Isotopenlabeling Radioisotope: 14C, 3H (T), 32P, 35S Detektion
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Pierre Stallforth // HKI Jena! Isotopenlabeling! Radioisotope: ! Detektion: ! ! ! !! ! Stabile Isotope: !14C, 3H (T), 32P, 35S! Detektion: ! !NMR, MS...! !Autoradiogramm, Szintillationszähler! !Geigerzähler/Zählkammer...! 2H (D), 13C, 15N, 18O, 34S Pierre Stallforth // HKI Jena! Isotopenlabeling! Fallstudien: !14C (t1/2 = 5700y, β) Coniin! !! 13C Terpen Biosynthese ! ! !Reverse Labeling (Isocyanide) !! Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! N H Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! Robinson Hypothese ! !! O H2N H2N CO2H N HO Lysin 2-14C-Lysin Feeding ! !! H2N H2N CO2H N H O O N H CO2H N H Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! Edward Leete ! !! 2-14C-Lysin Feeding ! !! H2N H2N N H CO2H 1-14C-Acetat Feeding O OH N H JACS, 1964, 86, 2509! Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! 14C-Feeding Isolierung des Metaboliten Abbauprodukte Bestimmung der Aktivität = 100% 100% 40% 20% 60% 40% Bestimmung der Aktivität (Szintillationszähler, Geigerzähler) Pierre Stallforth // HKI Jena! Schmidt Abbau! Isolierung des Metaboliten 14C-Feeding Bestimmung der Aktivität (Szintillationszähler, Geigerzähler) Abbauprodukte Bestimmung der Aktivität = 100% O R O H+ OH R O HN3 R N H N N O H2O NH R O H O -CO2 NH2 R NH2 R Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! Isolierung des Metaboliten 14C-Feeding Bestimmung der Aktivität = 100% BaCO3 [Ox] O ONa N H O H H Abbauprodukte Bestimmung der Aktivität (Szintillationszähler, Geigerzähler) Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! i) MeI i) Base MeI N H N ii) PtO, H2 ii) Base N N i) OsO4 i) NaIO4 O KMnO4 H O Schmidt BaCO3 i) NaIO4 O KMnO4 H H O O i) MeI ii) Base OH H O i) OsO4 H2N Schmidt H2N OH BaCO3 Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! [C] [C] [C] O N H OH O N H O HO2C [NH3] O 4x HO O Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! O N H HO2C O 4x O HO O [NH3] O OH N H OH N H O O N H O 4x OH HO JACS, 1970, 92, 3835! Pierre Stallforth // HKI Jena! Coniin! NH2 O O OH O O CO2H O H OH O CO2H NADPH O NH2 N N H Pierre Stallforth // HKI Jena! 13C Labeling! 14C: !findet immer noch Anwendung, z. B. bei Pflanzen, ! !oder falls wenig Produktion stattfindet !! ! 13C: !Seit der Erfindung des NMR sehr beliebt und ! !effizient. (kein Abbau nötig, Messung einfach, etc...)! Pierre Stallforth // HKI Jena! 13/14CO Feeding 2 ! Pierre Stallforth // HKI Jena! 13C Labeling! 13C: !ca. 1% in natürlichem Kohlenstoff !! !Anreicherung führt zu erhöhten Signalen im 13C-NMR! ! Probleme: !Welche 13C-Quelle verwenden?! ! !Scrambling (Anabolismus+Katabolismus) ! Pierre Stallforth // HKI Jena! Terpen Biosynthese! OPP OPP Pierre Stallforth // HKI Jena! Glykolyse! O OH OH OH O O PO OH OH OH O OH PO OH OH PO OH OP PO OH OH OH O PO HO HO OH O OH OH OH PO O OH OP O O SCoA OH O O OH O SCoA Pierre Stallforth // HKI Jena! Building Block Biosynthese – Mevalonat (MVA) Pathway! O SCoA O O O O HO O SCoA SCoA SCoA SCoA O HO HO OH O OH 3 OH PO 2 ATP OPP O OH ATP OPP O O H OPP OPP O O O SCoA 2 NADPH OPP Pierre Stallforth // HKI Jena! Bakterielle Hopanoide! OH OH OH NH2 OH OH OH NH2 Pierre Stallforth // HKI Jena! Bakterielle Hopanoide! Seitenkette:! ! Probleme: ! ! ! ! ! !aus dem Pentosephosphat Weg! !Biosynthese des Hopan Grundgerüsts ! !sollte trivial sein (Acetat...)! !Labeling Pattern passt nicht... ! Pierre Stallforth // HKI Jena! O OH OH OH O O PO OH OH OH O OH PO OH OH PO OH OP PO OH OH OH O PO OH O HO HO OH OH PO OH O OH OP O O SCoA OH O 3 O O SCoA OPP OH OPP O SCoA Pierre Stallforth // HKI Jena! 3 O SCoA ? OPP OPP OPP OPP Pierre Stallforth // HKI Jena! Alternativer Weg zum MVA Pathway! Erklärung: ! ! ! ! Bausteine: ! !Alternativer Biosyntheseweg für DMAPP !und IPP! !Nicht Acetat! Pierre Stallforth // HKI Jena! Alternativer Weg zum MVAPathway! Weitere Studien: ! ! ! ! !Bausteine stammen aus der! !Glycolyse! O OH PO O O OH Pierre Stallforth // HKI Jena! Alternativer Weg zum Mevalonat Pathway! HO HO OH O OH O OH OH PO O O OH Pierre Stallforth // HKI Jena! Alternativer Weg zum Mevalonat Pathway! N N N N O S OPP S OH OH PO HO Methyl erythritol phosphate MEP NADPH HO O OPP OH O OH PO HO PO S O H OH O PO OH N OPP S OPP N H2N N+ OH N+ N+ N H2N O H2N H2N PPO N N OH O PO OH OH Deoxy xylulose phosphate DOXP O Pierre Stallforth // HKI Jena! MVA vs non-MVA Pathway! Non-MVA: ! ! ! ! MVA: ! ! ! MEP: ! ! ! !Methyl Erythritol Pathway (MEP)! !Deoxy xylulose phophate (DOXP)! !GAP/Pyruvat! !Tiere, Pilze, (Bakterien), Archaea, Pflanzen! !Bakterien, Parasiten, Grünalgen, Pflanzen! !! Pierre Stallforth // HKI Jena! Inhibitoren! OH O OH OH DOXP reductoisomerase PO O PO HO Methyl erythritol phosphate MEP OH Deoxy xylulose phosphate DOXP O HO O P OH OH Fosmidomycin SCoA O SCoA OH O OH N statins HO O O O H OH HO HMG CoA reductase O OH Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! -C N+ H2N O OH isnA isnB N H -C N+ N H N H Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! -C N+ H2N O OH isnA N H isnB N H Normalerweise gibt die Struktur einer Verbindung Ansätze für die Biosynthese.! ! Bei einem Kohlenstoffatom ist das jedoch nahezu unmöglich! Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! -C N+ H2N O OH isnA N H Feeding: ! ! ! ! ! ! isnB N H !Wo soll man Anfangen? Gelabelte !Verbindungen (Aminosäuren, Zucker, etc !sind teuer)! Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! -C N+ H2N O OH isnA N H isnB N H Wenn man Glück hat kann der Organismus in Minimalmedium wachsen! ! Ansonsten ist es möglich die 2 Gene isnA und isnB in einen Organismus zu überführen, der in MM wachsen kann. Es bietet sich z. B. E. coli an.! Pierre Stallforth // HKI Jena! Beispiel 3: Reverse Labeling! Minimalmedium besteht aus einer Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Spurenelementen (Metalle, Salze, Schwefel, etc)! ! Es ist daher möglich einen 13C Background zu schaffen, wenn man z. B. als C-Quelle 13C6-Glucose verwendet!! ! Feeding wird dann mit 12C-Verbindungen durchgeführt – viel billiger! ! ! Pierre Stallforth // HKI Jena! Normales vs. Reverse Labeling! A* B* Minimal Medium C* D* E* Pierre Stallforth // HKI Jena! Normales vs. Reverse Labeling! A* B* Minimal Medium C* D* E* A B Minimal Medium* C D E Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! -C N+ H2N O OH isnA N H isnB N H Es existieren in E. coli Mutanten, die z. B. bestimmte Aminosäuren nicht produzieren können (auxotrophie) – ! besonders hilfreich, bei Feeding Experimenten! ACIE 2005, 44, 7045. Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! H2N O OH E. coli Trp- N H isnA OH HO HO O OH N+ isnB N H OH Es existieren in E. coli Mutanten, die z. B. bestimmte Aminosäuren nicht produzieren können (auxotrophie) – ! besonders hilfreich, bei Feeding Experimenten! Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! H2N O OH E. coli Trp- N H isnA OH HO HO O N+ isnB N H OH OH NH2 CO2H H2N E. coli Trp- Ala- O N+ OH N H isnA OH HO HO O OH OH isnB N H Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! H2N O OH E. coli Trp- N H isnA OH HO HO O OH N+ isnB N H OH ! C-Atom stammt nicht aus einer Aminosäure – vielleicht aus Glycolyse, TCA-Cylus oder Pentosephosphat Weg?! Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! H2N O OH E. coli Trp- N H isnA OH HO HO O OH N+ isnB N H OH ! C-Atom stammt nicht aus einer Aminosäure – vielleicht aus Glycolyse, TCA-Cylus oder Pentosephosphat Weg?! Pierre Stallforth // HKI Jena! Biosynthese von Isocyaniden! OH OH O OH OP O OH OH OH OP ! C-Atom stammt nicht aus einer Aminosäure – vielleicht aus Glycolyse, TCA-Cylus oder Pentosephosphat Weg?! Pierre Stallforth // HKI Jena! Bakterielle Sekundärmetabolitpeoduzenten! Actinobacterien: !Insbesondere der Gattung Streptomyces! ! γ-Proteobacterien:!Gattung Pseudomonas! ! δ-Proteobacterien: Ordnung Myxobacterien ! !! ! Pierre Stallforth // HKI Jena! Bakterielle Sekundärmetabolitpeoduzenten! Actinobacterien: !Insbesondere der Gattung Streptomyces! ! Mit Abstand die meisten Antibiotika (und Cytostatika) stammen aus diesen Gram+ Bakterien! Pierre Stallforth // HKI Jena! 2000 1970 1960 1950 1940 Daptomycin Mupirocin Kanamycin Rifamycin Vancomycin Erythromycin Tetracyclin Chloramphenicol Cephalosporins Streptomycin Penicillin S. roseosporus P. fluorescens S. kanamycinicus A. mediterranei S. orientalis Saccharopolyspora erythrea S. aureofaciens S. venezuelae S. clavuligerus S. griseus Penicillium chrysogenum
