Demonstration allgemeiner Enzymeigenschaftenl der Fumarase

Gruppe 3
06.06.2005
Demonstration allgemeiner Enzymeigenschaften am Beispiel der Fumarase
Einleitung:
An einem Fumarase-Präparat aus Schweineherz sollen einige Eigenschaften von Enzymen
demonstriert werden.
Material / Methoden:
siehe Skript
Die Reagenzien 1 und 2 angefertigt und uns zur Verfügung gestellt.
Durchführung:
siehe Skript
Beobachtung:
siehe Ausdruck
Auswertung:
1. Die Fumarase katalysiert die Reaktion in beide Richtungen. Fumarat absorbiert Licht der
Wellenlänge 240 nm. Da Malat keine Doppelbindung bei abnehmender Fumarat- und steigender
Malatkonzentration von 0,955 bis 0,236 ab.
Bei der Rückreaktion wird Fumarat gebildet und die Extinktion nimmt von 0,007 bis 0,236 zu.
Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der Seite des Malats.
2. Die Lage des Gleichgewichts wird durch die Enzymmenge nicht verändert. Ebenso hat die
Reaktionsrichtung keinen Einfluß auf das Gleichgewicht, wohl aber auf die Gleichgewichtskonstante.
c (Malat) = E / ε x d = 0,236 / 2,32 cm x cm/ mmol x 1 = 0,1 mmol
K = [Malat] / [Fumarat] = 0,1mmol / 0,4 mmol = 0,25
3. Die Fumarase ist hochspezifisch für Malat und Fumarat. Succinat und Maleinat werden durch die
Fumarase nicht umgesetzt.
4. Fügt man mehr Enzym bei gleich hoher Substratkonzentration hinzu, so wird mehr Substrat in
kürzerer Zeit umgesetzt. Dies kann man anhand der angelegten Geraden bei „Kurve“ 13 und 14
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erkennen. Umso steiler die Gerade, desto geringer ist die Exktinktionsänderung und desto geringer ist
die gebildete Menge an Fumarat.
5. Die Extinktionsänderung pro Minute beträgt 0,02 bei einer eingesetzten Enzymmenge von 20µl
(Kurve 14).
Die Extinktionsänderung pro Minute beträgt 0,01 bei einer eingesetzten Enzymmenge von 10µl
(Kurve 13)
Wieviel Substrat?: E = c * d * ε
c = E / d * ε Æ c = 0,01 / (1 * 2,32 cm * cm/ mmol) = 0,0043 mmol *1000 = 4,31 µmol
Ein mg Enzym würde 430µmol Substrat / min umsetzen. (430 U/mg).
6. Wechselzahl der Fumarase:
Die Wechselzahl gibt an, wie viele Substratmoleküle von einem Enzym-Molekül in einer bestimmten
Zeiteinheit (Sekunde oder Minute) umgesetzt wird.
Rechnung: Fumarase MG= 194000 g/mol
430 U = 430 mmol Substrat/min/g
(Avogadro-Zahl = 6x 1023 Moleküle/mol)
6x 1023/194000=3,09x1018 Moleküle/g Enzym
3,09x1018 Molekükle setzen 430m mol Substrat/min
430 / 3,09x1018 = 1,3x10-16 Moleküle setzen 1mmol Substrat/min um.
1,3x10-19 = 1mol Substrat/min
6x 1023 x 1,3x10-19 = 83420
7. Die Umsatzgeschwindigkeit der Fumarase wird durch eine Substratkonzentration von 50 mM
herabgesetzt. Dieses Phänomen bezeichnet man als Substrathemmung. Dabei bilden sich durch die
hohe Substratkonzentration inaktive Komplexe eines Enzymmoleküls mit mehreren
Substratmolekülen
(siehe Kurven 4a, 4b, 5a, 5b).
Durch die höhere Konzentration des Malats im Versuchsansatz 3 stellt sich das Gleichgewicht später
ein, als beim Versuch 1. Es wurde die 5-fache Substratkonzentration eingesetzt, woraus eine ca 5fache Extinktion resultiert. Die Gleichgewichtskonstante Keq bleibt dabei immer gleich! (siehe Kurven
1d und 3a).
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Diese Beobachtung läßt sich an den Extinktionswerten der Kurve 1d (E = 0,236) und 3a (ca. E = 0,95)
auch quantitativ aufzeigen.
8. Für die Reaktion Fumarat + H2O Æ Malat beträgt ∆G0 3146 kJ * mol -1
∆G0 ist – R * T * ln 0,25
für die Reaktion Malat Æ Fumarat +H2O beträgt ∆G0 - 3669,5 kJ*mol-1
(Keq für die
Reaktion Malat Æ Fumarat + H2O ist 5,22)
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