfläche von solo- als auch
kokultivierten - und Responder T-Zellen vorhanden. Die Expression war ab dem zweiten
Tag der Kultivierung nachweisbar und stieg bis zum siebten Tag an. In Kokultur war TIM-3
- 56 -
- Ergebnisse -
stärker auf - als auf Responder T-Zellen exprimiert (Abb. 11). Die Ektonukleotidase CD39
spaltet extrazelluläres als Entzündungsmediator relevantes ATP und wird mit der suppressiven Kapazität von Treg in Verbindung gebracht (Borsellino et al. 2007; Deaglio et al. 2007;
Kobie et al. 2006). Eine starke Expression von CD39 wurde sowohl auf solo- als auch in
kokultivierten Zellen auf T-Zellen festgestellt. Die Expression stieg auf solo- und kokultivierten T-Zellen zwischen dem vierten und siebten Tag deutlich an. Responder T-Zellen
wiesen nur in Kokultur eine, wenn auch wesentlich schwächere Expression auf (Abb. 11). Mit
Hilfe von LAP kann TGF- membranassoziiert präsentiert werden und so regulatorisch
wirken (Hyytiainen et al. 2004). LAP konnte auf - und Responder T-Zellen nur sehr
schwach exprimiert nachgewiesen werden. Die Expression wies hierbei einen kurvenförmigen Verlauf mit einem Höhepunkt an Tag vier auf (Abb. 11).
Die deutlichsten Unterschiede zwischen den beiden Zellpopulationen bezüglich der
Oberflächenexpression der analysierten Moleküle waren die starke Expression von CD28
und PD-1 auf den Responder- und die von CD39, CD86 und HLA-DR auf den T-Zellen.
6.1.5.
Funktionelle Analyse suppressiver Oberflächenmoleküle
Weiterhin sollte geklärt werden, ob es zur Interaktion der verschiedenen untersuchten,
potentiell immunregulatorischen Oberflächenmoleküle kommt bzw. ob diese auch funktionell
relevant ist. Hierfür wurde bei kokultivierten - und Responder T-Zellen selektiv die Interaktion zwischen den verschiedenen Partnermolekülen unterbunden und untersucht, ob dies
Auswirkungen auf das suppressive Potential der T-Zellen hatte. Um die Interaktion
zwischen CD80 bzw. CD86 und CTLA-4 zu unterbinden wurden blockierende mAk (antiCTLA-4, anti-CD80, anti-CD86) sowie ein CTLA-4/Fc-Fusionsprotein verwendet. Sowohl die
Zugabe von anti-CTLA-4 mAk als auch von anti-CD86 mAk verstärkte die Proliferation der
Responder T-Zellen, wobei der anti-CTLA-4 mAk außerdem die Proliferation der T-Zellen
steigerte. Der anti-CD80 mAk ließ bei beiden Zellpopulationen keinen Einfluss auf die
Proliferation erkennen. In Anwesenheit des CTLA-4/Fc-Fusionsproteins war die Proliferation
der T-Zellen gesteigert, während die der Responder T-Zellen verringert war (Abb. 12 A).
Um die Interaktion zwischen PD-L1 und PD-1 zu unterbinden wurden ebenfalls blockierende
mAk (anti-PD-1, anti-PD-L1) und ein Fusionsprotein verwendet (PD-1/Fc). Der gegen PD-L1
gerichtete mAk hatte einen deutlich positiven Effekt auf die Responder T-Zell-Proliferation,
während er keinen auf die Proliferation von T-Zellen aufwies. Der anti-PD-1 mAk besaß
keinen Einfluss auf die Proliferation der Zellpopulationen und das PD-1/Fc-Fusionsprotein
beeinflusste die Proliferation beider Zellpopulationen negativ (Abb. 12 A). Ob die verwendete
blockierende Entität spezifisch die Proliferation einer Zellpopulation bzw. die Suppression der
- 57 -
- Ergebnisse -
K
Resp
B
K
B
KB
CTLA-4/Fc
200
250
200
150
Verhältnis
100%
*
K
*
200
150
60%
100
100
40%
50
20%
100%
**
0,10
60%
400
300
40%
200
200
100
CD80
400
500
20%
0%
n.s.
100%
n.s.
300
Prozentualer Anteil
Absolutzellzahl x103 (SCDA)
*
80%
600
400
n.s.
300
100
200
80%
150
60%
100
40%
n.s.
300
20%
0,06
0%
n.s.
n.s.
100%
n.s.
300
300
200
200
100
100
PD-L1
1200
800
600
60%
200
20%
0%
CD86
400
600
200
400
40%
100
100
300
n.s.
100%
PD-1
400
500
400
200
400
KB
50
n.s.
80%
200
500
B
250
n.s.
0%
CTLA-4
800
600
50
Absolutzellzahl x103 (SCDA)
0,08
400
K
100
50
500
B
Verhältnis
PD-1/Fc
80%
150
Resp
1000
800
Prozentualer Anteil
A
80%
60%
40%
20%
0%
100%
*
**
80%
60%
600
400
200
40%
20%
0%
0,08
100%
**
80%
60%
200
40%
100
20%
0%
B
Abb. 12: Einfluss verschiedener blockierender Moleküle auf die Proliferation von - und
Responder T-Zellen in Kokultur. Frisch isolierte T-Zellen wurden mit Responder T-Zellen kokultiviert. Die Zellen wurden polyklonal unter Verwendung von plattengebundenem anti-CD3 und löslichem
anti-CD28 mAk stimuliert. Blockierende mAk und blockierende Fusionsproteine (= B) oder Kontrollantikörper bzw. -fusionsproteine (= K) wurden mit einer Konzentration von 5 µg/mL zeitgleich mit antiCD3 und anti-CD28 mAk an die Zellkulturplatten gebunden. A) Die Proliferation der einzelnen Zellpopulationen wurde mit der SCDA-Methode anhand der Absolutzellzahl an Tag 6 ermittelt. Jedes
Symbol repräsentiert einen Spender. Die einzelnen Datenpunkte stellen jeweils durch Vierfachbestimmung erhaltene experimentelle Mittelwerte dar. Die Gesamtmittelwerte sind durch Balken dargestellt.
Sterne symbolisieren statistische Signifikanz gemäß des studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05),
(** = p ≤ 0,01), (n.s. = nicht signifikant). K = Kontrolle, B = Blockierende Entität. Das prozentuale
Verhältnis der Zellpopulationen zueinander ist als Balkendiagramm dargestellt. Schwarze Balken
entsprechen den Mittelwerten des Responder-, graue Balken denen des T-Zell-Anteils. B)
Lichtmikroskopische Darstellung (50x Vergrößerung) der kultivierten Zellen in den Kavitäten der
Zellkulturplatte, am sechsten Tag der Zellkultur.
- 58 -
- Ergebnisse -
Responder T-Zellen beeinflusste, ließ sich an einer Verschiebung des Verhältnisses der
Populationen zueinander erkennen. Zu einer signifikanten Verschiebung und einem erhöhten
relativen T-Zell-Anteil kam es nur bei Verwendung des CTLA-4/Fc-Fusionsproteins. Die
gegen CTLA-4, CD86 und PD-L1 gerichteten blockierenden mAk führten zu einer
signifikanten Verschiebung des Verhältnisses zwischen den Zellpopulationen, wobei bei
diesen der Anteil der Responder T-Zellen erhöht war (Abb. 12, A, Säulendiagramme). Dies
war mit einer geringeren Suppression durch die T-Zellen gleichzusetzen. Bei
lichtmikroskopischer Untersuchung konnte man im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollen
bzw. anderen blockierenden Entitäten ebenfalls einen positiven Effekt der anti-CTLA-4-, antiCD86-
und
anti-PD-L1 mAk
in
Form
einer
erkennbar
gesteigerten
Anzahl
von
Proliferationsclustern beobachten (Abb. 12 A).
Die in Abbildung 12 dargestellten Ergebnisse der Studien mit blockierenden Entitäten sind
schematisch in Tabelle 1 zusammengefasst. Hierbei stellen Pfeile die Modulation der
Proliferation bzw. Suppression relativ zu der entsprechenden Kontrolle dar (↓ = herunter;
↑ = herauf; ~ = keine signifikante Regulation). Das Verhältniszwischen - und Responder
T-Zellen bzw. dessen Verschiebung ist durch gerichtete Pfeile dargestellt (Verschiebung zu:
↗ = Responder, ↖ = , ↔ = keine deutliche Veränderung).
Tab. 1: Einfluss verschiedener blockierender Moleküle auf die Proliferation von - und
Responder T-Zellen in Kokultur:
Proliferation
Blockierendes
Molekül
relativ
CD4
CTLA-4
CTLA-4/Fc
CD80
CD86
PD-L1
PD-1
PD-1/Fc
↑
↑
~
~
~
~
↓
↗
↖
↔
↗
↗
↔
↔
↑
↓
~
↑
↑
~
↓
- 59 -
- Ergebnisse -
6.2. TLR(2)-Liganden-induzierte Modulationen
6.2.1.
Der
Einfluss
von
TLR2-Liganden
auf
die
Proliferation
und
Suppressivität
Die Treg-vermittelte Suppression kann durch TLR-Liganden aufgehoben werden. So konnten
Oberg et al. eine teilweise Aufhebung der Suppression der Responder (CD4+CD25-) T-ZellProliferation beobachten, wenn die Treg mit einer Mischung verschiedener TLR2-Liganden
vorinkubiert wurden (Oberg et al. 2010). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss
verschiedener TLR-Liganden auf die Proliferation und das suppressive Potential von
T-Zellen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass TLR2-Liganden im Gegensatz zu anderen
TLR-Liganden die suppressive Funktion und Proliferation von T-Zellen beeinflussten (Abb.
13 A, Daten nicht gezeigt). Die TLR2-Oberflächenexpression konnte auf frisch isolierten
Abb. 13: Einfluss von TLR2-Liganden auf die Proliferation von T-Zellen bzw. auf deren
suppressives Potential. Frisch isolierte T-Zellen wurden in Zellkulturmedium oder unter Zusatz des
TLR2-L-Gemisches vorinkubiert (22 h) und anschließend zusammen mit Responder T-Zellen oder alleine
(in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2) kultiviert. Die Zellen wurden unter Verwendung von A/E-Partikeln (A, B)
oder von plattengebundenem anti-CD3- und löslichem anti-CD28 mAk (C) stimuliert. A) Die Proliferation
wurde mit der SCDA-Methode anhand der Anzahl vitaler Zellen (Absolutzellzahl) an Tag 7 ermittelt. B) Die
TLR2-Oberflächenexpression wurde auf frisch isolierten T-Zellen durch einen Fluorochrom-gekoppelten
anti-TLR2 mAk markiert (durchgängige Linie) und in Relation zu einem Kontollantikörper gleichen Isotyps
(gepunktete Linie) in einem Histogramm dargestellt. C) Lichtmikroskopische Darstellung (50x Vergrößerung) der kultivierten Zellen in den Kavitäten der Zellkulturplatte. Jedes Symbol repräsentiert einen
Spender. Die einzelnen Datenpunkte stellen jeweils durch Vierfach- (Responder Solo- und Kokulturen) bzw.
Dreifachbestimmung ( Solokulturen) erhaltene experimentelle Mittelwerte dar. Die Gesamtmittelwerte (18
unabhängige Experimente) sind durch Balken dargestellt. Sterne symbolisieren statistische Signifikanz
gemäß des studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01).
- 60 -
- Ergebnisse -
T-Zellen nachgewiesen werden (Abb. 13 B). Diese Beobachtung deckt sich mit Ergebnissen
von Pietschmann et al., denen zufolge T-Zellen TLR1, -2 und -6 exprimieren können
(Pietschmann et al. 2009). Da TLR2 mit TLR1 oder TLR6 als Heterodimer vorliegen kann,
wurden die T-Zellen mit einer Mischung verschiedener TLR2-Liganden, die von unterschiedlichen TLR2-Heterodimeren erkannt werden, vorinkubiert [Pam2CSK4 (TLR2/6)
Pam3CSK4 (TLR1/2, vermutlich auch TLR2/10) und FSL-1 (TLR2/6)] vorinkubiert. Wenn die
T-Zellen mit dem TLR2-Liganden-Gemisch vorinkubiert worden waren, wiesen
kokultivierte Responder T-Zellen nach sieben Tagen der Kokultivierung im Vergleich zur
Kokultur mit Medium-vorinkubierten T-Zellen eine signifikant höhere Zellzahl auf (Abb.
13 A). Die Vorinkubation übte auch auf die Proliferation der T-Zellen selbst einen positiven
Effekt aus. TLR2-Liganden-vorinkubierte T-Zellen wiesen nach sieben Tagen der Solobzw. Kokultur eine höhere Zellzahl im Vergleich zu Medium-vorinkubierten T-Zellen auf.
Es war bei TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen sogar eine leicht erhöhte Zellzahl
festzustellen, wenn diese alleine, aber ohne Supplementierung des Mediums mit IL-2,
kultiviert wurden (Abb. 13 A).
Lichtmikroskopisch ließ sich dieser proliferationssteigernde Effekt bei solokultivierten
T-Zellen ebenfalls erkennen. Sowohl die unter Verwendung von plattengebundenem antiCD3- und löslichem anti-CD28 mAk stimulierten als auch die mit A/E-Partikeln stimulierten
T-Zellen wiesen deutlich mehr bzw. größere Proliferationscluster auf, wenn diese zuvor mit
TLR2-Liganden vorinkubiert worden waren (Abb. 13 C). Die Vorinkubation mit TLR2Liganden beeinflusste die Suppressivität der T-Zellen negativ und verstärkte gleichzeitig
deren Proliferation.
6.2.2.
TLR2 abhängige Modulation von Oberflächenmolekülen
Da eine TLR2-Liganden-induzierte Abschwächung der T-Zell-vermittelten Suppression
beobachtet wurde, sollte untersucht werden, ob diese Modulation mit einer veränderten
Expression der zuvor untersuchten immunregulatorischen Oberflächenmoleküle (Abb. 10,
Abb. 12) korrelierte.
Direkt nach Vorinkubation der T-Zellen mit TLR2-Liganden vor Beginn der Kokulturexperimente war das aktivierungsassoziierte Molekül CD69 signifikant vermehrt auf deren Oberfläche zu finden (Abb. 14). Die Expression der anderen Oberflächenmoleküle wurde
detailliert zum Zeitpunkt deren höchster Expression in Kokultur betrachtet (Abb. 10). Durch
TLR2-Liganden-Vorinkubation der T-Zellen wurde die CTLA-4-Expression auf solo- oder
kokultivierten - oder Responder T-Zellen nicht signifikant beeinflusst. Allerdings konnte
trotzdem in den meisten Fällen bei kokultivierten vorinkubierten T-Zellen ein negativer
Effekt auf die CTLA-4-Expression festgestellt werden (7/9 Spender). Bei mit diesen kokulti-
- 61 -
- Ergebnisse -
CD69, Tag0
CTLA-4, Tag4
Resp
30
16
1400
0,09
n.s.
25
1000
12
15
800
8
600
10
6
5
200
2
M
0
T
M
T
T
M
M
0
T
T
+IL-2
80
70
*
M
T
+IL-2
Resp
HLA-DR, Tag7
Resp
Resp
4000
**
3500
*
n.s.
0,08
3000
*
50
80
4500
*
60
100
T
M
PD-L1, Tag4
Resp
120
Diff. Median
M
PD-1, Tag4
2500
**
40
60
40
30
1500
20
0,06
*
0
1000
10
M
T
T
M
M
T
0
M
T
+IL-2
M
T
50
*
0,08
*
50
n.s.
n.s.
40
n.s.
n.s.
30
n.s.
15
**
**
20
*
10
0
10
5
T
T
M
M
T
0
M
T
T
M
M
T
0
M
T
Resp
Resp
60
20
n.s.
+IL-2
T
+IL-2
70
25
n.s.
M
Resp
80
0,08
30
40
T
M
CD86, Tag7
Resp
35
50
n.s.
T
+IL-2
40
M
M
45
60
10
0
CD83, Tag4
Resp
70
-10
T
M
Resp
CD80, Tag4
20
**
Resp
30
n.s.
n.s.
500
80
2000
n.s.
*
20
Diff. Median
n.s.
Resp
140
**
400
4
0
**
*
Diff. Median
20
10
1200
n.s.
14
Resp
1600
n.s.
*
*
18
CD28, Tag7
**
20
Resp
T
M
M
T
+IL-2
Resp
+IL-2
Abb. 14: TLR2-Liganden-abhängige Modulation von Oberflächenmolekülen. Frisch isolierte TZellen wurden in Zellkulturmedium (= M) oder unter Zusatz des TLR2-L-Gemisches (= T) vorinkubiert und
anschließend zusammen mit Responder T-Zellen oder alleine (in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2)
kultiviert. Zur Stimulation der Zellen wurden A/E-Partikel verwendet. Das Vorhandensein der
verschiedenen Moleküle wurde zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert. Dargestellt ist der Zeitpunkt mit
der jeweils stärksten Oberflächenexpression. Oberhalb der Diagramme ist angegeben auf welche
Zellpopulation sich die dargestellten Expressionsdaten beziehen. Dargestellt ist die korrigierte mediane
Fluoreszenzintensität (Isotypkontrollen wurden subtrahiert). Jedes Symbol repräsentiert einen Spender.
Mittelwerte sind durch Balken dargestellt. Sterne symbolisieren statistische Signifikanz gemäß des
studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01), (n.s. = nicht signifikant).
- 62 -
- Ergebnisse -
vierten Responder T-Zellen konnte ein solcher negativer Effekt (8/9 Spender) ebenfalls
beobachtet werden (Abb. 14). Die TLR2-Liganden-Vorinkubation führte weiterhin sowohl auf
den - als auch auf den mit diesen kokultivierten Responder T-Zellen zu einer signifikanten
Hochregulation der CD28-Oberflächenexpression. Für solokultivierte T-Zellen wurde dies
nicht festgestellt.
Auf solokultivierten T-Zellen wurde die Expression von CD80 und CD83 durch TLR2Liganden-Vorinkubation der T-Zellen verstärkt. In Kokultur mit Responder T-Zellen war auf
der Oberfläche der T-Zellen wesentlich weniger CD80 und CD83 vorhanden. Diese Oberflächenexpression wurde durch TLR2-Liganden-Vorinkubation nicht verstärkt. Im Gegensatz
zu CD80/-83 war die CD86-Oberflächenexpression auf TLR2-Liganden-vorinkubierten
T-Zellen in Kokultur signifikant und in Solokultur ebenfalls deutlich gesteigert. Auf mit diesen
kokultiverten Responder T-Zellen war die CD86-Oberflächenexpression ebenfalls positiv
beeinflusst. Sie blieb allerdings insgesamt deutlich geringer als die Expression auf
T-Zellen (Abb. 14). Bei vier von fünf Spendern war weniger PD-1 auf der Oberfläche von
kokultivierten TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen vorhanden. Ebenso war PD-1 auch
auf der Oberfläche von mit diesen kokultivierten Responder T-Zellen signifikant reduziert. Auf
die ohnehin geringe PD1-Oberflächenexpression solokultivierter T-Zellen zeigte die
Vorinkubation keinen Einfluss. Im Unterschied zu PD-1 hatte die Vorinkubation mit TLR2Liganden einen verstärkenden Einfluss auf die PD-L1-Oberflächenexpression. Sowohl auf
TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen als auch auf mit diesen kokultivierten Responder
T-Zellen war die Expression signifikant erhöht. Bei solokultivierten T-Zellen ließ sich keine
Veränderung feststellen (Abb. 14). Das MHC Klasse II Molekül HLA-DR war auf TLR2Liganden-vorinkubierten T-Zellen in Solokultur signifikant und in Kokultur deutlich stärker
exprimiert. Die schwache HLA-DR-Oberflächenexpression auf Responder T-Zellen war bei
Kokultivierung mit TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen signifikant verstärkt.
Zusammenfassend zeigte sich, dass die Expression verschiedener immunregulatorischer
Oberflächenmoleküle bei Kokultivierung mit TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen nicht
nur auf diesen selbst, sondern ebenfalls auf den kokultivierten Responder T-Zellen deutlich
beeinflusst wurde. Es zeigte sich auf beiden Zellpopulationen eine verstärkte Expression von
CD28, HLA-DR, PD-L1 und CD86 sowie eine verringerte von PD-1- und CTLA-4. Die
Ergebnisse der TLR2-Liganden-abhängigen Modulation von Oberflächenmolekülen (Abb. 14)
sind schematisch in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Oberflächenexpression wurde anhand
der erhaltenen Mittelwerte der medianen Fluoreszenzintensitäten quantifiziert und tabellarisch dargestellt (- = <5; + = 5-30; ++ = 30-200; +++ = >200). Pfeile zeigen die TLR2Liganden-abhängige Modulation der Oberflächenexpression an (↓ = herunter; ↑ = herauf;
~ = keine signifikante Regulation). Der Expressionsverlauf ist durch gerichtete Pfeile
dargestellt. Die Ziffern symbolisieren die entsprechenden Zeitpunkte.
- 63 -
- Ergebnisse -
Tab. 2: Oberflächenexpression und TLR2-Liganden abhängige Modulation verschiedener
Oberflächenmoleküle im Suppressions-Assay:
Oberflächenmolekül
CD28
CD69
CD80
CD83
CD86
CTLA-4
HLA-DR
PD-1
PD-L1
6.2.3.
Expressionsverhältnis
Responder
Resp
Resp/Med
Resp/TLR2-L
++
++
+/+
+
+/++
++
+
++
+/+/+
+/++
+
↑
~
~
↑
~
~
↑
↓
↑
Expressionsverlauf
-Med/
Resp
CD4>
CD4>
>CD4
~CD4
>CD4
>CD4
>CD4
CD4>
CD4~
~+
++
+
+
++
+
++
++
+
TLR2L/Resp
~
~↑ Tag0
~
~
↑
↓
↑
↓
↑
-Med
+IL-2
+/++
++
+
+
+
++
+
+
TLR2-L
+IL-2
~
~↑ Tag0
~
↑
↑
~
↑
~
↑
7
↗
1,2
↗ ↘
4
↗↘
3,4
↗ ↘
7
↗
3,4
↗ ↘
7
↗
3,4
↗ ↘
3,4
↗ ↘
Der Einfluss von TLR2-Liganden auf die Produktion und Freisetzung
verschiedener löslicher Mediatoren
Wie von Pietschmann et al. bereits gezeigt, kann die Freisetzung der löslichen Mediatoren
IFN-, CXCL8 (IL-8) und CCL5 in T-Zellen durch TLR2-Liganden verstärkt werden
(Pietschmann et al. 2009). In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Vorinkubation
von T-Zellen mit TLR2-Liganden die Produktion und Freisetzung dieser und weiterer
löslicher Mediatoren beeinflusst. Hierfür wurden T-Zellen in Solokultur und in Kokultur mit
Responder T-Zellen betrachtet. Die intrazelluläre durchflusszytometrische Analyse ließ
erkennen, dass durch die TLR2-Liganden-Vorinkubation von T-Zellen sowohl deren
eigene Mediator-Produktion als auch die kokultivierter Responder T-Zellen verstärkt wurde.
Die Produktion in beiden Zellpopulationen war in Relation zur Kokultur mit Mediumvorinkubierten Zellen gesteigert (Daten nicht gezeigt). Die Modulation der Freisetzung von
löslichen Mediatoren in das Zellkulturmedium in Folge der TLR2-Liganden-Vorinkubation
wurde in Relation zu der Medium-vorinkubierter T-Zellen mit Hilfe von ELISA bestimmt.
Bei Kokultivierung mit Responder Zellen war die Konzentration von IFN-, TNF-, IL-2 und
Granzym B signifikant und die von CCL5 bei sämtlichen Spendern erhöht. Die Solokultur
TLR2-Liganden-vorinkubierter T-Zellen zeigte einen signifikanten Anstieg der Konzentration von IFN- und TNF-, während die von CCL5 und Granzym B weitgehend konstant
blieb (Abb. 15). Insgesamt ließ sich ein deutlich verstärkender Einfluss der TLR2-LigandenVorinkubation auf die Freisetzung unterschiedlicher Mediatoren feststellen. Dieser Anstieg
war bei kokultivierten Zellpopulationen wesentlich stärker ausgeprägt als bei solokultivierten.
- 64 -
- Ergebnisse IFN-
IL-2
500
450
**
350
**
**
*
1000
400
pg/mL
300
**
**
**
TNF-
1200
0,12
**
250
800
200
600
150
400
100
300
250
200
150
100
*
200
50
50
**
0
M
0
T
M
T
M
+IL-2
Resp
M
T
+IL-2
Resp
Granzym B
6000
*
*
5000
**
**
*
0,13
300
4000
250
pg/mL
T
CCL5 (RANTES)
350
M
Resp
400
0
T
200
3000
n.s.
150
2000
100
1000
50
0
0,11
M
T
M
T
0
M
Resp
T
M
T
+IL-2
Resp
+IL-2
Abb. 15: Einfluss von TLR2-Liganden auf die Freisetzung löslicher Mediatoren in Solo- und
Kokulturexperimenten. Frisch isolierte T-Zellen wurden in Zellkulturmedium (= M) oder unter
Zusatz des TLR2-L-Gemisches (= T) vorinkubiert und anschließend zusammen mit Responder
T-Zellen oder alleine (in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2) kultiviert. Zur Stimulation der Zellen wurden
A/E-Partikel verwendet. Der Gehalt löslicher Mediatoren im Zellkulturmedium wurde an Tag 3 (IFN-,
TNF-, Granzym B) bzw. an Tag 4 (IL-2, CCL5) durch ELISA bestimmt. Jedes Symbol repräsentiert
einen Spender. Sterne symbolisieren statistische Signifikanz gemäß des studentschen T-Tests
(* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01), (n.s. = nicht signifikant).
6.2.4.
Einfluss von TLR2-Liganden auf verschiedene Signalwege
Da die Vorinkubation von T-Zellen mit TLR2-Liganden die Oberflächenexpression
kostimulatorischer Moleküle und die Freisetzung von Th1-Zytokinen verstärkte, stellte sich
die Frage, welche Signalwege in den Zellen durch die Vorinkubation beeinflusst werden. Für
den TLR2-Signalweg ist die Beteiligung verschiedener Signalmoleküle, deren Aktivität durch
Phosphorylierung gesteuert wird, beschrieben. Unter anderem sind NF-B, MAP-Kinasen,
aber möglicherweise auch AKT darin involviert (Kawai & Akira 2010; Bhoj & Chen 2009;
Santos-Sierra et al. 2009). Mit Hilfe einer Phospho-Array-Analyse wurden Phosphorylierungszustände verschiedener Signalmoleküle (hauptsächlich MAP-Kinasen) analysiert.
Hierfür wurde ein Proteome Profiler™ Phospho-MAPK Array verwendet. Untersucht wurde
der
Phosphorylierungszustand
verschiedener
- 65 -
Signalmoleküle
in
TLR2-Liganden-
- Ergebnisse -
vorinkubierten verglichen mit Medium-vorinkubierten T-Zellen nach fünfminütiger antiCD2,-3,-28 mAk-Stimulation. Sowohl in Medium- als auch in TLR2-Liganden-vorinkubierten
T-Zellen zeigte die Analyse nach Stimulation der Zellen eine in Relation zu unstimulierten
Zellen verstärkte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1, ERK2 und p38sowie der
diesen nachfolgend (downstream) aktivierten Kinasen 90 kDa ribosomal S6 kinase 1 (RSK1),
mitogen-
and
stress-activated
protein
kinase
2 (MSK2)
und
glykogen
synthase
kinase (GSK) -3/. Hierbei war in TLR2-Liganden-vorinkubierten Zellen die Phosphorylierung von ERK1, ERK2, MSK2 und p38 in Relation zu den Medium-vorinkubierten erhöht.
Die Phosphorylierung von p38 und MSK2 war zudem auch in unstimulierten TLR2Liganden-vorinkubierten T-Zellen im Vergleich zu den korrespondierenden Medium-
45
40
+Stim.
35
-TLR2-L
30
-TLR2-L +Stim.
25
20
15
10
5
PBS
Ziege IgG
Maus IgG2B
Maus IgG2A
Maus IgG1
Kaninchen IgG
HSP27
p70 S6 Kinase
JNK3
MSK2
AKT3
AKT pan
RSK2
GSK-3
p38
p38
JNK2
Akt2
ERK2
Akt1
GSK-3/
p38
RSK1
p38
JNK pan
JNK1
0
ERK1
Relative Phosphorylierung [%]
vorinkubierten Zellen erhöht (Abb. 16).
Abb. 16: Analyse des Phosphorylierungsstatus von Signalmolekülen in TLR2-Ligandenvorinkubierten T-Zellen mit Hilfe eines Proteome Profiler™ Array. Frisch isolierte T-Zellen
wurden in Zellkulturmedium oder unter Zusatz des TLR2-L-Gemisches vorinkubiert. Die Zellen wurden
mit löslichem anti-CD2 mAk (1 µg/mL), anti-CD3 mAk (2 µg/mL) und anti-CD28 mAk (1 µg/mL) für 30
Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Stimulation bei 37°C durch Zugabe von Kaninchenanti-Maus-Antikörper (rm, 10 µg/mL) gestartet und nach Ablauf von fünf Minuten durch Zugabe von
eiskaltem PBS beendet. Die anschließend hergestellten Zelllysate wurden mit Hilfe eines Proteome
Profiler™ Phospho-MAPK Array analysiert. Dargestellt ist eines von zwei Experimenten deren
Ergebnisse miteinander deckungsgleich waren.
Durch eine Phospho-Array-Analyse (Proteome Profiler™ Phospho-MAPK Array) ergaben
sich Hinweise auf Signalmoleküle, die in Abhängigkeit von TLR2-Liganden aktiviert/phosphoryliert werden. Der Einflusses von TLR2-Liganden auf die Phosphorylierung der Signalmoleküle wurde unter Verwendung einer weitaus sensitiveren durchflusszytometrischen
Analysemethode mit Hilfe phosphorylierungsspezifischer mAk verifiziert bzw. detaillierter
analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass der zeitliche Verlauf der AKT-Phosphorylierung
für die beiden analysierten Phosphorylierungsstellen vergleichbar war. Nach einminütiger
Aktivierung erreichte die AKT-Phosphorylierung ihren höchsten Wert und fiel danach in der
Zeit zwischen fünf und 30 Minuten ab, wobei die Abnahme der Phosphorylierung von
Threonin 308 deutlicher zu beobachten war, als die von Serin 473. T-Zellen, die nicht über
- 66 -
- Ergebnisse -
A
Median
phos. AKT (pS473)
phos. AKT (pT308)
100
120
80
100
phos. NF-B/p65 (pS529)
**
25
*
80
60
*
20
*
*
1
5
15
60
40
10
40
20
5
20
0
0
0
1
5
0
0
30
1
5
30
0
30
min
B
160
[1 min Stimulation]
180
n.s.
25
*
[1 min Stimulation]
*
160
140
20
140
120
Median
[1 min Stimulation]
120
100
15
100
80
80
60
10
60
40
40
20
20
5
0
0
0
TLR2-L
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
CD2,-3,-28
+rm
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
phos. ERK1/2 (pT202, pY204/
pT185, pY187)
C
25
*
**
*
50
20
Median
phos. p38 MAPK (pT180, pY182)
60
*
40
15
CD2,-3,-28 + rm
30
10
20
5
-TLR2
CD2,-3,-28 + rm
10
0
-TLR2
0
0
1
5
30
0
1
5
30
min
D
35
[30 min Stimulation]
**
30
[30 min Stimulation]
*
50
25
Median
60
40
20
30
15
20
10
10
5
0
TLR2-L
CD2,-3,-28
+rm
0
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
Abb. 17: Einfluss der TLR2-Liganden-Vorinkubation auf die Phosphorylierung von Signalmolekülen in T-Zellen. Frisch isolierte T-Zellen wurden in Zellkulturmedium oder unter Zusatz
des TLR2-L-Gemisches vorinkubiert. Die Zellen wurden mit anti-CD2 mAk (1 µg/mL), anti-CD3 mAk
(2 µg/mL) und anti-CD28 mAk (1 µg/mL) für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Stimulation wurde im
Anschluss durch Zugabe von Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (rm, 10 µg/mL) bei 37°C gestartet und
™
zu angegebenen Zeitpunkten durch direkte Fixierung der Zellen beendet (Cytofix ). Anschließend
wurden die Zellen permeabilisiert und phosphorylierte Signalmoleküle wurden durch spezifische
Fluorochrom-gekoppelte mAk markiert. Der Phosphorylierungszustand der jeweiligen Signalmoleküle
wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt ist die mediane Fluoreszenzintensität unter
Verwendung von anti-AKT (pS473) mAk, anti-AKT (pT308) mAk, anti-NF-B/p65 (pS529) mAk, antiERK1/2 (pT202, pY204 bzw. pT185, pY187) mAk und anti-p38 (pT180, pY182) mAk. A, C) Zeitlicher
Verlauf der Phosphorylierung (Mittelwerte des Medians der Fluoreszenzintensität der untersuchten
- 67 -
- Ergebnisse -
Spender) der verschiedenen Signalmoleküle. B, D) Zustand der Signalmolekül-Phosphorylierung bei
den untersuchten Spendern zum Zeitpunkt der deutlichsten Differenz zwischen Medium- und TLR2Liganden-vorinkubierten T-Zellen. Jedes Symbol repräsentiert einen Spender. Mittelwerte sind
durch Balken dargestellt. Sterne symbolisieren statistische Signifikanz gemäß des studentschen TTests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01), (n.s. = nicht signifikant).
den TZR stimuliert wurden, wiesen keinen Anstieg der Phosphorylierung auf und taten dies
auch dann nicht, wenn sie mit TLR2-Liganden vorinkubiert worden waren. Allerdings ließ
sich eine verstärkte Phosphorylierung TLR2-Liganden-vorinkubierter T-Zellen nach antiCD2,-3,-28 mAk-Stimulation der Zellen beobachten. Die Phosphorylierung von Serin 473 war
verglichen mit Medium-vorinkubierten Zellen nur schwach und nicht signifikant erhöht,
während sie bei Threonin 308 eine bzw. fünf Minuten nach Beginn der Stimulation signifikant
anstieg (Abb. 17 A, B). NF-B/p65 wies an Serin 529 zwischen einer und 30 Minuten nach
Stimulationsbeginn einen Anstieg der Phosphorylierung auf, während unstimulierte Zellen
diesbezüglich keine Veränderung aufwiesen. Die TLR2-Liganden-Vorinkubation verstärkte
die NF-B-Phosphorylierung (eine, fünf bzw. 30 Minuten nach Beginn der Stimulation)
signifikant (Abb. 17 A, B). Die ERK1/2-Phosphorylierung an Threonin 202 und Tyrosin 204
(ERK1) bzw. Threonin 185 und Tyrosin 187 (ERK2) wurde ebenfalls erst durch die
Stimulation induziert und erreichte ihr Maximum eine Minute nach Beginn der Stimulation.
Waren die Zellen TLR2-Liganden-vorinkubiert, ging die Phosphorylierung im betrachteten
Zeitraum kaum zurück und war nach fünf bzw. 30 Minuten noch immer signifikant höher als
in Medium-vorinkubierten T-Zellen (Abb. 17 C, D). p38 war schon vor Beginn der
Stimulation an Threonin 180 und Tyrosin 182 zu einem gewissen Grad phosphoryliert.
Unstimulierte Zellen wiesen eine Minute nach Beginn der Untersuchung eine leicht
gesteigerte Phosphorylierung auf, die im weiteren Verlauf wieder zurückging. Die Stimulation
der T-Zellen führte auch bei p38 zu einer verstärkten Phosphorylierung, die nach einer
Minute ihr Maximum erreichte und anschließend abnahm. Die TLR2-Liganden-Vorinkubation
führte wie auch bei ERK1/2 zu einer verringerten Abnahme der Phosphorylierung. Nach fünf
bzw. 30 Minuten war diese noch signifikant höher als die Medium-vorinkubierter T-Zellen
(Abb. 17 C, D). Insgesamt führte die Vorinkubation der T-Zellen mit TLR2-Liganden (nur)
nach deren Stimulation zur verstärkten Phosphorylierung der betrachteten Signalmoleküle.
Um die durchflusszytometrisch gewonnenen Ergebnisse zu bestätigen, wurden Western blotAnalysen durchgeführt, für die ebenfalls phosphorylierungsspezifische mAk verwendet
wurden. Die Zellen wurden den durchflusszytometrisch analysierten Zellen entsprechend
stimuliert (Abb. 17). Die Stimulation wurde durch Zugabe von eiskaltem PBS beendet und
die Zellen wurden direkt im Anschluss lysiert. Der zeitliche Verlauf der Phosphorylierung der
betrachteten Signalmoleküle unterschied sich von dem durchflusszytometrisch ermittelten
- 68 -
- Ergebnisse -
insofern, als dass die Phosphorylierung im Vergleich insgesamt schneller wieder auf ein
niedriges Niveau zurückging. Die Phosphorylierung von ERK1/2, p38 und AKT (Thr 308) in
stimulierten, Medium-vorinkubierten Zellen war zwischen einer und fünf, die von NF-B/p65
nach fünf Minuten und die von AKT (Ser 473) zwischen fünf und 30 Minuten am stärksten
ausgeprägt und nahm danach wieder ab. Bei unstimulierten Zellen ließ sich nach einer
Minute eine deutliche Phosphorylierung von ERK1/2, p38, NF-B nachweisen, die bei ERK1
Abb. 18: Einfluss der TLR2-Liganden-Vorinkubation auf die Phosphorylierung von Signalmolekülen in T-Zellen. Frisch isolierte T-Zellen wurden in Zellkulturmedium oder unter Zusatz
des TLR2-L-Gemisches vorinkubiert. Die Zellen wurden mit anti-CD2 mAk (1 µg/mL), anti-CD3 mAk
(2 µg/mL) und anti-CD28 mAk (1 µg/mL) für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Stimulation wurde durch
Zugabe von Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (rm, 10 µg/mL) bei 37°C begonnen und an angegebenen Zeitpunkten durch Zugabe von eiskaltem PBS beendet. A) Anschließend wurden die Zellen
lysiert und der Phosphorylierungszustand verschiedener Signalmoleküle unter Verwendung von antiNF-B/p65 (S536), anti-ERK1/2 (pY202, pY204), anti-p38 (pY180, pY182), anti-AKT (pT308) und antiAKT (pS473) mAk durch Western blot-Analyse bestimmt. Als Beladungskontrollen wurde der
Nachweis von unphosphorylierten Molekülen (anti-ERK1/2, anti-p38 Ak) bzw. -Aktin (anti--Aktin
mAk) verwendet. Die Ziffern über den einzelnen Banden geben jeweils die Resultate der densitometrischen Auswertung an. B) Graphische Darstellung der densitometrischen Auswertung des
Western blots. Der Phosphorylierungszustand wurde in Relation zur jeweiligen Kontrolle ermittelt.
- 69 -
- Ergebnisse -
und NF-B ähnlich stark ausgeprägt war wie in stimulierten Zellen. Bei ERK1/2 und p38
nahm diese schnell wieder ab und war nach fünf Minuten nur noch schwach vorhanden. NFB hingegen wies, auch bei unstimulierten Zellen konstant einen gewissen Grad an
Phosphorylierung auf (Abb. 18). TLR2-Liganden-vorinkubierte, unstimulierte T-Zellen
wiesen eine Minute nach Untersuchungsbeginn eine erhöhte Phosphorylierung von p38 auf.
Abgesehen von dem schwachen Einfluss der TLR2-Liganden-Vorinkubabion auf p38 ließ
sich eine verstärkte Phosphorylierung nur nach Stimulation der Zellen feststellen. Sowohl die
Phosphorylierung von p38, ERK1/2, NF-B als auch von AKT war nach Stimulation TLR2Liganden-vorinkubierter Zellen in Relation zu Medium-vorinkubierten Zellen gesteigert.
Hierbei war die p38-, ERK2- und NF-B-Phosphorylierung fünf und 30 Minuten nach Beginn
der Stimulation erhöht. Verstärkende Effekte der TLR2-Liganden-Vorinkubation ließen sich
auch auf die AKT-Phosphorylierung feststellen, wobei die des Serin 473 fünf und die des
Threonin 308 eine Minute nach Stimulationsbeginn erhöht war. Die Phosphorylierung von
ERK1 hingegen war generell schwächer und es ließ sich kein Einfluss der TLR2-Liganden
erkennen (Abb. 18). Im Vergleich zu dem durchflusszytometrisch bestimmten Grad der der
Signalmolekül-Phosphorylierung zeigte sich eine ingesammt schnellere Abnahme. Qualitativ
wurde aber durch beide Methoden in TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen eine
gesteigerte Phosphorylierung von AKT (Thr 308) nach einminütiger bzw. von ERK, p38 und
NF-B nach fünf- oder 30-minütiger Stimulation nachgewiesen.
Der Phosphorylierungsgrad der Signalmoleküle NF-B und AKT wurde weiterhin zu späteren
Zeitpunkten der Kokultur von - und Responder T-Zellen bestimmt. Auf diese Weise war es
möglich mit Hilfe der sensitiveren durchflusszytometrischen Methode den Phosphorylierungszustand der Signalmoleküle parallel in kokultivierten - und Responder T-Zellen zu
ermitteln. Bei Verwendung dieser Methode konnten außerdem die für die Suppressionsuntersuchungen verwendeten A/E-Partikel zur Stimulation der Zellen genutzt werden.
Mehrere Tage nach der initialen Stimulation ließen sich bei TLR2-Liganden-vorinkubierten
T-Zellen Unterschiede in der Phosphorylierung von Signalmolekülen bei solo- und
kokultivierten T-Zellen beobachten. Die Phosphorylierung von AKT (Ser 473) war zwei
Tage nach der initialen Stimulation in solo- und kokultivierten TLR2-Liganden-vorinkubierten
T-Zellen signifikant erhöht, wobei diese Unterschiede in kokultivierten Zellen deutlicher
ausfielen (Abb. 19, obere Reihe). Ebenso war nach drei Tagen die Phosphorylierung von
AKT (Thr 308) und die von NF-B/p65 (Ser 529) bei jeweils 4/6 Spendern in kokultivierten
TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen deutlich erhöht. Bei solokultivierten T-Zellen
war diese gesteigerte Phosphorylierung zwar auch erkennbar, aber dies wiederum nicht
signifikant und weniger deutlich (Abb. 19, obere Reihe). Die Phosphorylierung der
Signalmoleküle in Responder T-Zellen wies zwischen solo- und kokultivierten Zellen
- 70 -
- Ergebnisse -
deutliche Unterschiede auf. Die Phosphorylierung von AKT (Ser 473) war deutlich und die
von AKT (Thr 308) und NF-B/p65 (Ser 529) signifikant verringert, wenn diese mit Mediumvorinkubierten T-Zellen kokultiviert wurden (Abb. 19, untere Reihe). Wurden die
Responder mit TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen kokultiviert, war die Phosphorylierung von AKT und NF-B/p65 auch in den Responder T-Zellen erhöht und der durch
Kokultivierung mit T-Zellen verursachte negative Effekt teilweise aufgehoben. Dies war bei
phos. AKT
(pS473)
phos. AKT
(pT308)
Phosphorylierung in T-Zellen
90
50
50
phos. NF-B/p65
(pS529)
80
*
40
40
70
0,08
0,09
0,08
60
30
30
*
20
n.s.
50
40
20
30
10
20
10
Diff. Median
10
0
TLR2-L +
Resp +
IL-2 -
0
0
+
+
+
-
50
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
+
+
-
+
+
Phosphorylierung in Responder T-Zellen
90
50
n.s.
0,05
+
+
-
n.s.
*
0,08
**
40
40
30
30
20
20
80
**
0,07
**
70
60
50
40
30
10
20
10
10
0
TLR2-L
Resp
+
+
+
0
+
+
+
0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Abb. 19: Einfluss der TLR2-Liganden-Vorinkubation von T-Zellen auf die Phosphorylierung
von Signalmolekülen in diesen und in kokultivierten Responder T-Zellen. Frisch isolierte
T-Zellen wurden in Zellkulturmedium oder unter Zusatz des TLR2-L-Gemisches vorinkubiert und
anschließend zusammen mit Responder T-Zellen oder alleine (in Anwesenheit von 50 U/mL IL-2)
kultiviert. Zur Stimulation der Zellen wurden A/E-Partikel verwendet. Nach 2 bzw. 3 Tagen wurden die
™
Zellen direkt fixiert (Cytofix ), permeabilisiert und der Phosphorylierungszustand der untersuchten
Signalmoleküle sowie die Zugehörigkeit zur jeweiligen Zellpopulation durchflusszytometrisch mit Hilfe
spezifischer Fluorochrom-gekoppelter mAk bestimmt. Dargestellt ist der korrigierte Median der
Fluoreszenzintensitäten, gemessen unter Verwendung von anti-AKT (pS473) mAk an Tag 2 sowie von
anti-AKT (pT308) mAk und anti-NF-B/p65 (pS529) mAk an Tag 3 der Kokultur. Jedes Symbol
repräsentiert einen Spender. Mittelwerte sind durch Balken dargestellt. Sterne symbolisieren
statistische Signifikanz gemäß des studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01), (n.s. = nicht
signifikant).
- 71 -
- Ergebnisse -
allen betrachteten Signalmolekülen klar erkennbar. Die Phosphorylierung von AKT (Ser 473)
war in allen Spendern, die von AKT (Thr 308) signifikant und die von NF-B/p65 (Ser 529) in
4/6 Spendern erhöht (Abb. 19, untere Reihe). Unter Verwendung verschiedener Ansätze zur
Bestimmung der Phosphorylierung ließ sich in T-Zellen ein deutlich positiver Effekt der
TLR2-Liganden auf die Phosphorylierung der Signalmoleküle ERK, p38, NF-B und AKT
feststellen. Bei Kokultur von Responder T-Zellen mit TLR2-Liganden-vorinkubierten
T-Zellen war die Phosphorylierung der Signalmoleküle AKT und NF-B im Vergleich zur
Kokultur mit Medium-vorinkubierten T-Zellen verstärkt. Die Signalmoleküle wiesen
(wieder) eine ähnlich starke Phosphorylierung wie in solokultivierten Responder T-Zellen auf.
- 72 -
- Ergebnisse -
6.3.
Expression von Transkriptionsfaktoren und deren Korrelation mit
suppressiver Aktivität
Wie bereits in Kapitel 6.1 gezeigt wurde, sind T-Zellen in der Lage die Proliferation von
Responder T-Zellen ähnlich effektiv wie Treg zu supprimieren. Um festzustellen ob
T-Zellen noch weitere phänotypische Gemeinsamkeiten aufweisen, wurde die Proteinexpression Treg-spezifischer Moleküle bei frisch isolierten T-Zellen untersucht und mit der
bei Treg bzw. Responder T-Zellen verglichen. Wie bereits in den Abbildungen 10 und 11
gezeigt, wiesen ruhende T-Zellen die für Treg charakteristischen Oberflächenmoleküle
PD-1 und PD-L1 oder CTLA-4 nicht auf, sondern taten dies erst nachdem sie aktiviert
wurden (Abb. 10, 11).
Abb. 20: Vergleich von T-Zellen mit Treg und Untersuchung der Helios-Expression in frisch
isolierten T-Zellen. Die Expression Treg-spezifischer Moleküle wurde bei frisch isolierten
+
T-Zellen, Treg und CD4 CD25 T-Zellen (Responder) untersucht. Auf der Zelloberfläche wurden
CD25, CD27, CD45RA und TZRV2 mit Hilfe Fluorochrom-gekoppelter mAk markiert. Zur intrazellulären Markierung wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Die Transkriptionsfaktoren Foxp3
(Klon: 259D und PCH101) und Helios wurden mit Hilfe spezifischer Fluorochrom-gekoppelter mAk
nachgewiesen. A) Gezeigt ist die Proteinexpression der verschiedenen Moleküle als Punktwolkendarstellung in einem repräsentativen von insgesamt fünf Spendern. Das kleine Punktwolkendiagramm
in der jeweils linken oberen Ecke stellt die korrespondierende Isotypkontrolle dar. Die Ziffern zeigen
die prozentuale Verteilung der Zellen relativ zur Isotypkontrolle. B) Die Helios-Expression wurde in
unstimulierten T-Zellen nachgewiesen. In der oberen Punktwolkendarstellung ist die Helios-Proteinexpression in V2-positiven und -negativen T-Zellen dargestellt. In der mittleren Punktwolkendarstellung wurden die Helios-positiven Zellen durch die Region 2 (R2) markiert. Diese Zellen sind in
der unteren Punktwolkendarstellung dunkel hervorgehoben. C) Dargestellt ist die Helios-Proteinexpression in Responder- und T-Zellen verschiedener Spender. Jedes Symbol repräsentiert einen
Spender. Mittelwerte sind durch Balken dargestellt.
- 73 -
- Ergebnisse -
Zum direkten Vergleich der Proteinexpression Treg-spezifischer Moleküle wurden Treg, und Responder T-Zellen magnetisch isoliert und durchflusszytometrisch untersucht. Treg
(CD4+CD25+) wiesen wie zu erwarten und in Übereinstimmung mit der Literatur eine hohe
Proteinexpression des aktivierungsassoziierten Moleküls CD25 sowie der Transkriptionsfaktoren Foxp3 und Helios auf (Abb. 20 A) (Vignali et al. 2008; Thornton et al. 2010).
In Relation zur jeweiligen Isotypkontrolle waren bei dem dargestellten Spender 96% der Treg
positiv für CD25, 88% für Helios und 96% bzw. 91% für Foxp3 (Klon PCH101 bzw. 259D).
CD25, Foxp3 und Helios waren bei den meisten Responder T-Zellen dieses Spenders nur
marginal vorhanden. Nur etwa 5% wiesen eine schwache Proteinexpression von CD25,
8,8% bzw. 16,6% die von Foxp3 (Klon PCH101 bzw. 259D) und nur 7% die von Helios auf.
Die frisch isolierte T-Zellen dieses Spenders wiesen ebenfalls kaum eine Proteinexpression von CD25 (6%) oder Foxp3 (Klon PCH101: 6% bzw. 259D: 5%) auf. Auffällig war
allerdings, dass ein Anteil von 32% der T-Zellen Helios-positiv war (Abb. 20 A). Der
Großteil der Helios-positiven T-Zellen wurde von V2-negativen Zellen ausgemacht. In
frisch isolierten T-Zellen war die Helios-Proteinexpression hauptsächlich auf die
CD27+CD45RA+-Zellpopulation beschränkt (Abb. 20 B). Der Anteil Helios-positiver
T-Zellen variierte bei den untersuchten Spendern zwischen etwa 20% und 50% (Abb. 20 C).
Es zeigte sich also, dass eine Zellpopulation innerhalb ruhender T-Zellen den für Treg
charakteristischen Transkriptionsfaktor Helios aufwies
6.3.1.
Helios- und Foxp3-Expression in Kokulturexperimenten
Es ist möglich, dass regulatorische Funktionen erst im Verlauf der (Ko-)kultivierung induziert
werden. T-Zellen könnten auch zur Induktion von Treg durch die Freisetzung tolerogener
Mediatoren beitragen. Daher wurde untersucht, ob es bei T-Zellen oder Responder
T-Zellen bei deren Kokultivierung zur Entstehung von Treg kommt. Da die für Treg
charakteristischen Oberflächenmoleküle allesamt auch aktivierungsinduziert auf nicht-TregZellen exprimiert werden (Vignali et al. 2008), wurde für beide Populationen die Proteinexpression der Treg-assoziierten Transkriptionsfaktoren Foxp3 und Helios im zeitlichen
Verlauf der (Ko-)kultivierung analysiert. Wie in Abbildung 21 gezeigt, wurde Foxp3 (PCH101)
sowohl in aktivierten - als auch Responder T-Zellen exprimiert. Unter Verwendung des
Klons PCH101 stieg die Proteinexpression von Foxp3 in solokultivierten Responder T-Zellen
bis zum vierten Tag nach Stimulation an und fiel dann wieder ab. Bei Kokultur mit T-Zellen
war die maximale Foxp3-Proteinexpression geringer, zeigte aber einen entsprechenden zeitlichen Verlauf. In mit Responder T-Zellen kokultivierten T-Zellen entsprach diese weitgehend der solokultivierter T-Zellen (Abb. 21 A, C). Während bei Verwendung des Klons
PCH101 zum Nachweis der Foxp3-Proteinexpression eine stimulationsbedingte Steigerung
- 74 -
- Ergebnisse -
Abb. 21: Proteinexpression von Helios und Foxp3 bei Solo- und Kokultur von - und Responder TZellen. Frisch isolierte T-Zellen wurden in Zellkulturmedium oder unter Zusatz des TLR2-L-Gemisches
vorinkubiert und anschließend zusammen mit Responder T-Zellen oder alleine (in Anwesenheit von
50 U/mL IL-2) kultiviert. Zur Stimulation der Zellen wurden A/E-Partikel verwendet. Anschließend wurden
die Zellen fixiert und permeabilisiert. Mit Hilfe spezifischer Fluorochrom-gekoppelter mAk wurden
Transkriptionsfaktoren intrazellulär markiert und durchflusszytometrisch nachgewiesen. A) Zeitlicher
Verlauf der Proteinexpression (Mittelwerte der mittleren Fluoreszenzintensität von drei bzw. fünf
Spendern) der verschiedenen Transkriptionsfaktoren in Solo- und Kokultur von - und Responder T-
- 75 -
- Ergebnisse -
Zellen. B) Dargestellt ist die mittlere Fluoreszenzintensität der Helios-Protinexpression an Tag 7 der
Zellkultur. Bei kokultivierten Zellen ist diese auf die in der Beschriftung zuerst genannte Population
bezogen. Jedes Symbol repräsentiert einen Spender. Mittelwerte sind durch Balken dargestellt. Sterne
symbolisieren statistische Signifikanz gemäß des studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01). C)
Punktwolkendarstellung der Proteinexpression von Helios und Foxp3 (Klone 259D und PCH101) unter
verschiedenen Kulturbedingungen. Die Einteilung der Quadranten wurde in Bezug zur Isotypkontrolle
vorgenommen.
mit einem Maximum an Tag 4 festgestellt wurde, zeigte sich bei Verwendung des Klons
259D unter den verwendeten Kulturbedingungen in keiner Zellpopulation eine Foxp3Induktion (Abb. 21 A, C). Nur in wenigen Responder-, aber in einem deutlichen Anteil der
T-Zellen kam es zur Helios-Proteinexpression. Die Proteinexpression von Helios in
solokultivierten Responder T-Zellen veränderte sich über den Zeitraum von sieben Tagen
kaum. In kokultiverten Responder T-Zellen war allerdings eine leicht gesteigerte
Proteinexpression zu beobachten (Abb. 21 B). Im Gegensatz dazu kam es sowohl in soloals auch kokultiverten T-Zellen zu einer deutlich verstärkten Helios-Proteinexpression.
Diese stieg vom zweiten bis zum siebten Tag der Zellkultur kontinuierlich an. Bei
solokultivierten T-Zellen war der Anstieg der Helios-Proteinexpression stärker, als in
kokultivierten (Abb. 21 A, C). Nach 22-stündiger Vorinkubation mit TLR2-Liganden wiesen
die unstimulierten T-Zellen keine Unterschiede bezüglich der Helios-Proteinexpression
auf. Wurden diese Zellen aber stimuliert und anschließend kultiviert, kam es in solokultivierten T-Zellen zu einer verstärkten und in kokultivierten T-Zellen zu einer
signifikant erhöhten Helios-Proteinexpression (Abb. 21 B, C; Abb. 22). Außerdem führte in
Responder T-Zellen die Kokultur mit TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen zu einer
schwachen, aber signifikanten Steigerung der Helios-Proteinexpression (Abb. 21 B, C).
Es kam in keiner der beiden Zellpopulationen zu einer Induktion von Foxp3 (bei Nachweis
durch den Klon 259D). Allerdings konnte in T-Zellen die aktivierungsinduzierte Induktion
des Transkriptionsfaktors Helios nachgewiesen werden.
6.3.2.
Die Expression verschiedener Transkriptionsfaktoren in T-Zellen
unter unterschiedlichen Expansionsbedingungen
Um die Rolle von Helios im Zusammenhang mit regulatorischen Funktionen näher zu
untersuchen, wurden T-Zellen auf unterschiedliche Weise stimuliert und es wurde die
Proteinexpression verschiedener Transkriptionsfaktoren bzw. deren Proteinexpression in
Korrelation mit Helios analysiert. In den vorangegangenen Experimenten konnte gezeigt
werden, dass es bei Stimulation mit A/E-Partikeln (anti-CD2,-3,-28 mAk) zu keiner Foxp3Proteinexpression (Klon 259D) kam (Abb. 21). In Übereinstimmung mit der Literatur konnte
bei Stimulation von T-Zellen mit BrHPP und zusätzlicher Supplementierung des Zellkulturmediums mit TGF-1und IL-15 ab dem zweiten Tag der Zellkultur eine, signifikante
Induktion von Foxp3 (Klon 259D) festgestellt werden (Abb. 22) (Casetti et al. 2009). Diese
- 76 -
- Ergebnisse -
korrelierte allerdings mit keiner deutlichen Helios-Proteinexpression. Helios wurde in BrHPPstimulierten T-Zellen in Anwesenheit von TGF-1 und IL-15 vergleichbar schwach
exprimiert wie in Abwesenheit der Zytokine (Abb. 22 A, B). Weiterhin war die Foxp3Proteinexpression hauptsächlich in Helios-negativen Zellen zu finden (Abb. 23). Zu einer
deutlichen Induktion von Helios kam es nur unter Verwendung von A/E-Partikeln (bei
Anwesenheit eines CD28-Kostimulus). Wurde zusätzlich zu diesem Stimulus das Medium
mit TGF-1und IL-15 supplementiert, hatte dies keinen Einfluss auf die Helios-Expression.
Anders als bei der BrHPP-Stimulation konnte in diesem Fall aber auch eine Induktion von
Foxp3 in Helios+ Zellen beobachtet werden (Abb. 22 B). In T-Zellen konnte also in
Anwesenheit von TGF-1 und IL-15 unabhängig vom Stimulus (A/E-Partikel oder BrHPP) die
Induktion von Foxp3 (Klon 259D) nachgewiesen werden.
Die unterschiedlichen Kulturbedingungen hatten außerdem Einfluss auf die Oberflächenexpression von CD27. Bei A/E-Partikel-Stimulation (anti-CD2,-3,-28 mAk) kam es ab Tag 2
zu einer starken CD27-Oberflächenexpression, wobei CD27 und Helios koexprimiert wurden
(Abb. 23). T-Zellen die zusätzlich zur A/E-Partikel-Stimulation unter Zusatz von IL-15 und
TGF-1kultiviert wurden, wiesen eine deutlich reduzierte CD27-Oberflächenexpression auf,
die aber auf Helios-positive Zellen beschränkt blieb. Bei BrHPP-Stimulation kam es zu einer
nur schwachen Induktion von CD27 auf Helios-negativen Zellen. Wurde bei BrHPPStimulation dem Zellkulturmedium IL-15 und TGF-hinzugegeben, kam es ebenfalls zu einer
schwachen CD27-Oberflächenexpression, die aber in diesem Fall auf schwach Heliospositive Zellen beschränkt war (Abb. 22 A, B, Abb. 23).
Aufgrund des von Serre et al. beschriebenen Zusammenhangs zwischen Helios-Proteinexpression und Prozessen der Th(2) -Differenzierung, wurde die Proteinexpression von
Helios in Korrelation mit denen für die Th1- bzw. Th2-Differenzierung spezifischen
Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA-3 analysiert (Serre et al. 2011). Hierbei zeigte sich
nach Stimulation ein leichter Anstieg der GATA-3-Proteinexpression, der bei allen
verschiedenen Kulturbedingungen in gleicher Weise zu beobachten war. Deutliche
Unterschiede hingegen wies die Proteinexpression des für Th1-Differenzierung spezifischen
Transkriptionsfaktors T-bet auf. In mit A/E-Partikeln (anti-CD2,-3,-28 mAk) stimulierten
T-Zellen kam es zwischen Tag 4 und 8 der Kultivierung zu einer deutlich gesteigerten
Expression. Diese war etwas stärker als nach BrHPP-Stimulation. Wurden die Zellen aber in
Anwesenheit von IL-15 und TGF-1 kultiviert, war die T-bet-Proteinexpression bei beiden
Stimulationsvarianten signifikant reduziert. Diese Reduktion war besonders deutlich bei
Stimulation mit A/E-Partikeln (anti-CD2,-3,-28 mAk) (Abb. 22 C, D).
- 77 -
- Ergebnisse -
A
CD27
250
Diff. Mittel
20
80
150
15
60
100
10
40
50
5
20
0
0
0
0
2
4
6
**
400
0
8
Tag 6
450
2
Diff. Mittel
6
0,06
200
**
**
**
25
50
Expansionsbedingungen:
0
TLR2-L
A/E-P (CD2,-3,-28)
BrHPP
IL-2
TGF-, IL-15
*
100
15
*
n.s.
0,07
10
100
50
5
0
0
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
-
T-bet
100
+
+
80
80
60
60
40
40
20
20
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
-
2
4
6
Tag 6
140
*
**
*
**
+A/E-P (CD2,-3,-28)
+IL-2
8
0
2
4
6
Tag 6
80
n.s.
n.s.
**
8
TLR2-L
+A/E-P (CD2,-3,-28)
+IL-2
*
90
120
+
+
+BrHPP +TGF- +IL-15
100
n.s.
+
+
+
-
+BrHPP +IL-2
Tag
160
+
+
-
Expansionsbedingungen
der T-Zellen:
0
0
+
+
GATA-3
100
0
Diff. Mittel
8
20
200
150
D
6
30
150
250
4
*
35
**
2
Tag 8
40
*
**
0
8
Tag 6
250
300
Diff. Mittel
4
Tag
0,05
0,07
350
C
Foxp3 (259D)
25
100
200
B
Helios
120
+A/E-P (CD2,-3,-28)
+TGF- +IL-15
n.s.
70
100
60
80
50
60
40
30
40
20
20
Expansionsbedingungen:
0
TLR2-L
A/E-P (CD2,-3,-28)
BrHPP
IL-2
TGF-, IL-15
10
0
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
Abb. 22: Einfluss unterschiedlicher T-Zell-Expansionsbedingungen auf die Proteinexpression von CD27 und verschiedenen Transkriptionsfaktoren. Frisch isolierte T-Zellen
wurden in Zellkulturmedium oder unter Zusatz des TLR2-L-Gemisches vorinkubiert und anschließend
entweder mit Hilfe von A/E-Partikeln (anti-CD2,-3,-28 mAk), A/E-Partikeln (nur anti-CD3 mAk) oder
BrHPP stimuliert. Die unterschiedlich stimulierten Zellen wurden entweder in Anwesenheit von IL-2
(50 U/mL) oder von TGF-1 (1,7 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) und IL-2 (10 U/mL) kultiviert. Zu
angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen durch durch Fluorochrom-gekoppelte anti-CD27 mAk
markiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und intrazelluläre Transkriptionsfaktoren wurden mit Hilfe von spezifischen Fluorochrom-gekoppelten mAk (u.a. anti-Foxp3 mAk: Klon
259D) markiert. Die Zellen wurden durchflusszytometrisch analysiert. A, C) Analyse des zeitlichen
- 78 -
- Ergebnisse -
Verlaufs der Proteinexpression der verschiedenen Moleküle. Die Linien stellen Mittelwerte der
korrigierten, mittleren Fluoreszenzintensitäten der untersuchten Spender dar. B, D) Proteinexpression
der Moleküle bei den verschiedenen Spendern zu einem bestimmten Zeitpunkt. Jedes Symbol
repräsentiert einen Spender. Mittelwerte sind durch Balken dargestellt. Sterne symbolisieren
statistische Signifikanz gemäß des studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01), (n.s. = nicht
signifikant).
Abb. 23: Korrelation der Helios-Proteinexpression mit CD27, Foxp3 und V2 bei unterschiedlichen T-Zell-Expansionsbedingungen. Frisch isolierte T-Zellen wurden entweder mit
Hilfe von A/E-Partikeln oder von BrHPP stimuliert. Die unterschiedlich stimulierten Zellen wurden
entweder in Anwesenheit von IL-2 (50 U/mL) oder von TGF-1 (1,7 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) und IL-2
(10 U/mL) kultiviert. Die Koexpression von CD27, Foxp3 und TZRV2 mit Helios ist als Punktwolkendarstellung für jeweils einen repräsentativen von insgesammt vier Spendern abgebildet. Zu den
angegebenen Zeitpunkten wurden CD27 und TZRV2 durch Fluorochrom-gekoppelte mAk markiert.
Anschließende wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Intrazelluläre Transkriptionsfaktoren
wurden durch spezifische Fluorochrom-gekoppelte mAk markiert (anti-Foxp3: Klon 259D).
Anschließend wurden die Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Die Einteilung der Quadranten
wurde anhand der korrespondierenden Isotypkontrolle vorgenommen.
Wurden zur Stimulation der Zellen anstatt der anti-CD2,-3,-28 mAk-umhüllten nur antiCD3 mAk-umhüllte A/E-Partikel verwendet, kam es zu einer mit der BrHPP-Stimulation
vergleichbar schwachen Proteinexpression von Helios und CD27 (Abb. 23).
Die Vorinkubation der T-Zellen mit TLR2-Liganden und deren anschließende Stimulation
durch A/E-Partikel (anti-CD2,-3,-28 mAk) zeigte keinen Einfluss auf die Proteinexpression
von Foxp3 oder GATA-3, führte aber zu einer deutlichen Steigerung der CD27- und Helios-
- 79 -
- Ergebnisse -
Proteinexpression (Abb. 22 A, B). Außerdem konnte ein signifikant-negativer Effekt der
Vorinkubation auf die Proteinexpression von T-bet festgestellt werden (Abb. 22 C, D).
Der BrHPP-Stimulation folgend wurden V2 T-Zellen selektiv expandiert. Nach Stimulation
mit A/E-Partikeln in Anwesenheit von IL-2 kam es ebenfalls zur präferentiellen Expansion
von V2 T-Zellen (Abb. 23). Wurde das Medium mit TGF-1 und IL-15 supplementiert, ließ
sich bei der BrHPP-Stimulation das Auftreten einer kleinen Population (6%), bei A/E-PartikelStimulation das einer großen Population von Helios+ V2-negativen (V1) T-Zellen (52%)
beobachten (Abb. 23).
Zusammenfassend konnte bei Stimulation mit A/E-Partikeln eine deutlich gesteigerte HeliosProteinexpression in T-Zellen festgestellt werden. Weiterhin konnte die Induzierbarkeit von
Foxp3 in Helios-positiven T-Zellen sowie ein negativer Einfluss von TGF-1 und IL-15 auf
die CD27- und T-bet-Proteinexpression gezeigt werden.
6.3.3.
Korrelation von Helios-Expression und suppressivem Potential bei
T-Zellen
Wie im Rahmen dieser Arbeit gezeigt wurde, besitzen polyklonal mit A/E-Partikeln (antiCD2,-3,-28 mAk) stimulierte T-Zellen suppressives Potential und können die Proliferation
von entsprechend stimulierten Responder T-Zellen negativ beeinflussen (Abb. 6). Die auf
verschiedene Weise expandierten T-Zellen wiesen unterschiedliche Proteinexpressionsmuster von Helios, Foxp3 (Klon 259D), CD27 und T-bet auf. Je nach verwendetem Stimulus
(BrHPP oder A/E-Partikel) konnte die Proteinexpression von Treg-spezifischem Foxp3 (Klon
259D) sowohl in Korrelation als auch unabhängig von Helios induziert werden. Es sollte
daher geklärt werden, ob die unterschiedlich expandierten T-Zellen Unterschiede
bezüglich ihrer suppressiven Kapazität aufweisen bzw. ob die Proteinexpression von Helios
oder Foxp3 mit dieser in Zusammenhang steht.
T-Zellen wurden unter Bedingungen, die denen zur Untersuchung der Proteinexpression
verschiedener Transkriptionsfaktoren (Abb. 22) entsprachen, stimuliert und für 16 Tage
expandiert. Zur Charakterisierung des Einflusses der unterschiedlichen Expansionsbedingungen wurde die Proliferation der T-Zellen fünf Tage nach initialer Stimulation
bestimmt. Hiermit sollte u.a. auch untersucht werden, ob der initiale Stimulus in etwa die
gleiche Stärke bzw. Qualität besaß. Grundsätzlich proliferierten die BrHPP-stimulierten
Zellen stärker (Abb. 25 A). Fünf Tage nach initialer Stimulation (sowohl BrHPP- als auch bei
A/E-Partikel-Stimulation) war die Proliferation bei Zugabe von TGF-1 geringer als ohne
diese. Weiterhin wurden die für 16 Tage expandierten T-Zellen mit Hilfe von TPA
restimuliert und die intrazelluläre Proteinexpression verschiedener löslicher Mediatoren
bestimmt. Bei keiner der verschiedenen Methoden zur Expansion der T-Zellen konnte
intrazellulär eine nennenswerte Proteinexpression von IL-2, IL-4, IL-10 oder IL-12 nachge- 80 -
- Ergebnisse -
wiesen werden (Daten nicht gezeigt). IFN-, TNF-, Granzym B, CCL3 und CCL5 waren
jedoch in allen untersuchten T-Zellen vorhanden. Beim Vergleich der durch BrHPP- und
A/E-Partikel- (in Anwesenheit von IL-2) expandierten T-Zellen fiel auf, dass die Proteinexpression von Granzym B und CCL3 in A/E-Partikel-expandierten Zellen höher war,
während sich deren IFN--,TNF-- und CCL5-Proteinexpression kaum von dem BrHPPexpandierter Zellen unterschied. Wurden die T-Zellen in Anwesenheit von IL-15 und
TGF-1 anstatt von IL-2 expandiert, ließ sich nach Restimulation, bei initial A/E-Partikel-
A
Initiale Stimulation
80
T-Zellen wurden für 16 Tage unter
folgenden Bedingungen expandiert:
3H-TdR
[cpm]
70
60
50
BrHPP +IL-2
40
BrHPP +TGF- +IL-15
30
20
A/E-Partikel + IL-2
10
A/E-Partikel +TGF- +IL-15
B
Restimulation mit TPA
IFN-
TNF-
400
25
Granzym B
n.s.
0,09
CCL3 (MIP-1)
35
700
*
0,05
350
600
Diff. Mittel
500
n.s.
100
20
300
n.s.
**
30
*
CCL5 (RANTES)
120
0,08
25
80
250
15
*
400
20
300
15
200
10
100
5
60
200
10
150
40
100
5
50
0
A/E-P (CD2,-3,-28) - BrHPP + +
IL-2 + TGF-, IL-15 - +
0
+
+
-
+
+
0
+
+
-
+
+
+
+
-
+
0
0
+
+
-
+
-
20
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
Abb. 24: Charakterisierung unterschiedlich expandierter T-Zellen. Frisch isolierte T-Zellen
wurden entweder mit Hilfe von A/E-Partikeln oder von BrHPP stimuliert. Die unterschiedlich stimulierten Zellen wurden entweder in Anwesenheit von IL-2 (50 U/mL) oder von TGF-1 (1,7 ng/mL), IL15 (10 ng/mL) und IL-2 (10 U/mL) kultiviert. A) Die Proliferation nach initialer Stimulation wurde nach
3
3
fünf Tagen durch Bestimmung der H-Thymidininkorporation [ H-TdR] in Form von experimentellen
Triplikaten quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus fünf unabhängigen Experimenten B) Nach 16-tägiger Expansion der T-Zellen wurden diese für acht Stunden
mit TPA restimuliert. Die Exozytose löslicher Mediatoren wurde vier Stunden vor Fixierung mit Hilfe
von Monensin blockiert. Im Anschluss wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und die Proteinexpression verschiedener Mediatoren wurde intrazellulär mit Hilfe spezifischer Fluorochrom-gekoppelter mAk
durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt ist die korrigierte mittlere Fluoreszenzintensität. Jedes
Symbol repräsentiert einen Spender. Sterne symbolisieren statistische Signifikanz gemäß des
studentschen T-Tests (* = p ≤ 0,05), (** = p ≤ 0,01), (n.s. = nicht signifikant).
- 81 -
- Ergebnisse -
stimulierten ein höherer und bei initial BrHPP-stimulierten T-Zellen ein geringerer Gehalt
löslicher Mediatoren feststellen. Bei A/E-Partikel-, TGF-1- und IL-15-expandierten
T-Zellen war die Granzym B- (in 6/6 Spendern), CCL3- (in 7/7 Spendern), IFN-- (in 5/7
Spendern) sowie die TNF--Proteinexpression (in 4/7 Spendern) reduziert. In BrHPP-, TGF1- und IL-15-expandierten T-Zellen kam es zu einer verstärkten Granzym B- (in 5/6
Spendern), IFN-- (in 6/7 Spendern), TNF-- und CCL3-Proteinexpression (jeweils 5/7
Spender). Die CCL5-Proteinexpression schien bei T-Zellen unabhängig von deren initialer
Stimulation erhöht zu sein, wenn diese in Anwesenheit von TGF-1 und IL-15 expandiert
wurden.
Zur funktionellen Analyse der suppressiven Kapazität der auf unterschiedliche Weise
expandierten T-Zellen wurden diese zusammen mit autologen (bis zur Verwendung kryokonservierten) Responder T-Zellen kokultiviert. Es wurden zwei verschiedene Methoden der
Stimulation bzw. Restimulation zur Analyse des suppressiven Potentials verwendet. Zum
einen wurden die auf verschiedene Weise expandierten - und die kokultivierten Responder
T-Zellen durch A/E-Partikel stimuliert. Diese Weise der polyklonalen Stimulation entspricht
der für die Suppressionsversuche mit frisch isolierten T-Zellen verwendeten Methode
(Abb. 6). Die auf unterschiedliche Weise expandierten T-Zellen proliferierten in Solokultur
nach Restimulation nur schwach. Eine Ausnahme stellten A/E-Partikel-, TGF-1-und IL-15expandierte Zellen dar, welche ein starkes proliferatives Potential besaßen. Diese wiesen
gefolgt von BrHPP-, TGF-1-und IL-15-expandierten T-Zellen in Kokultur mit Responder
T-Zellen die stärkste Proliferation auf. Die ohne Zusatz von TGF-1und IL-15 expandierten
Zellen proliferierten in Kokultur nur schwach (Abb. 25 A). Das Wachstum der kokultivierten
Responder T-Zellen wurde von allen, außer von denen unter Verwendung von BrHPP,
TGF-1und IL-15 expandierten T-Zellen, supprimiert (Abb. 25 A).
Als weitere Methode zur Untersuchung des suppressiven Potentials wurden beide
Zellpopulationen jeweils spezifisch, in Anwesenheit antigenpräsentierender Zellen durch
BrHPP und ein SE-Gemisch stimuliert. Auf diese Weise mit Responder T-Zellen kokultivierte
T-Zellen wiesen eine sehr eingeschränkte Proliferation auf. Nur die initial durch A/EPartikel stimulierten, unter Zusatz von TGF-1und IL-15 expandierten T-Zellen
proliferierten sowohl in Ko- als auch in Solokultur stark. Bei diesem methodischen Ansatz zur
Suppressionsanalyse waren nur diese T-Zellen in der Lage die Proliferation der
Responder T-Zellen deutlich zu supprimieren (Abb. 25 C). Zusammenfassend konnte also
festgestellt werden, dass es durch Supplementierung des Zellkulturmediums mit TGF-1und
IL-15 (auch wenn die Treg-spezifische Foxp3-Proteinexpression (Klon 259D) festgestellt
wurde) nicht zwangsläufig Treg entstanden, sondern dass die Art und Weise der initialen
Stimulation hierfür ebenfalls entscheidend war.
- 82 -
- Ergebnisse T-Zellen wurden für 16 Tage unter folgenden Bedingungen
expandiert :
(3)
(1)
BrHPP +IL-2
A/E-Partikel + IL-2
(2)
(4)
BrHPP +TGF- IL-15
A/E-Partikel +TGF- +IL-15
A
A/E-Partikel-Stimulation
Absolutzellzahl x103 (SCDA)
Resp
250
300
200
250
200
150
150
100
100
50
50
Kokultur mit
Kokultur mit Resp
B
+IL-2
Expression in Kokultur
Helios
Resp
GATA-3
(4)
(3)
(2)
(1)
(4)
(3)
(2)
(1)
C
BrHPP- +SE-Stimulation
Resp
Absolutzellzahl x103 (SCDA)
T-bet
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
Kokultur mit
Kokultur mit Resp
+IL-2
D
Expression in Kokultur
Helios
Resp
T-bet
GATA-3
(4)
(3)
(2)
(1)
(4)
(3)
(2)
(1)
Abb. 25: Suppressives Potential der verschiedenen expandierten T-Zellen. Frisch isolierte
T-Zellen wurden entweder mit A/E-Partikeln oder BrHPP stimuliert. Die unterschiedlich stimulierten
Zellen wurden entweder in Anwesenheit von IL-2 (50 U/mL) oder von TGF-1 (1,7 ng/mL), IL-15
(10 ng/mL) und IL-2 (10 U/mL) kultiviert. Nach einem Expansionszeitraum von 16 Tagen wurden die
- 83 -
- Ergebnisse -
unterschiedlich expandierten T-Zellen zusammen mit autologen Responder T-Zellen oder alleine (in
Anwesenheit von 50 U/mL IL-2) kultiviert. A), B) Zur Stimulation der solo- und kokultivierten Zellen
wurden A/E-Partikel verwendet. C), D) Die solo- und kokultivierten Zellen wurden unter Verwendung
von BrHPP und des SE-Gemisches stimuliert. Die Proliferation der einzelnen Zellpopulationen wurde
nach sechs (C) bzw. sieben (A) Tagen durchflusszytometrisch anhand der Absolutzellzahl vitaler
Zellen unter Verwendung der SCDA-Methode ermittelt. Im Säulendiagramm sind die Mittelwerte aus
sechs (A) bzw. fünf (C) unabhängigen Experimenten mitsamt der dazugehörigen Standardabweichung
dargestellt, wobei die Daten einzelner Experimente jeweils durch Vierfach- (Responder Solo- und
Kokulturen) bzw. Dreifachbestimmung ( Solokulturen) erhaltene experimentelle Mittelwerte
repräsentieren. B), D) Dargestellt ist die Proteinexpression verschiedener Transkriptionsfaktoren in
Responder- und T-Zellen, an Tag 6 der Kokultur, anhand eines exemplarischen Spenders. Zur
Differenzierung von Responder- und T-Zellen wurden diese durch spezifische Fluorochromgekoppelte mAk (anti-CD4 und anti-TZRV2) markiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert,
permeabilisiert und die Transkriptionsfaktoren Helios, T-bet und GATA-3 intrazellulär mit Hilfe
spezifischer Fluorochrom-gekoppelter mAk markiert und durchflusszytometrisch analysiert. Die
einzelnen Histogramme wurden anhand der vertikalen Linie, die der mittleren Fluoreszenz der
jeweiligen korrespondierenden Isotypkontrollen entsprechen, ausgerichtet. B): Stimulation wie A); D):
Stimulation wie C).
Um zu untersuchen, ob die festgestellten regulatorischen Funktionen (Abb. 25 A, C) mit der
Expression der untersuchten Transkriptionsfaktoren (Helios, Foxp3, T-bet, GATA-3)
korrelierten, wurde deren Proteinexpression in kokultivierten Responder- und T-Zellen
analysiert. Nach der Restimulation war in keinem Fall mehr die Foxp3-Proteinexpression
nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Eine deutliche Helios-Proteinexpression wurde in
T-Zellen, die unter Verwendung von A/E-Partikeln, TGF-1 und IL-15 expandiert wurden, bei
beiden
verwendeten
(Re-)stimulations-Methoden
festgestellt.
Eine
vergleichsweise
schwächere Helios-Proteinexpression war bei BrHPP-Restimulation von A/E-Partikel- und
IL-2-expandierten T-Zellen zu beobachten. Sowohl die unterschiedlich expandierten als auch die Responder T-Zellen wiesen bei BrHPP-(Re-)stimulation eine in Relation zur
A/E-Partikel-(Re-)stimulation leicht erhöhte Proteinexpression von T-bet und GATA-3 auf.
Bei (Re-)stimulation der Zellen durch A/E-Partikel wurde nur bei Kokultivierung mit BrHPP-,
TGF-1- und IL-15-expandierten T-Zellen keine Suppression der Responder T-ZellProliferation
beobachtet.
Dies korrelierte
sowohl
mit
einer
gesteigerten
GATA-3-
Proteinexpression in Responder- und T-Zellen als auch mit der von T-bet in den
T-Zellen. Die übrigen unterschiedlich konditionierten - und kokultivierten Responder
T-Zellen wiesen bei dieser (Re-)stimulationmethode nur eine geringe GATA-3- und T-betProteinexpression auf (Abb. 25 B). Im Gegensatz hierzu kam es bei BrHPP-/SE-Gemisch(Re-)stimulation A/E-Partikel-, TGF-1- und IL-15-expandierter T-Zellen zur Suppression
der Proliferation kokultivierter Responder T-Zellen. Diese korrelierte mit einer gesteigerten
GATA-3-Proteinexpression in Responder- und T-Zellen (Abb. 25 D).
Bei der Untersuchung des suppressiven Potentials der expandierten T-Zellen zeigte sich,
dass nach Restimulation weder die Helios- noch die Foxp3-Proteinexpression direkt mit dem
suppressiven Potential der Zellen korrelierten. Für die GATA-3- (und T-bet-) Proteinexpression ließ sich eine solche Korrelation allerdings beobachten.
- 84 -
- Ergebnisse -
Die Ergebnisse der Untersuchungen an den unterschiedlich expandierten T-Zellen sind in
Tabelle 3 zusammengefasst. Die korrigierten Fluoreszenzintensitäten der durchflusszytometrisch untersuchten Moleküle wurden an den in Abbildung 22 B, D (anhand der
erhaltenen Mittelwerte) bzw. Abbildung 24 B, D betrachteten Zeitpunkten quantifiziert und
tabellarisch dargestellt [- = <5; + = 5-50; ++ = 51-200; +++ = >200]. Die in Abbildung 25
untersuchte Proliferation solokultivierter T-Zellen wurde ebenfalls anhand der erhaltenen
Mittelwerte
quantifiziert
und
tabellarisch
dargestellt
[- = <5;
+ = 5-50;
++ = 51-100;
+++ = >100]. Die Suppression der Responder T-Zell-Proliferation in Kokultur wurde in
Relation zu ihrer Proliferation in Solokultur prozentual dargestellt.
Tab. 3: Einfluss der unterschiedlichen Expansionsbedingungen auf den Phänotyp der
T-Zellen.
Expression nach initialem
Stimulus
CD27
Helios
Foxp3 (259D)
T-bet
GATA-3
Expression löslicher
Mediatoren nach
Restimulation
IFN-
TNF-
CCL3
Granzym B
CCL5
Proliferation/Suppression
A/E-Partikel-Stimulation
(Solokultur)
A/E-Partikel-Stimulation
(Kokultur)
A/E-Partikel-Stimulation
(Suppression)
BrHPP- +SE-Stimulation
(Solokultur)
BrHPP- +SE-Stimulation
(Kokultur)
BrHPP- +SE-Stimulation
(Suppression)
+BrHPP
+IL-2
+BrHPP
+IL-15 +TGF-1
+A/E-Partikel
+IL-2
+A/E-Partikel
+IL-15 +TGF-1
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+++
++
++
++
+
++
+
+
+
+
+
+
++
+
++
+
+
++
+
++
+
+
+++
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+++
+
++
+
+++
81%
-43%
65%
37%
+
+
+
+++
+
+
+
++
-32%
-1%
-8%
51%
- 85 -
- Diskussion -
7. Diskussion
7.1.
T-Zellen besitzen suppressives Potential
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass frisch isolierte humane mit Responder (CD4+CD25-) T-Zellen interagieren und in der Lage sind deren Proliferation zu
supprimieren. Diese Ergebnisse lassen sich mit Beobachtungen in Einklang bringen, die auf
eine Regulation der T-Zell-Immunantwort durch T-Zellen hindeuten (Bhagat et al. 2008;
Kühl et al. 2009; Traxlmayr et al. 2010). Traxlmayr et al. beschrieben eine T-Zellvermittelte Suppression, welche die Anwesenheit von APZ benötigt (Traxlmayr et al. 2010).
In vorliegender Arbeit konnte gezeigt werden, dass frisch isolierte T-Zellen auch in
Abwesenheit von APZ die Proliferation von Responder T-Zellen supprimieren können und
dass APZ für eine T-Zell-vermittelte Suppression nicht notwendig sind. Im Gegensatz zu
den von Traxlmayr et al. durchgeführten Untersuchungen wurden- und Responder
T-Zellen hierbei nicht antigenspezifisch, sondern polyklonal durch A/E-Partikel stimuliert
(Abb. 6). Um auszuschließen, dass regulatorische Effekte direkt oder indirekt auf bereits in
den CD4+ T-Zellen vorhandene konventionelle Treg zurückzuführen sind, wurden der CD25+
Anteil der CD4+ T-Zellen depletiert. Erst die dadurch entstandenen Responder T-Zellen
(CD4+CD25-) wurden zur Untersuchung des suppressiven Potentials von T-Zellen
verwendet. Aufgrund der Verwendung von autologen Responder T-Zellen unterscheiden sich
die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen klar von denen von Kühl et al.
durchgeführten, die ebenfalls eine durch polyklonal stimulierte T-Zellen vermittelte
Suppression beobachteten. In den von Kühl et al. durchgeführten Untersuchungen konnte
allerdings weder der Suppressionsmechanismus aufgeklärt, noch festgestellt werden, ob nur
bestimmte T-Zell-Subpopulationen
suppressive
Eigenschaften
besitzen
(Kühl et al. 2009).
In
vorliegender
Arbeit
wurden
T-Zellen im gleichen Mengenverhältnis
mit Responder T-Zellen kokultiviert.
Innerhalb
der
PBMZ
kommen-
und T-Zellen normalerweise nicht im
gleichen Verhältnis zueinander vor, da
Abb. 26: Schematische Darstellung der
Inhibition der Responder T-Zell-Proliferation
durch T-Zellen.
T-Zellen nur einen geringen Anteil
der PBMZ ausmachen. Ein ausgeglichenes Verhältnis beider Popula-
- 86 -
- Diskussion tionen kann sich aber innerhalb von Lymphknoten in der Mikroumgebung von DZ oder in
Geweben ergeben und kann daher bei der Entstehung von Toleranz eine Rolle spielen. Die
Interaktion zwischen - und T-Zellen bei Stimulation durch anti-CD3 und -CD28 mAk ist
in Abbildung 26 schematisch dargestellt.
7.2.
T-Zellen weisen weder einen klassischen Treg Phänotyp auf noch
induzieren sie diesen bei Responder T-Zellen
Obwohl - die Proliferation von Responder T-Zellen supprimierten, unterschieden sich diese
doch von klassischen Treg. Anders als bei der Treg-vermittelten Suppression wurde bei der
in vorliegender Arbeit untersuchten T-Zell-vermittelten Suppression die Expression der
meisten löslichen Mediatoren in Responder T-Zellen nicht negativ beeinflusst. Durch
intrazelluläre durchflusszytometrische Untersuchungen und ELISA-Analysen des Zellkulturmediums konnte festgestellt werden, dass es bei Kokultur von - und Responder T-Zellen
zu einer verstärkten Produktion bzw. Freisetzung von IFN-, TNF-, Granzym B, CCL3 und
CCL5 kam. Einzig der im Zellkulturmedium festgestellte IL-2-Gehalt war bei Kokultur
reduziert (Abb. 7, Abb. 8).
T-Zellen exprimieren die auf Treg konstitutiv vorhandenen Oberflächenmoleküle wie CD25
und CTLA-4 erst nach Aktivierung (Smith 1988; Vignali et al. 2008; Linsley et al. 1996). In
dieser Arbeit konnte auf T-Zellen keine konstitutive Expression von für Treg charakteristischen Oberflächenmolekülen festgestellt werden. Erst nach A/E-Partikel-Stimulation
kam es auf T-Zellen zur aktivierungsinduzierten Expression von CD25, CD39, LAP und
CTLA-4 (Abb. 10, Abb. 11). Hinsichtlich der Oberflächenexpression dieser Moleküle
unterscheiden sich T-Zellen also von Treg und ähneln eher Responder T-Zellen.
T-Zellen könnten auch indirekt z.B. durch TGF- regulatorische Funktionen in kokultivierten Responder T-Zellen induzieren. Aus dem peripheren Blut isolierte T-Zellen, welche
die Proliferation von Responder T-Zellen supprimieren, sind Kühl et al. zufolge in der Lage
TGF- zu produzieren. Kühl et al. vermuten die regulatorische Aktivität und TGF-Produktion innerhalb der V1 T-Zell-Subpopulation (Kühl et al. 2009). Auch die T-Zellvermittelte Immunregulation durch Freisetzung von IL-10 wurde, wenn auch bisher nur bei
Untersuchungen in der Maus, beschrieben (Rhodes et al. 2008). An dem in vorliegender
Arbeit untersuchten suppressiven Effekt durch frisch isolierte T-Zellen scheinen diese
Zytokine allerdings nicht beteiligt zu sein, da diese weder im Zellkulturmedium (TGF-;
ELISA) noch bei intrazellulärer durchflusszytometrischer Untersuchung (TGF- und IL-10)
nachgewiesen werden konnten (Daten nicht gezeigt).
Zur Charakterisierung von Treg wird häufig der Transkriptionsfaktor Foxp3 verwendet. Für
dessen Nachweis können unterschiedliche mAk verwendet werden, von denen die Klone
- 87 -
- Diskussion PCH101 und 259D die allgemein gebräuchlichsten sind. Diese unterscheiden sich bezüglich
der Antigenerkennung, wobei kontrovers diskutiert wird, welcher am besten zum Nachweis
von Treg bzw. der Treg-spezifischen Foxp3-Expression geeignet ist (Tran et al. 2007; Pillai &
Karandikar 2008; Fox et al. 2008). In dieser Arbeit konnte unter Verwendung beider mAk
gezeigt werden, dass frisch isolierte T-Zellen im Gegensatz zu Treg kein Foxp3
exprimieren (Abb. 20). In der Maus ist eine klare Unterscheidung zwischen Foxp3+ Treg und
Foxp3- Responder T-Zellen möglich. Im Menschen hingegen wurde beim Nachweis durch
den Klon PCH101 ein transienter aktivierungsinduzierter Anstieg der Foxp3-Expression
beschrieben. Diese transiente Expression korreliert allerdings nicht mit einer regulatorischen
Funktion der Foxp3+ Responder T-Zellen (Allan et al. 2007). In Übereinstimmung hiermit
konnte im Rahmen vorliegender Arbeit nach Stimulation durch A/E-Partikel sowohl bei - als
auch Responder T-Zellen eine transiente Induktion von Foxp3 beim Nachweis durch den
Klon PCH101 beobachtet werden (Abb. 21). In der Literatur wird die Möglichkeit in Erwägung
gezogen, dass dieser mAk kreuzreaktiv ist und in aktivierten T-Zellen an weitere Proteinen
bindet (Tran et al. 2007). Der mAk PCH101 interagiert mit Foxp3 im N-Terminalen Bereich,
während der andere verwendete Foxp3 Klon 259D im Bereich der Zinkfinger- und der
Leucin-Zipper-Domäne (zwischen den Aminosäuren 105-235) bindet, die für die Foxp3Funktion (Proteininteraktionen bzw. Dimerisierung) notwendig sind (Fox et al. 2008). Beide
mAk weisen das vollständige Protein und dessen Splice-Varianten nach. Der Klon 259D
weist allerdings im Gegensatz zu PCH101 keine aktivierungsinduzierte Foxp3-Expression in
Responder T-Zellen, sondern nur die Treg-spezifische Expression nach (Tran et al. 2007;
Fox et al. 2008). Bei Verwendung dieses Treg-spezifischen mAk ließ sich in vorliegender
Arbeit in A/E-Partikel-stimulierten Zellen weder bei - noch bei Responder T-Zellen in Solooder Kokultur eine Induktion von Foxp3 beobachten (Abb. 21). Ebenso wurde keine
Expression bei Stimulation der T-Zellen durch BrHPP festgestellt (Abb. 22).
Zusammenfassend konnte weder bei T-Zellen noch bei kokultivierten Responder T-Zellen
(CD4+CD25-) nach A/E-Partikel-Stimulation ein klassischer regulatorischer Phänotyp bzw.
die Induktion eines solchen beobachtet werden.
7.3.
Verschiedene mögliche Mechanismen könnten zur Suppression von
T-Zellen führen
Treg können durch Konkurrenz um Wachstumsfaktoren und die Freisetzung bzw. Produktion
suppressiver Mediatoren die Proliferation anderer Zellen supprimieren (de la Rosa et al.
2004; Pandiyan et al. 2007; Borsellino et al. 2007; Deaglio et al. 2007; Kobie et al. 2006;
Collison et al. 2007; Belkaid & Rouse 2005; McGeachy et al. 2005). Auch für die in
vorliegender Arbeit beobachtete Suppression durch T-Zellen wurde die Möglichkeit eines
solchen Suppressionsmechanismus untersucht. Wie Treg sind T-Zellen auf das
- 88 -
- Diskussion Vorhandensein von exogenem IL-2 angewiesen (Chen et al. 2006; Schubert et al. 2001; Wu
et al. 2006a; Chen & Letvin 2003a; Wesch et al. 1997). Da Kompetition um IL-2 als ein
möglicher suppressiver Mechanismus von Treg beschrieben ist, könnte dieser auch für die
T-Zell-vermittelte Suppression relevant sein (de la Rosa et al. 2004; Pandiyan et al. 2007;
Chen & Letvin 2003a; Wesch et al. 1997). In vorliegender Arbeit konnte bei der Kokultur von
- mit Responder T-Zellen eine Reduktion der Menge des im Zellkulturmedium vorhandenen
IL-2 feststellt werden (Abb. 15). Durch die Gabe von exogenem IL-2 wurde die Proliferation
von Responder- und T-Zellen zwar gesteigert, allerdings war weiterhin eine Suppression
der Responder T-Zellen zu beobachten. Da die Proliferation beider Zellpopulationen bei
Gabe von exogenem IL-2 gesteigert war, wäre es möglich, dass die eingeschränkte
Proliferation bei Kokultivierung aus einer zu hohen Zelldichte in den Zellkulturkavitäten
resultierte. Dies erscheint allerdings unwahrscheinlich, da bei Gabe von IL-2 die Gesamtzellzahlen bei Kokultur deutlich kleiner blieben als die höchsten bei Solokultur von Responder
T-Zellen. Der Suppressionsmechanismus ist daher im Wesentlichen als IL-2-unabhängig
anzusehen. Es ist allerdings nicht vollständig auszuschließen, dass die Konkurrenz um IL-2
einen Teilaspekt des Suppressionsmechanismus darstellt (Abb. 9). Die festgestellte IL-2Unabhängigkeit der Suppression stimmt mit Ergebnissen anderer Untersuchungen zur
Suppression durch frisch isolierte T-Zellen überein. Kühl et al. beschreiben beispielsweise
eine Suppression der CD4+ T-Zell-Proliferation durch Foxp3- T-Zellen, die nicht durch
Konkurrenz um IL-2 bedingt ist (Kühl et al. 2009). Ebenso schlossen Traxlmayr et al. bei
einer durch mature IL-12-sezernierende DZ induzierten, V2 T-Zell-vermittelten Suppression
auf einen IL-2-unabhängigen Mechanismus (Traxlmayr et al. 2010).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch Beobachtungen gemacht, die auf eine Rolle von
löslichen Mediatoren bei der beobachteten Suppression hinweisen könnten. Erstmals konnte
eine CD39-Oberflächenexpression auf (A/E-Partikel-stimulierten) T-Zellen nachgewiesen
werden, während diese auf ko- oder solokultivierten Responder T-Zellen nur schwach
vorhanden war (Abb. 11). CD39 ist stark auf der Oberfläche von Treg vorhanden. Es ist
beteiligt am Abbau von extrazellulärem ATP, welches proinflammatorische Eigenschaften
besitzt. Das beim Abbau entstehende Adenosin besitzt außerdem anti-inflammatorische
Eigenschaften (Borsellino et al. 2007; Deaglio et al. 2007). Somit wäre es denkbar, dass
CD39 zur T-Zell-vermittelten Suppression beiträgt, indem es ATP abbaut und zur
Produktion von Adenosin beiträgt. T-Zellen exprimieren außerdem die Serin-Protease
Granzym B (Pietschmann et al. 2009). Durch diese können zytotoxische Effektorfunktionen,
aber auch der Abbau der extrazellulären Matrix vermittelt werden. Ein weiterer für Treg
beschriebener Mechanismus der Suppression wird durch Granzym B vermittelt (Gondek et
al. 2005; Loebbermann et al. 2012). Diese regulatorische Funktionen wurden vor allem in
murinen Treg beschrieben und spielen bei der Funktion humaner Treg wohl keine
- 89 -
- Diskussion bedeutende Rolle (Ashley & Baecher-Allan 2009). Hierfür spricht auch, dass Responder
T-Zellen in Kokultur deutlich mehr Granzym B produzieren als Treg (Oberg et al. 2010). Man
kann daher also annehmen, dass, obwohl T-Zellen nach Stimulation mit A/E-Partikeln
deutlich größere Mengen Granzym B als Responder T-Zellen produzieren, dies in keinen
Zusammenhang zur beobachteten Suppression steht (Abb. 7, Abb. 8). Die in vorliegender
Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Suppressivität frisch isolierter T-Zellen wurden
im Gegensatz zu einer Studie von Kühl et al. anhand autologer Zellpopulationen durchgeführt (Kühl et al. 2009). Auf diese Weise wurden (zytotoxische) Effekte gegen allogene
(CD4+ T-) Zellen vermieden, welche als verringerte Proliferation missinterpretiert werden
könnten.
7.4.
Die Suppression wird durch zellkontaktabhängige Interaktionen
vermittelt
Bei Kokultur von A/E-Partikel-stimulierten - und Responder T-Zellen konnten die suppressiven Zytokine TGF- und IL-10 nicht nachgewiesen werden. Mit der Konkurrenz um IL-2 ließ
sich die beobachtete Suppression ebenfalls nicht ausreichend erklären. Zwar wurde die
Expression von Granzym B und CD39 beobachtet, aber die durchgeführten Doppelkammerexperimente weisen darauf hin, dass der direkte Zellkontakt beider Zellpopulationen zur
Entstehung der Suppression notwendig ist. Waren die Zellpopulationen durch eine
semipermeable Membran voneinander getrennt, wurde die Proliferation der Responder
T-Zellen nicht supprimiert (Abb. 9). Bei der T-Zell-vermittelten Suppression spielen folglich
also vor allem zellkontaktabhängige Interaktionen eine Rolle.
Im Unterschied zu Treg können T-Zellen auch kostimulatorische Eigenschaften wie z.B.
APZ-ähnliche Funktionen aufweisen (Brandes et al. 2005; Brandes et al. 2009; Meuter et al.
2010; Landmeier et al. 2009; Himoudi et al. 2012). In der vorliegenden Arbeit konnte die
aktivierungsinduzierte Oberflächenexpression von verschiedenen APZ-typischen Molekülen
wie z.B. CD80/-86 oder PD-L1 gezeigt werden (Abb. 10, Abb. 11). In diesem Punkt
unterscheiden sich T-Zellen deutlich von Treg, die keine APZ-typischen kostimulatorischen Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren. Oberflächenmoleküle der B7- und
CD28-Familie spielen bekanntermaßen bei der Immunregulation eine zentrale Rolle. Durch
die Interaktion von PD-1 und PD-L1 bzw. CTLA-4 und CD80/-86 kann die Aktivierung und
Proliferation von T-Zellen negativ reguliert werden (siehe Kap. 3.5).
In vorliegender Arbeit konnte gezeigt werden, dass CD80/-86 auf Responder T-Zellen nur
schwach, aber auf T-Zellen wesentlich stärker exprimiert wurde, während CTLA-4 auf und Responder T-Zellen gleichermaßen zu finden war (Abb. 10). Durch Verwendung
blockierender anti-CD86 und -CTLA-4 mAk konnte die T-Zell-vermittelte Suppression
teilweise aufgehoben werden. Die Verwendung eines blockierenden anti-CD80 mAk hatte
- 90 -
- Diskussion kaum Einfluss auf die Suppression, was sich entweder durch die geringere Expression von
CD80 auf den T-Zellen oder eine schwächere Interaktion mit CTLA-4 begründen lässt
(Abb. 12). Diese Ergebnisse deuten auf eine wichtige Rolle der Interaktion von CD86 mit
CTLA-4 bei der T-Zell-vermittelten Suppression der Responder T-Zell-Proliferation hin.
Andererseits scheint auch ein reverses Signal in Richtung der CD80/-86-exprimierenden
Zelle möglich zu sein. Es ist bekannt, dass CTLA-4 direkt mit CD80/-86 auf T-Zellen
interagieren und die T-Zell-Effektorfunktionen herunterregulieren kann (Paust & Cantor
2005). Die Interaktion von CTLA-4 mit CD80 und/oder CD86 spielt auch bei der Tregvermittelten Suppression eine Rolle. Durch die Bindung von CTLA-4 kann in DZ ein
reverses, CD80/-86-vermitteltes Signal induziert werden, welches den TryptophanStoffwechsel von DZ beeinflusst. Bei Verwendung eines blockierenden anti-CTLA-4 mAk
wird die durch Treg induzierte und DZ vermittelte Suppression von Effektor T-Zellen
abgeschwächt (Fallarino et al. 2003; Grohmann et al. 2002). Die Verwendung eines solchen
mAk wirkt der Expression von IDO in DZ entgegen (Munn et al. 2004). IDO beeinflusst den
Tryptophan-Stoffwechsel und wirkt auf diese Weise immunsuppressiv. Durch membrangebundenes oder lösliches CTLA-4/Fc-Fusionsprotein kann in DZ ein reverses CD80/-86Signal ausgelöst werden, welches die Expression von IDO induziert (Puccetti & Grohmann
2007; Fallarino et al. 2003; Grohmann et al. 2002). Nach Blockierung von CD80/-86 durch
plattengebundenes CTLA-4/Fc ließ sich in vorliegender Arbeit eine gesteigerte Proliferation
der T-Zellen beobachten. Weiterhin wurde die Proliferation der Responder T-Zellen durch
CTLA-4/Fc negativ beeinflusst. Die durch CTLA-4/Fc gesteigerte Proliferation der CD80/-86exprimierenden T-Zellen weist auf das Vorhandensein eines solchen reversen Signals hin.
Die verringerte Proliferation der Responder T-Zellen wurde vermutlich durch die CTLA-4/Fcvermittelte Blockade des kostimulatorischen CD80/-86-Signals bedingt (Abb. 12). Es wäre
allerdings auch denkbar, dass ein reverses CD80/-86-Signal außerdem zur Expression von
IDO in T-Zellen führt, welches die Responder T-Zell-Proliferation ebenfalls negativ beeinflussen könnte.
Durch Bindung von PD-L1 an PD-1 wird sowohl die Proliferation als auch die
Zytokinproduktion inhibiert (Freeman et al. 2000). Es ist bekannt, dass es nach TZRStimulation auf T-Zellen zur Oberflächenexpression von PD-1 kommt (Agata et al. 1996;
Iwasaki et al. 2011). Dies konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Die
beobachtete Oberflächenexpression von PD-1 war auf - allerdings deutlich schwächer als
auf Responder T-Zellen. Die Expression von PD-L1 (nicht aber von PD-L2) konnte ähnlich
stark ausgeprägt sowohl auf Responder- als auch erstmalig auf T-Zellen gezeigt werden
(Abb. 10). Das Expressionsmuster von Rezeptor und Ligand kann sowohl für eine T-Zellvermittelte Regulation als auch für eine durch Responder T-Zell selbst vermittelte Regulation
der Proliferation sprechen. In vorliegender Arbeit konnte die T-Zell-vermittelte Suppression
- 91 -
- Diskussion durch anti-PD-L1 mAk aufgehoben werden, während sie durch anti-PD-1 mAk nur schwach
positiv beeinflusst wurde (Abb. 10, Daten nicht gezeigt). Diese Tatsache lässt sich auf
verschiedene Weise erklären. Eine Möglichkeit könnte wie von Sharp et al. vermutet die
Bindung von PD-L1 an einen weiteren, bisher unbekannten (negativ-) kostimulatorischen
Rezeptor sein (Sharpe & Freeman 2002). Diese Möglichkeit scheint in Anbetracht der
vorhanden Literatur zur PD-1 : PD-L1-Interaktion nicht unwahrscheinlich, da viele der
funktionellen Untersuchungen dieser Interaktion nur auf der Blockierung von PD-L1 beruhen
bzw. bei Nutzung beider blockierenden mAk nur Effekte durch anti-PD-L1 beobachtet
wurden (Brown et al. 2003; Rodig et al. 2003; Nakamoto et al. 2009; Radziewicz et al. 2007).
Die in vorliegender Arbeit gemachte Beobachtung, dass durch anti-PD-L1 mAk, nicht aber
durch PD-1/Fc die T-Zell-vermittelte Suppression der Responder T-Zell-Proliferation
teilweise aufgehoben wurde, spricht ebenfalls für diese Hypothese (Abb. 12). Auch eine nicht
effiziente Blockade der PD-1 : PD-L1-Interaktion durch den in vorliegender Arbeit
verwendeten anti-PD-1 mAk wäre denkbar. Eine andere Erklärung wiederum wäre die
Existenz eines PD-L1-vermittelten reversen Signals. Es ist beschrieben, dass ein solches
Signal die Reifung von DZ inhibieren kann (Kuipers et al. 2006). Man könnte daher
vermuten, dass die in vorliegender Arbeit festgestellte gesteigerte Responder T-ZellProliferation nach Zugabe von anti-PD-L1 mAk auf ein reverses PD-L1-Signal zurückzuführen ist. Dies erscheint allerdings unwahrscheinlich, da T-Zellen PD-L1 in gleichem
Maße wie Responder T-Zellen auf ihrer Oberfläche exprimierten, aber ihre Proliferation
durch den mAk nicht beeinflusst wurde. Des Weiteren wurde eine Interaktion von PD-L1 und
CD80 beschrieben, die in einem bidirektionalen, inhibitorischen Signal mündet (Park et al.
2010). Allerdings ließ sich in vorliegender Arbeit (wie bereits erwähnt), bei Blockade von
CD80 durch einen mAk kein Einfluss auf die
Suppression beobachten (Abb. 12). Man
kann folglich davon ausgehen, dass die
CD80 : PD-L1-Interaktion oder ein reverses
PD-L1-Signal für die T-Zell-vermittelte
Suppression nicht von Bedeutung ist.
In dieser Arbeit konnte auf T-Zellen nach
Stimulation
mit
A/E-Partikeln
die
akti-
vierungsinduzierte Expression von CD28,
CD80, CD86, CTLA-4, PD-1 und PD-L1 und
festgestellt werden. Bis auf die OberflächenAbb. 27: Schematische Darstellung negativkostimulatorischer Interaktionen, zwischen
+
CD4 und T-Zellen bzw. deren Blockierung.
expression von CD80/-86 wurden diese
auch auf Responder T-Zellen festgestellt.
Anhand von Blockierungsstudien konnte
- 92 -
- Diskussion gezeigt werden, dass sowohl die Interaktion von CTLA-4 mit CD86 als auch die von PD-L1
mit seinem Rezeptor bei der T-Zell-vermittelten Suppression von Responder T-Zellen eine
Rolle spielt (Abb. 10, Abb. 12). Beide Signalwege können zum Zellzyklusarrest führen und
auf diese Weise zur Suppression der Responder T-Zellen beitragen (Sharpe & Freeman
2002). Vermutlich spielt die Interaktion von PD-1 und PD-L1 bei der Regulation und
Entstehung von peripherer Toleranz eine geringere Rolle als die von CTLA-4 und CD80,-86
(Sharpe & Freeman 2002). Auch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine
zentralere Rolle der CTLA-4 : CD86-Interaktion für die Entstehung der beobachteten
Suppression hin. Da CTLA-4 der CD28-vermittelten Kostimulation entgegenwirkt, wird
indirekt auch die IL-2-Produktion negativ beeinflusst, während PD-1 diese nicht negativ
beeinflusst (Sharpe & Freeman 2002). In vorliegender Arbeit wurde bei Kokultur von - und
Responder T-Zellen eine Abnahme der IL-2-Menge im Zellkulturmedium festgestellt, was auf
eine verminderte Produktion von IL-2 zurückzuführen sein könnte. Bei in situ Experimenten
mit murinen T-Zellen konnte wiederum durch die Zugabe von exogenem IL-2 die PD-L1/FcFusionsprotein-vermittelte Suppression von CD4+ und CD8+ T-Zellen aufgehoben werden
(Carter et al. 2002). Eine Aufhebung der Suppression durch Supplementierung der Kokultur
mit IL-2 konnte in dieser Arbeit nicht beobachten werden (Abb. 9), was wiederum für einen
geringeren Einfluss der PD-1 : PD-L1-Interaktion spricht. Es lässt sich daher mutmaßen,
dass die CTLA-4 : CD86-Interaktion eine bedeutendere Rolle für die in dieser Arbeit
beobachtete T-Zell-vermittelte Suppression spielt.
Die durch PD-1 und CTLA-4 vermittelten Signale wirken der Aktivierung des PI3K/AKTSignalweges entgegen. Nach Ligandenbindung werden sowohl von PD-1 als auch CTLA-4
Phosphatasen rekrutiert, was zur Dephosphorylierung verschiedener Signalmoleküle führt
(siehe Schema; Abb. 3). In dieser Arbeit ließ sich bei Kokultur von Responder- und
T-Zellen eine entsprechend reduzierte Phosphorylierung von AKT und NF-B beobachten.
Der zugrundeliegende Mechanismus ist in Kapitel 7.7 näher diskutiert (Abb. 19). Die
Annahme, dass sowohl die Interaktion der Oberflächenmoleküle CTLA-4 : CD86 und PD1 : PD-L1 wichtig für den T-Zell-vermittelten immunregulatorischen Effekt ist, wird
zusätzlich durch den die Immunsuppression aufhebenden Effekt von TLR2-Liganden
unterstützt. In Korrelation mit diesem konnte eine Modulation der Oberflächenexpression von
PD-1, PD-L1, CTLA-4 und CD86 feststellt werden (Abb. 14).
7.5.
TLR2-Liganden modulieren die Funktionen von T-Zellen
T-Zellen weisen ein breites Wirkungsspektrum und eine gewisse Plastizität in ihrer
Funktionalität auf und können sowohl zytotoxische Effektorfunktionen als auch immunregulatorische oder APZ-ähnliche Funktionen ausüben (Vantourout & Hayday 2013). TLR
repräsentieren einen möglichen Mechanismus zur Differenzierung zwischen immunsuppres-
- 93 -
- Diskussion siven und proinflammatorischen Funktionen. Durch die Expression von TLR sind T-Zellen
beispielsweise in der Lage effektiv auf eine Infektion zu reagieren, was darauf hindeutet,
dass T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer Immunantwort spielen können
(Wesch et al. 2011). Frisch isolierte T-Zellen reagieren nicht direkt auf TLR-Stimulation,
sondern benötigen einen zusätzlichen TZR-Stimulus (Pietschmann et al. 2009; Wesch et al.
2006). Neben diesen direkten kostimulatorischen Effekten sind für T-Zellen auch indirekte
durch von TLR-exprimierenden DZ vermittelte Effekte von TLR-Liganden beschrieben
worden (Pietschmann et al. 2009; Shrestha et al. 2005). In der Publikation von Deetz et al.
ist zwar eine TLR2-Ligand-vermittelte (Pam3CSK4) Kostimulation von T-Zell-Linien
beschrieben, allerdings konnten in deren Untersuchungen indirekte TLR-Effekte durch in der
Zellkultur verbliebene APZ nicht ausgeschlossen werden. Um indirekte Effekte ausschließen
zu können, wurde in vorliegender Arbeit der Einfluss von TLR2-Liganden auf die Interaktion
von - und Responder T-Zellen in Abwesenheit von APZ untersucht. Eine TLR2-Ligandenverstärkte Produktion löslicher Mediatoren (IFN-, CXCL8 (IL-8), CCL5) konnte zuerst in
unserer Arbeitsgruppe nachgewiesen (Pietschmann et al. 2009) und im Weiteren auch in
vorliegender Arbeit bestätigt werden. Es wurde eine verstärkte Produktion der Mediatoren
IFN-, TNF-, CCL5 und Granzym B nachgewiesen (Abb. 15). Auch bei Kokultur der TLR2Liganden-vorinkubierten - mit Responder T-Zellen war die Produktion dieser Mediatoren
sowie zusätzlich die von IL-2 gesteigert (Abb. 15).
Es ist bekannt, dass es durch TLR2-Liganden zur Aufhebung der durch humane Treg
vermittelten Suppression der Responder (CD4+CD25-) T-Zell-Zytokinproduktion kommt
(Oberg et al. 2010). Eine erhöhte bzw. wiederhergestellte IL-2-Produktion bei Kokultivierung
mit TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zell in vorliegender Arbeit könnte also ebenfalls die
Aufhebung der Suppression der IL-2-Produktion darstellen (Abb. 7). Allerdings folgt, wie in
Kapitel 7.3 festgestellt wurde, aus einem gesteigerten IL-2-Gehalt im Zellkulturmedium nicht
die Aufhebung der T-Zell-vermittelten Suppression der Responder T-Zell-Proliferation.
Dennoch konnte eine TLR2-Liganden-abhängige (partielle) Aufhebung der T-Zell-vermittelten Suppression der Responder T-Zell-Proliferation festgestellt werden. Diesbezüglich
besteht eine Analogie zu Treg, für die ebenfalls eine TLR-Liganden-induzierte Modulation
der Suppression beschrieben ist. Während TLR(4,5) -Liganden die Treg-vermittelte
Suppression verstärken, wird diese bei murinen und auch humanen Treg durch TLR2Liganden aufgehoben (Caramalho et al. 2003; Crellin et al. 2005; Liu et al. 2006; Sutmuller et
al. 2006; Oberg et al. 2010).
Außerdem konnte in vorliegender Arbeit erstmals ein direkter kostimulatorischer Einfluss von
TLR2-Liganden auf die Proliferation von T-Zellen sowohl in Solo- (in Anwesenheit von
IL-2) als auch in Kokultur mit Responder T-Zellen demonstriert werden (Abb. 13). Für
humane und murine CD4+_ und CD8+ T-Zellen ist bereits ein kostimulatorischer,
- 94 -
- Diskussion proliferationssteigernder Effekt von TLR2-Liganden (Pam3CSK4) beschrieben worden (Lee
et al. 2009; Komai-Koma et al. 2004). Auch die Proliferation muriner nTreg kann durch TLR2Liganden verstärkt werden (Sutmuller et al. 2006; Liu et al. 2006). Ebenso wie für diese
beschrieben, konnte in vorliegender Arbeit nur in Anwesenheit von IL-2 ein deutlicher
positiver Einfluss der TLR2-Liganden auf die Proliferation solokultivierter T-Zellen
festgestellt werden (Abb. 13).
7.6.
Für die suppressive Rolle der CTLA-4 : CD86 und der PD-1 : PD-L1Interaktion spricht auch die Modulation der beteiligten Oberflächenmoleküle nach TLR2-Liganden-Vorinkubation
Die in vorliegender Arbeit beobachtete TLR2-Liganden-induzierte Abnahme des suppressiven Potentials und die damit einhergehend verstärkte Proliferation der T-Zellen
entspricht den für Treg beschriebenen TLR2-Liganden-vermittelten Effekten (Abb. 13)
(Sutmuller et al. 2006; Liu et al. 2006; Oberg et al. 2010). Allerdings unterscheidet sich, wie
in den Kapiteln 7.1 - 7.5 festgestellt wurde, die in vorliegender Arbeit beobachtete durch
frisch isolierte A/E-Partikel-stimulierte T-Zellen vermittelte Suppression von der Tregvermittelten. Die T-Zell-vermittelte Suppression wird demnach hauptsächlich durch die
Interaktion von CD86 und CTLA-4 bzw. PD-L1 und seinem Liganden vermittelt und
entspricht eher der durch tolerogene DZ vermittelten Suppression (Kap. 7.4). Es ist bekannt,
dass auch das immunregulatorische Potential von DZ TLR-abhängig moduliert werden kann.
TLR können zur Reifung von DZ beitragen, was zum Wandel von einem tolerogenen zu
einem die Immunantwort stimulierenden Phänotyp führt (Steinman & Hemmi 2006; Akira &
Takeda 2004). Für DZ ist die TLR2-Liganden-abhängige Modulation bzw. gesteigerte
Expression von Molekülen der B7-Familie wie CD80/-86 und PD-L1 vielfach beschrieben
worden. Die TLR2-Liganden Pam2CSK4 und Pam3CSK4 führen zur Reifung humaner DZ
und zur Heraufregulation von CD83 und CD86 (Peiser et al. 2008). Bei murinen DZ führt die
Bindung des TLR2-Liganden FSL-1 an TLR2 zur gesteigerten Expression von CD80, CD86
und MHC II (Kiura et al. 2006). In vorliegender Arbeit konnte ebenfalls die TLR2-Ligandenbedingte Steigerung der Oberflächenexpression von CD80 und -86 auf A/E-Partikelstimulierten T-Zellen demonstriert werden (Abb. 14). Außerdem konnte eine gesteigerte
Expression des MHC II-Moleküls HLA-DR festgestellt werden, welches ebenfalls auf der
Oberfläche reifer APZ exprimiert wird (Abb. 14).
Auf humanen Plasmazellen von multiplen Myelompatienten wird die PD-L1-Oberflächenexpression durch TLR2-Liganden verstärkt (Liu et al. 2007). Die in vorliegender Arbeit
beobachtete verstärkte PD-L1-Oberflächenexpression auf TLR2-Liganden-vorinkubierten,
mit Responder T-Zellen kokultivierten T-Zellen spricht dafür, dass TLR2-Liganden auch
- 95 -
- Diskussion bei T-Zellen die PD-L1-Oberflächenexpression verstärken, hier allerdings nur kostimulatorisch in Verbindung mit TZR-Stimulation (Abb. 14). Verschiedene Untersuchungen deuten
darauf hin, dass PD-L1 außer mit dem negativ-kostimulatorischen Molekül PD-1 auch mit
einem bisher nicht näher charakterisierten, positiv-kostimulatorischen Molekül interagiert
(Dong et al. 1999; Tamura et al. 2001). Für eine solche Interaktion spricht u.a. dass es in
Abhängigkeit von PD-L1-Kostimulation durch
immobilisiertes
PD-L1/Fc
bei
murinen
T-Zellen zu einer gesteigerten Proliferation
kommt. Außerdem konnte bei Kostimulation
muriner
Th-Zellen
durch
PD-L1/Fc
die
Produktion von IFN- in ähnlicher Weise wie
bei Kostimulation durch CD28 erhöht werden
(Dong et al. 1999; Tamura et al. 2001). Von
einer
solchen
positiv-kostimulatorischen
Rolle des PD-L1-Moleküls ausgehend, wäre
es möglich, dass die in vorliegender Arbeit
beobachtete verstärkte PD-L1-Oberflächenexpression auf TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen zu deren verstärkter ProliAbb. 28: Schematische Darstellung der
Modulation kostimulatorischer Oberflächenmoleküle, nach TLR2-Vorinkubation der TZellen.
feration und der verringerten Suppression
kokultivierter Responder T-Zellen beiträgt
(Abb. 13, Abb. 14).
Wie Simone et al. anhand humaner CD4+ T-Zellen beschrieben, kann durch TLR-Liganden
auch die Oberflächenexpression von Molekülen der CD28-Familie beeinflusst werden.
Beispielsweise steigern TLR3,-4,-5-Liganden die Oberflächenexpression von PD-1 und
CTLA-4 (Simone et al. 2009). In vorliegender Arbeit konnte nach TLR2-LigandenVorinkubation der T-Zellen ebenfalls eine Modulation der PD-1- und CTLA-4-Expression
festgestellt werden. Die verringerte Oberflächenexpression beider Moleküle auf den
vorinkubierten T-Zellen steht im Gegensatz zu den Ergebnissen von Simone et al., was
aber durch die Stimulation unterschiedlicher TLR erklärt werden kann (Abb. 14).
Zusammenfassend konnte in vorliegender Arbeit gezeigt werden, dass ein TLR2-Stimulus
bei T-Zellen ähnlich wie bei DZ zur verstärkten Oberflächenexpression von Molekülen wie
CD80, -83, -86, PD-L1 und HLA-DR führt, die mit APZ (bzw. APZ-Funktionen) in Zusammenhang stehen (Abb. 10, Abb. 11). Diese verstärkte Expression kann zur gesteigerten
Proliferation von - und kokultivierten Responder T-Zellen beitragen. Die Aufhebung der
Suppression durch TLR2-Liganden korreliert also mit einer verstärkten Expression
- 96 -
- Diskussion kostimulatorischer Oberflächenmoleküle und weist daher eher Parallelen zu Charakteristika
immunsuppressiver myeloider DZ (Amodio & Gregori 2012) als zu denen von Treg auf.
In vorliegender Arbeit konnte weiterhin bei Kokultivierung von TLR2-Liganden-vorinkubierten
- mit Responder T-Zellen in beiden Zellpopulationen eine verstärkte Phosphorylierung der
Signalmoleküle AKT und NF-B/p65 festgestellt werden. Da die Responder T-Zellen nicht
direkt mit TLR2-Liganden in Berührung kamen, muss bei diesen die verstärkte Phosphorylierung durch die vorinkubierten T-Zellen induziert worden sein. Dazu trug möglicherweise
die TLR2-Liganden-bedingt verstärkte Expression von CD86 und PD-L1 auf T-Zellen bei.
Außerdem war auf Responder T-Zellen die Oberflächenexpression von CD28 verstärkt und
die von PD-1 und CTLA-4 verringert (Abb. 28). CTLA-4 und PD-1 verringern und CD28
verstärkt die Phosphorylierung von ATK und NF-B/p65. Der Mechanismus durch den die
untersuchten Oberflächenmoleküle die Phosphorylierung verschiedener Signalmoleküle
beeinflussen können ist in Kapitel 7.7 detailliert erläutert.
7.7.
TLR2-Liganden steigern die Phosphorylierung von Signalmolekülen
TZR-Stimulation mit anti-CD3 mAk oder einem Phosphoantigen führt in T-Zellen zur
Phosphorylierung von ERK2, p38 und AKT (an Serin 473) (Correia et al. 2009; Beetz et al.
2008; Lafont et al. 2001). Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Phosphorylierung dieser
Signalmoleküle ebenfalls nach anti-CD3,-28 mAk- bzw. A/E-Partikel-Stimulation von
T-Zellen festgestellt werden. Außerdem wurde hierbei auch die Phosphorylierung von AKT
am Threonin 308 sowie die von NF-B nachgewiesen (Abb. 17, Abb. 18). Bei den Untersuchungen zum Einfluss von TLR2-Liganden auf T-Zellen wurde eine verstärkte
Phosphorylierung von Signalmolekülen des PI3K/AKT- (AKT), NF-B- (NF-B/p65) und
MAP-Kinase-Signalweges (p38, ERK) nur festgestellt, wenn die T-Zellen zusätzlich über
den TZR stimuliert wurden. Die TLR2-Liganden-Vorinkubation induzierte in Abwesenheit
eines TZR-Stimulus keine Phosphorylierung (Daten nicht gezeigt, Abb. 17, Abb. 18). Diese
Beobachtung bestätigt auf Ebene der Signalmolekül-Phosphorylierung die Ergebnisse der
vorliegenden Arbeit und aus vorangegangenen Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe,
denen zufolge TLR2-Liganden kostimulatorische Effekte (auf die Produktion verschiedener
löslicher Mediatoren) besitzen, alleine aber deren Produktion nicht induzieren können (Abb.
15) (Pietschmann et al. 2009).
Wie bereits erwähnt, konnte wie zuvor von unserer Arbeitsgruppe für nTreg beschrieben
(Oberg et al. 2010) in vorliegender Arbeit die T-Zell-vermittelte Suppression durch TLR2Liganden teilweise aufgehoben werden. Im Unterschied zu nTreg, kam es allerdings
unmittelbar
nach
Stimulation
TLR2-Liganden-vorinkubierter
T-Zellen
zu
keiner
gesteigerten AKT-Phosphorylierung an Serin 473. Stattdessen wurde eine signifikant höhere
Phosphorylierung des Threonin 308 festgestellt (Abb. 17, Abb. 18). Peng et al. konnten
- 97 -
- Diskussion weiterhin zeigen, dass die suppressive Funktion tumorinfiltrierender V1 T-Zellen durch
Applikation von TLR8-Liganden aufgehoben werden kann. Diese Aufhebung konnte
wiederum mit Hilfe eines siRNA-vermittelten p38-knockdowns komplett blockiert werden
(Peng et al. 2007). Die in vorliegender Arbeit beobachtete TLR2-Liganden-abhängig
verstärkte Phosphorylierung von AKT und p38 in T-Zellen spielt vermutlich eine zentrale
Rolle bei der Aufhebung der suppressiven Funktion der T-Zellen (Abb. 17, Abb. 18).
TLR2 kann die Aktivierung von PI3K verstärken und somit die AKT-Phosphorylierung am
Threonin 308 bewirken (Troutman et al. 2012; Santos-Sierra et al. 2009). Dementsprechend
konnte in vorliegender Arbeit eine TLR2-Liganden-bedingt verstärkte Phosphorylierung von
AKT an Threonin 308 direkt nach Stimulation der T-Zellen festgestellt werden. Die AKTPhosphorylierung an Serin 473 wird durch TZR-Stimulation induziert, von mTORC2 vermittelt
und durch TLR-Signale nicht beeinflusst. Wie daher zu erwarten, wurde nach initialer
Stimulation eine TLR2-Liganden-abhängig verstärkte Serin 473-Phosphorylierung nicht
beobachtet. Für die Funktion von AKT besitzt die Phosphorylierung an Threonin 308 die
größere Bedeutung. So konnten Vincent et al. in humanen Lungenkrebszellen (non-smallcell lung carcinoma) zeigen, dass nur die Phosphorylierung an Threonin 308 direkt mit der
Phosphorylierung der AKT-Substrate korreliert und von größerer funktioneller Wichtigkeit ist
als die an Serin 473 (Vincent et al. 2011).
Die festgestellte initial gesteigerte Threonin 308-Phosphorylierung von AKT korrelierte des
Weiteren mit einem höheren proliferativen Potential der TLR2-Liganden-vorinkubierten
T-Zellen (Abb. 13). AKT kann verschiedene Proteine (wie z.B. cyclin-dependent inhibitor
1A (p21Cip1), cyclin-dependent inhibitor 1B (p27Kip1) und GSK-3), die dem Fortschreiten des
Zellzyklus entgegenwirken, phosphorylieren und dadurch inaktivieren. Auf diese Weise kann
AKT den Zellzyklus initiieren bzw. dessen Fortschreiten gewährleisten und steht daher mit
der Zellproliferation in Zusammenhang (Hers et al. 2011; Shin et al. 2002; Rossig et al.
2001). In TZR-stimulierten T-Zellen ist die Phosphorylierung von AKT (Serin 473) sowie
die von GSK-3 beschrieben worden (Correia et al. 2009). In vorliegender Arbeit ließ sich in
proliferierenden solo- und kokultivierten bzw. Responder T-Zellen eine positive
Korrelation zwischen AKT-Phosphorylierung und Zellvermehrung feststellen (Abb. 19). Eine
erhöhte Proliferation von solo- und kokultivierten TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen
ging mit einer verstärkten Phosphorylierung von AKT an Threonin 308, aber auch an
Serin 473 einher. Während bei Kokultur mit T-Zellen die Phosphorylierung von AKT
(Thr 308, Ser 473) in Responder T-Zellen reduziert war, zeigte sich bei Kokultur mit TLR2Liganden-vorinkubierten T-Zellen in Responder T-Zellen eine nahezu vollständig wiederhergestellte AKT-Phosphorylierung. Wahrscheinlich war bei Kokultur die Phosphorylierung in
Responder T-Zellen durch den Einfluss inhibitorischer Korezeptoren negativ beeinflusst.
Infolge der TLR2-Liganden-Vorinkubation war deren Expression verringert und die von
- 98 -
- Diskussion kostimulatorischen Molekülen wie CD28 und CD86 stattdessen verstärkt (Abb. 19). CTLA-4
rekrutiert die Phosphatase PP2A, wodurch hauptsächlich die Dephosphorylierung von AKT
am Threonin 308 vermittelt wird (Kuo et al. 2008; Parry et al. 2005). Des Weiteren können
sowohl CTLA-4 als auch PD-1 die Phosphatase SHP-2 rekrutieren (Parry et al. 2005;
Marengere et al. 1996; Chuang et al. 2000). Die TLR2-Liganden-bedingt verringerte
Expression von CTLA-4 und PD-1 kann daher zur verstärkten Phosphorylierung von AKT an
Threonin 308, aber auch zu der von PI3K und TZR-proximalen Kinasen und somit zur
verstärkten Phosphorylierung von AKT an Threonin 308 und Serin 473 führen. Die
verstärkten Expression von CD28 auf Responder T-Zellen und von dessen Ligand CD86 auf
TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen führt in Responder T-Zellen zur Aktivierung der
PI3K und somit zur Phosphorylierung von AKT an Threonin 308 (Abb. 19). Vermutlich wird
also die Phosphorylierung von AKT an Threonin 308 und Serin 473 und damit auch die
Proliferation der Zellen bei Kokultivierung durch die Interaktion von positiv- und negativkostimulatorischen Oberflächenmolekülen moduliert. Die verstärkte Expression von positivund die verringerte von negativ-kostimulatorischen Oberflächenmolekülen bei Kokultur mit
TLR2-Liganden-vorinkubierten T-Zellen kann daher die verstärkte AKT-Phosphorylierung
und somit auch die verstärkte Proliferation bedingen.
Mit Hilfe der Phospho-Array-Analyse der Phosphorylierungszustände verschiedener Signalmoleküle (Proteome Profiler™ Phospho-MAPK Array) wurde keine gesteigerte AKTPhosphorylierung nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Ein Einfluss der TLR2-LigandenVorinkubation wurde hierbei ebenfalls nicht beobachtet (Abb. 16). Diese Beobachtung steht
im Gegensatz zu den durchflusszytometrischen und Western blot-Untersuchungen, die eine
deutliche Zunahme der AKT-Phosphorylierung nach Stimulation der T-Zellen zeigten
(Abb. 17, Abb. 18). Die Unterschiede begründen sich vermutlich in einer unterschiedlichen
Spezifität der Antikörper, die bei der verwendeten Phospho-Array-Analyse z.B. nur die AKT
Serin-Phosphorylierung nachweisen konnten. Des Weiteren wurden bei der Phospho-ArrayAnalyse die Antikörper-beschichteten Platten über Nacht direkt mit den Zelllysaten inkubiert,
was möglicherweise auch zu einem Rückgang der Phosphorylierung geführt haben kann.
Die Analyse durch einen Phospho-Array kann also lediglich als ein erster Hinweis auf den
Phosphorylierungszustand von Signalmolekülen gesehen werden, sollte aber in jeden Fall
durch andere spezifischere Methoden überprüft werden.
Moleküle des MAP-Kinase-Signalweges spielen eine Rolle bei vielen zellulären Prozessen.
p38 wird vor allem durch Zellstress oder inflammatorische Zytokine aktiviert. ERK steht vor
allem mit Zellproliferation und Wachstumsfaktoren im Zusammenhang (Rincon et al. 2000).
Anhand Druckwellen-behandelter T-Zellen konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte p38Phosphorylierung ebenfalls mit verstärkter Proliferation korrelieren kann (Yu et al. 2010). In
vorliegender Arbeit konnte in anti-CD3,-28 mAk-stimulierten T-Zellen die Phosphorylierung
- 99 -
- Diskussion von ERK und p38 festgestellt werden (Abb. 17, Abb. 18). Mit Hilfe einer Phospho-ArrayAnalyse der Phosphorylierungszustände konnte festgestellt werden, dass spezifisch p38
phosphoryliert wurde (Abb. 16). Die Induktion von p38 durch Zellstress konnte ebenfalls bei
Stimulation der T-Zellen beobachtet werden. Obwohl die Zellen bei 37°C über Nacht
ruhten, wiesen auch unstimulierte Zellen zu Beginn der Untersuchung kurzzeitig eine erhöhte
p38-Phosphorylierung auf. Diese Phosphorylierung war aber im Vergleich zu der durch TZRStimulation induzierten deutlich weniger stabil und ging schnell wieder zurück. Da
unstimulierte Zellen grundsätzlich keine Proliferation oder Effektorfunktionen aufwiesen, war
die transiente p38-Expression hierfür vermutlich nicht relevant (Abb. 17, Abb. 18). Des
Weiteren konnte in vorliegender Arbeit nach Stimulation TLR2-Liganden-vorinkubierter
T-Zellen eine gesteigerte Phosphorylierung von p38() und ERK2 beobachtet werden (Abb.
16, Abb. 17, Abb. 18). TLR-Signale können durch die Kinase TAK an MAP-Kinasen weitergegeben werden (Huang et al. 2009; Rincon et al. 2000) und auf diese Weise die
Phosphorylierung von ERK und p38 verstärken. Da ERK und p38 wie bereits erwähnt in
Zusammenhang mit Zellproliferation stehen, trägt deren TLR2-Liganden-bedingt gesteigerte
Phosphorylierung vermutlich ebenfalls zu dem in dieser Arbeit festgestellten gesteigerten
proliferativen Potential vorinkubierter Zellen bei (Abb. 13).
Die Aktivierung von ERK oder p38 kann jeweils in der Aktivierung des Transkriptionsfaktors
AP-1 münden, der viele zelluläre Prozesse wie Differenzierung, Proliferation und Apoptose
beeinflussen kann (Rincon et al. 2000; Huang et al. 2009). AP-1 ist u.a. auch für die
Induktion von TNF- und IL-1 von Bedeutung (Kyriakis & Avruch 2001). In T-Zellen führt
die Phosphorylierung der Signalmoleküle p38 und ERK2 nach TZR-Stimulus unter anderem
zur Produktion von IFN- und TNF- (Beetz et al. 2008; Correia et al. 2009). Die in
vorliegender Arbeit festgestellte TLR2-bedingt gesteigerte ERK- und p38-Phosphorylierung
in TZR-stimulierten T-Zellen ließ sich ebenfalls mit einer gesteigerten Produktion von
TNF- korrelieren (Abb. 15, Abb. 17, Abb. 18). Für p38 ist eine Rolle bei der Regulation der
Expression von Th1 spezifischen Zytokinen beschrieben worden. Bei Verwendung eines
spezifischen p38-Inhibitors wurde die Produktion von IFN- in Th1-Zellen, nicht aber die
Produktion spezifischer Zytokine in Th2-Zellen inhibiert (Rincon et al. 1998). Li et al. konnten
anhand von murinen T-Zellen zeigen, dass die IFN--Expression nach Stimulation mit antiCD3 mAk bei zusätzlichem TLR2-Stimulus erhöht ist. Aus Ergebnissen von Inhibitor-Studien
schlossen sie auf eine Beteiligung von p38 und ERK an dem TLR2-induzierten Effekt (Li et
al. 2012). In vorliegender Arbeit konnte ebenfalls bei TLR2-Liganden-vorinkubierten
T-Zellen eine gesteigerte Produktion und Freisetzung von IFN- beobachtet werden (Abb.
15). Eine mögliche Interpretation wäre, dass durch TLR2-Agonisten die Th1-Differenzierung
der T-Zellen unterstützt wird. Gegen diese Theorie spricht allerdings, dass es in TLR2-
- 100 -
- Diskussion Liganden vorinkubierten T-Zellen zu einer vergleichsweise schwächeren Expression von
T-bet kam (Abb. 22).
Mitchell et al. konnten in murinen DZ demonstrieren, dass für deren TLR-induzierte
Chemokinproduktion (u.a. CCL5 und CCL3) ebenfalls p38 und ERK eine Rolle spielen, aber
vor allem NF-B notwendig ist (Mitchell & Olive 2010). Die in vorliegender Arbeit festgestellte
TLR2-induziert verstärkte Zytokinproduktion lässt sich Kawai und Akria zufolge vermutlich
hauptsächlich auf die gesteigerte Phosphorylierung von NF-B zurückzuführen (Kawai &
Akira 2011). In vorliegender Arbeit wurde zudem die Phosphorylierung der p65-Untereinheit
von NF-B analysiert, da diese hauptverantwortlich für das Transkriptions-aktivierende
Potential von NF-B ist (Schmitz & Baeuerle 1991). Es wurden die am besten charakterisierten und funktionell bedeutendsten Phosphorylierungsstellen von NF-B/p65 an Serin 529
und 536, die sich im Bereich der C-terminalen Transaktivierungsdomäne (TAD) befinden,
analysiert. Anhand der Stimulation durch IL-1 oder TNF- ist gezeigt worden, dass Serin 529
durch die Casein Kinase 2 (CK2), Serin 536 hingegen durch IKKs phosphoryliert wird (Chen
& Greene 2004). Bei Untersuchung des Einfluss von TLR2-Liganden auf die NF-BPhosphorylierung in T-Zellen wurde in vorliegender Arbeit vor allem eine verstärkte
Phosphorylierung von Serin 536 erwartet, da beschrieben ist, dass TLR-Signale zur
Aktivierung von IKKs führen (Bhoj & Chen 2009). Es wurde allerdings eine verstärkte
Phosphorylierung an Serin 536, aber auch an Serin 529 beobachtet (Abb. 17, Abb. 18). Die
in vorliegender Arbeit ebenfalls festgestellte TLR2-Liganden-induzierte Verstärkung der p38Phosphorylierung kann zu einer gesteigerten Aktivierung von CK2 führen. Da CK2 NF-B an
Serin 529 phosphoryliert, könnte auf diese Weise die NF-B Serin 529-Phosphorylierung
durch TLR2-Liganden indirekt beeinflusst werden (Abb. 18) (Sayed et al. 2000; Chen &
Greene 2004). TLR2-Signale können also möglicherweise über eine verstärkte p38Phosphorylierung auch indirekt die Phosphorylierung von NFB/p65 verstärken. Sowohl die
Phosphorylierungen von NFB/p65 an Serin 529 als auch an Serin 536 ist notwendig für eine
effiziente NF-B-induzierte Transkription (Chen & Greene 2004). Des Weiteren ist (in
humanen 293T Zellen bzw. Nagetier-Fibroblasten) eine Aktivierung von NF-B/p65 durch
den PI3K/AKT-Signalweg beschrieben worden. Für die Aktivierung von NF-B ist
Phosphorylierung von AKT an Threonin 308 notwendig (Madrid et al. 2000). Durch
Aktivierung von IKK2 kann AKT die Phosphorylierung von NF-B/p65 initiieren bzw. steigern
(Ozes et al. 1999; Romashkova & Makarov 1999). Die in dieser Arbeit festgestellte TLR2bedingt gesteigerte AKT-Phosphorylierung in T-Zellen könnte also zu der gesteigerten
NF-B/p65-Phosphorylierung führen. Unter Umständen lässt sich auch die verstärkte NF-BPhosphorylierung in mit diesen kokultivierten Responder T-Zellen auf deren gesteigerte AKT-
- 101 -
- Diskussion Phosphorylierung zurückzuführen (Abb. 19). Der Einfluss von TLR2 auf verschiedene
Signalmoleküle ist in Abbildung 29 schematisch zusammengefasst.
Abb. 29: Vereinfachte schematische Darstellung des Einflusses von TLR2 auf die in TZellen untersuchten Signalmoleküle und deren Interaktion mit verschiedenen Signalwegen.
Sterne stellen Phosphorylierungsstellen dar, wobei die funktionell weniger bedeutsamen grau
eingefärbt sind. Die gestrichelten Linien stellen indirekte Effekte durch Modulation von
Oberflächenmolekülen dar.
Die Ergebnisse zur Phosphorylierung der Signalmoleküle, die durch Western blot-Analysen
und durch durchflusszytometrische Untersuchung erhalten wurden, sind in der Qualität ihrer
Aussage gleich. Allerdings konnte mit Hilfe der durchflusszytometrischen Analyse die Signalmolekül-Phosphorylierung auch in kokultivierten Zellpopulationen untersucht werden.
Außerdem scheint die durchflusszytometrische Analyse sensitiver zu sein, da anders als bei
Western blot-Untersuchungen auch leichte Unterschiede in der Phosphorylierung der Signalmoleküle deutlich zu erkennen waren. Die Ergebnisse der beiden Untersuchungsmethoden
unterscheiden sich vor allem bezüglich des zeitlichen Verlaufs der Abnahme der
Phosphorylierung. Bei durchflusszytometrischer Untersuchung wurde auch nach 30 Minuten
noch eine deutliche Phosphorylierung von AKT (pS473 und pT308), NFB/p65 (pS529),
ERK1/2 (pT202, pY204 bzw. pT185, pY187) und p38 (pT180, pY182) nachgewiesen,
wohingegen im Western blot diese bei AKT (pS473 und pT308), NFB/p65 (pS536), ERK1/2
(T202, Y204) und p38 (T180, Y182) zu diesem Zeitpunkt nur noch schwach vorhanden war
- 102 -
- Diskussion (Abb. 17; Abb. 18). Die beobachteten Unterschiede können unter Umständen auch auf
Unterschiede in der Methodik zurückzuführen sein. Bei der Western blot-Analyse wurden
höhere Zellzahlen (0,5*106) als bei der durchflusszytometrischen (0,2*106) verwendet.
Außerdem wurde die Stimulation durch Hinzufügen von eiskaltem PBS, anschließendes
Zentrifugieren
und
Lysieren
der
Zellen
beendet,
wohingegen
dies
für
die
durchflusszytometrische Untersuchung durch direkte Fixierung der Zellen geschah. Durch
die direkte Fixierung wurde bei der durchflusszytometischen Untersuchungsmethode
möglicherweise die Aktivität von Phosphatasen besser und schneller inhibiert, wodurch der
langsamere Rückgang der Phosphorylierung zu erklären wäre.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass TLR2-Liganden-induzierte Effekte in
T-Zellen nur eine kostimulatorische Funktion besitzen und zusätzlich einen TZR-Stimulus
benötigen. TLR2-Signale selbst konnten keine Effektorfunktionen oder Zellproliferation
auslösen, waren aber in der Lage diese bei einem vorhandenen TZR-Stimulus deutlich zu
verstärken, wobei sowohl der PI3K/AKT-, der MAPK- als auch der NFB-Signalweg involviert
waren. Das erhöhte proliferative Potential in Folge der TLR2-Liganden-Vorinkubation der
T-Zellen lässt sich durch eine erhöhte Phosphorylierung von AKT (an Threonin 308) und der
MAP-Kinasen p38 und ERK begründen. Die gesteigerte Produktion proinflammatorischer
bzw. Th1-charakteristischer Zytokine wie IFN- kann in Zusammenhang mit der verstärkten
Phosphorylierung von NF-B und auch von p38 gesetzt werden. Die Produktion von
Chemokinen wie CCL5 und CCL3 steht vor allem mit NF-B aber auch p38 und ERK in
Zusammenhang. Die einzelnen betrachteten Signalwege weisen untereinander zahlreiche
Interaktionen auf.
7.8.
T-Zellen exprimieren Helios
In vorliegender Arbeit konnte, wie von Akimova et al. beschrieben, nur bei einem geringen
Anteil (< 10 %) der frisch isolierten Responder T-Zellen eine Helios-Proteinexpression nachgewiesen werden (Abb. 20) (Akimova et al. 2011). Im Gegensatz zu Responder T-Zellen
wies ein größerer Teil der frisch isolierten T-Zellen eine Helios-Proteinexpression auf.
Auch bei gleicher Stimulation beider Zellpopulationen (A/E-Partikel-Stimulation) wurde nur in
T-Zellen die Helios-Proteinexpression induziert (Abb. 21). T-Zellen unterscheiden sich
in ihrer Entwicklung von CD4+ T-Zellen und verlassen anders als diese den Thymus bereits
während des DN (CD4-CD8-) -Stadiums der Thymozytenentwicklung. Im Thymus wird Helios
stark im DN- und schwächer im DP (CD4+CD8+) -Stadium exprimiert (Kelley et al. 1998;
Hahm et al. 1998). Cai et al. konnten keinen Einfluss von Helios auf die T-Zell-Entwicklung
und -Funktion in Helios-defizienten Mäusen feststellen (Cai et al. 2009). Zhang et al. konnten
allerdings zeigen, dass die Überexpression von Helios die Entwicklung von T-Zellen
blockiert und zu einer erhöhten Anzahl von T-Zellen (und NK-Zellen) führt (Zhang et al.
- 103 -
- Diskussion 2007). Da der Großteil Helios-defizienter Mäuse innerhalb der ersten Lebenswochen stirbt,
kann man vermuten, dass in den von Cai et al. untersuchten adulten Mäusen die HeliosFunktion durch andere Mitglieder der Ikaros-Familie übernommen und somit kompensiert
wurde. Vermutlich geben daher die Untersuchungen von Zhang et al. einen besseren
Hinweis auf die Funktion von Helios. Die in vorliegender Arbeit festgestellten Unterschiede in
der Helios-Proteinexpression zwischen - und Responder T-Zellen lassen sich also
möglicherweise auf die unterschiedliche thymische Entwicklung zurückführen.
Akimova et al. beschrieben, dass murine Helios- CD4+- bzw. CD8+ T-Zellen im Vergleich zu
Helios+ Zellen tendenziell einen eher naiven Phänotyp aufweisen. Akimova et al. zeigten
allerdings auch, dass bei Kokultivierung von CD4+ T-Zellen mit Treg Helios+ CD4+ T-Zellen
eine CD45RA-Oberflächenexpression aufweisen (Akimova et al. 2011). In dieser Arbeit
konnte bei frisch isolierten T-Zellen innerhalb naiver T-Zellen (CD27+CD45RA+) eine
deutliche Akkumulation von Helios+ Zellen beobachtet werden (Abb. 23, A). Es ist nicht
auszuschließen, dass sich die Unterschiede zu den von Akimova et al. gemachten
Beobachtungen aufgrund der abweichenden Definition für naive T-Zellen ergeben. Während
Akimova et al. zwar ebenfalls die CD45-Oberflächenexpression zur Charakterisierung
humaner naiver T-Zellen verwendeten, wurde die CD27-Oberflächenexpression hierbei nicht
berücksichtig. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass CD27-CD45RA+ TEMRA in die
Untersuchung der CD27+CD45RA+ naiven T-Zellen mit eingingen.
7.9.
Die Expression von Helios in T-Zellen hat keinen direkten Einfluss
auf ihre regulatorische Funktion
In vorliegender Arbeit konnte gezeigt werden, dass ähnlich wie nTreg auch ein erheblicher
Anteil (ca. 30 %) frisch isolierter T-Zellen den Transkriptionsfaktor Helios exprimiert (Abb.
20). Helios wurde von verschiedenen Gruppen mit Treg in Zusammenhang gebracht (Getnet
et al. 2010; Hill et al. 2007; Sugimoto et al. 2006; Thornton et al. 2010; Zheng et al. 2007;
Zheng & Rudensky 2007). Thornton et al. beschrieben Helios als ein für nTreg
charakteristisches Molekül, welches nicht von iTreg exprimiert wird (Thornton et al. 2010).
Von anderen Arbeitsgruppen aber wurde festgestellt, dass Helios auch in in vitro induzierten
iTreg exprimiert werden kann und dass die Art des verwendeten Stimulus hierfür
entscheidend ist (Akimova et al. 2011; Gottschalk et al. 2012; Verhagen & Wraith 2010). In
der Maus konnte die Induzierbarkeit von Helios zusammen mit Foxp3 in iTreg in vivo gezeigt
werden. Dies und die anschließend lange stabile Helios-Proteinexpression stellen Helios als
nTreg-Differenzierungsmarker in Frage (Gottschalk et al. 2012). Auch scheint die
Proteinexpression von Helios selbst vermutlich nicht mit einer regulatorischen Funktion in
direktem Zusammenhang zu stehen. Thorton et al. wiesen bei Treg aus Helios-defizienten
Mäusen normale regulatorische Funktionen nach. Ebenso waren humane Treg, obwohl
- 104 -
- Diskussion deren Helios-Proteinexpression durch siRNA herunterreguliert war, weiterhin suppressiv
(Thornton et al. 2010). Diese These unterstützend ist Expression von Helios nicht auf Foxp3exprimierende Zellen beschränkt und konnte auch in CD4+ und CD8+ Foxp3- T-Zellen gezeigt
werden. Auch in vorliegender Arbeit wurde festgestellt, dass die Helios-Proteinexpression
nicht mit der von Foxp3 korreliert. Frisch isolierte T-Zellen exprimieren Helios unabhängig
von Foxp3. Auch nach deren Aktivierung war die Helios-Proteinexpression nicht an die von
Foxp3 gebunden (Abb. 20, Abb. 22). Bei Untersuchungen zur Suppressivität expandierter
T-Zellen stand bei A/E-Partikel-(Re-)stimulation der Zellen die Helios-Proteinexpression
ebenfalls in keinem Zusammenhang mit deren suppressiven Potential (Abb. 25).
7.10. CD28-Kostimulation induziert die Helios-Expression
Wie bereits erwähnt ist die Induktion der Helios-Proteinexpression höchstwahrscheinlich
abhängig von der verwendeten Stimulationsmethode. Es ist bekannt, dass es in Treg ex vivo
und auch in vivo zu einer Abnahme der Helios-Proteinexpression kommt, die vermutlich
durch die Abwesenheit von Ag-spezifischen Interaktionen mit APZ bzw. von kostimulatorischen Signalen durch diese bedingt ist. In murinen iTreg ist die Anwesenheit von APZ
ebenfalls essentiell für die Induktion der Helios-Proteinexpression. Durch Stimulation mit
plattengebundenem
anti-CD3 mAk
oder
einem
TZR-spezifischen
Peptid
kann
in
Anwesenheit von APZ die Helios-Proteinexpression induziert werden (Akimova et al. 2011;
Gottschalk et al. 2012). Diese Untersuchungen weisen auf die Notwendigkeit eines APZKostimulus für die Helios-Proteinexpression hin. Weder Gottschalk et al. noch Verhagen et
al. konnten bei Generierung muriner iTreg nach Stimulation mit anti-CD3 und Kostimulation
durch anti-CD28 mAk eine Induktion von Helios beobachten (Gottschalk et al. 2012;
Verhagen & Wraith 2010). Im Widerspruch zu diesen Ergebnissen steht die Tatsache, dass
Akimova et al. bei Stimulation muriner T-Zellen oder PBMZ durch anti-CD3 und antiCD28 mAk die Induktion der Helios-Proteinexpression feststellen konnten. Zabransky et al.
konnten ebenfalls eine Helios-Induktion bei Stimulation naiver muriner CD4+ T-Zellen mit
anti-CD3,-28 mAk-umhüllten Partikeln im Zuge der Generierung von iTreg beobachten
(Akimova et al. 2011; Zabransky et al. 2012).
Die in dieser Arbeit gemachten Beobachtungen sprechen in Übereinstimmung mit den von
Akimova et al. und Zabansky et al. durchgeführten Untersuchungen für eine Induktion der
Helios-Proteinexpression bei Stimulation durch anti-CD3,-28 mAk. Bei Kostimulation mit
löslichem anti-CD28 mAk konnte ebenfalls die Induktion von Helios beobachtet werden, die
allerdings weniger stark ausgeprägt war (Daten nicht gezeigt). Zwischen Induktion der
Helios-Proteinexpression und CD28-Kostimulation konnte ein direkter Zusammenhang
hergestellt werden. Bei Verwendung von A/E-Partikeln die nur mit anti-CD3 und nicht mit
anti-CD28 mAk umhüllt waren, kam es anders als bei anti-CD3,-CD28 mAk-umhüllten A/EPartikeln zu keiner gesteigerten Helios-Proteinexpression (Abb. 22, Abb. 23). Diese
- 105 -
- Diskussion Ergebnisse sprechen dafür, dass die CD28-Kostimulation für die Induktion von Helios
verantwortlich ist. Diese Induktion war bei BrHPP-stimulierten T-Zellen wesentlich
schwächer ausgeprägt. Dies kann möglicherweise auf eine geringere CD28-Kostimulation
bei der BrHPP-Stimulation (durch die hierbei anwesenden PBMZ) zurückgeführt werden
(Abb. 22). In dieser Arbeit wurden zur Induktion regulatorischer T-Zellen u.a. vergleichbarere Zellkulturbedingungen wie in Experimenten von Gottschalk et al. und Verhagen et al.
zur Induktion von iTreg verwendet. Auch unter diesen Bedingungen konnte die direkte
Abhängigkeit der Helios-Induktion vom Vorhandensein eines CD28-Kostimulus festgestellt
werden (Abb. 22, Abb. 23) (Gottschalk et al. 2012; Verhagen & Wraith 2010). Die TLR2abhängig gesteigerte Helios-Proteinexpression unterstützt die Auffassung, dass TLR2Stimulation einen (nur) kostimulatorischen Einfluss auf T-Zellen hat (Abb. 21).
Ferner ließ sich die in vorliegender Arbeit beschriebene verstärkte Helios-Proteinexpression
nicht wie von Akimova et al. vorgeschlagen mit dem Maße der Proliferation der Zellen
korrelieren (Akimova et al. 2011). Obwohl in vorliegender Arbeit die Responder T-Zellen in
Solokultur eine im Vergleich zu T-Zellen stärkere Proliferation aufwiesen, konnte trotzdem
weder in Solo- noch in kokultivierten Responder T-Zellen eine nennenswerte HeliosProteinexpression nachgewiesen werden (Abb. 21). Bei T-Zellen korrelierte die HeliosProteinexpression ebenso wenig mit einer gesteigerten Proliferation. Auch die im Vergleich
zur A/E-Partikel-Stimulation stärkere Proliferation von T-Zellen nach BrHPP-Stimulation
korrelierte nicht mit einer stärkeren Helios-Proteinexpression (Abb. 24). Auch konnte anders
als von Akimova et al. für CD4+ und CD8+ T-Zellen beschrieben in vorliegender Arbeit kein
Helios-induzierender Einfluss von IL-2 in T-Zellen beobachtet werden (Akimova et al.
2011). Allerdings war bei Anwesenheit von IL-2 (nur in A/E-Partikel-stimulierten) in
T-Zellen die Induktion von Helios verstärkt (Abb. 21). Möglicherweise hat IL-2 also einen
positiven Einfluss auf die CD28-induzierte Helios-Proteinexpression. Die bekanntermaßen
durch CD28-Kostimulation gesteigerte Stabilität der IL-2-mRNA kann möglicherweise zu
einer positiven Rückkopplung führen und die Helios-Expression zusätzlich verstärken.
7.11. Kostimulation durch CD28 steht im Zusammenhang mit der
Induktion von regulatorischen Funktionen in T-Zellen
In vorangegangenen Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnte beobachtet werden,
dass frisch isolierte, mit BrHPP stimulierte T-Zellen in der Lage sind in Anwesenheit von
B-Zellen und Monozyten (E-APZ) die durch SEA/B induzierte Proliferation von CD4+ T-Zellen
zu supprimieren. Es wurde gefolgert, dass für die beschriebene T-Zell-vermittelte
Suppression die Anwesenheit von APZ essentiell ist (Traxlmayr et al. 2010). Möglicherweise
ist also die alleinige Aktivierung der T-Zellen nicht ausreichend zur Induktion von
suppressiver Aktivität, sondern es ist zusätzlich ein APZ-vermittelter Kostimulus notwendig.
- 106 -
- Diskussion Statt der Stimulation in Anwesenheit von APZ wurden in dieser Arbeit zur Stimulation der
Zellen u.a. A/E-Partikel verwendet. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Stimulation
durch diese ausreichend zur Etablierung einer T-Zell-vermittelten Suppression von
Responder T-Zellen war (Abb. 6). Da die Zellen zusätzlich zum TZR-Stimulus (antiCD3 mAk) nur einen CD28-Kostimulus erhielten, kann man auf eine zentrale Rolle von CD28
bei der Entstehung der beobachteten Suppression schließen. Bei Restimulation BrHPP- oder
A/E-Partikel-expandierter T-Zellen (in Anwesenheit von IL-2) durch A/E-Partikel konnte
ebenfalls ein suppressiver Effekt auf die Proliferation der Responder T-Zellen beobachtet
werden. Dieser war vergleichbar mit dem durch frisch isolierte T-Zellen vermittelten
suppressiven Effekt (Abb. 6, Abb. 25).
Im Gegensatz zur A/E-Partikel-Stimulation konnten frisch isolierte T-Zellen nach BrHPPStimulation die Proliferation kokultivierter SE-Gemisch-stimulierter Responder T-Zellen nicht
supprimieren (Abb. 6, Daten nicht gezeigt). Des Weiteren waren mit Hilfe von BrHPP bzw.
A/E-Partikeln (in Anwesenheit von IL-2) expandierte T-Zellen nach BrHPP-Restimulation
ebenfalls nicht in der Lage die Proliferation von SE-Gemisch-stimulierten Responder
T-Zellen zu inhibieren. Stattdessen war in diesem Fall die Proliferation der T-Zellen selbst
deutlich eingeschränkt (Abb. 25). Eine mögliche Ursache für die Unterschiede der im
Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente zu den von Traxlmayr et al. gemachten
Beobachtungen liegt in der Verwendung eines SE-Gemisches anstatt von einzelnen SE.
Durch das SE-Gemisch wurden verhältnismäßig deutlich mehr CD4+ T-Zellen aktiviert und es
kam zu einer verstärkten Zytokinausschüttung, welche wiederum einer Suppression
entgegenwirkte. Wie schon erwähnt, scheint die BrHPP-Stimulation nur mit einem
schwachen CD28-Kostimulus verbunden zu sein. Möglicherweise ist dieser Kostimulus bei
starker Aktivierung einer großen Anzahl von CD4+ T-Zellen nicht ausreichend um eine
Suppression zu etablieren. Ein starker CD28-Kostimulus ist also vermutlich ein
entscheidender Faktor für die Entstehung der in vorliegender Arbeit beschriebenen
Suppression bei A/E-Partikel-Stimulation.
7.12. TGF- führt zur Induktion von Foxp3 in T-Zellen, nicht aber
notwendigerweise zu einem regulatorischen Phänotyp
Wie in vorliegender Arbeit gezeigt werden konnte exprimieren T-Zellen kein Tregspezifisches Foxp3 (259D), auch nicht nach Aktivierung über den TZR oder bei einem
zusätzlichem Kostimulus (Abb. 21, Abb. 23). Casetti et al. und Li et al. konnten
demonstrieren, dass es möglich ist die Foxp3-Proteinexpression in V2 bzw. V1 T-Zellen
zu induzieren (Casetti et al. 2009; Li et al. 2011). In vorliegender Arbeit konnte eine solche
Induktion von Foxp3 in T-Zellen durch Zugabe der entsprechenden Zytokine ebenfalls
erreicht werden (Abb. 22).
- 107 -
- Diskussion Für die Generierung von CD4+ iTreg ist vor allem TGF-1, aber auch IL-15 notwendig (Chen
et al. 2003; Imamichi et al. 2008). Auch in BrHPP-stimulierten V2 T-Zellen induzieren
IL-15 und TGF-1 die Expression von Foxp3. Diese T-Zellen sind Casetti et al. zufolge
anschließend in der Lage die Proliferation kokultivierter PBMZ bei Stimulation durch
plattengebundene anti-CD3,-28 mAk zu supprimieren (Casetti et al. 2009). T-Zellen die im
Rahmen vorliegender Arbeit unter vergleichbaren Bedingungen (durch BrHPP, TGF-1 und
IL-15)
expandiert
wurden,
wiesen
zwar
während
der
Expansion
eine
Foxp3-
Proteinexpression (259D) auf, waren aber bei Restimulation mit A/E-Partikeln oder BrHPP
nicht in der Lage die Proliferation von Responder T-Zellen zu supprimieren (Abb. 22, Abb.
25). Dass sich in vorliegender Arbeit im Gegensatz zu den von Casetti et al. durchgeführten
Experimenten unter ähnlichen Bedingungen keine Suppression beobachten ließ, ist
möglicherweise auf Unterschiede in der Versuchsdurchführung zurückführen. Casetti et al.
demonstrierten die Suppressivität anhand der Inhibition der PBMZ-Proliferation. Die
innerhalb der PBMZ enthaltenden Zellpopulationen wie z.B. Treg, die ebenfalls durch den
von ihnen verwendeten polyklonalen Stimulus aktiviert werden, könnten eine Erklärung für
diese unterschiedlichen Beobachtungen darstellen. Da bei den in vorliegender Arbeit
durchgeführten Untersuchung der (direkten) Interaktion von Responder- und T-Zellen
keine weiteren Zellpopulationen vorhanden waren, ließen sich hier eventuelle Einflusse
durch diese ausschließen. Außerdem wurden die von Casetti et al. verwendeten V2 TZellen nach einem Expansionszeitraum von nur zehn Tagen verwendet. Zu diesem Zeitpunkt
war bei den in dieser Arbeit verwendeten auf unterschiedliche Weise expandierten TZellen in allen Fällen noch eine starke Proliferation zu erkennen. Um eine Suppression durch
bereits
aktivierte
bzw.
proliferierende
Zellen
aufgrund
von
Konkurrenz
um
Wachstumsfaktoren ausschließen zu können, wurden in vorliegender Arbeit die expandierten
T-Zellen erst verwendet, als diese keine Proliferation mehr aufwiesen (nach 16 Tagen).
Bei einer verfrühten Restimulation der Zellen besteht weiterhin die Gefahr AICD in diesen
auszulösen. Nach BrHPP-Restimulation BrHPP-, TGF-1- und IL-15-expandierter T-Zellen
wurde die Proliferation von Responder T-Zellen, die mit einem SE-Gemisch stimuliert
wurden, nicht supprimiert (Abb. 25). Hierzu im Widerspruch steht die von Li et al. gemachte
Beobachtung, dass unter Verwendung von TZR-Stimulus, TGF-1 und IL-2 expandierte
CD27+ V1 T-Zellen bei Restimulation durch anti-CD3 mAk die Proliferation von CD4+ TZellen inhibieren (Li et al. 2011). Die unterschiedliche Suppressivität lässt sich
möglicherweise darauf zurückführen, dass es sich bei den in dieser Arbeit unter Verwendung
von BrHPP, TGF-1 und IL-15 expandierten T-Zellen hauptsächlich um V2 T-Zellen
handelt (Abb. 23). Sowohl die von Casetti et al. als auch die von Li et. al. durchgeführte TZell-Expansion zur Induktion regulatorischer Funktion fand innerhalb der PBMZ statt, wobei
erstere IPP und letztere anti-TZR zur initialen Stimulation der T-Zellen verwendeten
- 108 -
- Diskussion (Casetti et al. 2009; Li et al. 2011). In vorliegender Arbeit wurden die T-Zellen vor deren
Expansion magnetisch separiert, was ebenfalls eine Erklärung für die beobachteten Unterschiede sein könnte. Durch die vorangegangene Isolation war es möglich die Zellen unter
definierten Bedingungen zu stimulieren und Einflüsse von anderen in den PBMZ
enthaltenden Zellpopulationen zu vermeiden. Ferner war es dadurch möglich, zusätzlich zur
TZR-Stimulation einen CD28-Kostimulus zu applizieren ohne dabei andere Zellen
unspezifisch zu aktivieren.
Die Tatsache, dass die im Rahmen vorliegender Arbeit durch BrHPP, TGF-1 und IL-15
expandierte T-Zellen keine suppressive Aktivität aufwiesen, obwohl die Proteinexpression
von Foxp3 (Klon 259D) induziert wurde, lässt sich mit Ergebnissen anderer Untersuchungen
vereinbaren. Imamichi et al. konnten zeigen, dass mit anti-CD3 mAk stimulierte und mit Hilfe
der erwähnten Zytokine induzierte CD4+ iTreg nur eine schwache regulatorische Aktivität
aufweisen (Imamichi et al. 2008). Tran et al. beschrieben weiterhin, dass die Induktion von
Treg-spezifischem Foxp3 in T-Zellen durch TGF-1 nicht zwingend zu einem anergen oder
suppressiven Phänotyp führt und außerdem mit erhöhter Zytokinproduktion der Zellen
einhergehen kann (Tran et al. 2007). Kang et al. stellten weiterhin fest, dass bei antiTCR mAK-Stimulation in Anwesenheit von TGF-1 bei aus dem peripheren Blut isolierten
humanen T-Zellen anders als bei murinen T-Zellen nicht die Entstehung regulatorischer
T-Zellen induziert wird (Kang et al. 2009). Von Allan et al. durchgeführte Experimente
zeigen, dass retroviral mit Foxp3 transfizierte humane CD4+ T-Zellen keinen suppressiven
Phänotyp besitzen (Allan et al. 2005). Zusammenfassend lässt sich also feststellen, dass die
alleinige Expression von Foxp3 nicht ausreichend für die Induktion suppressiver Aktivität ist
und noch andere Faktoren hierfür von Bedeutung sein müssen. Ferner ist bekannt, dass in
mit Hilfe von TGF-1 induzierten CD4+ Treg die Foxp3-Proteinexpression weniger stabil als
in nTreg ist und diese nur in Anwesenheit von TGF-1 aufrecht erhalten wird (Baron et al.
2007; Floess et al. 2007). Diese Tatsache deckt sich ebenfalls mit den in vorliegender Arbeit
gemachten Beobachtungen. Bei Expansion der T-Zellen unter Zusatz von TGF-1 und
IL-15 kam es ebenfalls nur zur transienten Proteinexpression von Foxp3, welche 16 Tage
nach initialer Stimulation (zu Beginn der Kokultur zur Untersuchung der suppressiven
Kapazität) kaum noch nachweisbar war (Abb. 25) (Casetti et al. 2009).
Weiterhin ist ein negativer Einfluss von TGF-1 auf die Proliferation verschiedener
Lymphozyten-Populationen beschrieben worden. TGF-1 kann die Proliferation von T-Zellen
und NK-Zellen negativ beeinflussen und wird häufig von Tumoren zur Suppression von
Immunantworten freigesetzt (Gorelik & Flavell 2002; Siegel & Massague 2003). Außerdem
stellt TGF-1 einen Bestandteil der Suppressionsmechanismen von Treg dar (Gorelik &
Flavell 2002; Cerwenka & Swain 1999). Capietto et al. konnten einen negativen Einfluss von
TGF-1 auf die Proliferation von V2+ T-Zellen feststellen, der allerdings durch Applikation
- 109 -
- Diskussion von höheren Mengen BrHPP oder IL-2 aufgehoben wurde (Capietto et al. 2010). Li et al.
berichteten, dass bei anti-CD3 mAk-Stimulation expandierter T-Zellen in Anwesenheit von
TGF-1 und IL-15 diese ebenfalls eine eingeschränkte Proliferation aufwiesen (Li et al.
2011). Eine verringerte Expansion von T-Zellen in Anwesenheit von TGF-1und IL-15 ließ
sich in vorliegender Arbeit fünf Tage nach Stimulation durch BrHPP oder durch A/E-Partikel
beobachten (Abb. 24). Zu späteren Zeitpunkten der Expansion bzw. nach Restimulation
konnte allerdings eine deutlich gesteigerte Proliferation der initial mit TGF-1 und IL-15
behandelten T-Zellen festgestellt werden (Abb. 25). TGF-1 scheint in den hier durchgeführten Untersuchungen nicht als suppressives Zytokin zu fungieren. Die anfänglich
reduzierte, später deutlich gesteigerte Proliferation lässt sich hingegen gut mit einer
möglichen Rolle von TGF-1 bei der T-Zell-Differenzierung vereinbaren.
7.13. Helios und Foxp3 sind notwendig für die Differenzierung regulatorischer () T-Zellen
Wie bereits erwähnt, waren (BrHPP-, TGF-- und IL-15-expandierte) T-Zellen, in denen
die Foxp3-Proteinexpression (Klon 259D) induziert wurde, nach BrHPP-Restimulation nicht
in der Lage die Proliferation von SE-stimulierten Responder T-Zellen zu supprimieren.
Ebenso wenig waren (A/E-Partikel- und IL-2-expandierte) T-Zellen, in denen die HeliosProteinexpression induziert wurde, nach BrHPP-Restimulation in der Lage die Proliferation
dieser Responder T-Zellen zu supprimieren. Einzig (A/E-Partikel-, TGF-- und IL-15expandierte) T-Zellen, in denen sowohl die Foxp3- als auch Helios-Proteinexpression
induziert wurde, supprimierten bei entsprechender (Re-)stimulation die Responder T-ZellProliferation (Abb. 23, Abb. 25). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Helios nicht per se zu
regulatorischen Funktionen führt oder diese steuert, aber vermutlich einen Faktor bei der
Differenzierung zu regulatorischen Zellen darstellt. Die gleichzeitige Induktion von Helios
zusammen mit weiteren Faktoren wie z.B. Foxp3 nach initialer Stimulation von T-Zellen
besitzt bei diesen möglicherweise einen maßgeblichen Anteil an der Entstehung
regulatorischer Funktionen.
Aufgrund seiner Beteiligung an epigenetischen Prozessen ist es wahrscheinlich, dass Helios
bei T-Zell-Differenzierungsprozessen eine Rolle spielt. Innerhalb des NuRD-Komplexes interagiert Helios mit verschiedenen HDAC und Methyltransferasen. Aufgrund dieser Interaktion
ist
es
möglich,
dass
Helios
das
Chromatinremodelling
beeinflusst,
welches
bei
verschiedenen zellulären Prozessen u.a. bei der Zellproliferation und Differenzierung eine
Rolle spielt (Bruniquel & Schwartz 2003; Rao et al. 2003; Sridharan & Smale 2007; Kim et al.
1999). Durch die Beteiligung an diesen Prozessen kann Helios möglicherweise die
Expression anderer Transkriptionsfaktoren epigenetisch regulieren/beeinflussen. Für Foxp3
etwa ist bekannt, dass dessen Expression bzw. Stabilität maßgeblich durch die Methylierung
- 110 -
- Diskussion des Foxp3-Gens beeinflusst und gesteuert wird. Für eine stabile Foxp3-Expression sind die
Demethylierung des Foxp3-Gens, das in naiven T-Zellen methyliert vorliegt sowie die cisaktivierender Bereiche notwendig (Floess et al. 2007; Hoffmann et al. 2009; Lal et al. 2009).
Zur wechselseitigen Interaktion zwischen Helios und Foxp3 existieren widersprüchliche
Beobachtungen, vermutlich aber wird die Foxp3-Expression durch Helios beeinflusst (Zheng
& Rudensky 2007). Da Helios mit nTreg, die eine stabile Foxp3-Transkription aufweisen, in
Zusammenhang gebracht wird (Thornton et al. 2010), scheint eine Rolle von Helios bei der
epigenetischen Steuerung der stabilen Foxp3-Transkription möglich. Vermutlich übt Helios
selbst keinen direkten Einfluss auf suppressive Funktion aus, spielt aber eine Rolle bei der
Entstehung von Treg und bei der stabilen Expression von Foxp3. Andere Publikationen
beschreiben eine Interaktion von Foxp3 mit Eos, einem anderen Transkriptionsfaktor der
Ikaros-Familie. In murinen nTreg ist diese Interaktion an der Foxp3-vermittelten
epigenetischen Stilllegung der Transkription verschiedener Gene beteiligt. Weiterhin scheint
die Expression von Eos im Gegensatz zu der von Foxp3 notwendig für die suppressive
Funktion von Treg zu sein (Pan et al. 2009). Erste weiterführende Ergebnisse zeigen die
Induktion der Eos-Genexpression in T-Zellen, nachdem diese in Anwesenheit von TGF-
und IL-15 durch A/E-Partikel stimuliert wurden (Daten nicht gezeigt). In diesen Zellen wurde,
wie schon erwähnt, außer der Expression von Eos auch die von Foxp3 und Helios induziert.
Diese Zellen supprimierten nach BrHPP-Restimulation die Proliferation von Responder TZellen (Abb. 22, Abb. 25). Im Gegensatz zu der Expression von Helios oder Foxp3 wurde die
von Eos nur bei Anwesenheit von sowohl TGF- und IL-15 als auch eines CD28-Kostimulus
induziert. Helios und Eos können über C-Terminal lokalisierte Zinkfinger-Domänen
miteinander als Heterodimer interagieren (Cobb & Smale 2005). Diese Interaktion könnte
ebenfalls eine Rolle bei bestimmten Differenzierungsvorgängen bzw. der Entstehung
regulatorischer Zellen spielen.
Zusammenfassend ist für die Differenzierung von (regulatorischen) T-Zellen vermutlich eher
das Zusammenspiel verschiedener Transkriptionsfaktoren von Bedeutung, als die exklusive
Expression eines einzelnen. Es ist durchaus denkbar, dass in diesem Zusammenhang die
gleichzeitige Expression von Foxp3, Helios und Eos eine entscheidende Rolle spielt.
7.14. TGF- führt zur Differenzierung von T-Zellen
Li et al. beschreiben für anti-TZR stimulierte und mit TGF- behandelte T-Zellen eine
leicht präferentielle Expansion der V1-, während der relative Anteil der V2 T-ZellPopulation leicht zurückging (Li et al. 2011). In vorliegender Arbeit kam es bei A/E-PartikelStimulation (nicht bei BrHPP-Stimulation) unter dem Einfluss von TGF- und IL-15 zu einer
Expansion von V1 (V2-negativen) T-Zellen. Bei Stimulation von T-Zellen mit A/EPartikeln unter IL-2-Zugabe kam es zu keiner deutlichen Verschiebung des initialen
- 111 -
- Diskussion Verhältnisses der T-Zellsubpopulationen untereinander. Folglich war vermutlich der
zusätzliche CD28-Kostimulus in Verbindung mit TGF- für die verstärkte Expansion von V1
T-Zellen verantwortlich. Weil es sich bei einem Großteil der naiven - um V1 T-Zellen
handelt, ist es wahrscheinlich, dass durch die A/E-Partikel-Stimulation unter Zugabe von
TGF- hauptsächlich naive T-Zellen proliferieren (Abb. 23). Da durch BrHPP selektiv V2
T-Zellen stimuliert werden, spricht die Suppression von Responder T-Zellen durch A/EPartikel-, TGF-- und IL-15-expandierte T-Zellen nach BrHPP-Restimulation dafür, dass
trotz des deutlich gesteigerten V1- (V2-negativen-) Anteils die beobachtete Suppression
durch V2 T-Zellen vermittelt wurde.
Es ist bekannt, dass TGF- als ein Faktor zur Differenzierung von T-Zellen beitragen kann
(Gorelik & Flavell 2002). Yamagiwa et al. beschrieben weiterhin, dass TGF- in naiven CD4+
T-Zellen nicht nur zur Expression von Foxp3, sondern auch zur Differenzierung von
CD45RA+ CD4+ T-Zellen zu einem aktivierten CD45RO+ Phänotyp führt (Yamagiwa et al.
2001). In vorliegender Arbeit konnte (unabhängig von der Stimulationsmethode) durch
TGF- ein Rückgang der CD27-Oberflächenexpression festgestellt werden (Abb. 22). Dieser
konnte vor allem innerhalb der Helios- T-Zellen beobachtet werden (Abb. 23). TGF-
scheint demnach die Differenzierung von Helios- T-Zellen zu CD27- Effektorzellen zu
fördern. Wie von Caccamo et al. beschrieben, produzieren Effektorzellen (TEM und TEMRA)
größere Mengen proinflammatorischer Zytokine (Caccamo et al. 2005). In vorliegender
Arbeit ließ sich bei Restimulation mit einem Phorbolester (TPA) eine gesteigerte Produktion
löslicher Mediatoren (von Granzym B, IFN-, TNF- und CCL3) der durch BrHPP, TGF- und
IL-15 expandierten Helios- T-Zellen bestätigen (Abb. 24). Auch in Helios+ Zellen führte
TGF- zu einer verminderten CD27-Oberflächenexpression, war aber weiterhin vorhanden.
Die durch A/E-Partikel-Stimulation induzierte Helios-Proteinexpression korrelierte mit der
CD27-Oberflächenexpression (Abb. 23). Vermutlich repräsentieren diese Helios und CD27
doppelt-positiven Zellen einen naiven Phänotyp. Capietto et al. konnten nach TZRStimulation
in
Anwesenheit
von
TGF-
ebenfalls
eine
Zunahme
proliferierender
CD27+CD45RA+ T-Zellen nachweisen (Capietto et al. 2010). Auch wurde beschrieben,
dass TGF- die Differenzierung von naiven zu TCM fördern kann (Gorelik & Flavell 2002).
Nach Phorbolester-Restimulation der A/E-Partikel-, TGF-- und IL-15-expandierten
T-Zellen wurde trotz der verringerten CD27-Oberflächenexpression der vorwiegend Heliosexprimierenden Zellen eine verringerte Proteinexpression proinflammatorischer Mediatoren
(Granzym B, IFN-, TNF- und CCL3) festgestellt (Abb. 24). Durch TGF- wird also
vermutlich die Differenzierung von Helios- T-Zellen zu Effektorzellen verstärkt, während es
auf Helios-exprimierende T-Zellen anscheinend einen anderen Einfluss hat. Diese
differenzieren nicht zu klassischen Effektorzellen. Die geringere Expression proinflamma-
- 112 -
- Diskussion torischer Mediatoren und das hohe proliferative Potential dieser Zellen nach Restimulation
weist auf eine Differenzierung zu TCM hin (Abb. 24, Abb. 25).
T-Zellen, die über den TZR und CD28 stimuliert werden, können verschiedene Transkriptionsfaktoren koexprimieren. Eine solche Koexpression wurde in aktivierten, proliferierenden
T-Zellen beschrieben. Diese T-Zellen befinden sich in einem Stadium zwischen naiven und
differenzierten Zellen (Malmhall et al. 2012). Die T-bet- und GATA-3-Expression stehen zu
Beginn der Differenzierungsphase von T-Zellen miteinander in Konkurrenz. T-bet kann die
Funktion von GATA-3 direkt inhibieren. GATA-3 wirkt der Th1-Differenzierung indirekt
entgegen, indem es die Genexpression des IL-12-Rezeptors verhindert. Die Koexpression
unterschiedlicher Transkriptionsfaktoren ermöglicht die Integration verschiedener Signale
und bestimmt so den Phänotyp der T-Zellen (Usui et al. 2006; Hwang et al. 2005; Ansel et al.
2006). In vorliegender Arbeit konnte in T-Zellen sowohl nach A/E-Partikel- als auch
BrHPP-Stimulation in Anwesenheit von IL-2 die Proteinexpression von T-bet und GATA-3
festgestellt werden. Die T-bet-Proteinexpression war hierbei vergleichsweise stärker (Abb.
22).
Ferner ist bekannt, dass TGF- der Th1- und Th2-Differenzierung entgegen wirken kann.
TGF- verhindert die Th1- und Th2-Differenzierung durch Inhibition der T-bet bzw. GATA-3Expression (Gorelik et al. 2000; Gorelik et al. 2002; Heath et al. 2000; Neurath et al. 2002).
Der antagonistische Effekt von TGF- auf T-bet besitzt vermutlich die größere physiologische
Relevanz. Murine CD4+ T-Zellen die keinen TGF--Rezeptor II exprimieren, differenzieren zu
Th1-Zellen und weisen einen hyperproliferativen Phänotyp auf (Li et al. 2006). In
vorliegender Arbeit wiesen T-Zellen, die in Anwesenheit von TGF- und IL-15 expandiert
wurden, unabhängig vom initial verwendeten Stimulus (BrHPP oder A/E-Partikel) eine
geringere T-bet-Proteinexpression auf. Hierbei war die T-bet-Proteinexpression in A/EPartikel-stimulierten T-Zellen besonders deutlich reduziert. Die GATA-3-Proteinexpression
wurde innerhalb der ersten 8 Tage nach Stimulation durch TGF- und IL-15 nicht beeinflusst,
war aber aufgrund der verringerten T-bet-Proteinexpression in Relation zu dieser verstärkt
(Abb. 22). A/E-Partikel-, TGF-- und IL-15-expandierte T-Zellen wiesen nach BrHPPRestimulation eine starke GATA-3-Proteinexpression auf. Diese korrelierte mit der
Suppression kokultivierter SE-Gemisch-stimulierter Responder T-Zellen. Auf andere Weise
expandierte T-Zellen waren bei BrHPP-Restimulation weder suppressiv noch exprimierten
sie GATA-3 (Abb. 25). Möglicherweise ist in A/E-Partikel-, TGF-1- und IL-15-expandierten,
BrHPP-restimulierten T-Zellen die Expression von GATA-3 und eine damit verbundene
Freisetzung von Th2-Zytokinen eine Reaktion auf die durch das SE-Gemisch induzierte,
starke Th1-Antwort der kokultiverten Responder T-Zellen. Die Induktion der GATA-3Proteinexpression in den kokultivierten Responder T-Zellen spricht für das Vorhandensein
von Th2-Zytokinen. Hansmann et al. konnten zeigen, dass humane nTreg, die einen memory
- 113 -
- Diskussion Phänotyp aufweisen, nach in vitro Expansion die Foxp3-Proteinexpression herunterregulieren. Diese Herabregulation korrelierte mit der verstärkten GATA-3-Proteinexpression
(bzw. mit der Expression von Th2-assoziierten Genen) (Hansmann et al. 2012). Wohlfert et
al. konnten in (humanen und murinen) nTreg nach TZR-Stimulation ebenfalls eine verstärkte
GATA-3-Proteinexpression nachweisen. Die GATA-3-Proteinexpression wirkte in Treg auch
im inflammatorischen Kontext (unter Bedingungen zur Induktion einer Th1- oder Th17Differenzierung) einer Differenzierung bzw. der Expression von Th1- und Th17-assoziierten
Transkriptionsfaktoren entgegen (Wohlfert et al. 2011). Man kann also folgern, dass die in
dieser Arbeit beobachtete GATA-3-Proteinexpression möglicherweise in Zusammenhang mit
dem beobachteten suppressiven Phänotyp der T-Zellen steht.
Serre et al. stellten einen Zusammenhang zwischen Helios-Expression und Th2-Differenzierung her (Serre et al. 2011). Ein solcher Zusammenhang konnte im Rahmen dieser Arbeit
nicht bestätigt werden. Obwohl A/E-Partikel-, TGF-- und IL-15-expandierte T-Zellen nach
BrHPP-Restimulation sowohl GATA-3 als auch Helios exprimierten, wiesen A/E-Partikel- und
IL-2-expandierte T-Zellen trotz Helios-Proteinexpression bei BrHPP-Restimulation keine
GATA-3-Proteinexpression auf. Andererseits wurde GATA-3 nach A/E-Partikel-Restimulation
auch von BrHPP-, TGF-- und IL-15-expandierten T-Zellen exprimiert, die nur eine
geringe Helios-Proteinexpression aufwiesen (Abb. 25). Diese Zellen waren im Übrigen die
einzigen die nach A/E-Partikel-Restimulation sowohl die Proteinexpression von GATA-3 als
Abb. 30: Schematische Darstellung der funktionellen Unterschiede expandierter T-Zellen.
A/E-P = A/E-Partikel
- 114 -
- Diskussion auch von T-bet aufwiesen und die Proliferation von SE-Gemisch-stimulierten Responder
T-Zellen nicht supprimierten. Die gleichzeitige Proteinexpression von GATA-3 und T-bet
könnte auf einen Differenzierungsvorgang nach Restimulation dieser T-Zellen hindeuten.
Der Einfluss von TGF- auf die unterschiedlich stimulierten T-Zellen ist in Abbildung 30
zusammengefasst.
- 115 -
- Diskussion -
7.15. Fazit
T-Zellen unterscheiden sich phänotypisch klar von Treg. Die durch A/E-Partikelstimulierte, frisch isolierte T-Zellen vermittelte Suppression der Responder T-ZellProliferation wird im Wesentlichen durch die Interaktion negativ-kostimulatorischer Oberflächenmoleküle mit ihren Liganden vermittelt. Beiden Zellpopulationen stehen miteinander in
einer dynamischen Wechselwirkung. Diese Suppression kann durch TLR2-Liganden
moduliert bzw. partiell aufgehoben werden. Dies geht einher mit einem Wandel von einem
immunsuppressiven zu einem stimulatorischen T-Zell Phänotyp. Diese Möglichkeit zur
Modulation einer Reaktion spricht für eine hohe funktionelle Plastizität von T-Zellen und
könnte in der frühen Phase der Entstehung einer Immunantwort von Bedeutung sein. Diese
starke funktionelle Plastizität wird vermutlich durch die Integration verschiedener (z.B. TZR,
TLR) Signale in gemeinsamen Signalwegen (wie z.B. der PI3K/AKT-, NF-B- und MAPKinase-Signalweg) erreicht.
Auch bei der Differenzierung (TGF--) induzierter regulatorischer T-Zellen zeigte sich,
dass nicht nur das Zytokinmilieu, sondern auch der Kontext der initialen Stimulation
ausschlaggebend für die Differenzierung von T-Zellen ist. Bei der Differenzierung der
induzierten regulatorischen T-Zellen ist wiederum die Integration verschiedener Signale
bzw. die Stärke der Proteinexpression verschiedener Transkriptionsfaktoren (GATA-3-,
T-bet-, Foxp3 und Helios) für den entstehenden Phänotyp entscheidend.
Zusammenfassend zeigen die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnisse,
dass T-Zellen im Gegensatz zu Treg keinen per se suppressiven Phänotyp besitzen.
Vielmehr scheinen T-Zellen ein hohes Maß an Plastizität zu besitzen und abhängig vom
Kontext ihrer Stimulation in der Lage zu sein andere Zellpopulationen zu beeinflussen. Diese
Feststellung lässt sich mit einem Zitat von Göran Möller aus dem Jahre 1988
zusammenfassen, in welchem er vom Konzept einer eigenständigen „Suppressor“ T-ZellPopulation abstand nimmt (bevor man diese als Treg durch den Transkriptionsfaktor Foxp3
charakterisieren konnte): „Ich zweifel nicht an der Existenz suppressiver Phänomene oder
daran, dass T-Zellen Suppressivität vermitteln können, aber ich bin skeptisch bezüglich der
Auffassung, dass suppressive T-Zellen eine eigenständige Subpopulation innerhalb der
T-Zellen darstellen (Möller 1988)“. Vermutlich spiegelt ein Konzept bei dem suppressive
Funktionen nicht auf eine bestimmte T-Zell-(Sub)population beschränkt sind, sondern je
nach Kontext der Antigenerkennung initiert werden die Verhältnisse in vivo realistisch wider,
da es besser mit der funktionellen Diversität von T-Zellen vereinbar ist.
- 116 -
- Diskussion -
8. Zusammenfassung
8.1. Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Suppression der Proliferation von CD4+CD25(Responder) T-Zellen durch frisch isolierte T-Zellen gezeigt werden. Obwohl T-Zellen
vergleichbar den Treg in der Lage waren die Proliferation der Responder T-Zellen
zellzahlabhängig zu supprimieren, unterschieden sich T-Zellen jedoch phänotypisch von
Treg. Konstitutiv von Treg exprimierte Moleküle wie CTLA-4, CD25, CD39 und andere waren
auf der Oberfläche von T-Zellen erst nach deren Stimulation nachweisbar. Einzig der
Transkriptionsfaktor Helios war bei etwa einem Drittel der T-Zellen konstitutiv vorhanden.
Ferner wurde die Helios-Proteinexpression nach TZR-Stimulation in Verbindung mit einem
CD28-Kostimulus spezifisch in T-Zellen induziert. Der für Treg charakteristische
Transkriptionsfaktor Foxp3 (Klon 259D) wurde in T-Zellen nur in Anwesenheit von Treginduzierenden Bedingungen exprimiert. Die Untersuchungen zur Induktion regulatorischer
Funktionen deuten darauf hin, dass die CD28-Kostimulation eine entscheidende Rolle für die
Differenzierung regulatorischer () T-Zellen spielt und dass sowohl die Expression von
Foxp3 als auch Helios für diese Differenzierung notwendig ist.
Bei der Suppression von Responder T-Zellen durch aktivierte frisch isolierte T-Zellen
spielte die Konkurrenz um IL-2 keine entscheidende Rolle. Die festgestellte Suppression war
zellkontaktabhängig und wurde durch die Interaktion der immunregulatorischen Oberflächenmoleküle CD86 und CTLA-4 bzw. PD-L1 und dessen Liganden (PD-1) vermittelt. Diese Art
der Suppression ähnelte eher der durch suppressive (myeloide) DZ als der durch Treg
vermittelten Suppression.
Des Weiteren konnte eine partielle Aufhebung der T-Zell-vermittelten Suppression durch
TLR2-Liganden gezeigt werden. Die TLR2-abhängige Modulation der Oberflächenexpression
von CTLA-4, CD86, PD-L1 und PD-1, die mit einer Aufhebung der Suppression einherging,
spricht ebenfalls für eine Beteiligung dieser Moleküle an der T-Zell-vermittelten
Suppression. TLR2-Liganden führten bei T-Zellen außerdem zu einer gesteigerten
Proliferation und Produktion löslicher Mediatoren (IFN-, TNF-, CCL5 und Granzym B). Die
TLR2-Liganden besaßen ausschließlich kostimulatorische Funktion und hatten nur in
Verbindung mit einem TZR-Stimulus eine Wirkung. Durch Kostimulation mit TLR2-Liganden
war die Phosphorylierung von Signalmolekülen der PI3K/AKT- (AKT), NF-B- (NF-B/p65)
und MAP-Kinase-Signalwege (p38, ERK) gesteigert.
Die Ergebnisse vorliegender Arbeit können zu einem besseren Verständnis intrinsischer
regulatorischer Funkionen von T-Zellen sowie von Vorgängen bei der Entstehung bzw.
Induktion regulatorischer T-Zellen beitragen. Die Regulation der Responder T-Zell-
- 117 -
- Diskussion Proliferation durch aktivierte T-Zellen könnte dazu beitragen Autoimmunreaktionen
entgegenzuwirken. Des Weiteren können diese Ergebnisse helfen suppressive Eigenschaften von T-Zellen, die im Rahmen einer Tumorbehandlung durch adoptiven Transfer
verabreicht werden, zu unterdrücken bzw. zu vermeiden.
- 118 -
- Diskussion -
8.2. Summary
The aim of this doctoral thesis was to characterize human regulatory T cells, which can
mediate suppression of CD4+ CD25- (responder) T cell proliferation, in vitro. Comparable to
conventional regulatory T cells (Treg) freshly isolated T cells inhibited responder T cell
proliferation, but they differed from Treg in their phenotype. Molecules constitutively
expressed on Treg including CTLA-4, CD25, CD39 and others, were detected on the surface
of T cells only after stimulation. Among the analyzed markers, only the transcription factor
Helios was constitutively present in about one-third of the T cells, and was further upregulated after T cell receptor (TCR) stimulation in combination with CD28 co-stimulation.
Foxp3 (clone 259D), the master transcription factor of Treg, was expressed in T cells only
under Treg-inducing conditions. The analysis of the induction of regulatory activity indicated
that CD28 co-stimulation played a crucial role in regulating the differentiation of regulatory
T cells, and that the expression of both Foxp3 and Helios seemed to be necessary for this
differentiation process.
Competition for IL-2 could be excluded as the mechanism for responder T cell suppression
by freshly isolated activated T cells. The observed suppression was cell contactdependent and was mediated by the reciprocal interaction of the immune regulatory surface
molecules CD86 and CTLA-4, PD-L1 and its ligand (PD-1). This type of suppression
resembles more the inhibition mediated by suppressive (myeloid) dendritic cells rather than
the inhibition mediated by Treg.
Further studies revealed a partial abrogation of T cell-mediated suppression by TLR2
ligands. The TLR2-dependent modulation of CTLA-4, CD86, PD-L1 and PD-1 cell surface
expression which was accompanied by the abrogation of suppression also argues for a role
of these molecules in the T cell-mediated suppression. In T cells TLR2 ligands induced
an increased proliferation and production of soluble mediators (IFN-, TNF-, CCL5 and
granzyme B). The TLR2 ligands displayed only a co-stimulatory function and thus required a
TCR-stimulus. Co-stimulation with TLR2 ligands enhanced the phosphorylation of PI3K/AKT(AKT), NF-B- (NF-B/p65) and MAP kinase (p38, ERK) pathway signalling molecules.
The results of this thesis contribute to a better understanding of the intrinsic regulatory
functions of T cells as well as of pathways involved in the development and induction of
regulatory T cells. The regulation of responder T cell proliferation by activated T cells
might contribute to counteracting autoimmune reactions. Moreover, these results could help
to prevent or rather avoid suppressive properties of T cells in conditions where T cells
are administered therapeutically, e.g. within the frame of tumor immunotherapy.
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- Anhang -
10.
Anhang
Publikationsliste
Originalarbeiten
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D. (2009). Differential poly(I:C) responses of human VgammaVdelta2 T cells
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Meyer, T., Oberg, H. H., Peters, C., Martens, I., Adam-Klages, S., Kabelitz, D. &
Wesch, D. (2012). poly(I:C) costimulation induces a stronger antiviral chemokine
and granzyme B release in human CD4 T cells than CD28 costimulation.
J.Leukoc.Biol..
Peters, C., Oberg, H. H., Kabelitz, D., and Wesch, D.. Phenotype and function of
immunosuppressive V2-expressing T cells. Manuskript eingereicht.
Übersichtsarbeiten (reviews)
Wesch, D., Peters, C., Oberg, H. H., Pietschmann, K. & Kabelitz, D. (2011).
Modulation of gammadelta T cell responses by TLR ligands. Cell Mol.Life Sci.,
68, 2357-2370.
Kabelitz, D., Peters, C., Wesch, D., Oberg, H. H. (2013). Regulatory functions of
gamma delta T cells. International Immunopharmacology.
Zitable Abstracts
Christian Peters, Hans-Heinrich Oberg, Lothar Marischen, Dieter Kabelitz and
Daniela Wesch. TLR2 ligands abrogate suppressive function of gammadelta T
cells. 4th international gammadelta T Cell Conference, Kiel, Mai 2010.
Christian Peters, Hans-Heinrich Oberg, Lothar Marischen, Dieter Kabelitz and
Daniela Wesch. The abolishment of gammadelta T cell mediated suppression by
TLR2 ligands is accompanied by an increased phosphorylation. Norddeutsche
Immunologentagung, Borstel, September 2010.
Christian Peters, Hans-Heinrich Oberg, Lothar Marischen, Dieter Kabelitz and
Daniela Wesch.TLR2 dependent abrogation of the gammadelta T cell mediated
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Signal Transduction Society, Weimar, Oktober 2010.
Christian Peters, Hans-Heinrich Oberg, Juliane Fazio, Dieter Kabelitz and
Daniela Wesch. Activation of MAP-Kinase-, NF-kappaB- and Akt-Pathways in a
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Vdelta2 gammadelta T cells. Joint Annual Meeting - DGFI, SICA, Riccione, Italien,
September 2011.
Anne Kammel, Christian Peters, Hans-Heinrich Oberg, Dieter Kabelitz and
Daniela Wesch. Modulation of TIM-3 expression on alphabeta and gammadelta T
cells. Norddeutsche Immunologentagung, Borstel, November 2011.
Christian Peters, Hans-Heinrich Oberg, Juliane Fazio, Dieter Kabelitz and
Daniela Wesch. Vdelta2 can do: Suppressive vs. stimulatory functions mediated
by gammadelta T cells. Norddeutsche Immunologentagung, Borstel, November
2011.,
Christian Peters, Hans-Heinrich Oberg, Dieter Kabelitz and Daniela Wesch.
PD-1 and CTLA-4 contribute to Vdelta2Vgamma9 T cell-mediated suppression.
5th International gammadelta T Cell Conference, Freiburg, Mai 2012.
- 141 -
- Anhang -
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich an Eides statt gemäß § 8 der Promotionsordnung der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vom 12. Mai
2009, dass ich die vorliegende Arbeit unter der wissenschaftlichen Leitung von Prof. Dr. T.
Roeder selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst habe. Die Abhandlung ist nach Form und
Inhalt, abgesehen von der Beratung durch PD Dr. D. Wesch und Prof. Dr. D. Kabelitz, die
eigene Arbeit.
Weiterhin habe ich keine anderen, als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel
benutzt. Die wörtlich oder inhaltlich den verwendeten Werken entnommenen Stellen wurden
als solche kenntlich gemacht. Die vorliegende Arbeit entstand unter Einhaltung der Regeln
guter wissenschaftlicher Praxis der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Auszüge der
Dissertation wurden in Fachzeitschriften eingereicht.
Ich versichere, dass ich weder an der Universität Kiel noch anderweitig versucht habe eine
Dissertation einzureichen oder mich einer Promotionsprüfung zu unterziehen.
Kiel, 24.03.2013
________________________________________
Christian Peters
- 142 -
- Anhang -
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Christian Peters
Geburtsdatum:
22.10.1980
Geburtsort:
Hamburg
Adresse:
Saarbrückenstraße 160, 24113 Kiel
Promotionsstudium:
Seit Juli 2008
Doktorand in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. D. Kabelitz / PD. Dr. D.
Wesch am Institut für Immunologie des Universitätsklinikum SchleswigHolstein, Campus Kiel
Hochschulstudium:
Bis März 2008
Diplomarbeit am Heinrich-Pette-Institute für experimentelle Virologie
und Immunologie in Hamburg in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr.
Thomas Dobner. Thema der Arbeit: „Untersuchungen zur Interaktion
des adenoviralen Proteins E1B55K mit der humanen Ubiqutinligase
USP7.“
2001-2008
Studium der Biologie in Hamburg
Grundwehrdienst:
2001
Grundwehrdienst, Hamburg-Fischbek
Schulbildung:
1991 – 2000
Gymnasium Grootmoor, Hamburg; Erwerb der allgemeinen
Hochschulreife
Kiel, 24.03.2013
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- Anhang -
Danksagung
Herzlich bedanken möchte ich Herrn Professor Dr. Dieter Kabelitz und Frau PD Dr.
Daniela Wesch für die Möglichkeit die vorliegende Arbeit in ihrer Arbeitsgruppe
anzufertigen. Die herrvoragenden Arbeitsbedingungen und das gute Betriebsklima
habe ich sehr geschätzt.
Frau PD Dr. Daniela Wesch bin ich für die herrvoragende tägliche Betreuung meiner
Arbeit zu besonderem Dank verpflichtet. Die Möglichkeit bei theoretischen und
praktischen Fragen bei ihr jederzeit ein offenes Ohr zu finden haben wesentlich zum
Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Besonders bedanken möchte ich mich bei Professor Dr. Thomas Roeder für die
freundliche Übernahme der Betreuung und des Referats meiner Arbeit vor der
mathematischen-naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität
zu Kiel. Des Weiteren möchte ich Frau PD Dr. Daniela Wesch für die Übernahme des
Korreferats danken.
Für das kritische Lesen der Arbeit gebührt Frau PD Dr. Daniela Wesch, Frau
Henriette Oberdörster und Herrn Prof. Dr. Dieter Kabelitz mein Dank.
Den Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe Dani, Heiner, Lothar, Tim, Jule, Sandra, Ina,
Moni und Hoa möchte ich für die stete Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima
sowie die Unterstützung bei allen technischen Fragen danken. Bei Sandra, Ina und
Jule möchte ich mich besonders für die gute Zusammenarbeit und Hilfe bei Arbeiten
im Labor bedanken.
Ebenso möchte ich mich bei all meinen Mit-Doktoranden, vor allem bei Tim, Lothar
und Jule für die wissenschaftlichen und unwissenschaftlichen Diskussionen und die
schöne Zeit bedanken.
Meiner Familie möchte ich danken, dass sie mich stets auf meinem Weg unterstützt
und gefördert hat und meinen Freunden dafür, dass sie immer noch mit mir reden,
auch wenn ich nicht gerade viel von mir hören lasse.
Zu guter Letzt und vor allem möchte ich mich bei meiner „kleinen“ Familie, die oft
ohne mich auskommen musste, für den Rückhalt und die Nachsicht mit mir
bedanken. Katharina danke ich für die mentale Unterstützung und auch die
Unterstützung in allen Alltagsangelegenheiten.
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