Diagnostik und Impfungen - Ruhr
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Grundlagen der Immunologie 5. Semester - Dienstags 11.15 Uhr Ruhr-Universität Bochum, HMA 20 Diagnostik und Impfungen Albrecht Bufe www.ruhr-uni-bochum.de/homeexpneu Immundiagnostik (Antikörper-/ Antigennachweis) Antikörpernachweis: Nephelometrie Antigenüberschuß / Äquivalenz Präzipitation Licht Hohe Dichte / Antikörperüberschuß Antikörpernachweis: Nephelometrie Streulicht (relative Einheit Antigenüberschuß / Äquivalenz / Antikörperüberschuß Antikörperkonzentration mg/dl Quantifizierung von Gesamt-Ig-Antikörpern mittels ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Alkalische Phosphatase Capture-AK (IgG-Anti-IgE) + Serum-IgE + Nachweis-AK (IgG-Anti-IgE) + Substrat Nachweis von spezifischen Ig-Antikörpern mittels ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Alkalische Phosphatase Antigen (spezifisches Allergen) + Serum-IgE + Nachweis-AK (IgG-Anti-IgE) + Substrat Quantifizierung des Substrats mittels Photometer SDS-PAGE (Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese) Western Blot (to blot = mit Löschpapier abtupfen) Gefärbtes SDS-PAGE-Gel Blot nach dem Transfer der Proteine Western Blot Banden, mit einem spezifischen Antikörper identifiziert Western Blot (spezifischer Nachweis eines Proteins mittels Antikörper) Hier Verwendung unterschiedlicher Färbemethoden Immundiagnostik (Nachweis von spezifischen Zellen) Antigendarstellung: Fluoreszenz Figure A-17 part 1 of 2 Antigendarstellung: Fluoreszenz l=488 nm Fluorochrom l=530 nm Antikörper Laser (Anregung) Häufig verwendete Fluorochrome Emission Anregung (nm) Photodetektor + angeschlossenes Analysesystem (PC) Abstrahlung (nm) Antigendarstellung: Fluoreszenz Medizinische Bedeutung: Nachweis verschiedener Zelltypen in Suspension (Differentialblutbild) und Gewebeschnitten Langerhansschen Inseln im Pankreas) Zellen (orange = Glutamin-Decarboxylase) ß Zellen (grün = Glucagon) Immundiagnostik (Charakterisierung, Sortierung und Präparation spezifischer Zellen) Zellsortierung: Mononukleäre Zellen mit FicollHypaque-Gradientenzentrifugation Thrombozyten verdünntes Blut Ficoll (Dichte = 1,078) Zellkultur in vitro Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) Zentrifugation Erythrozyten Granulozyten Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Prinzip] Laser (488 nm) Vorwärtsstreuung (FSC) Zellgröße Seitwärtsstreuung (SSC) Granularität Zellanalysen: Durchflußzytometrie (oder: Fluoreszenz assisted cell sorting = FACS) Zellgemisch mit fluoreszierenden Ak Photodetektoren Flüssigkeitsstrom mit Ak-markierten Zellen grün rot FSC Laser SSC Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Vollblutanalyse mittels Morphologie] Granulozyten SSC R1 Monozyten FSC Zellschrott Lymphozyten Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Fuoreszenzanalyse aus R1] Dot Plot Histogramm CD3+ T-Zellen CD3+ T-Zellen 20% R1 CD64+ Monozyten Quantitativ ! 54% FSC Zellgemisch mit fluoreszierenden Ak Photodetektoren Zellsortierung: Flüssigkeitsstrom mit Ak-markierten Zellen grün rot FSC Laser Ablenkplatten Sortierte Zellen SSC Zellsortierung: Magnetisch Zweck: Isolierung magnetisch markierter Zellpopulationen aus einem Zellgemisch zur funktionellen oder phänotypischen Analyse Prinzip: Anlegen eines Magnetfeldes Zellgemisch mit Ak, an die paramagnetische Partikel gekoppelt sind Magnetisch markierte Zellen werden zurückgehalten Entfernen des Magneten gebundene Zellen werden freigesetzt Impfung Impfung (vaccination): Schutzimpfung: Erzeugung einer Immunität zur individuellen und kollektiven Vorbeugung (Prävention) gegen Infektionskrankheiten Aktive Schutzimpfung: künstliche Erzeugung einer abgeschwächten Erkrankung durch Einverleibung vermehrungsfähiger, virulenzabgeschwächter Krankheitserreger beziehungsweise Impfkeime. Passive Schutzimpfung: Einspritzung von Immunglobulinpräparationen (spezifische Antikörper) oder Serum aktiv immunisierter Menschen bzw. Tiere Tetanus Diphtherie Pertussis Haemophilus influenzae Typ b Poliomyelitis Hepatitis B Pneumokokken Meningokokken Masern, Mumps, Röteln (MMR) Varizellen Influenza Humane Papillomviren Empfehlungen der Ständigen Impfkommission (STIKO); Robert Koch Institut (RKI); Epidemiologisches Bulletin; 2.8.2010 Welchen Anforderungen muss ein Impfstoffe genügen ? • Zur Immunisierung gegen extrazelluläre Antigene müssen T-Helfer-Zellen aktiviert werden, die B-Zellen zur Antikörperproduktion stimulieren. • Zur Immunisierung gegen intrazelluläre Antigene müssen zytotoxische T-Zellen aktiviert werden. Welchen Anforderungen muss ein Impfstoffe genügen ? • Zum Schutz vor Toxinen (und manchen intrazellulären Erregern) müssen bereits zu Beginn der Erkrankung Antikörper vorliegen, um eine wirksame Abwehr zu ermöglichen. • Gewünscht ist ein besonderer Schutz an der Eintrittsstelle des Pathogens (oft: Schleimhäute Aktivierung von IgAAntikörpern). Welchen Anforderungen muss ein Impfstoffe genügen ? • T-Zellen und Antikörper müssen sich gegen die richtigen Erkennungsstellen richten. • Sicherheit (geringe Nebenwirkungen), Erzeugung langlebiger Gedächtniszellen, Impfschutz bei einem hohen Prozentsatz der Geimpften, günstiger Preis. Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 1) Konjugatimpfstoffe erleichtern die Kooperation zwischen B- und T-Zellen 2) Adjuvantien erhöhen die Immunogenität von Impfstoffen 3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von Lebendimpfstoffen 4) Synthetische Peptide können eine schützende Immunantwort hervorrufen 5) Applikationsweg der Impfung kann für die Wirkung entscheidend sein 6) Neue Strategien: DNA Vakzination Konjugatimpfstoffe: erleichtern die Kooperation zwischen B- und T-Zellen Marginal-Zonen BZellen findet man nur in der Milz. Sie werden T-Zell unabhängig vor allem von Kapselpolysacchariden aktiviert. Bei Neugeborenen und Kindern bis zum 2. Lebensjahr sind sie nur in niedrigen Zahlen vorhanden. Klouvenberg et al. 2008 Clin Dev Immunol Mit der Konjugation der Kapselpolysaccharide umgeht man die Schwäche von Neugeborenen und Kleinkindern, auf die Polysaccharide zu reagieren, indem man das Polysaccharid an eine Protein, z.B. ein Bakterientoxin (oder wie bei der Meningokokken B Impfung an Vesikeln) koppelt und so eine Thymus-abhängige Immunantwort auslöst. Klouvenberg et al. 2008 Clin Dev Immunol Adjuvantien erhöhen die Immunogenität von Impfstoffen Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 2) Adjuvantien erhöhen die Immunogenität von Impfstoffen: • Aluminiumsalze (polyvalente Bindung an Proteine) • Pertussistoxin • Zellwandbestandteile von Mycobakterien • Gabe von Cytokinen (IL-12, verstärkt IgG-Produktion) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von Lebendimpfstoffen Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von Lebendimpfstoffen Risiko: Rückmutation, immunschwache Patienten Heute: gezielte Veränderung durch Gentechnologie Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 3) Attenuierung von Viren erhöht die Sicherheit von Lebendimpfstoffen Heute: gezielte Veränderung durch Gentechnologie (Anwendung auch im Fall von Bakterien) Applikationsweg der Impfung kann für die Wirkung entscheidend sein Strategien zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe 5) Der Applikationsweg bei der Impfung kann für die Wirkung entscheidend sein subkutan/i.m. oral Neue Strategien: z.B. DNA Vakzination
