Diagnostik und Impfungen - Ruhr

Grundlagen der Immunologie
5. Semester - Dienstags 11.15 Uhr
Ruhr-Universität Bochum, HMA 20
Diagnostik und Impfungen
Albrecht Bufe
www.ruhr-uni-bochum.de/homeexpneu
Immundiagnostik
(Antikörper-/ Antigennachweis)
Antikörpernachweis: Nephelometrie
Antigenüberschuß
/
Äquivalenz
Präzipitation
Licht
Hohe Dichte
/
Antikörperüberschuß
Antikörpernachweis: Nephelometrie
Streulicht (relative Einheit
Antigenüberschuß / Äquivalenz / Antikörperüberschuß
Antikörperkonzentration mg/dl
Quantifizierung von Gesamt-Ig-Antikörpern mittels ELISA
(Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay)
Substrat:
BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)
+
NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)
Alkalische
Phosphatase
Capture-AK
(IgG-Anti-IgE)
+ Serum-IgE
+ Nachweis-AK
(IgG-Anti-IgE)
+ Substrat
Nachweis von spezifischen Ig-Antikörpern mittels
ELISA
(Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay)
Substrat:
BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)
+
NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)
Alkalische
Phosphatase
Antigen
(spezifisches Allergen)
+ Serum-IgE
+ Nachweis-AK
(IgG-Anti-IgE)
+ Substrat
Quantifizierung des Substrats mittels Photometer
SDS-PAGE
(Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese)
Western Blot (to blot = mit Löschpapier abtupfen)
Gefärbtes
SDS-PAGE-Gel
Blot nach dem
Transfer der Proteine
Western Blot Banden,
mit einem spezifischen
Antikörper identifiziert
Western Blot (spezifischer Nachweis eines Proteins mittels Antikörper)
Hier Verwendung
unterschiedlicher
Färbemethoden
Immundiagnostik
(Nachweis von spezifischen Zellen)
Antigendarstellung: Fluoreszenz
Figure A-17 part 1 of 2
Antigendarstellung: Fluoreszenz
l=488 nm
Fluorochrom
l=530 nm
Antikörper
Laser (Anregung)
Häufig verwendete
Fluorochrome
Emission
Anregung
(nm)
Photodetektor +
angeschlossenes
Analysesystem (PC)
Abstrahlung
(nm)
Antigendarstellung: Fluoreszenz
Medizinische Bedeutung:
Nachweis verschiedener
Zelltypen in Suspension
(Differentialblutbild) und
Gewebeschnitten
Langerhansschen Inseln im Pankreas)
 Zellen (orange = Glutamin-Decarboxylase)
ß Zellen (grün = Glucagon)
Immundiagnostik
(Charakterisierung, Sortierung und
Präparation spezifischer Zellen)
Zellsortierung: Mononukleäre Zellen mit FicollHypaque-Gradientenzentrifugation
Thrombozyten
verdünntes
Blut
Ficoll
(Dichte = 1,078)
Zellkultur
in vitro
Mononukleäre Zellen
des peripheren Blutes
(PBMC)
Zentrifugation
Erythrozyten
Granulozyten
Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Prinzip]
Laser
(488 nm)
Vorwärtsstreuung
(FSC)
Zellgröße
Seitwärtsstreuung
(SSC)
Granularität
Zellanalysen: Durchflußzytometrie
(oder: Fluoreszenz assisted cell sorting = FACS)
Zellgemisch mit fluoreszierenden Ak
Photodetektoren
Flüssigkeitsstrom mit
Ak-markierten Zellen
grün
rot
FSC
Laser
SSC
Zellanalysen: Durchflußzytometrie
[Vollblutanalyse mittels Morphologie]
Granulozyten
SSC
R1
Monozyten
FSC
Zellschrott
Lymphozyten
Zellanalysen: Durchflußzytometrie
[Fuoreszenzanalyse aus R1]
Dot Plot
Histogramm
CD3+
T-Zellen
CD3+
T-Zellen
20%
R1
CD64+
Monozyten
Quantitativ !
54%
FSC
Zellgemisch mit
fluoreszierenden Ak
Photodetektoren
Zellsortierung:
Flüssigkeitsstrom mit
Ak-markierten Zellen
grün
rot
FSC
Laser
Ablenkplatten
Sortierte
Zellen
SSC
Zellsortierung: Magnetisch
Zweck:
Isolierung magnetisch markierter Zellpopulationen aus einem
Zellgemisch zur funktionellen oder phänotypischen Analyse
Prinzip:
Anlegen eines Magnetfeldes
Zellgemisch mit Ak, an die
paramagnetische Partikel
gekoppelt sind
Magnetisch markierte Zellen
werden zurückgehalten
Entfernen des Magneten
gebundene Zellen
werden freigesetzt
Impfung
Impfung (vaccination):
Schutzimpfung: Erzeugung einer
Immunität zur individuellen und kollektiven
Vorbeugung (Prävention) gegen
Infektionskrankheiten
Aktive
Schutzimpfung:
künstliche
Erzeugung einer
abgeschwächten
Erkrankung durch
Einverleibung
vermehrungsfähiger,
virulenzabgeschwächter
Krankheitserreger
beziehungsweise
Impfkeime.
Passive
Schutzimpfung:
Einspritzung von
Immunglobulinpräparationen
(spezifische Antikörper)
oder Serum aktiv
immunisierter
Menschen
bzw. Tiere
Tetanus
Diphtherie
Pertussis
Haemophilus
influenzae Typ b
Poliomyelitis
Hepatitis B
Pneumokokken
Meningokokken
Masern, Mumps,
Röteln (MMR)
Varizellen
Influenza
Humane
Papillomviren
Empfehlungen der Ständigen Impfkommission (STIKO); Robert Koch Institut (RKI); Epidemiologisches Bulletin; 2.8.2010
Welchen Anforderungen muss ein
Impfstoffe genügen ?
• Zur Immunisierung gegen extrazelluläre
Antigene müssen T-Helfer-Zellen aktiviert
werden, die B-Zellen zur
Antikörperproduktion stimulieren.
• Zur Immunisierung gegen intrazelluläre
Antigene müssen zytotoxische T-Zellen
aktiviert werden.
Welchen Anforderungen muss ein
Impfstoffe genügen ?
• Zum Schutz vor Toxinen (und manchen
intrazellulären Erregern) müssen bereits
zu Beginn der Erkrankung Antikörper
vorliegen, um eine wirksame Abwehr zu
ermöglichen.
• Gewünscht ist ein besonderer Schutz an
der Eintrittsstelle des Pathogens (oft:
Schleimhäute  Aktivierung von IgAAntikörpern).
Welchen Anforderungen muss ein
Impfstoffe genügen ?
• T-Zellen und Antikörper müssen sich
gegen die richtigen Erkennungsstellen
richten.
• Sicherheit (geringe Nebenwirkungen),
Erzeugung langlebiger Gedächtniszellen,
Impfschutz bei einem hohen Prozentsatz
der Geimpften, günstiger Preis.
Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe
1) Konjugatimpfstoffe erleichtern die Kooperation
zwischen B- und T-Zellen
2) Adjuvantien erhöhen die Immunogenität von
Impfstoffen
3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von
Lebendimpfstoffen
4) Synthetische Peptide können eine schützende
Immunantwort hervorrufen
5) Applikationsweg der Impfung kann für die Wirkung
entscheidend sein
6) Neue Strategien: DNA Vakzination
Konjugatimpfstoffe:
erleichtern die Kooperation
zwischen B- und T-Zellen
Marginal-Zonen BZellen findet man
nur in der Milz. Sie
werden T-Zell
unabhängig vor
allem von Kapselpolysacchariden
aktiviert. Bei
Neugeborenen und
Kindern bis zum 2.
Lebensjahr sind sie
nur in niedrigen
Zahlen vorhanden.
Klouvenberg et al. 2008 Clin Dev Immunol
Mit der Konjugation der
Kapselpolysaccharide
umgeht man die
Schwäche von
Neugeborenen und
Kleinkindern, auf die
Polysaccharide zu
reagieren, indem man
das Polysaccharid an
eine Protein, z.B. ein
Bakterientoxin (oder
wie bei der
Meningokokken B
Impfung an Vesikeln)
koppelt und so eine
Thymus-abhängige
Immunantwort auslöst.
Klouvenberg et al. 2008 Clin Dev Immunol
Adjuvantien erhöhen die
Immunogenität von Impfstoffen
Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe
2) Adjuvantien erhöhen die Immunogenität von
Impfstoffen:
• Aluminiumsalze (polyvalente Bindung an Proteine)
• Pertussistoxin
• Zellwandbestandteile von Mycobakterien
• Gabe von Cytokinen (IL-12, verstärkt IgG-Produktion)
Attenuierung von Viren erhöht die
Sicherheit von Lebendimpfstoffen
Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe
3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von
Lebendimpfstoffen
Risiko: Rückmutation, immunschwache Patienten
Heute: gezielte Veränderung durch Gentechnologie
Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe
3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von
Lebendimpfstoffen
Heute: gezielte Veränderung durch Gentechnologie
(Anwendung auch im Fall von Bakterien)
Applikationsweg der Impfung kann für
die Wirkung entscheidend sein
Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe
5) Der Applikationsweg bei der Impfung kann für die
Wirkung entscheidend sein
subkutan/i.m.
oral
Neue Strategien: z.B. DNA Vakzination