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Aus der Klinik für Vögel und Reptilien und dem Institut für Virologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Vorkommen aviärer Metapneumoviren in sächsischen Legehennenbeständen während der Legeperiode Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Britt Nemecek, geb. Laner aus Berlin Leipzig, 2011 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. med. vet. Uwe Truyen Betreuer: Prof. Dr. med. vet. Maria-Elisabeth Krautwald-Junghanns Prof. Dr. med. vet. Hermann Müller Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Maria-Elisabeth Krautwald-Junghanns Klinik für Vögel und Reptilien Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig Prof. Dr. med. vet. Hermann Müller Institut für Virologie Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig Prof. Dr. med. vet. Hafez Mohamed Hafez Institut für Geflügelkrankheiten Fachbereich Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin Tag der Verteidigung: 5. Juni 2011 Für Michi Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 Das aviäre Metapneumovirus (aMPV) Geschichte, Vorkommen und Bedeutung Klassifikation Struktur Subtypen des aMPV Eigenschaften 2 2 3 3 4 5 2.2 Pathogenese 6 2.3 Immunreaktionen 7 2.4 Epizootiologie 8 2.5 Wirtsspektrum 9 2.6 2.6.1 2.6.2 Klinische Erscheinungen Puten Hühner 9 9 10 2.7 Verlauf der Infektion 11 2.8 Pathologisch-anatomische Veränderungen 12 2.9 Histopathologische Veränderungen 13 2.10 2.10.1 2.10.1.1 2.10.1.2 2.10.1.3 2.10.1.4 2.10.2 Diagnose Direkter Nachweis Elektronenmikroskopie Virusisolierung Nachweis von Antigen Nachweis des Genoms Indirekter Nachweis 14 14 14 15 15 15 16 2.11 Differentialdiagnosen 17 2.12 Therapie 17 2.13 Immunprophylaxe 18 3 Material und Methoden 20 3.1 3.1.1 3.1.1.1 Material Geräte und Verbrauchsmaterial Geräte 20 20 20 Inhaltsverzeichnis 3.1.1.2 3.1.1.3 3.1.2 3.1.3 3.1.3.1 3.1.3.2 3.1.3.3 3.1.3.4 3.1.3.5 3.1.3.5.1 3.1.3.5.2 3.1.3.5.3 3.1.3.6 3.1.4 3.1.5 Verbrauchsmaterial Software Tiere Biologische Materialien Impfstoffe Bakterien Plasmide Enzyme Molekulargewichtsmarker DNA-Längenstandard dV1/PAT DNA-Längenstandard HaeIII RNA-Längenstandard Oligonukleotide (Primer) Vorgefertigte Systeme („Kits“) Lösungen, Puffer und Medien 20 20 21 24 24 24 24 25 25 25 25 25 25 27 27 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.3.1 3.2.3.2 3.2.3.3 3.2.3.4 3.2.3.5 3.2.3.6 3.2.4 3.2.5 3.2.5.1 3.2.5.2 3.2.6 3.2.6.1 3.2.6.2 3.2.6.3 3.2.6.3.1 3.2.6.3.2 3.2.6.4 3.2.7 3.2.7.1 3.2.7.2 3.2.8 3.2.9 3.2.10 3.2.10.1 3.2.10.2 3.2.11 3.2.11.1 3.2.11.2 3.2.12 3.2.12.1 3.2.12.2 Methoden Felduntersuchungen und Probengewinnung RNA-Isolierung PCR Qualitätssicherung Primerdesign Duplex Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (duplex RT-PCR) Nested Polymerase-Kettenreaktion (nested PCR) PCR zur Herstellung von „Fremdsequenzen“ Probenauswertung Nachweis von DNA durch Agarose-Gel-Elektrophorese Reinigung von DNA-Fragmenten Gene clean Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System Klonierung von DNA in Escherichia coli (E. coli) TOPO-TA-Klonierung Klonierung in K12 XL1-Blue MRF Charakterisierung rekombinanter DNA Selektion durch Antibiotikaresistenz Selektion durch -Komplementation (Blue-White-Screening) Plasmidpräparation aus E. coli Restriktionsenzymanalyse (REA) Analytische und präparative REA REA der Plasmid-DNA DNA-Sequenzierung Herstellung der Positivkontrollen In vitro-Transkription DNase-Verdau Nachweis von RNA durch Agarose-Gel-Elektrophorese Herstellung von Verdünnungsreihen und Sensitivitätstest der PCRs Nukleotid-Konzentrationsmessung Herstellung von RNA-Standards mit definierter Molekülmenge Serologische Untersuchung Interpretation der Ergebnisse Probenauswertung 27 27 28 28 28 29 29 30 30 31 31 31 31 31 32 32 32 33 33 33 34 34 35 35 35 35 36 36 37 37 37 38 39 40 40 Inhaltsverzeichnis 3.2.13 Statistische Auswertung 41 4 Ergebnisse 42 4.1 Konstruktion der Primer 42 4.2 Herstellung von Plasmiden 42 4.3 Herstellung der Positivkontrollen aMPV-Subtyp A und B 44 4.4 4.4.1 4.4.2 Sensitivitätsstudien In vitro-Transkription Herstellung von RNA-Standards mit definierter Molekülmenge 48 48 48 4.5 AMPV-Genomnachweis während der Legeperiode 51 4.6 Nachweis der aMPV-Subtypen 54 4.7 4.7.1 4.7.2 4.7.3 Analyse der PCR-Produkte Analyse der 209 bp-Amplifikate Analyse der PCR-Produkte des aMPV-Subtyp A Analyse der aMPV-Produkte des Subtyps B 55 57 60 62 4.8 PCR-Ergebnisse unter Einbeziehung des Alters der Legehennen 67 4.9 PCR-Ergebnisse unter Einbeziehung der Jahreszeit 68 4.10 PCR-Ergebnisse unter Einbeziehung der Haltungsform 68 4.11 4.11.1 4.11.2 4.11.3 Antikörper-Nachweis gegen aMPV Vergleich zweier kommerzieller ELISAs Antikörperstatus zum Zeitpunkt der Einstallung Antikörpernachweis während der Legeperiode 69 69 70 70 4.12 4.12.1 4.12.2 4.12.3 Wirtschaftliche Parameter Klinische Befunde Legeleistung Abgänge 71 72 72 73 5 Diskussion 74 5.1 5.1.1 5.1.2 Kritische Betrachtung der Methodik PCR ELISA 74 74 77 5.2 Verbreitung des aviären Metapneumovirus (aMPV) in Legehennenbetrieben 78 5.3 Vorherrschende Subtypen 80 5.4 AMPV-Nachweis in aMPV-geimpften Betrieben 82 5.5 AMPV in unterschiedlichen Haltungsformen 83 Inhaltsverzeichnis 5.6 Jahreszeitliche Schwankungen 83 5.7 Wirtschaftliche Bedeutung des aMPV 84 5.8 Schlussbetrachtung und zukünftige Fragestellungen 85 6 Zusammenfassung 87 7 Summary 89 8 Literaturverzeichnis 91 Anhang A 112 Anhang B 116 Anhang C 120 Abkürzungen Abkürzungen °C 3' (5') Grad Celsius 3' (5')- Ende eines Nukleinsäurestranges Abb. AE Aqua bidest. aMPV APV AS ATP Abbildung Aviäre Encephalomyelitis doppelt destilliertes Wasser aviäres Metapneumovirus aviäre Polyomavirus Aminosäure Adenosintriphosphat B bp Bodenhaltung Basenpaar (base pair) CEF CER cDNA chicken embryo fibroblasten chicken embryo rough komplementäre DNA (auch: copy DNA) d dATP dCTP DEPC dGTP DNA dNTP dTTP Tag Desoxyriboadenosintriphosphat Desoxyribocytidintriphosphat Diethylenpyrocarbonat Desoxyriboguanidintriphosphat Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonukleosidtriphosphat Desoxythymidintriphosphat E.coli EDTA EDS ELISA Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure egg drop syndrome enzyme-linked immunosorbent assay F F Freilandhaltung Fusionsprotein des aMPV G ges. Adhäsionsglykoprotein des aMPV gesamt HEF hMPV H2O2 Hühnerembryofibroblasten humanes Metapneumovirus Wasserstoffperoxid IB IBV IBD IBDV ICTV IFN ILT infektiöse Bronchitis (infectious bronchitis) Virus der infektiösen Bronchitis (infectious bronchitis virus) infektiöse Bursitis (infectious bursitis disease) Virus der infektiösen Bursitis (infectious bursal disease virus) International Committee on Taxonomy of Viruses Interferon Infektiöse Laryngotracheitis Abkürzungen IPTG i.v. Isopropyl- -D-Thiogalactopyranosid intravenös K kb Käfighaltung Kilobase L LB LB-Agar LB-Medium LSL LT LW RNA-Polymeraseprotein des aMPV Lohmann Brown Luria-Bertani-Agar Luria-Bertani-Medium Lohmann LSL Lohmann Tradition Lebenswoche Wellenlänge M M2 M m mg min ml mM mRNA µ µg µl µM Matrixprotein des aMPV 2. Matrixprotein des aMPV molar milli (10-3) Milligramm Minute Milliliter millimolar Botenfunktions-RNA (messenger RNA) mikro (10-6) Mikrogramm Mikroliter mikromolar N n NaJ NCBI ND NDV n.d. nm Nr. nt Nukleoprotein des aMPV nano (10-9) Natriumjodid National Center for Biotechnology Information Newcastle Disease Virus der Newcastle Disease nicht durchgeführt Nanometer Nummer Nukleotid OD ORT optische Dichte Ornithobacterium rhinotracheale P PE PCR p.i. p pmol pos. pVL Phosphoprotein des aMPV Probenentnahme Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) post infectionem piko (10-12) pikomol positiv Plasmid Virologie Leipzig Abkürzungen REA RNA RNase rNTP rpm RT-PCR Restriktionsenzymanalyse Ribonukleinsäure (ribonucleic acid) Ribonuklease (RNA-spaltendes Enzym) Ribonukleotid-Triphosphat Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute) reverse-Transkriptase PCR sec s. S. SH SHS SNT ss SPF Sekunde siehe Seite Small Hydrophobic Protein des aMPV Swollen Head Syndrome Serumneutralisationstest einzelsträngig (single stranded) spezifiziert pathogenfrei Tab. TAE Tm Tris TRT Tabelle Tris-Acetat-EDTA-Puffer Schmelztemperatur (melting temperature) Tris(Hydroxymethyl)-Aminomethan Rhinotracheitis der Puten (turkey rhinotracheitis) U ü.N. UV Unit über Nacht ultraviolett V Volt ZPE zytopathischer Effekt Abkürzungen Abkürzungen für Aminosäuren und Nukleotide (Internationaler Einbuchstabencode) Nukleotide A C G K M N R S T U W Y Aminosäuren Adenin Cytosin Guanin G oder T A oder C A, C, G, oder T A oder G C oder G Thymin Uracil A oder T C oder T A B C D E F G H I K L M N P Q R S T V W X Y Z Alanin Aspartat oder Asparagin Cystein Aspartat Glutamat Phenylalanin Glycin Histidin Isoleucin Lysin Leucin Methionin Asparagin Prolin Glutamin Arginin Serin Threonin Valin Tryptophan beliebige Aminosäure Tyrosin Glutamat oder Glutamin Kapitel 1 1 Einleitung Einleitung Legehennenbetriebe müssen mit verschiedenen wirtschaftlichen Einbußen während einer Legeperiode rechnen und daher entsprechende Vorsichtsmaßnahmen treffen. Dabei ist es vor allem wichtig, auf ein gutes Management (u.a. optimale Futter- und Wasserversorgung, Lichtregime und Stallklima) zu achten und bei der Vielzahl an Impfmöglichkeiten die richtige Impfstrategie auszuwählen. Das Vorkommen und die Bedeutung der entsprechenden Erreger sollten dabei ebenso eine große Rolle spielen wie das Wissen über die Interaktionen einiger Impfstoffe. So kann z.B. die humorale Antwort gegen aviäre Metapneumoviren (aMPV) bei einer gleichzeitigen Impfung gegen das Newcastle Disease-Virus (NDV) oder das Virus der infektiösen Bronchitis (IBV) vermindert sein. Seit einigen Jahren ist die Impfung gegen das aMPV weit verbreitet, da eine aMPV-Infektion zu großen wirtschaftlichen Einbußen führen kann. Das Virus gewann seit Mitte der 80er Jahre weltweit als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner an Bedeutung. Bisher sind die Subtypen A-D bekannt, von denen in Europa vor allem A und B vorkommen sollen. Bei Legehennen zeigte sich bald, dass die Infektion nicht immer das klinische Bild des SHS auslöst, sondern auch subklinisch bleiben kann. Ein Legeleistungsabfall mit verminderter Eischalenqualität wurde in Zusammenhang mit einer aMPV-Infektion gebracht. Über die Verbreitung des aMPV in den Legehennenbeständen liegen allerdings bisher nur wenige gesicherte Angaben vor, eine Langzeitstudie existiert nur für Broiler. Im Rahmen der vorliegenden Studie sollten daher zum ersten Mal mehrere Legehennenherden über die gesamte Legperiode untersucht werden, um so Rückschlüsse auf die Verbreitung und Bedeutung des Virus für die Legehennenbetriebe zu erhalten. Dabei wurden verschiedene Haltungssysteme berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Parallel zu den Erhebungen wurde der Gesundheitszustand des Einzeltieres sowie der Herde und wirtschaftliche Parameter wie Legeleistung und Abgänge erfasst. Weiter sollte die Verbreitung der Subtypen A und B, gegebenenfalls auch anderer, sowie Sequenzunterschiede innerhalb eines Subtyps aufgeklärt werden. 1 Kapitel 2 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Das aviäre Metapneumovirus (aMPV) 2.1.1 Geschichte, Vorkommen und Bedeutung In den 1970er Jahren wurde erstmals über das Vorkommen einer akuten Atemwegserkrankung bei Puten in Südafrika berichtet (BUYS und DuPREEZ 1980). Die Erkrankung zeichnete sich durch hohe Kontagiosität und Mortalität (25%) aus. Fast parallel zeigten im gleichen Land Hühner eine Erkrankung, die mit Schwellungen im Kopfbereich verbunden waren (BUYS et al. 1989a). In den folgenden Jahren wurde in Frankreich (GIRAUD et al. 1986b) und in England (ANON 1985) von ähnlichen Erkrankungen berichtet, wo auch die Isolierung des Erregers (McDOUGALL und COOK 1986; WILDING et al. 1986; WYETH et al. 1986) und die Charakterisierung als Pneumovirus (CAVANAGH und BARRETT 1988) erfolgte. Die aus Nukleotidsequenzen beider Genome abgeleitete Aminosäuresequenz des Virus zeigte ca. 40% Übereinstimmung mit Pneumoviren der Säugetiere (Genus Pneumovirus). Außerdem unterschied sich die Anordnung der Gene. AMPV wurde daher dem neuen Genus Metapneumovirus zugeordnet (PRINGLE 1998; LAMB et al. 2000), zu dem auch das humane Metapneumovirus (hMPV) zählt. Dieses ist bereits seit ca. 50 Jahren in Kindern präsent (van den HOOGEN et al. 2001) und verursacht klinische Symptome des oberen Respirationstrakts und teils schwere Bronchiolitis und Pneumonie. AMPV ist inzwischen weit verbreitet. Der Nachweis des Virus bzw. aMPV-spezifischer Antikörper gelang u.a. in Südafrika, Europa, Israel, Marokko, Zimbabwe, Taiwan, Japan, Brasilien, Zentralamerika (JONES 1996), USA (SENNE et al. 1997; COOK et al. 1999; SEAL 2000), Kanada (GOYAL et al. 2003), Nigeria (OWOADE et al. 2006), Korea (LEE et al. 2007; KWON et al. 2010) und Jordanien (GHARAIBEH und ALGHARAIBEH 2007). Bisher konnte in Australien kein Nachweis des aMPV erbracht werden (BELL und ALEXANDER 1990). Zur Zeit werden vier Subtypen (A-D) unterschieden. Die Subtypen A und B kommen weltweit vor. Entgegen der langjährigen Meinung, dass der Subtyp A vornehmlich in England und der Subtyp B vornehmlich auf dem europäischen Festland auftreten würden, kommen beide Subtypen sowohl auf dem europäischen Festland als auch in England vor (NAYLOR et al. 1997; VAN de ZANDE et al. 1998). Der Subtyp C wurde erstmals in Nordamerika (SENNE et al. 1997) und später in Korea (LEE et al. 2007) und Frankreich (TOQUIN et al. 1999a, 2006) nachgewiesen. Der Nachweis des Subtyps D gelang bisher nur zweimal in Frankreich (BÄYON-AUBOYER et al. 2000). Bei Untersuchungen in Brasilien (ARNS und HAFEZ 1992) wurden bei 50% der untersuchten Legehennenherden Antikörper gegen aMPV nachgewiesen. Hingegen konnten COOK et al. (1988) 2 Kapitel 2 Literaturübersicht in England und WEMMER (1993) in Deutschland bei ca. 80% der untersuchten Legehennenherden positive ELISA-Ergebnisse erzielen. In Nigeria konnte eine Seroprevalenz von 40% in den untersuchten Geflügelherden nachgewiesen werden. Die Infektion erfolgte i.d.R. in der 25. Lebenswoche (OWOADE et al. 2006). In Jordanien erfolgte der Antikörper-Nachweis bei ca. 22% der Broilerherden, 75% der Legehennenherden und in 100% der Broiler-Elterntierherden. AMPVRNA konnte in nur ca. 13% der Broilerherden, 43% der Legehennenherden und in keinen der Broiler-Elterntierherden nachgewiesen werden. Alle nachgewiesenen Isolate gehörten zu dem Subtyp B (GHARAIBEH und ALGHARAIBEH 2007). HAARLÄNDER (2005) konnte in fünf der acht untersuchten Herden (62%) aus Brandenburg und Bayern das aMPV-Genom mittels RT-PCR nachweisen. In vier der fünf positiven Herden wurde Subtyp A nachgewiesen, in einer weiteren sowohl der Subtyp A als auch der Subtyp B. In Israel waren in 44% der Geflügelherden mittels RTPCR positiv, der Subtyp B dominierte. Eine aMPV-Infektion kann zusammen mit Sekundärerregern zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führen – durch erhöhte Todesfälle, zusätzliche Arzneimittelkosten, eine erhöhte Anzahl beanstandeter Tiere bei der Schlachtung sowie durch einen Rückgang der Legetätigkeit und verminderte Eischalenqualität bei Elterntieren und Legehennen (HAFEZ 1994). 2.1.2 Klassifikation Das aviäre Metapneumovirus (aMPV) wurde gemäß des International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) aufgrund seiner morphologischen, physikalischen, chemischen und serologischen Eigenschaften in die Familie der Paramyxoviridae, Unterfamilie Pneumovirinae, Genus Metapneumovirus, eingeordnet. 2.1.3 Struktur Das aMPV ist ein behülltes RNA-Virus mit pleomorpher Gestalt. Sphärische Formen besitzen einen Durchmesser von ca. 80-200 nm, runde Formen 500-700 nm. Filamentöse Formen sind 80-100 nm lang (GIRAUD et al. 1986b; MC DOUGALL und COOK 1986; BAXTER-JONES et al. 1987; COLLINS und GOUGH 1988; BUYS et al. 1989b; O´LOAN et al. 1992). Isolate aus Organkulturen können sogar eine Länge bis zu 1000 nm erreichen (COLLINS und GOUGH 1988; GOUGH 2003). Die Oberfläche der lipidhaltigen Hülle ist mit ca. 15 nm langen Projektionen bestückt. Der Raum zwischen den Spikes beträgt 2-3 nm (GIRAUD et al. 1986a; MC DOUGALL und COOK 1986; BUYS et al. 1989a; HAFEZ und WEILAND 1990). Das Nukleokapsid ist helikalsymmetrisch aufgebaut, hat einen Strangdurchmesser von 14-15 nm und eine Ganghöhe von 3 Kapitel 2 Literaturübersicht 7 nm. Das Genom des aMPV besteht aus einsträngiger, nicht segmentierter RNA mit negativer Polarität. Das Genom hat eine Größe von ca. 13,4 kb und beinhaltet acht verschiedene Bereiche, die jeweils ein Protein kodieren: Nukleoprotein N, Phosphoprotein P, Matrixprotein M, Fusionsprotein F, zweites Matrixprotein M2, Small Hydrophobic Protein SH, Adhäsionsglykoprotein G, RNAPolymeraseprotein L. Durch intensive Erforschung der Proteine sind Unterschiede zu den anderen Pneumoviren zutage getreten, die PRINGLE 1998 veranlassten, die Pneumovirinae in zwei Genera aufzuteilen, die Pneumoviren und die Metapneumoviren. Im Unterschied zu den Pneumoviren der Säugetiere besitzt aMPV keine nichtstrukturellen Proteine NS1 und NS2 (RANDHAWA et al. 1997). Die Reihenfolge der aviären Gene (3'-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5') differiert in der Anordnung (LING et al. 1992) und das L-Gen ist kleiner (RANDHAWA et al. 1996). Das G-Protein und das F-Protein an der Oberfläche des Virus induzieren neutralisierende Antikörper. Über das G-Protein bindet das Virus an die Wirtszelle (LEVINE et al. 1987). Das G-Protein ist außerdem ein wichtiger Faktor für die Pathogenität und die Immunogenität des Virus (GOVINDARAJAN et al. 2010). Das F-Protein ist die für die Aufnahme des Virus durch Fusion der Zellmembran mit der Virusmembran bei physiologischem pH zuständig (HERNANDEZ et al. 1996). Die Replikation des Virus erfolgt im Zytoplasma (COLLINS 1991). 2.1.4 Subtypen des aMPV Bis heute sind vier Subtypen bekannt: die Subtypen A und B, die unter anderem in Europa vorkommen (COOK et al. 1993a), der Subtyp C, der erstmals in Nordamerika (SENNE et al. 1997), später auch in Korea (BANET-NOACH et al. 2005) und Frankreich (TOQUIN et al. 1999a, 2006) nachgewiesen wurde, und der Subtyp D, der in Frankreich zweimal isoliert werden konnte (BÄYON-AUBOYER et al. 2000). Die Subtypen A und B konnten mit Hilfe von Neutralisationstests (COOK et al. 1993a) und Sequenzierung des Adhäsionsglykoproteins G (JUHASZ und EASTON 1994) unterschieden werden. Diese werden einem Serotyp zugerechnet (COOK et al. 1993a). Bei einem Vergleich der Aminosäuresequenzen des G-Proteins konnte innerhalb eines Subtyps eine Homologie von 98,5 bis 99,7% nachgewiesen werden, zwischen den Subtypen A und B von ca. 38% (JUHASZ und EASTON 1994). Die Aminosäuresequenzen des M-Proteins besitzen zwischen diesen Subtypen 89% (SEAL 1998), die des F-Proteins 83% Homologie (SEAL et al. 2000). Die israelischen Subtyp B Stämme unterscheiden sich von den europäischen und den Impfstämmen, sind aber untereinander relativ homogen (BANET-NOACH et al. 2005). Der Subtyp C wurde erstmals Ende der 90er Jahre in Nordamerika nachgewiesen (SENNE et al. 1997). Er unterscheidet sich serologisch von den europäischen Isolaten (KLEVEN 1997; 4 Kapitel 2 Literaturübersicht SENNE et al. 1997). Der Subtyp C und das humane Metapneumovirus (hMPV) grenzen sich durch den Nukleotid- und Aminosäuresequenzvergleich des G-Proteins vom Subtyp A, B und Subtyp D und des SH-Proteins vom Subtyp A und B ab (LWAMBA et al. 2002; ALVAREZ et al. 2003; NJENGA et al. 2003; TOQUIN et al. 2003; YUNUS et al. 2003). Der Subtyp C hat im L-Protein eine Aminosäuresequenzhomologie von 80% mit dem hMPV und von 68% mit dem Subtyp A (GOVINDARAJAN und SAMAL 2004). Im Vergleich zu den Subtypen A und B besteht im FProtein eine Sequenzhomologie von ca. 72% (SEAL et al. 2000), im M-Protein von 77-78% (SEAL 1998). Dieser Subtyp verursacht keine Ziliostase in Trachea-Organkulturen, jedoch einen ZPE in CEF-Kulturen (COOK et al. 1999). In Frankreich wurde aus Moschusenten ein Subtyp C isoliert (TOQUIN et al. 1999a), der zu einer unterschiedlichen genetischen Abstammung als der Subtyp C aus Nordamerika gehört. Er hat im Vergleich zu den nordamerikanischen Stämmen im G-Protein nur 75-83% Nukleotid- und maximal 70% Aminosäurenübereinstimmungen. Diese Unterschiede passen zu dem unterschiedlich geographischen Ursprung und den unterschiedlichen Wirtsspezies (TOQUIN et al. 2006). Der Subtyp D wurde bisher nur zweimal bei Puten in Frankreich nachgewiesen. Mit den Subtypen A und B teilt er ca. 55% der Nukleotid- und 31–43% der Aminosäuresequenz des G-Proteins und 76% der Aminosäuresequenz des L-Proteins; das F-Gen weist gegenüber dem Subtyp C 70-80% Homologie der Nukleotidsequenz auf (BÄYONAUBOYER et al. 2000). 2.1.5 Eigenschaften Das Virus ist gegen Äther, Chloroform und Hitze (56°C, 30 min) empfindlich. Es kann innerhalb von 15 min durch Lipidlösungsmittel, nichtionische Detergentien, H2O2 und Formalin vollständig inaktiviert werden (HAFEZ und ARNS 1991). Handelsübliche Desinfektionsmittel wie Lysovet-PA (Schülke und Mayr, Norderstedt), Venno-vet-1 (Menno Chemie-Vertrieb GmbH, Norderstedt) sind wirksam. Kommerzielle Handdesinfektionsmittel wirken innerhalb von einer Minute nach Auftragen auf die Finger (PATNAYAK et al. 2008). Stabil ist aMPV dagegen in einem pH-Bereich von 3 bis 9. Das Virus kann bis zu sechs Tage, aber nicht länger als neun Tage auf bestimmten Oberflächen stabil bleiben. Auf nicht porösen Oberflächen ist das Virus länger intakt als auf porösen (TIWARI et al. 2006). Es bleibt zwei Wochen bei Raumtemperatur oder vier Wochen bei 4°C stabil (COLLINS et al. 1986; GIRAUD et al. 1986a; HAFEZ und WEILAND 1990). Der Subtyp C des aMPV zeigt eine höhere Tenazität. Dieser Subtyp kann sechs Monate bei –20°C, zwölf Wochen bei 4°C, vier Wochen bei 20°C und bei 50°C bis zu sechs Stunden infektiös bleiben. Die Infektiosität bleibt nach zwölf Gefrier- und Auftauzyklen und sieben Tage langer Trocknung bei Raumtemperatur erhalten (TOWNSEND et al. 2000). VELAYUDHAN et al. (2003) 5 Kapitel 2 Literaturübersicht konnte die Infektiosität des aMPV (Subtyp C) in Einstreu aus Putenställen nach 60 Tagen dauernder Lagerung bei –12°C nachweisen. Der Erreger besitzt keine Neuraminidase-Aktivität und keine hämagglutinierenden Eigenschaften mit Erythrozyten von Huhn, Pute, Meerschweinchen, Kaninchen, Ente, Gans, Schwein, Pferd, Kuh, Maus, Schaf und Mensch (Blutgruppe 0) (COLLINS et al. 1986; GIRAUD et al. 1986a; WYETH et al. 1986; COOK et al. 1987; HAFEZ und WEILAND 1990). Die Replikationsrate des Virus im Wirt ist gering (COOK et al. 1991; JONES 1996). Der Einfluss anderer Viren auf die Replikation von aMPV und die serologische Antwort auf aMPV wurde für das Infektiöse Bronchitis Virus (IBV) (CAVANAGH et al. 1999; COOK et al. 2001; TARPEY et al. 2007) und des Newcastle Disease Virus (NDV) (GANAPATHY et al. 2005, 2006, 2007) untersucht. In beiden Fällen scheint die Replikationsrate des aMPV durch die Replikation der anderen Viren vermindert zu sein. AMPV-Lebendimpfstoff konnte doppelt so lange nachgewiesen werden, wenn die Impfung gleichzeitig mit ND-Impfstoff erfolgte (GANAPATHY et al. 2005). Obwohl die serologische Antwort auf aMPV deutlich verringert war, schützte die Impfung vor klinischen Symptomen (GANAPATHY et al. 2007, TARPEY et al. 2007). 2.2 Pathogenese Die Vermehrung des Virus findet hauptsächlich im oberen Atmungstrakt statt, schwächer in den Luftsäcken und der Lunge (JONES et al. 1988; COOK et al. 1991, 1993b; MAJO et al. 1995; CATELLI et al. 1998). Bei legenden Tieren kann sich das Virus mit Ausnahme des Subtyps C auch im Eileiterepithel replizieren (JONES et al. 1988; COOK et al. 2000; CHARY et al. 2002; JIRJIS et al. 2002). AMPV infiziert dabei die gleichen Zellen im Eileiter des Huhnes wie EDS-76 (COOK et al. 2000). Im Huhn konnte die Beteiligung des Eileiters nur über intravenöse Belastungsinfektionsversuche nachgewiesen werden. MAJO et al. (1995) konnten über den natürlichen Infektionsweg keine Beteiligung des Reproduktionstrakts beobachten. In einer Studie zu der Pathogenese des aMPV bei Broilern wurden die Subtypen A und B verglichen. So zeigten eine größere Anzahl an Tieren klinische Symptome, wie Depression, Husten, nasales Exsudat, schaumigen Augenausfluss und Schwellungen der Sinus, die mit Subtyp B infiziert wurden. Subtyp B zeigte eine größere Gewebeverteilung und eine längere Persistenz als Subtyp A. Beide Subtypen führten zu histopathologischen Veränderungen im Gewebe des Respirationstrakts und den paraoculären Drüsen, wie z.B. den Harderschen Drüsen oder den Tränendrüsen (AUNG et al. 2008). 6 Kapitel 2 2.3 Literaturübersicht Immunreaktionen Nach den Ergebnissen von Untersuchungen verschiedener Autoren führten experimentelle und Feldinfektionen zur Bildung von Antikörpern (PICAULT et al. 1987a, b; WYETH et al. 1987; COOK et al. 1988; PATTISON et al. 1989; SHIN et al. 2000b), die ab dem 5. Tag nach Auftreten der ersten Symptome mittels serologischer Methoden nachweisbar waren (BAXTER-JONES et al. 1989). AUNG et al. (2008) beobachteten eine Serokonversion bei Broilern 10-11 Tage p.i. Gleichzeitig mit dem Auftreten von Antikörpern kam es zu einer Tilgung des aMPV-Genoms. Eine Reinfektion war in der Regel mit einem Titeranstieg ohne klinische Erscheinungen verbunden. Unabhängig von der Klinik konnten in Seren von Elterntier-, Broiler-, Legehennen- und Perlhuhnherden aMPV-spezifische Antikörper festgestellt werden (PICAULT et al. 1987a, b; COOK et al. 1988; PATTISON et al. 1989). Nach Angaben von JONES et al. (1988) persistieren Antikörper bei älteren Puten um einiges länger (96 Tage) im Vergleich zu jungen Puten (35 Tage). Bei Puten wurde gezeigt, dass maternale Antikörper über das Ei übertragen werden. Die Titer sinken nach drei bis vier Wochen ab (HAFEZ et al. 1993; POLLAN und ANRATHER 1993) und scheinen nicht vor einer Feldinfektion zu schützen (LE GROS et al. 1988; COOK et al. 1989a, b; WILLIAMS et al. 1991a, b). COOK et al. (1989a) vermuten jedoch, dass die maternalen Antikörper gegen aMPV die Schäden reduzieren, die durch die Virusvermehrung verursacht werden können. Bei Hühnern konnte ebenfalls maternale Antikörper nachgewiesen werden (GOATER 1991; WEMMER 1993), die ab der 4.-10. Lebenswoche nicht mehr detektiert werden konnten (WEMMER 1993). Die Ergebnisse von Untersuchungen an Tieren, bei denen mit Cyclophosphamid eine B-Zellspezifische Immunsuppression ausgelöst wurde, deuten daraufhin, dass die Schutzwirkung gegen die aMPV-Infektion vorwiegend durch die zellgebundene Immunität vermittelt wird (JONES et al. 1992). Bei einer gleichzeitigen Impfung gegen NDV oder IBV ist die humorale Immunantwort gegen aMPV vermindert, ein Schutz besteht jedoch trotzdem, vermutlich vermittelt durch eine lokale Immunantwort (COOK et al. 2001; GANAPATHY et al. 2005, 2007; TARPEY et al. 2007). Bei Puten führte eine Infektion mit aMPV-Subtyp A oder B zu einem Anstieg der CD4+ T Zell Population in der Milz und den Harderschen Drüsen an Tag 7 oder 14 p.i. Infektion mit einem attenuierten Subtyp B Stamm führten bis zu sieben Tage p.i. zu einer Stimulation von MilzLeukozyten, welche zu einem Anstieg von Interferonen (IFN), Interleukin-6 und Nitridoxide führten. Eine Infektion mit virulentem aMPV führte zu einem Anstieg der IFNγ-Expression in den Harderschen Drüsen, in der Milz variierte die IFNγ-Expression je nach Stamm und Tag p.i. Die meisten lokalen Immunreaktionen waren jedoch unabhängig von dem verwendeten aMPV-Stamm (LIMAN und RAUTENSCHLEIN 2007). Lokale mucosale Immunglobuline spielen in der 7 Kapitel 2 Literaturübersicht Pathogenese des aMPV-Subtyp C bei Puten eine Rolle (CHA et al. 2007). Infektionen mit aMPV führen zu einer temporären Immunsuppression und können sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunität negativ beeinflussen (TIMMS et al. 1986). CHARY et al. (2002) zeigten, dass in der akuten Phase der Infektion (3.-7. Tag p.i.) Splenozyten nach einer Concanavalin A-Stimulation langsamer proliferierten und damit einen Anstieg der Nitridoxidinduzierenden Faktoren und der Interferone zur Folge hatten. Nitridoxide hemmen die Proliferation von T-Zellen (VAN der VEEN 2001). Zwischen den Subtypen A und B besteht eine belastbare Kreuzimmunität (COOK et al. 1995, 1996, 1999, 2000; ETERADOSSI et al. 1995; TOQUIN et al. 1996, 1999b). 2.4 Epizootiologie Das aMPV ist hochkontagiös und kann sich sehr schnell auf direktem oder indirektem Weg horizontal verbreiten (GIRAUD et al. 1986b; JONES et al. 1987; COOK et al. 1991). Kontakttiere von experimentell infizierten Broilern zeigten bereits nach 3-7 Tagen klinische Symptome (JONES et al. 1987). Die vertikale Übertragung wurde bisher nicht nachgewiesen. Da jedoch Jungputen, deren Elterntiere sich während der Legezeit mit aMPV infiziert hatten, im Alter von 3-16 Tagen auch erkrankten und die Inkubationszeit bei 3-7 Tagen liegt, wird die vertikale Übertragung als wahrscheinlich angesehen (SHIN et al. 2002a). JONES et al. (1988) konnten aMPV bei Putenelterntieren bis neun Tage p.i. im Eileiter experimentell infizierter Tiere nachweisen. STUART (1989) nahm an, dass die Ausbreitung über Futter und Trinkwasser stattfindet. Eine Übertragung über die Luft wurde von NAGARAJA et al. (2001) nachgewiesen, jedoch von ALKAHALAF et al. (2002) widerlegt. Den Wildvögeln wird eine Rolle in der Verbreitung des Virus zugeschrieben (NAGARAJA et al. 2000; SHIN et al. 2000a), ihre Bedeutung ist jedoch noch nicht endgültig geklärt (BENNETT et al. 2004). TURPIN et al. (2008) wiesen in Georgia, South Carolina, Arkansas und Ohio in fünf von 15 getesteten Wildvögelarten (Amerikanische Blesshühner, Amerikanische Krähen, Kanadische Wildgänse, Kuhreiher und Felsentaube) aMPVspezifische Antikörper nach. Amerikanische Blesshühner und Kanadische Wildgänse hatten die meisten seropositiven Ergebnisse und wurden zusätzlich mit Erfolg mittels RT-PCR getestet. Somit wurde demonstriert, dass Wildvögel als potentielles Erregerreservoir dienen und zur Verbreitung des Virus beitragen können. 8 Kapitel 2 2.5 Literaturübersicht Wirtsspektrum Die größte Bedeutung als potentielle Wirte für aMPV haben Puten und Hühner. Weitere Vogelarten, bei denen eine aMPV-Infektion beobachtet werden konnte, sind Fasane (GOUGH et al. 1988; CATELLI et al. 2001), Perlhühner (LITJENS et al. 1980; PICAULT et al. 1987b; GOUGH et al. 1988), Enten (TOQUIN et al. 1999b; SHIN et al. 2000b, 2001, 2002b), kanadische Wildgänse und Blauflügelenten (BENNETT et al. 2002). In den USA konnte SHIN et al. (2000b) das aMPVGenom auch in Gänsen, Sperlingen, Staren und Enten nachweisen, TURPIN et al. (2008) in Amerikanischen Blesshühnern und Kanadischen Wildgänsen. Der Antikörpernachweis erfolgte in den USA in Amerikanischen Blesshühnern, Amerikanischen Krähen, Kanadischen Wildgänsen, Kuhreihern und Felsentauben (TURPIN et al. 2008). Der aMPV-Antikörpernachweis, jedoch keine Virusisolierung, gelang bei Straußen in Zimbabwe (CADMAN et al. 1994) und bei Möwen aus dem Baltikum (HEFFELS-REDMANN et al. 1998). Eine experimentelle Infektion von wilden Fasanen und Perlhühnern induzierte eine Antikörperbildung, die Tiere blieben aber klinisch unauffällig (GOUGH et al. 1988). 2.6 Klinische Erscheinungen 2.6.1 Puten AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Turkey Rhinotracheitis (TRT) bekannt. Dabei handelt es sich um eine schwere respiratorische Infektion, die mit Niesen, Husten und Kopfschütteln einhergeht. Die Sinus infraorbitales sind geschwollen, ein schaumiger oculonasaler Ausfluss ist zu beobachten. Bakterielle Sekundärinfektionen verschlimmern die Klinik bis hin zu einem mukopurulenten Nasenausfluss. Die Erkrankung kann sich innerhalb von 24 Stunden im gesamten Stall ausbreiten (STUART 1989). Bei schlechtem Management und bakterieller Sekundärinfektion steigt die Mortalität (COOK et al. 1991). Bei einer aMPV-Infektion von Putenelterntieren und Legeputen kommt es neben milden respiratorischen Symptomen zu Einbußen in der Legeleistung bis zu 40% (STUART 1989; COOK et al. 1996), wobei auch vermehrt dünnschalige, deformierte und unpigmentierte Eier gelegt werden. Eine Infektion zu Legebeginn führt in der Regel zu einem starken Abfall der Legeleistung (JONES und WILDING 1990). Unter experimentellen Bedingungen konnten NAYLOR et al. (1992) beobachten, das eine aMPVInfektion die Folgen einer Infektion mit Mycoplasma gallisepticum verstärkt. 9 Kapitel 2 2.6.2 Literaturübersicht Hühner Die Rolle des aMPV als primäres Pathogen in Hühnern ist nicht eindeutig geklärt. Das Virus wurde aus Hühnern jeden Alters isoliert (PICAULT et al. 1987a; BUYS et al. 1989a; JONES et al. 1991; GOUGH et al. 1994; TANAKA et al. 1995). Auch eine spezifische Immunantwort kann nachgewiesen werden (WYETH et al. 1987), obwohl die Infektion nicht immer mit klinischer Symptomatik in den Hühnern verbunden ist (COOK et al. 1988). Hühner konnten experimentell mit aMPV infiziert werden (JONES et al. 1987; COOK et al. 1993b; MAJO et al. 1995; CATELLI et al. 1998). AMPV ist in das multifaktorielle Geschehen des Swollen Head Syndromes (SHS) involviert, das sowohl bei Broilern als auch bei Elterntieren beobachtet wird (COOK 2000a). Es stellt sich klinisch als Schwellung des Kopfes und des Infraorbitalsinus mit Apathie dar (Abb. 1A). Cerebrale Desorientierung, Torticollis und Opisthotonus folgen häufig (Abb. 1B) (O´BRIEN 1985; PATTISON et al. 1989; HAFEZ 1993). Auch Durchfall kann beobachtet werden (PATTISON et al. 1989). In Elterntieren wird ein Legeleistungsabfall beobachtet. Die Mortalität übersteigt selten 2%, die Morbidität kann 10% erreichen. Als weitere Erreger dieser Erkrankung gelten IBV (MORLEY und THOMSON 1984) und Escherichia coli (DROUAL und WOOLCOCK 1994; NAKAMURA et al. 1998). B A Abbildung 1. Klinische Bilder des Swollen Head Syndroms (SHS): A) geschwollene Sinus; B) Opisthotonus. aus: A) www.partnersahvetcornell.edu; B) www.poultrymed.com. Die Art des die Infektion auslösenden aMPV-Stamms scheint für das Auftreten klinischer Symptome eine wichtige Rolle zu spielen. So wird angenommen, dass Puten–Isolate keine respiratorischen Symptome in Broilern oder Legehühnern hervorrufen (BUYS et al. 1989a). JONES et al. (1987) konnten jedoch experimentell milde respiratorische Symptome in jungen Hühnern auslösen und die Replikation von aMPV im Respirationstrakt mit Hilfe des IFT nachweisen. 10 Kapitel 2 Literaturübersicht Es besteht die Annahme, dass aMPV neben dem Einfluss auf das Krankheitsbild des SHS auch eine Rolle bei einer verringerten Eiproduktion spielt (O´BRIEN 1985; WYETH et al. 1987; PATTISON et al. 1989; HAFEZ 1993). Nach okulonasaler Infektion konnte Antigen im Respirationstrakt, jedoch nicht im Eileiter, nachgewiesen werden (MAJO et al. 1995; CATELLI et al. 1998). Dem gegenüber gelang COOK et al. (2000) der Nachweis des Antigens im Eileiter mittels Immunperoxidasetest neun Tage nach einer i.v. Belastungsinfektion 50 Wochen alter Legehennen. Diese Arbeitsgruppe vermutete daher, dass die Effekte auf die Legeleistung direkt durch das Virus verursacht werden und nicht Begleiterscheinungen durch den generellen Effekt des Virus auf den gesamten Organismus darstellen. Intravenöse Belastungsinfektionsversuche bei Legehennen mit einem aMPV-Stamm des Subtyps B führten zu Legeleistungseinbußen bis zu 25% (COOK et al. 2000; HESS et al. 2004a) bzw. 50% (SUGIYAMA et al. 2006) und einer Verschlechterung der Eischalenqualität, die durch das vermehrte Auftreten dünn- und weichschaliger Eier gekennzeichnet war (COOK et al. 2000; SUGIYAMA et al. 2006). Die Tiere waren zudem apathisch und zeigten klinische Symptome wie Husten und wässrigen Kot (COOK et al. 2000; HESS et al. 2004a). Dabei blieb unklar, ob es sich bei dem wässrigen Kot um echten Durchfall oder um den vermehrten Absatz von Flüssigkeit und Schleim aus dem Legeapparat handelte (COOK et al. 2000). SUGIYAMA et al. (2006) konnten in ihren Versuchen keine respiratorischen Symptome aber leichte Diarrhoe beobachten. Okulonasale Belastungsinfektionen, dem natürlichen Infektionsweg entsprechend, hatten ebenfalls klinische Symptome wie Husten und Durchfall zur Folge, jedoch keinen Effekt auf die Legleistung, die Eischalenqualität (COOK et al. 2000), oder den Reproduktionstrakt (MAJO et al. 1995). COOK et al. (2000) vermuten, dass der aMPV-Stamm und evtl. die Zuchtlinie der Legehennen eine wichtige Rolle spielen, um den entsprechenden Effekt auf den Legeapparat zu erzielen. VILLARREAL et al. (2007) konnten eine mögliche Beteiligung des aMPV und des IBV bei Fertilitätsstörungen, Orchitis und epididymalen Steinen bei männlichen Hühnern nachweisen. 2.7 Verlauf der Infektion Krankheitsverlauf und Mortalität variieren bei einer aMPV-Infektion sehr stark und werden hauptsächlich durch Faktoren wie Management, Stress, Luftumsatzrate, Besatzdichte, sonstige Erkrankungen und die Art der bakteriellen Begleitinfektionen beeinflusst (MORLEY und THOMSON 1984; ANON 1985; STUART 1986). Nach einer aMPV-Infektion kann es zu einer Ansiedlung von Bordetella avium- und Pasteurella-ähnlichen Keimen kommen (COOK et al. 1991). NAYLOR et al. (1992) und GANAPATHY et al. (1998) wiesen Mycoplasma gallisepticum und Mycoplasma imitans im unteren Respirationstrakt nach. Die klinischen Symptome nehmen bei einer 11 Kapitel 2 Literaturübersicht zusätzlichen Infektion mit Escherichia coli, Ornithobacterium rhinotracheale und besonders bei einer Infektion mit Bordetella avium zu (VAN de ZANDE et al. 1998; JIRJIS et al. 2004). In Belgien und Frankreich konnte ein Zusammenhang zwischen Chlamydophila psittaci-, aMPV- und ORT-Infektionen in der Putenhaltung nachgewiesen werden (LOOCK et al. 2005, 2006). In den USA wurde bei Puten eine saisonale Häufung der aMPV-Infektionen beobachtet (SHIN et al. 2002c; GOYAL et al. 2003). Bei Puten wurde eine Inkubationszeit von 3-7 Tagen (JONES et al. 1987) gefolgt von einer Krankheitsdauer von 7-14 Tagen gezeigt. Morbidität beträgt bis zu 100%, die Mortalität schwankt zwischen 3% und 40% (ANON 1985). Puten jeden Alters sind betroffen. Broiler jeden Alters sind infektionsempfänglich, am häufigsten kann SHS aber zwischen der 4. und 6. Lebenswoche über ca. 1-2 Wochen beobachtet werden (MORLEY und THOMSON 1984). Die Inkubationszeit liegt zwischen 4-7 Tagen (KALETA 1992). Die Mortalität schwankt in komplikationslosen Fällen zwischen 1% und 5%, kann aber durch zusätzliche Faktoren in Einzelfällen 20-30% erreichen. Die Morbidität kann bis zu 60% betragen (DIAZ de ESPADA und PERONA 1984). Bei Mastelterntieren tritt die Krankheit am häufigsten um die 30. Lebenswoche auf und erstreckt sich auf ca. 21 Tage (PATTISON et al. 1989; HAFEZ und LÖHREN 1990). Die Morbiditätsrate liegt mit 8-10% relativ niedrig (ARNS und HAFEZ 1992), ebenso wie die Mortalität, die ohne Komplikationen 1-3% betragen kann (MORLEY und THOMSON 1984; O`BRIEN 1985). Innerhalb einer Nutzungsperiode können bis zu zwei Reinfektionen stattfinden (PROUS 1984). In Legehennen konnten bei Belastungsinfektionsversuchen klinische Symptome zwischen dem 4. und 12. Tag p.i. beobachtet werden (COOK et al. 2000; HESS et al. 2004a). Die Herden scheinen v.a. kurz vor dem Produktionsbeginn und in der Zeit der Leistungsspitze betroffen zu sein (PELETEIRO 1991). Ähnlich wie bei Mastelterntieren konnte eine Morbidität bis zu 8% und eine Mortalität zwischen 0 und 2% beobachtet werden (ARNS und HAFEZ 1992). 2.8 Pathologisch-anatomische Veränderungen Bei Hühnern mit der klinischen Form des SHS kann man bei der pathologisch-anatomischen Untersuchung Rhinitis und gelegentlich Sinusitis feststellen. Im Bereich des Kopfes sind fibrinöse bis blutige Einlagerungen in der Unterhaut zu finden. Unter Beteiligung bakterieller Sekundärinfektionen können Aerosacculitis und Perikarditis auftreten. Bei Tieren mit zentralnervösen Störungen werden fast immer Entzündungen des Mittelohrs mit Ansammlungen von eitrigem Exsudat festgestellt. Zusätzlich wird bei Legehennen auf entzündliche Veränderungen des Eierstocks, des Eileiters sowie des Bauchfells hingewiesen (MORLEY und THOMSON 1984; 12 Kapitel 2 Literaturübersicht GOREN 1985; PERELMAN et al. 1988; PATTISON et al. 1989; PELETEIRO 1991; ARNS und HAFEZ 1992). Bei intravenösen Belastungsinfektionsversuchen mit aMPV bei Legehennen wurden kranke oder moribunde Tiere getötet und zerlegt. Bei den meisten Tieren war der Respirationstrakt ohne besonderen Befund; nur teilweise konnte Mucus in der Trachea und wenig nasales Exsudat gefunden werden. Die einzigen pathologische Veränderungen wurden im Reproduktionstrakt, wie z.B. Eileiterperitonitis gefunden. Der Eierstock und der Eileiter waren zurückgebildet. Der Belastungsinfektionsversuch wurde fünf Wochen p.i. beendet, die übrigen Tiere wurden zerlegt. Der Legedarm eines Huhnes, welches immer noch keine Legetätigkeit zeigte, war stark zurückgebildet, eingedicktes Eigelb wurde im Peritoneum gefunden. Die übrigen Tiere zeigten keine Veränderungen (COOK et al. 2000). In Hähnchen konnten bei einer dualen Infektion mit aMPV und IBV Orchitis und epididymale Steine beobachtet werden (VILLARREAL et al. 2007). 2.9 Histopathologische Veränderungen Bei den histopathologischen Untersuchungen der von SHS betroffenen Tiere wurden mikroskopisch eine Abflachung des Trachealepithels sowie eine verringerte Zilienaktivität und schließlich ein fortschreitender Verlust der Zilien festgestellt. Zusätzlich lagen eine subepitheliale Blutstauung und eine lymphoide Hyperplasie vor (MORLEY und THOMSON 1984). In Zilienzellen waren azidophile zytoplasmatische Einschlusskörperchen zu beobachten (PICAULT et al. 1987a). Oft wurden Zellulitis, Periostitis und eine purulente Entzündung der Schädelknochen festgestellt. In manchen Fällen waren auch eine Otitis externa, eine Otitis interna und Meningitis vorhanden (PATTISON et al. 1989). Im zerebralen Gewebe zeigten sich Gliosis mit Hyperämie, perivaskuläre Ansammlung von Leukozyten und geringgradige Blutungen. Degenerative Veränderungen konnten nur in den Purkinje-Zellen des Cerebellums gesehen werden (SAN GABRIEL 1984). Renale Hyperämien und Glomerulonephritiden wurden ebenfalls beobachtet. CATELLI et al. (1998) führten einen Versuch an SPF- (24 d) und kommerziellen (1 d) Hühnerküken durch. Nach einer okulonasalen oder nasalen Infektion mit einem Isolat des Subtyps B zeigten die Tiere nach zwei Tagen eine mononukleäre Zellinfiltration und Ödeme im Zilienepithel mit einer erhöhten Sekretion. Nach vier Tagen lösten sich die Zellen ab und die Lamina propria zeigte eine Hyperämie. Bis zum 18. Tag erholten sich die Tiere wieder. Nach 4-7 Tagen flachte sich das Epithel der Trachea ab. Mononukleäre Zellen und Ödeme traten auf. Im Sinus waren mononukleäre Zellen vom 4. bis 18. Tag zu sehen. Die Autoren folgerten, dass die Virusreplikation im Sinus stattfindet und ab Tag 4 p.i. durch mikroskopische Veränderungen eine 13 Kapitel 2 Literaturübersicht Eintrittspforte für Sekundärerreger verursacht. Im Eierstock traten Epitheldefekte auf und der Erreger konnte nachgewiesen werden. Im Unterschied zu anderen Versuchen wurde hier keine heterophile Infiltration der Lamina propria (JONES et al. 1987) oder purulentes Exsudat (MAJO et al. 1995) beobachtet. Nur der obere Respirationstrakt war betroffen – ohne Befall der Bronchien (MAJO et al. 1995). Bei intravenösen Belastungsinfektionsversuchen mit aMPV bei Legehennen wurden kranke oder moribunde Tiere getötet und zerlegt. Histopathologische Veränderungen wurden nur im Legedarm gefunden. In den meisten Fällen war das Epithel verletzt oder zerstört. In den Tieren, die am Ende des Infektionsversuches noch lebten (fünf Wochen p.i.) konnten keine Veränderungen gefunden werden (COOK et al. 2000). Broiler, die experimentell mit aMPV infiziert wurden, zeigten histopathologische Veränderungen im Gewebe des Respirationstrakts und den paraoculären Drüsen, wie z.B. den Harderschen oder den Tränendrüsen (AUNG et al. 2008). 2.10 Diagnose Da die Erkrankung in hohem Maße von Umweltbedingungen und Sekundärinfektionen abhängig ist, können sehr variable Krankheitsbilder auftreten. Daher ist es schwierig, eine Diagnose einer aMPV-Infektion nur anhand klinischer und pathologischer Befunde zu stellen. Aus diesem Grund ist eine labordiagnostische Untersuchung immer notwendig. 2.10.1 Direkter Nachweis 2.10.1.1 Elektronenmikroskopie Das aMPV stellt sich bei der Untersuchung im Elektronenmikroskop mittels Negativfärbung als annähernd rundes, häufig jedoch hoch pleomorphes, behülltes Partikel dar (Abb. 2). Um das Isolat zu bestätigen kann die Elektronenmikroskopie in Kombination mit spezifischen Antikörpern eingesetzt werden (O´LOAN et al. 1992). Abbildung 2. Elektronenmikroskopische Aufnahme von aMPV. aus: template.bio.warwick.ac.uk 14 Kapitel 2 2.10.1.2 Literaturübersicht Virusisolierung Die Virusisolierung erfolgt durch Beimpfung von Trachealringkulturen (MC DOUGALL und COOK 1986; WILDING et al. 1986; WYETH et al. 1986; GIRAUD et al. 1988) oder embryonierten Hühnereiern (GIRAUD et al. 1988; BUYS et al. 1989b; PANIGRAPHY et al. 2000). Eine anschließende Vermehrung in der Zellkultur, wie z.B. in Affennierenzellen (VERO) (BUYS et al. 1989b) oder Hühnerembryofibroblasten (HEF) (PANIGRAPHY et al. 2000) ist möglich. Weitere geeignete Zellkulturen zur aMPV-Isolierung stellen die QT-35-Zelllinie (Fibrosarkom-Zelllinie der japanischen Wachtel) (D’APRILE 1989) und die CER-Zelllinie (Chicken Embryo Rough) (HAFEZ 1994) dar. Die Virusisolierung ist aber mit zwei Problemen verbunden. Zum einen ist sie nur in einem kurzen Zeitfenster nach der Infektion möglich (MC DOUGALL und COOK 1987), zum anderen scheint sie bei Hühnern schwieriger durchzuführen zu sein als bei Puten (JONES 1996). 2.10.1.3 Nachweis von Antigen Der Antigennachweis in infiziertem Gewebe gelang bei Hühnern und Puten mit Hilfe des Immunperoxidasetests (MAJO et al. 1995; CATELLI et al. 1998) und des Immunfluoreszenztests (JONES et al. 1987). Bei Puten wurde zusätzlich die Immunogold-staining Methode angewandt (O´LOAN et al. 1992). Sensitivität und Spezifität dieser Tests wurden bisher noch nicht vergleichend untersucht. 2.10.1.4 Nachweis des Genoms Das aMPV-Genom kann mittels der Reversen Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RTPCR) nachgewiesen werden; eine nested PCR kann folgen. Für die verschiedenen Isolate wurden unterschiedliche PCR-Methoden entwickelt. Für die europäischen Isolate stehen mehrere Protokolle zur Verfügung (JUHASZ und EASTON 1994; MASE et al. 1996; NAYLOR et al. 1997; BÄYONAUBOYER et al. 1999, 2000; DANI et al. 1999; TOQUIN et al. 1999a; HAARLÄNDER 2005). Dabei wird zwischen Subtypen-spezifischen und generellen PCRs unterschieden. Erstere wurden entwickelt, um gleichzeitig mehrere Subtypen nachzuweisen; letztere weisen aMPV generell nach, eine Unterscheidung der Subtypen muss nachträglich über Sequenzanalyse oder Restriktionsenzymanalyse erfolgen. Eine generelle PCR, die alle bekannten und evtl. auch neue Subtypen detektiert, ist schwieriger zu entwerfen (COOK und CAVANAGH 2002). COOK und CAVANAGH (2002) beschrieben die Probleme, auf die verschiedene Arbeitsgruppen stießen, die sich mit dem Nachweis von aMPV mittels RT-PCR beschäftigten: Die Nachweiswahrscheinlichkeit kann durch aMPV-Vakzination, Replikation anderer Viren, schlechte Replikation mancher 15 Kapitel 2 Literaturübersicht aMPV-Stämme und durch die generellen Unterschiede in der Empfänglichkeit der verschiedenen Wirtsspezies beeinflusst werden. Ein grundsätzliches Risiko dieser hoch sensitiven Methode ist die Gefahr der Kontamination. Trotz Vorsichtsmaßnahmen kann diese nicht hundertprozentig ausgeschlossen werden. Daher ist es immer ratsam, andere Nachweismethoden zur Diagnose von aMPV mit einzubeziehen (COOK und CAVANAGH 2002). Eine RT-PCR kann in unterschiedlichsten Probenmaterialien das Virusgenom detektieren. Zum einen kann sie nach Virusvermehrung in der Zellkultur oder in Trachealringkulturen angewandt werden. Dies ist aber bei großen Probenmengen nicht praktikabel (COOK und CAVANAGH 2002). JING et al. (1993) verglichen den Genomnachweis aus Tracheal- und Oesophagealtupfern mit denen aus Nasal- und Trachealgewebe; sie konnten die RNA aus den Gewebeproben nur in einem großen Volumen nachweisen, da wahrscheinlich diese Proben Inhibitoren enthalten, die verdünnt werden müssen. Die RNA kann aus trockenen und feuchten Tupfern gleichermaßen nachgewiesen werden (JING et al. 1993; BÄYON-AUBOYER et al. 1999). CAVANAGH et al. (1999) favorisierten trockene Tupfer, da diese bei Umgebungstemperatur versendet werden können ohne das Risiko, dass kontaminierende Mikroorganismen die virale RNA zerstören könnten (zitiert nach COOK und CAVANAGH 2002). COOK et al. (2001) verglichen Tupfer aus Schnabelhöhle, Oropharynx und Nase. Mittels Nasentupfern waren nach einer Infektion mit einem attenuierten Stamm nur wenige Tiere positiv getestet worden; an den anderen Stellen gewonnene Tupfer wurden hingegen nach jeder Infektion bei allen Tieren aMPV-positiv getestet. Somit besteht bei ausschließlicher Untersuchung von Nasentupfern die Gefahr „falsch negativer“ Ergebnisse. HESS et al. (2004a) gelang der aMPV-Nachweis mittels nested PCR aus Kloaken- und Pharyngealtupfern bis vier Wochen nach einer Belastungsinfektion (Ende des Untersuchungszeitraums). 2.10.2 Indirekter Nachweis Für den Nachweis aMPV-spezifischer Antikörper wurden drei Methoden entwickelt: der indirekte Immunfluoreszenztest (IFT), der Serumneutralisationstest (SNT) und der ELISA. Ein Vergleich dieser Methoden bei einer natürlichen Infektion von Puten führte zu analogen Ergebnissen (BAXTER-JONES et al. 1989). Mindestens 34 Tage nach dem ersten Auftreten klinischer Symptome konnten Antikörper nachgewiesen werden. Nach BAXTER-JONES et al. (1989) stellt aufgrund der einfachen und schnellen Durchführung der ELISA-Test die Methode der Wahl in der aMPV-Serologie dar. In einem Vergleich zwischen ELISA und SNT zum Nachweis der vier bekannten Subtypen zeigten TOQUIN et al. (2000), dass der ELISA die effizientere Methode ist. Verschiedene kommerzielle ELISA-Tests sind erhältlich, die jedoch eine unterschiedliche 16 Kapitel 2 Literaturübersicht Sensitivität besitzen sollen. Dabei handelt es sich sowohl um indirekte als auch um kompetitive Tests. Der indirekte Test ist sensitiver, dagegen hat der kompetitive Test eine höhere Spezifität (COOK und CAVANAGH 2002). Allerdings scheint die Wahl des aMPV-Stamms, welcher im Test als Antigen verwendet wird, eine wichtige Rolle zu spielen (BAXTER-JONES et al. 1987; HAFEZ 1991; ETERRADOSSI et al. 1992 zitiert in COOK und CAVANAGH 2002). Bei ungünstiger Wahl kann es zu geringeren bzw. falsch negativen Titern kommen, so dass eine frühzeitige Diagnose einer aMPV-Infektion verhindert werden kann (ETERRADOSSI et al. 1995). 2.11 Differentialdiagnosen Aufgrund des variablen Krankheitsbildes ist es wichtig, den jeweils vorliegenden Krankheitsfall von verschiedenen Virusinfektionen, u.a. der Newcastle Disease (ND), der Infektiösen Bronchitis (IB), Influenza A, aber auch von primär pathogenen bakteriellen Erregern wie Hämophilus paragallinarum, Pasteurella multocida (HAFEZ 1993), Mycoplasma gallisepticum, Chlamydophila psittaci und auch Mykosen abzugrenzen (KALETA 1992). Das Management ist immer mit zu überprüfen. 2.12 Therapie Sekundäre bakterielle Infektionen können durch wirksame antibakterielle Chemotherapeutika reduziert werden (SCHRICKE 1986; STUART 1989; HAFEZ 1990; JONES und WILDING 1990) und somit die Mortalitätsrate senken. Grundsätzlich können diese Mittel nur dann Aussicht auf Erfolg haben, wenn gleichzeitig Maßnahmen zur Verbesserung der hygienischen Bedingungen, Ausschaltung aller schwächenden Umwelteinflüsse und optimale Futter- und Trinkversorgung gewährleistet werden. Durch gutes Management kann die Einschleppung von Infektionen vermieden und die Auswirkungen einer aMPV-Infektion minimiert werden. U.a. ist die Ventilation zu optimieren, da ein hoher Ammoniakgehalt das Abwehrsystem des Respirationstrakts schwächt. Bei Erkrankungen drängen sich die Tiere dichter zusammen, daher ist auf gute Belüftung zu achten. Zu hohe Staubbildung ist zu vermeiden (PATTISON et al. 1989; HAFEZ 1990; GOUGH 2003). In Colorado (USA) war man in der Lage, durch absolute biologische Hygiene und gutes Management, die Infektionssituation binnen kürzester Zeit erfolgreich zu ändern und die Krankheit auszulöschen (COOK 2000b). 17 Kapitel 2 2.13 Literaturübersicht Immunprophylaxe Durch eine sorgfältige Immunprophylaxe kann wirtschaftlichen Schäden durch aMPVInfektionen vorgebeugt werden (GIRAUD et al. 1987; BUYS et al. 1989a; COOK et al. 1989b; WILLIAMS et al. 1991b; COOK et al. 1995). In Deutschland sind Lebend- und inaktivierte Impfstoffe für Hühner und Puten zugelassen. Lebendvakzine werden durch Attenuierung von Virusisolaten aus Puten oder Hühnern gewonnen. Sie werden zur Immunisierung von Masthühnern und zur Erstimpfung bei Legehennen eingesetzt und stimulieren sowohl die lokale Immunität im Respirationstrakt als auch eine systemische Immunität (KHEHRA und JONES 1998). Alle Lebendimpfstoffe können Impfreaktionen nach ca. zwei Wochen verursachen, wie z.B. Husten, Kopfschütteln, geschwollene Sinus und Augenausfluss. Ohne bakterielle Sekundärinfektion erholen sich die Tiere aber wieder. Lebendvakzine können durch Passagen im Feld wieder virulent werden. So konnte CATELLI et al. (2006) zeigen, dass ein attenuierter Subtyp A-Impfstoff in Küken länger persistierte als unter experimentellen Bedingungen. Er wurde wieder virulent und führte daher zu ähnlichen klinischen Symptomen wie denen, die durch virulentes Feldvirus verursacht werden. GANAPATHY und JONES (2007) konnten zeigen, dass kommerzielle aMPV-Subtyp-BLebendimpfstoffe bei Hühnern unabhängig von der Herkunft der Impfstämme identischen Schutz vor klinischen Symptomen bieten können. Entsprechend hohe Antikörpertiter wurden gebildet. Auch schützt eine aMPV-Impfung effektiv vor Virusausscheidung (HESS et al. 2004a). GANAPATHY et al. (2010) verglichen drei mögliche Applikationswege eines aMPVImpfstoffes bei Broilern: die Trinkwasser-, Spray- und oculo-orale Applikation. Obwohl keine Antikörper nach der Spray- bzw. Trinkwasserapplikation detektiert werden konnten, boten alle drei Wege einen identischen Schutz vor klinischen Symptomen. In ovo Impfungen bei Hühnern stellten sich als vorteilhafter zu der Impfung von Eintagsküken heraus. Über diese Route kam es zu einer signifikant höheren Antikörperbildung, obwohl eine geringere Impfdosis als bei der Impfung von Eintagsküken gewählt wurde (HESS et al. 2004b; TARPEY und HUGGINS 2007). Auch war das Einsetzen der Immunität drei Tage früher (TARPEY und HUGGINS 2007). Zwischen den Subtypen A und B besteht eine belastbare Kreuzimmunität (COOK et al. 1995, 1996, 1999, 2000; ETERADOSSI et al. 1995; TOQUIN et al. 1996, 1999b). Die Impfstoffe gegen A und B schützen auch gegen Subtyp C aus Nordamerika (COOK et al. 1999) und den Subtyp C Stamm aus Frankreich (TOQUIN et al. 1999a). In Amerika wurde ein Lebendimpfstoff auf der Basis von Subtyp C hergestellt, der nach 61 Passagen in VERO-Zellen ausreichend attenuiert war und den Puten Schutz vor virulentem Virus bot (PATNAYAK et al. 2002). Ein weiterer Impfstoff 18 Kapitel 2 Literaturübersicht wurde auf VERO-Zellen Kälte-adaptiert (31°C) und erwies sich als ebenso wirksam (PATNAYAK et al. 2003; PATNAYAK und GOYAL 2004a, b). Die Gabe von einer Inaktivatvakzine alleine schützt gut vor den klinischen Symptomen nach einer Infektion des Reproduktionstrakts (COOK et al. 2000). In einem ähnlichen Versuch konnte bei Puten beobachtet werden, dass Inaktivatvakzine alleine schlecht gegen Symptome des Respirationstrakts aber gut gegen die klinischen Symptome nach einer Infektion des Reproduktionstrakts schützen (COOK et al. 1996). Nur nach kombinierter Applikation von Lebend- und inaktivierter Vakzine wird eine protektive Immunität ausgebildet. Dabei wurde der Lebendimpfstoff am ersten Lebenstag verabreicht, gefolgt von einer Inaktivatvakzine mit 16 Lebenswochen (COOK et al. 2000). SUGIYAMA et al. (2006) konnten jedoch einen besseren Schutz vor Legeleistungseinbußen durch die Gabe des Lebendimpfstoffes an Lebenstag 77 statt Tag 7 beobachten. Die Inaktivatvakzine wurde in diesem Versuch an Tag 105 verabreicht. 19 Kapitel 3 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterial 3.1.1.1 Geräte Elektrophoresekammer: Horizontal-Gel-Elektrohphorese (von Keutz, Reiskirchen); ELISAReader: „Thermo-Max“ (MWG Biotech AG, München); Geldokumentationssystem: Multi-ImageTM Light Cabinet (Biozym, Oldendorf); Heizblöcke (Eppendorf, Hamburg); Kühl- und Gefrierschränke (Heraeus, Hanau; Liebherr, Ochsenhausen); Photometer: DU-640 (Beckman, München); Pipettierhilfen (Brand, Wertheim; Gilson, Villiers-le-Bel, Frankreich); Schüttler: Orbitalschüttler (Forma Scientific, Ohio, USA), Vortexer (Bender & Hobein, Zürich, Schweiz); Sequenzierautomat: ABI PRISMTM-Sequenzierautomat, Modell 377 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA); Stickstofftank: L´Air Liquide GT 140 (L´Air Liquide, Champigny sur Marne, Frankreich); Thermocycler (MJ Research); Waage: PM 400 (Mettler Toledo, Greifensee, Schweiz); Wasserbäder (GFL, Burgwedel); Zentrifugen: Tischzentrifuge, gekühlt (Heraeus, Hanau), Großzentrifuge „Avanti“ (Beckman, München). 3.1.1.2 Verbrauchsmaterial Einmalkanülen: Neoject® 40 x 0,9mm 20G (Dispomed Witt oHG, Gelnhausen); Glaspipetten (Brand, Wertheim); Handschuhe: Rotiprotect latex (Roth, Karlsruhe); Kryo-Tubes (Nunc, Wiesbaden); 3MM-Papier (Schleicher & Schüll, Dassel); Parafilm (Azwell Inc., Osaka, Japan); Pipettenspitzen (Greiner bio-one, Frickenhausen); Reaktionsgefäße: 50 ml, 15 ml, 1,5 ml (Greiner bio-one, Frickenhausen), 0,2 ml für PCR (Alpha Laboratories, Hampshire, UK); Serumröhrchen: Monovette® 10 ml (Sarstedt, Nümbrecht); Wattestäbchen (Albrecht, Aulendorf); Zentrifugenbecher (Beckmann, München). 3.1.1.3 Software Zur Analyse von Elektrophorese-Bildern wurde das Programm AlphaImager 1120 v. 5.5 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, USA) und zur Analyse von Nukleotidsequenzen das Programm „Lasergene“ (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA) verwendet. Das Alignment der Sequenzen erfolgte durch die „ClustalW-Methode“. Dabei werden die Sequenzen aufgrund der Distanzen zwischen den einzelnen Sequenzpaaren in sogenannte „Cluster“ geteilt. Die „Cluster“ werden zuerst paarweise und dann gruppenweise verglichen. 20 Kapitel 3 Material und Methoden Die ELISA-Platten wurden mit dem Programm „SOFTmax® PRO 1.2.0“ (Molecular Devices GmbH, Ismaning) ausgewertet. 3.1.2 Tiere An der Feldstudie waren 18 Legehennenherden in Sachsen beteiligt. Abbildung 3 zeigt die geographische Verteilung der Herden. Jeweils sechs Herden wurden in Freiland-, Boden- bzw. Käfighaltung gehalten. In einer Käfighaltung wurden kleine Gruppen von drei bis neun Legehennen in Käfigen innerhalb eines großen Stallraumes gehalten. Hühner in Bodenhaltung wurden ausschließlich im Stall gehalten. Der Stall war ausgestattet mit Scharrraum, Kotgrube oder -band, Futterband, Wassertrögen, Sitzstangen und Legenestern. Die Stalleinrichtung der Freilandhaltung entsprach den Verhältnissen der Bodenhaltung, zudem hatten die Tiere tagsüber eine Auslauffläche zur Verfügung stehen. Als Herde wurden die Legehennen bezeichnet, die zusammen in einem Stallraum gehalten wurden, getrennt von anderen Tieren. I.d.R. hatten die Tiere einer Herde das gleiche Alter und sind zusammen aufgezogen worden. Detaillierte Angaben zu Herdengröße, Zeitpunkt der Einstallung, Zuchtlinie und aMPV-Impfstatus sind in Tabelle 1 aufgelistet. 14 17 13 15 16 18 Bodenhaltung Käfighaltung Freilandhaltung Abbildung 3. Geographische Verteilung der 18 beteiligten Legehennenbetriebe in Sachsen. 1-18: Betrieb Nr. 1-18. 21 Kapitel 3 Material und Methoden Tabelle 1. Überblick der an der Studie beteiligten Herden. 1 2 Herde Nr. Impfstatus1 Haltungsform Einstallung Herdengröße Zuchtlinie2 1 negativ Käfig Juni 2004 23350 LB 2 negativ Käfig Juli 2004 27399 LB 3 negativ Käfig November 2004 24742 LSL 4 negativ Käfig Januar 2005 19500 LSL 5 positiv Käfig September 2004 19500 6 positiv Käfig November 2004 84040 LSL 7 positiv Boden November 2004 21500 Hisex braun 8 negativ Boden April 2004 5500 LB 9 negativ Boden Juni 2004 2900 LSL, LB 10 negativ Boden Juli 2004 8444 LB 11 negativ Boden November 2004 3850 LB 12 negativ Boden Februar 2005 8000 LB 13 negativ Freiland März 2004 15000 LB 14 negativ Freiland Mai 2004 4200 LB 15 negativ Freiland Juni 2004 5300 LB 16 negativ Freiland Juli 2004 2400 LT 17 negativ Freiland August 2004 3800 LB 18 negativ Freiland Oktober 2004 18500 LB positiv: gegen aMPV geimpft; negativ: nicht gegen aMPV geimpft LB: Lohmann Brown; LSL: Lohmann LSL; LT: Lohmann Tradition 22 Hisex weiß, LSL Kapitel 3 Material und Methoden Alle beteiligten Herden wurden während der Aufzuchtperiode gegen die Mareksche Krankheit, Salmonellen, ND, IB, Infektiöse Bronchitis (IBD), Infektiöse Laryngotracheitis (ILT), Aviäre Encephalomyelitis (AE) und das Egg Drop Syndrome (EDS) geimpft. In 11 Betrieben erfolgte zusätzlich eine Impfung gegen Pocken und/oder stallspezifische E.coli. Je eine Herde war außerdem gegen Mycoplasmen bzw. gegen Pasteurellen geimpft worden (Tab. 2). Zwei Herden (Nr. 5, 6) in Käfighaltung und eine Herde (Nr. 7) in Bodenhaltung waren bei der Einstallung gegen aMPV geimpft. Die Impfung erfolgte gegen den Subtyp B während der Aufzuchtphase zum einen über das Trinkwasser mit der Lebendvakzine Nemovac® (Merial, Hallbergmoos) in der 7. und 12. Lebenswoche und zum anderen bei der Umstallung in der 18. Lebenswoche per intramuskulärer Injektion mit der quatrivalenten Inaktivatvakzine Gallimune® 407 ND+IB+EDS+ART (Merial, Hallbergmoos). Tabelle 2. Überblick über durchgeführte Impfungen in den beteiligten Herden während der Aufzuchtperiode. Herde Nr. Impfungen gegen 1-18 Mareksche Krankheit Salmonellen Newcastle Disease (ND) Infektiöse Bronchitis (IB) Infektiöse Bursitis (IBD) Infektiöse Laryngotracheitis (ILT) Aviäre Encephalomyelitis (AE) Egg Drop Syndrome (EDS) 1, 3, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 18 Pocken 1, 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18 stallspezifische E.coli 9 Mycoplasmen 17 Pasteurellen 5, 6, 7 aMPV-Subtyp B Während der Legeperiode erfolgte in sechs Herden (Nr. 4, 5, 9, 10, 13, 17) zusätzlich eine Impfung gegen IBV und in vier Herden (Nr. 2, 6, 7, 11) zusätzlich gegen IBV und NDV (Anhang C, S. 120). 23 Kapitel 3 Material und Methoden 3.1.3 Biologische Materialien 3.1.3.1 Impfstoffe Für die Herstellung der Positivkontrollen und zur Bestimmung der Sensitivität der nested PCR wurden folgende aMPV-Lebendimpfstoffe verwendet: Nobilis® TRT (Intervet, Unterschleißheim) enthält den in England aus Puten in Trachealringkulturen isolierten und an HEF adaptierten, geklonten und attenuierten aMPV-Stamm BUT 1#8544, Subtyp A. Nemovac® (Merial, Hallbergmoos) enthält den in Frankreich aus Hühnern isolierten aMPV-Stamm PL-21, Subtyp B. Zur Bestimmung der Sequenzen des Amplifikatprodukts der nested PCR wurde zusätzlich Terivac® (Merial, Hallbergmoos) verwendet. Dieser Impfstoff enthält das in Frankreich aus Puten isolierte und in VERO-Zellen attenuierte aMPV-Isolat VCO3. Das jeweilige Vakzinelyophylisat wurde vor der RNA-Isolierung in 1 ml RNase-freiem Wasser aufgelöst. 3.1.3.2 Bakterien Zur Klonierung von DNA wurden zum einen die im TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing (Invitrogen, Box, Niederlande) enthaltene Bakterien „TOP 10 F E. coli“ und zum anderen der Stamm „K12 XL1-Blue MRF“ (Stratagene, La Jolla, CA/USA) von E. coli verwendet. 3.1.3.3 Plasmide Die beiden Vektoren pCR®2.1-TOPO und pCR®4-TOPO (Invitrogen, Box, Niederlande) wurden zur Klonierung und Sequenzierung von DNA benutzt. Weiterhin wurde zur Herstellung der Positivkontrollen am Institut vorhandene Plasmide genutzt, die Teile von viralen Genomen enthielten (Tab. 3). Tabelle 3. Überblick über verwendete Plasmide. Bezeichnung pVL 84 pVL 281 Charakterisierung Insert pBluescript BFDV Volle-Länge-Klon K12 XL1-Blue JOHNE et al. 2000 II SK (+) budgerigar (4981 bp) MRF [AF 241168] IBDV Volle-Länge-Klon K12 XL1-Blue RAUE und MAZAHERI Cu1B (2827 bp) MRF 2003 [-] PuC18 des Inserts 24 Bakterienstamm Referenz [GenBank Vektor Zugangsnummer] Kapitel 3 3.1.3.4 Material und Methoden Enzyme Enzyme folgender Hersteller fanden Verwendung: Alkalische Phosphatase; Restriktionsendonukleasen (New England Biolabs, Frankfurt am Main); RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega, Madison); Taq Polymerase (Peqlab, Erlangen); RNAsin Ribonuklease Inhibitor (Promega, Madison); T4-DNA-Ligase (AGS, Heidelberg); T7-RNA-Polymerase (Promega, Madison); DNase (Promega, Madison). 3.1.3.5 Molekulargewichtsmarker 3.1.3.5.1 DNA-Längenstandard dV1/PAT Als DNA-Längenstandard wurde eine Mischung aus PstI-, BamHI-, HindIII-Fragmenten des Plasmid PAT553/PB1 (Prof. Dr. Dr. G. Hobom, Gießen) und HaeIII-verdauter Phagen DNA von dV1 (Prof. Dr. Dr. G. Hobom, Gießen) verwendet. Es entstehen Fragmente mit folgenden Längen (in bp): 5664, 4133, 3146, 2528, 1713, 1310, 890, 845, 696, 535, 460, 362, 352, 272, 223, 213, 212, 178, 142, 132, 83 und 40. 3.1.3.5.2 DNA-Längenstandard HaeIII Als Längenstandard für kleinere DNA-Fragmente wurde DNA vom Phagen dV1 (Prof. Dr. Dr. G. Hobom, Gießen) mit HaeIII verdaut. Es entstehen Fragmente mit folgenden Längen (in bp): 1713, 1310, 890, 535, 460, 362, 352, 272, 223, 213, 212, 178, 142, 132, 83 und 40. 3.1.3.5.3 RNA-Längenstandard Als Längenstandard für kleine RNA-Moleküle wurde der Low Range RNA-Leiter (Peqlab, Erlangen) verwendet. Folgende Fragmente sind zu sehen: 1000, 800, 600, 400, 300, 200 und 100 Basen. 3.1.3.6 Oligonukleotide (Primer) In Tabelle 4 sind die für die PCRs und DNA-Sequenzierung verwendeten Primer (Hermann GbR, Freiburg) aufgeführt. 25 Kapitel 3 Material und Methoden Tabelle 4. Überblick über verwendete Oligonukleotide. Virus Gen Primer (s,+ sense; as,- antisense) Sequenz (5’-3’)a Größe der Amplifikate Referenz aMPV Glykoprotein G1+ ggg aca agt atc ymk at 441 bp NAYLOR et al. G6- ctg aca aat tgg tcc tga tt G5- caa aga rcc aat aag ccc G8+A cac tca ctg tta gcg tca ta G9+B tag tcc tca agc aag tcc tc G5-b cgg gga gcc ggt ggg ccc g 350 bp - P-s gaa gaa aat yts agc atg ata 209 bp - P-as acg ctc cca tyy cct att ttt g APV-s caa gca tat gtc cct tta tcc c 310 bp JOHNE und APV-as ctg ttt aag gcc ttc caa gat g B1F agc aag gaa aag ccc aat gc B2R tgt ccc atg tag gtc cca ct M13 rev-as gga aac agc tat gac cat g - - Bkorr ctg aca aat tgg tcc tga ttg aca - - - - aMPV APV IBDV Phosphoprotein T/t-Antigen RNA abhängige RNA Polymerase VP1 Vektoren 1997 267 - CAVANAGH et al. 1999 351 bp MÜLLER 1998 166 bp RAUE und MAZAHERI 2003 pCR® 2.1 TOPO pCR® 4 TOPO - aag aac caa taa gcc cag gcg gtc - a B11805 cac cga tcg ccc ttc cca aca Degenerierte Primer können an den mit k, m, r, s und y gekennzeichneten Positionen verschiedene Nukleotide besitzen [k = g oder t; m = a oder c; r = a oder g; s = c oder g; y = c oder t] 26 Kapitel 3 3.1.4 Material und Methoden Vorgefertigte Systeme („Kits“) Kits folgender Hersteller fanden Verwendung: Fast start high fidelity PCR system (Roche, Mannheim); RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden); QIAGEN® One Step RT-PCR Kit (Qiagen, Hilden); Qiagen® Plasmid Kit (Qiagen, Hilden); TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing (Invitrogen, Box, Niederlande); Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, USA). 3.1.5 Lösungen, Puffer und Medien Die Zusammensetzung der verwendeten Lösungen, Puffer und Medien ist im Anhang A (S. 112) beschrieben. 3.2 Methoden 3.2.1 Felduntersuchungen und Probengewinnung 18 sächsische Legehennenherden (3.1.2, S. 21) wurden, beginnend mit der Einstallung, über die gesamte Legeperiode im Abstand von drei Monaten mittels PCR und ELISA auf das Vorkommen von aMPV-Genom bzw. -Antikörper untersucht. Die letzte Probenentnahme erfolgte i.d.R. nach ca. einem Jahr zum Zeitpunkt der Ausstallung mit Ausnahme von zwei Herden, die bereits nach sechs bzw. neun Monaten ausgestallt wurden. Vor dem Versuchsbeginn wurden Grunddaten der einzelnen Betriebe erhoben (Anhang B1, S. 116). Diese wurden ab dem zweiten Besuch um den Zeitraum zwischen zwei Probenentnahmen in einem Vorbericht (Anhang B2, S. 117) ergänzt. Vor jeder Probenentnahme wurden jeweils zehn Tiere einer klinischen Untersuchung durch einen Tierarzt unterzogen; die Ergebnisse wurden dokumentiert (Anhang B3, B4, S. 118, 119). Für den Nachweis von aMPV-Antikörpern mittels eines kommerziellen ELISAs wurden ca. 5 ml Blut aus der Vena ulnaris steril mit einer Einmalkanüle und Monovette® gewonnen. Für den Nachweis des Virusgenoms mittels RT-PCR wurde ein trockener Pharyngeal-/ Trachealtupfer mit einem Abstrichtupfer pro Tier entnommen. Der Pharyngeal-/ Trachealtupfer wurden nach der Entnahme sofort in ein steriles Eppendorfröhrchen verbracht und auf Eis gelagert. Zum Teil wurden die Proben wenige Stunden nach Entnahme weiterverarbeitet oder bei –70°C gelagert. Das Serum wurde spätestens ein Tag später gewonnen und bei –20°C gelagert, um alle Proben im Block mit einer Charge untersuchen zu können. Die Proben wurden mit drei Ziffern gekennzeichnet: die erste Ziffer steht für die Herdennummer, die zweite für die Nummer des 27 Kapitel 3 Material und Methoden untersuchten Huhns und die dritte für die jeweilige Probenentnahme (Beispiel: 1-1-1: Herde Nr. 1, Huhn Nr. 1, 1. Probenentnahme). 3.2.2 RNA-Isolierung Zur Isolierung der Gesamt-RNA wurde der RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden) nach Anweisung des Herstellers verwendet. Die Trachealtupfer wurden dazu jeweils zehn Minuten auf Eis in 600 µl Lysis-Puffer (RLT-Puffer + -Mercaptoethanol) unter mehrmaligem kurzem Vortexen zur Auflösung der Zellen inkubiert. Im Falle der RNA-Isolierung aus Impfstoffen wurden 50 µl des aufgelösten Vakzinelyophylisats mit 300 µl Lysis-Puffer inkubiert. Je 350 µl dieser Ansätze wurden mit 350 µl 70%igem Ethanol versetzt und auf eine Trennsäule überführt. Während der folgenden Zentrifugation (10.000 rpm, 15 sec) erfolgte die Bindung der RNA an eine Silika-Gel-Membran. Nach drei Waschschritten unter Verwendung von 700 µl RW1-Puffer bzw. 500 µl RPE-Puffer konnte die Gesamt-RNA in zwei Schritten in einem Gesamtvolumen von 60 µl RNase-freiem Wasser in ein RNase-freies Eppendorfgefäß eluiert werden. Die anschließende Lagerung erfolgte bei –70°C. 3.2.3 PCR Die PCR ist eine von SAIKI et al. (1988) entwickelte Methode zur Amplifikation von DNA. Diese Reaktion besteht aus folgenden Hauptschritten: Denaturierung der DNA-Doppelstränge durch Erhitzen, Hybridisierung der Einzelstränge mit den Primern (Annealing) und Synthese des komplementären Stranges (Extension). 3.2.3.1 Qualitätssicherung Da die PCR eine hoch sensitive Nachweismethode ist, ist die Kontaminationsgefahr und damit die Gefahr von falsch positiven Ergebnissen sehr hoch. Um dieses Risiko zu minimieren, wurde zum einen ein sogenanntes „Ein-Schritt“-System, der QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Hilden), verwendet. Durch entfallende Pipettierschritte wird die Kontaminationsrate gesenkt; eine schnelle Durchführung wird so ermöglicht. Zum anderen wurden die RNA-Isolierung, die Amplifizierung der Nukleinsäuren und die Analyse der Produkte räumlich getrennt voneinander durchgeführt. Die Mischung der Reagenzien erfolgte auf Eis, um vorzeitige Reaktionen zu verhindern. Die Positivkontrollen wurden so hergestellt, dass eine deutliche Unterscheidung zwischen Kontrolle und Feldvirus anhand der PCR-Produktgrößen ermöglicht wurde. Für die Lagerung der Tupferproben und für die RNA-Isolierung wurden stets Einweg-Probengefäße 28 Kapitel 3 Material und Methoden benutzt. Isolierte RNA wurde bei –70°C, örtlich getrennt von PCR-Produkten, aufbewahrt. Durch Verwendung von Reagenzien, Prämixen, Pipetten und Filterspitzen, die nur für die PCR benutzt wurden, konnte das Auftreten von Kontaminationen verhindert werden. 3.2.3.2 Primerdesign Die verwendeten Primer wurden zum Teil von verschiedenen Autoren übernommen, andere wurden selbst konstruiert (Tab. 4, S. 26). Wenn immer möglich, wurde versucht, die Auswahlkriterien zur Herstellung von Primerpaaren basierend auf den Regeln von INNIS et al. (1990) und DIEFFENBACH et al. (1993) einzuhalten, die wie folgt lauten: - keine ungewöhnlichen Sequenzen - Primerlänge 18-28 Basen - GC-Gehalt 50-60% - Schmelztemperaturen (Tm) beider Primer ohne deutliche Unterschiede - keine komplementären Sequenzen an den 3`-Enden, um die Bildung von Primer-Dimeren zu vermeiden - am 3`-Ende nicht mehr als dreimal C oder G - keine Palindromsequenzen - als letztes Nukleotid C oder G. Die Schmelztemperaturen (Tm) der Primer wurden nach der Formel von THEIN et al. (1986) errechnet: [Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C)]. Die Festlegung der Sequenzen der Primer erfolgte auf der Basis vorhandener DNASequenzanalysen (GenBank Database des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA und Datenbank des European Molecular Biology Laboratory (EMBL), verfügbar unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). 3.2.3.3 Duplex Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (duplex RT-PCR) In einer Duplex RT-PCR werden zwei Gene des aMPV detektiert. Da es sich bei aMPV um ein RNA-Virus handelt, musste vor der Durchführung der PCR die RNA in cDNA mittels reverser Transkription überführt werden. Dies erfolgte mit Hilfe des QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Hilden). Bei diesem Kit handelt es sich um ein sogenanntes „Ein-Schritt“-System, da die reverse Transkription (RT) und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ohne zwischenzeitliches Öffnen des Reaktionsgefäßes ablaufen können. Die Angaben des Herstellers wurden berücksichtigt. 20 µl RNA, die mit Hilfe des RNeasy® Mini Kits gewonnen wurden, wurden jeweils zunächst 29 Kapitel 3 Material und Methoden 3 min bei 72°C im Thermocycler denaturiert und sofort auf Eis gestellt. Daraufhin wurden 30 µl des Mastermix hinzupipettiert. Der Mastermix enthielt 10 µl 5x Puffer, 10 µl Q-Solution, 2 µl dNTPMix, 0,25 l RNasin®, 2 l Enzym-Mix, je 1 l der benötigten Primer (100 pmol/µl) und RNasefreies Wasser ad 30 µl. Die reverse Transkription wurde für 30 min bei 50°C durchgeführt. Es folgte ein 15 min dauernder Inkubationsschritt bei 95°C zur Inaktivierung der reversen Transkriptase und zur Aktivierung der HotStar Taq®-DNA-Polymerase. Die synthetisierte cDNA wurde in 40 Zyklen amplifiziert mit jeweils 1 min Denaturierung bei 94°C, 1 min 30 sec Primer-Annealing bei 50°C und 2 min Polymerisation bei 72°C. Abschließend folgte noch ein Extensionsschritt durch fünf minütige Inkubation bei 72°C. Der Ansatz wurde auf 4°C gekühlt. 3.2.3.4 Nested Polymerase-Kettenreaktion (nested PCR) Als Ausgangsmaterial (template) dient bei einer nested PCR ein Amplifikationsprodukt aus einer vorangegangenen PCR. Die Primer für diese Methode sind innerhalb des ersten Amplifikats lokalisiert. Mittels der verwendeten nested PCR nach CAVANAGH et al. (1999) konnten auch einzelne virale RNA-Moleküle noch nachgewiesen und zwischen den Subtypen A und B unterschieden werden. Hierbei wurden 5 µl des duplex RT-PCR-Produkts zu 45 µl eines Prämixs bestehend aus 5 µl 10 x Puffer (Peqlab, Erlangen), 0,5 µl Taq DNA-Polymerase [5 U/µl] (Peqlab, Erlangen), 4 µl dNTP-Mix (10mM eines jeden dNTP; Peqlab, Erlangen), jeweils 1 µl der benötigten Primer (100 pmol/µl) und ad 45 µl RNase-freiem Wasser zugegeben. Die DNA wurde für 5 min bei 95°C denaturiert und über 40 Zyklen mit je 1 min Denaturierung bei 94°C, 1,5 min Annealing bei 50°C und 2 min Extension bei 72°C amplifiziert. Abschließend erfolgte eine Inkubation über 5 min bei 72°C und Kühlung auf 4°C. Dieses Temperaturprofil und der Reaktionsansatz wurden mit entsprechenden Primern auch für die Korrektur der Primerbindungsstelle der Positivkontrolle Subtyp B und für die Verkleinerung der Plasmide für die in vitro-Transkription der Positivkontrollen genutzt. 3.2.3.5 PCR zur Herstellung von „Fremdsequenzen“ Zur Herstellung der Positivkontrollen wurden „Fremdsequenzen“ erzeugt. Hierfür wurden die im Institut vorhandenen Plasmide pVL 84 und pVL 281Q mit dem Fast start high fidelity PCR system (Roche, Mannheim) amplifiziert. 5 µl DNA wurden zu 45 µl Prämix, bestehend aus 5 µl Puffer 2, 4 µl dNTPs, 0,5 µl Enzym, 33,5 µl sterilem Wasser und je 1 µl Primer (100 pmol/µl) zugegeben. Die DNA wurde für 5 min bei 95°C denaturiert und über 40 Zyklen mit je 30 sec Denaturierung bei 94°C, 30 sec Annealing bei 60°C und 30 sec Extension bei 72°C amplifiziert. Abschließend erfolgte eine Inkubation über 5 min bei 72°C und Kühlung auf 4°C. 30 Kapitel 3 3.2.3.6 Material und Methoden Probenauswertung Jeweils zehn Tiere pro Herde wurden auf das Vorkommen von aMPV-Genom untersucht. Wurde mindestens ein Tier positiv getestet, wurde die gesamte Herde als aMPV-positiv betrachtet. 3.2.4 Nachweis von DNA durch Agarose-Gel-Elektrophorese DNA-Fragmente mit einer Länge von 100 - 15.000 bp können im Agarose-Gel aufgetrennt und durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht werden. Universal-Agarose (PeqLab, Erlangen) wurde in TAE-Puffer in Konzentration von 0,8 - 2% (w/v) durch Aufkochen in einem Mikrowellengerät gelöst und in die vorbereiteten Gelkammern gegossen. Die DNA-Proben wurden mit DNA-Ladepuffer gemischt und in die Taschen des Gels pipettiert. Die Elektrophorese erfolgte in TAE-Puffer bei 90 - 160 V, bis sich das Bromphenolblau bzw. Xylencyanol im letzten Drittel des Gels befand. Anschließend wurde das Gel für ca. 10 min in einer Ethidiumbromid-Lösung getränkt und die DNA im Transilluminator unter UV-Licht ( = 366 nm) sichtbar gemacht. 3.2.5 Reinigung von DNA-Fragmenten 3.2.5.1 Gene clean Zur Reinigung von DNA-Fragmenten für die Klonierung oder Sequenzierung wurde die DNA zunächst im Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.4, S. 31). Nach Färbung im Ethidiumbromidbad wurde die benötigte Bande mit einer Skalpellklinge auf einem Transilluminator unter UV-Licht ( = 366 nm) ausgeschnitten, zerkleinert und in ein Reaktionsgefäß überführt. Durch Zugabe von 1 ml NaJ-Lösung wurde die Agarose im Wasserbad bei 65°C geschmolzen. Danach wurden 10 µl Glasmilch zugegeben und die Suspension für 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Glasmilch mit der gebundenen DNA wurde nun durch zweiminütige Zentrifugation bei 13.000 rpm pelletiert und zweimal mit 200 µl New-Waschpuffer gewaschen. Das Pellet wurde in 30 µl Aqua bidest. resuspendiert und im Wasserbad 5 min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurde die Suspension für 4 min bei 13.000 rpm zentrifugiert und der Überstand mit der gelösten DNA abgenommen. 3.2.5.2 Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System DNA, die zur Herstellung der Positivkontrolle für die PCR bestimmt war, wurde mittels Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System gereinigt, um einen höheren Reinheitsgrad zu erzielen. Die Präparation erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. 31 Kapitel 3 Material und Methoden 3.2.6 Klonierung von DNA in Escherichia coli (E. coli) 3.2.6.1 TOPO-TA-Klonierung Eine moderne Methode für direktes Klonieren nutzt einen linearisierten Vektor, welcher einen einzelnen 3`-T-Überhang besitzt und PCR-Produkte (Inserts) mit einem einzelnen 3`-A-Überhang akzeptiert. Dieses System wird als T/A-Klonierung bezeichnet und nutzt die Extendase-Aktivität verschiedener DNA-Polymerasen (CLARK 1988; HU 1993). Die Extendase-Aktivität wird definiert als die von der Zielsequenz unabhängige Addition eines einzelnen Nukleotids am 3`- Ende eines PCR-Produkts (LEVIS 1995). Bei der Taq-Polymerase ist dieses Nukleotid generell ein A (HU 1993). Zur Erstellung der Positivkontrollen für die PCRs und zum Zwecke der Sequenzierung wurden ausgewählte PCR-Produkte kloniert. Hierfür wurde der TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing (Invitrogen, Box, Niederlande) verwendet. Bei der TOPO-Klonierung wird die Ligationsaktivität der Topoisomerase genutzt, die durch einen „aktivierten“ TOPO-TA-Vektor bereitgestellt wird. Innerhalb von 5 min ligiert der Vektor sehr effizient mit einem PCR-Produkt das einen 3`-A-Überhang besitzt. Das Ligationsprodukt kann direkt in kompetente Zellen überführt werden. Die TOPO-TA-Klonierung wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt: Die PCR-Produkte (3.2.3, S. 28) wurden nach der Elektrophorese ausgeschnitten und aufgereinigt (3.2.5, S. 31). 2 µl des gereinigten PCR-Produkts wurden mit 1 µl TOPO-Vektor sowie 1 µl Salzlösung (1,2 M NaCl; 0,006 M MgCl2) und 2 µl sterilem Wasser vermischt, für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und in die chemisch kompetenten Zellen TOP 10 F` E. coli trasformiert. Dazu wurden 2 µl des Ligationsansatzes zu den kompetenten Bakterienzellen gegeben und für 20 min auf Eis gekühlt. Nach einem Hitzeschock bei 42°C über 30 sec wird der Transformationsansatz erneut auf Eis überführt und 250 µl S.O.C.-Medium zugesetzt. Im Anschluss an eine Inkubation für 60 min bei 37°C im Orbitalschüttler wurden 20 bzw. 50 µl der Bakteriensuspension auf LuriaBertani (LB)-Agar mit Ampicillin ausgestrichen. Die beimpften Platten wurden ü.N. bei 37°C bebrütet. Einzelne weiße Kolonien wurden in 2 ml LB-Medium (mit 100 µg Ampicillin/ml) angezüchtet und konnten anschließend analysiert werden. 3.2.6.2 Klonierung in K12 XL1-Blue MRF a) Ligation: Das Zusammenfügen von DNA-Fragmenten wurde mit der T4-DNA-Ligase nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Das Mengenverhältnis von Vektor-DNA zu InsertDNA wurde auf 1:2 eingestellt. Die Reaktionsansätze von 20 µl wurden ü.N. bei 16°C und nach nochmaliger Zugabe von 1 µl Ligase und 1 µl ATP eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. 32 Kapitel 3 Material und Methoden b) Herstellung komepetenter E.coli: Von einer ü.N. gewachsenen K12 XL1-Blue MRF E.coliKultur wurde 1 ml für 10 min bei 6.000 rpm zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde nach Verwerfen des Überstandes wiederholt. Das entstandene Pellet wurde mit 100 µl kaltem 0,1 M CaCl2 vorsichtig resuspendiert. Nach Zugabe von 400 µl CaCl2 wurden die Zellen für 20 min auf Eis inkubiert und nochmals für 10 min bei 4°C und 6.000 rpm pelletiert. Das so gewonnene Pellet wurde abschließend in 200 µl 0,1 M CaCl2 aufgenommen und auf Eis 60 min inkubiert. Die kompetenten E.coli wurden entweder sofort verwendet oder bei –70°C gelagert. Zum Gebrauch wurden die Zellen bei Raumtemperatur aufgetaut und sofort zur Transformation eingesetzt. c) Transformation: Die Aufnahme fremder DNA in kompetente E.coli wurde durch eine Serie von Temperaturwechsel veranlasst. Dazu wurden 100 µl kompetenter Zellen mit 20 µl des Ligationsansatzes vermischt. Die Inkubationen wurden folgendermaßen durchgeführt: 30 min auf Eis, 60 sec bei 42°C und 5 min auf Eis. Nach Zugabe von 0,8 ml LB-Medium (ohne Ampicillin) wurde der Ansatz für eine Stunde bei 37°C im Orbitalschüttler inkubiert und anschließend 0,2 ml auf eine Bakterienschale mit LB-Agar (mit 100 µg Ampicillin/ml) ausgestrichen, auf dessen Oberfläche vorher 100 µl Isopropyl- -D-Thiogalacropyranosid (IPTG) und 80 µl X-Gal verteilt worden waren. Die beimpfte Platten wurden ü.N. bei 37°C bebrütet. Einzelne weiße Kolonien wurden in 2 ml LB-Medium (mit 100 µg Ampicillin/ml) angezüchtet und konnten anschließend analysiert werden. 3.2.6.3 Charakterisierung rekombinanter DNA 3.2.6.3.1 Selektion durch Antibiotikaresistenz Durch Verwendung von Vektoren mit Resistenzgenen kann durch Zugabe der entsprechenden Antibiotika eine Selektion von Klonen durchgeführt und eine Kontamination mit Fremdbakterien verhindert werden. Die verwendeten Klonierungsvektoren pCR®2.1-TOPO und pCR®4-TOPO besitzen ein Ampicillin- und Kanamycinresistenzgen. Durch Verwendung von LB-Agar und LBMedium mit Ampicillin war eine Selektion der Bakterienzellen mit Vektor möglich. 3.2.6.3.2 Selektion durch -Komplementation (Blue-White-Screening) Die Bildung eines aktiven Enzyms ( -Galaktosidase) aus zwei enzymatisch inaktiven und von unterschiedlichen Genen exprimierten Untereinheiten wird als -Komplementation bezeichnet. Die -Galaktosidase spaltet Laktose in Glukose und Galaktose, akzeptiert aber auch chromogene Substrate wie X-Gal. Die verwendeten Bakterienstämme besitzen eine Deletion im lacZ-Gen, 33 Kapitel 3 Material und Methoden welches im sogenannten lac-Operon lokalisiert ist. Durch IPTG kann die Expression des lacZ-Gens induziert werden. Die Deletion im lacZ-Gen kann durch die von lacZ-Gen des Vektors pCR®2.1-TOPO kodierte Untereinheit des Enzyms komplementiert werden. Das so entstehende aktive Enzym kann X-Gal in einen blauen Farbstoff und Glukose hydrolisieren. Die Bakterienzellen mit Vektor werden daher blau angefärbt. Durch Insertion von Fremd-DNA in das lacZ-Gens des Vektors geht die Fähigkeit zur Komplementation und damit zur Bildung des aktiven Enzyms verloren. Die so entstehenden weißen Kolonien enthalten die Fremd-DNA. 3.2.6.4 Plasmidpräparation aus E. coli Die Plasmid-DNA wurde nach der Minilysat-Methode aus E. coli isoliert. Von den bebrüteten Bakterienschalen der Transformation wurden einzelne E. coli-Kolonien in je 2 ml LB-Medium (mit 100 µg Ampicillin/ml) ü.N. bei 37°C im Orbitalschüttler angezüchtet. Von den Suspensionskulturen wurde 1 ml abgenommen und 5 min bei 6.000 rpm (Tischzentrifuge) zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 100 µl Lösung 1 aufgenommen und 5 min auf Eis inkubiert. Durch Zugabe von 200 µl Lösung 2 wurde die DNA für 5 min auf Eis denaturiert und DNA mit 150 µl Lösung 3 neutralisiert. Die Suspension wurde 30 min auf Eis inkubiert und danach für 10 min bei 15.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 1 ml absoluten Ethanol versetzt und die Plasmid-DNA durch zehnminütige Zentrifugation bei 15.000 rpm gefällt. Das Pellet wurde mit eiskaltem 70%igen Ethanol und erneuter fünfminütiger Zentrifugation bei 15.000 rpm gewaschen, bei 37°C getrocknet und anschließend in 50 µl Aqua bidest. resuspendiert. DNA, die zur Sequenzierung oder zur Verwendung als Positivkontrolle für die PCR bestimmt war, wurde mit dem Qiagen® Plasmid Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt, um einen höheren Reinheitsgrad zu erzielen. Hierbei wurde die DNA and eine Silica-Matrix gebunden, gereinigt und eluiert. Die Präparation erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. 3.2.7 Restriktionsenzymanalyse (REA) Restriktionsendonukleasen spalten DNA sequenzspezifisch und erzeugen an ihr glatte oder 3`- bzw. 5`-überhängende Enden. Sie können zur Analyse einer DNA-Sequenz oder zur Erzeugung von Fragmenten für die Klonierung benutzt werden. Die Reaktionen mit den verschiedenen Restriktionsendonukleasen wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. 34 Kapitel 3 3.2.7.1 Material und Methoden Analytische und präparative REA Für die analytische REA mit einem Gesamtvolumen von 15 µl wurden 5 µl DNA-Lösung aus einer Plasmidpräparation oder eines PCR-Produkts mit einem oder mehreren Enzymen und dem entsprechenden Puffer gemischt und für zwei Stunden bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur inkubiert. Präparative Spaltungen wurden mit 20 µl Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 50 µl ü.N. durchgeführt. 3.2.7.2 REA der Plasmid-DNA Nach Selektion der Klone und Isolierung der Plasmid-DNA (3.2.6, S. 32) wurde durch REA die einklonierte Fremd-DNA, das sogenannte Insert, auf seine Länge kontrolliert. Die Rückspaltung der Inserts wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI innerhalb der multiplen Klonierungsstelle durchgeführt. EcoRI hat im Vektor zwei Schnittstellen: Elf Nukleotide stromaufwärts und sechs Nukleotide stromabwärts des Inserts. Die nach der Digestion entstandenen Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese (3.2.4, S. 31) aufgetrennt und ihre Größe bestimmt. 3.2.8 DNA-Sequenzierung Zur Bestimmung der Sequenzen von Inserts in Plasmiden wurden die Plasmide mittels des Qiagen® Plasmid Kits (Qiagen, Hilden) aufgearbeitet; PCR-Produkte wurden mit Hilfe eines Gene Clean gereinigt. Im „Zentralen Funktionsbereich DNA-Sequenzierung“ des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung, Universität Leipzig, wurde die DNA mit einem ABI PRISMTMSequenzierautomaten, Modell 377 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA) unter Verwendung verschiedener Primer mit Hilfe einer modifizierten Kettenabbruchmethode nach SANGER et al. (1977) sequenziert. 3.2.9 Herstellung der Positivkontrollen Die in dieser Arbeit hergestellten Positivkontrollen sollten zum einen die Funktion der RT- PCR überprüfen und zum anderen eine deutliche Unterscheidung zwischen Kontrolle und Feldvirus ermöglichen. Daher wurde zunächst RNA mit Hilfe des RNeasy mini Kits (Qiagen, Hilden) (3.2.2, S. 28) aus den Impfstoffen Nobilis® TRT (Intervet, Unterschleißheim) und Nemovac® (Merial, Hallbergmoos) gewonnen, um anschließend eine RT-PCR (3.2.3.3, S. 29) durchzuführen. Die PCRProdukte wurden mit Hilfe des TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing (Invitrogen, Box, Niederlande) kloniert (3.2.6.1, S. 32) und anschließend im „Zentralen Funktionsbereich DNA35 Kapitel 3 Material und Methoden Sequenzierung“ des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung, Universität Leipzig, sequenziert (3.2.8, S. 35). Aufgrund von Sequenzunterschieden an der Primerbindungsstelle zwischen dem Impfstoff Nemovac® von der Firma Merial und dem verwendeten Primer G5- wurde die Positivkontrolle Subtyp B entsprechend umgebaut, um eine 100%ige Bindung des Primer G5zu garantieren. Dazu wurde eine PCR durchgeführt um mit Hilfe eines Megaprimers die Primerbindungsstelle einzubauen. Um eine deutliche Unterscheidung zwischen Kontrollen und Feldvirus zu ermöglichen, wurde eine zusätzliche, fremde Sequenz in die erzeugten Positivkontrollen eingebaut. Hierfür wurden die Plasmide zunächst präparativ gespalten (3.2.7.1, S. 35) und anschließend die Enden dephosphoriliert. 43µl der verdauten Plasmid-DNA wurden mit 5 µl Puffer one-for-all und 2µl 1:20 verdünnte alkalische Phosphatase gemischt und bei 37°C 30 min und anschließend bei 85°C über 15 min inkubiert. Die Fremdsequenzen wurden mit Hilfe der PCR hergestellt (3.2.3.5, S. 30) und mit Hilfe der T4-DNA-Ligase in die Plasmide eingebaut und in K12 XL1-Blue MRF kloniert (3.2.6.2, S. 32). Um die reverse Transkription mit Hilfe der Positivkontrollen überprüfen zu können, wurde in einer in vitro-Transkription RNA hergestellt (3.2.10, S. 36). Nach Aufreinigung der hergestellten RNA mittels RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden) (3.2.2, S. 28) und anschließender Sensitivitätsstudie (3.2.11, S. 37) wurden die entsprechenden Verdünnungsstufen der Positivkontrollen in Aliquots von 20 µl bei –70°C gelagert. 3.2.10 In vitro-Transkription Die in vitro-Transkription erfolgte mit Hilfe der T7-RNA-Polymerase. Die dazu verwendeten Plasmide besitzen direkt vor dem ersten Insert-Basenpaar eine T7 Promotor-Sequenz. Vor der Durchführung der in vitro-Transkription wurde eine PCR zur Verkleinerung des Plasmids durchgeführt. Die entstandenen Amplifikate wurden mit dem Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System gereinigt. Für den Reaktionsansatz wurden je 5µl der gereinigten DNA in den Verdünnungsstufen 1:10, 1:20, 1:50 mit dem Prämix bestehend aus 10 µl 5 x Transkriptionspuffer, 5 µl 100mM DTT, 7,5 µl 10 mM ACU, 5 µl 1 mM rGTP, 2 ml RNasin, 2 µl T7-RNA-Polymerase und 13,5 µl RNase-freies Wasser gemischt und bei 37°C 60 min inkubiert. 3.2.10.1 DNase Verdau Nach der in vitro-Transkription wurde mit 40 µl des Ansatzes ein DNase Verdau bei 37°C über 30 min durchgeführt. Der Reaktionsansatz beinhaltete zusätzlich 4 µl DNase und 4 µl DNase Puffer (Promega, Madison, USA). 36 Kapitel 3 3.2.10.2 Material und Methoden Nachweis von RNA durch Agarose-Gel-Elektrophorese Der Nachweis von RNA erfolgte wie der Nachweis von DNA bis auf folgende Ausnahmen. So wurde der TAE-Puffer zur Herstellung des Agarosegels mit DEPC behandeltem Wasser hergestellt. Die Elektrophoresekammer sowie der Gelschlitten wurden vorher gründlich mit Ethanol gereinigt. Je 10 µl der hergestellten RNA vor und nach dem DNase Verdau und RNA-Marker wurden mit RNA-Ladepuffer gemischt und 10 min bei 70°C inkubiert und anschließend und in die Taschen des Gels pipettiert. 3.2.11 Herstellung von Verdünnungsreihen und Sensitivitätstest der PCRs 3.2.11.1 Nukleotid-Konzentrationsmessung Nach Aufreinigung der RNA mit Hilfe des RNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden) wurde die RNA-Konzentration photometrisch bestimmt. Zur Bestimmung der Konzentration wurde ein Aliquot der isolierten Nukleinsäuren in RNase-freiem Wasser 1:100 verdünnt und zur Messung eingesetzt. Zuvor wurde das Gerät mittels RNase-freiem Wasser geeicht. Anschließend wurde die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von = 260 nm gemessen. Die Konzentration der Nukleinsäuren pro µl wurde mit Hilfe der aus zwei unabhängigen Messungen gemittelten optischen Dichte nach folgender Formel (SAMBROOK et al. 1989) berechnet (Abb. 4): c = OD260 x V x F : 1000 µg RNA/µl = OD260 x 100 x 40 : 1000 es gilt: c = Konzentration der Probe in µg/µl OD260 = optische Dichte bei λ 260 nm V = Verdünnungsfaktor der Probe F = 40 für ss RNA Abbildung 4. Berechnung der Nukleinsäurekonzentration aus einem OD-Wert (SAMBROOK et al. 1989). 37 Kapitel 3 3.2.11.2 Material und Methoden Herstellung von RNA-Standards mit definierter Molekülmenge Die Anzahl der RNA-Moleküle pro µg hergestellter RNA wurden nach der in Abb. 5 aufgeführten Formel (SAMBROOK et al. 1989) berechnet. NA x mol-1 Anzahl transkribierter Moleküle/g RNA = Ntrans x φ Masse eines rNTPs g/mol NA = 6,023 x 1023 x mol-1 (Avogadro-Zahl; Zahl der Moleküle in 1 Mol) Ntrans = Anzahl der transkribierten Basen rNTP = Ribonukleotid-Triphosphat (1 Mol rNTP = 330 g) Abbildung 5. Formel (SAMBROOK et al. 1989) zur Berechnung der Anzahl der RNA-Moleküle in den hergestellten RNA-Präparationen. Die Anzahl der transkribierten Basen (Ntrans) errechnet sich aus der Länge des Inserts des jeweiligen Plasmides und der Anzahl der Nukleotide vom T7-Promotor bis zur Primerbindungsstelle des M13rev. Letztere beträgt bei den verwendeten Vektoren pCR-4 TOPO® und pCR®2.1 144 bzw. 177 Nucleotide. Um eine Verdünnungsreihe herstellen zu können, wurde die Anzahl der Moleküle pro µl RNA-Präparation mit folgender Formel berechnet (Abb. 6): Anzahl der Moleküle/µl = Moleküle/µg RNA x Konzentration der RNA-Präparation µg/µl Abbildung 6. Formel (SAMBROOK et al. 1989) zur Berechnung der Anzahl der RNA-Moleküle pro µl RNAPräparation. Für die Verwendung der hergestellten Transkripte wurden diese auf eine definierte Molekülzahl eingestellt. Um die Nachweisgrenze der PCR festzustellen, wurden Verdünnungsreihen transkribierter RNA in 10er Schritten ausgehend von 1010 Genomäquivalenten angefertigt. Als template kamen 105 bis 100 Genomäquivalente zum Einsatz. Zur Verdünnung der RNA-Präparationen diente Hefe-t-RNA (100 ng/µl). 38 Kapitel 3 3.2.12 Material und Methoden Serologische Untersuchung Folgende kommerzielle ELISA-Tests wurden verwendet und entsprechend der jeweiligen Protokolle der Hersteller durchgeführt: aMPV-ELISA Flock Check® „Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen das Aviäre Pneumovirus“ (IDEXX, Wörrstadt) und der avian rhinotracheitis antibody test kit® (BioChek, Gouda, Holland). Diese Tests waren bereits in früheren Studien erfolgreich eingesetzt worden (OWOADE et al. 2006; Aung 2007) und finden häufig in der Betreuung von Legehennenherden Anwendung. Laut Hersteller sind sie geeignet Antikörper gegen aMPV-Subtyp A, B und C sowohl in Hühnern als auch in Puten zu detektieren (Produktinformation zu aMPV-ELISA Flock Check® IDEXX, 2006; Barend van Dam, BioChek B.V., Niederlande, persönliche Korrespodenz, 2009). Die Serumproben wurden für die Durchführung des aMPV-ELISA Flock Check® 1:500 mit dem Probenverdünnungspuffer verdünnt. Anschließend wurden je 100 µl Probenmaterial in die Kavitäten pipettiert und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit destilliertem Wasser wurde 100 µl (Ziegen-) Anti-Huhn/Anti-Pute: Meerrettichperoxidase (HRPO)Konjugat hinzugegeben und 30 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach erneutem fünfmaligem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Proben nach Zugabe von 100 µl Tetramethylbenziden-Substrat 15 min inkubiert. Nach Zugabe der Stopplösung wurde die Extinktion der Proben mit einem Photometer bei 650 nm gemessen. Mit der vom Hersteller mitgelieferten Formel wurde das S/P-Verhältnis und der dekadische Logarithmus des Endpunkttiters berechnet (Abb. 7). S/P = Mittelwert der Probe – Mittelwert der negativen Kontrolle Mittelwert der positiven Kontrolle – Mittelwert der negativen Kontrolle Log10 Titer = 1,09 (Log10 S/P) + 3,36 Titer = Antilog Abbildung 7. Berechnung des Endpunkttiters nach Anwendung des aMPV ELISA Flock Check® „Testkit zum Nachweis von Antikörpern gegen das Aviäre Pneumovirus“ (IDEXX, Wörrstadt). Für die Durchführung des avian rhinotracheitis antibody test kit® wurden die Serumproben 1:500 mit dem Probenverdünnungspuffer verdünnt und je 100 µl Probenmaterial in die Kavitäten pipettiert und für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 300 µl Waschpuffer wurde 100 µl (Schaf-) Anti-Huhn: alkaline phosphatase-Konjugat hinzugegeben und 60 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach erneutem viermaligem Waschen mit 300 µl 39 Kapitel 3 Material und Methoden Waschpuffer wurden die Proben nach Zugabe von 100 µl PNPP (p-Nitrophenyl phosphate)-Substrat 30 min inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl Stopplösung wurde die Extinktion der Proben mit einem Photometer bei 405 nm gemessen. Mit der vom Hersteller mitgelieferten Formeln wurde das S/PVerhältnis und der dekadische Logarithmus des Endpunkttiters berechnet (Abb. 8). S/P = Mittelwert der Probe – Mittelwert der negativen Kontrolle Mittelwert der positiven Kontrolle – Mittelwert der negativen Kontrolle Log10 Titer = 1,0 (Log10 S/P) + 3,52 Titer = Antilog Abbildung 8. Berechnung des Endpunkttiters nach Anwendung des avian rhinotracheitis antibody test kit® (BioChek, Gouda, Holland). Die Serumproben wurden bis zur Untersuchung bei –20°C gelagert und nach Abschluss der Probennahmen alle mit derselben Charge des jeweiligen Testkits untersucht. 3.2.12.1 Interpretation der Ergebnisse Die Ergebnisse des ELISAs wurden nach den Empfehlungen des Herstellers interpretiert (Tab. 5). Tabelle 5. Interpretation der ELISA-Ergebnisse. Testkit BioChek IDEXX 3.2.12.2 Ergebnisse Antikörper-Status Negativ Fraglich Positiv S/P < 0,349 0,350 – 0,499 > 0,500 Titer < 1158 1159 – 1655 > 1656 S/P 0,2 > 0,2 Titer 396 > 396 Probenauswertung Jeweils zehn Tiere pro Herde wurden auf das Vorkommen von aMPV-Antikörpern untersucht. Um den aMPV-Kontakt beurteilen zu können, wurde die gesamte Herde als aMPV-positiv betrachtet sobald mindestens ein Tier positiv getestet wurde. 40 Kapitel 3 3.2.13 Material und Methoden Statistische Auswertung Die statistische Bearbeitung erfolgte mit den Statistikprogrammen SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) Version 11.5 und 13 (SPSS Inc. Headquarters, 233 S. Wacker Drive, 11th floor Chicago, Illinois 60606, USA). Zur Anwendung kamen der Chi²-Test, Fisher-Test, ANOVA und Bonferroni-Test. 41 Kapitel 4 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Konstruktion der Primer Zusätzlich zu den publizierten Primern zum Nachweis von aMPV-Subtyp A und B (NAYLOR et al. 1997; CAVANAGH et al. 1999) wurden als interne Kontrolle neue Primerkombinationen entwickelt (Tab. 4, S. 26). Diese sollten an alle bekannten Sequenzen aller aMPV-Subtypen binden und in der Gel-Elektrophorese eindeutig von den Banden der anderen PCR-Produkte [G1+/G6-, G8+A bzw. G9+B/G5-] zu unterscheiden sein. Hierfür wurden publizierte Nukleotidsequenzdaten des Gens, welches für das Phosphoprotein kodiert, genutzt, um die Primer P-s und P-as zur Amplifikation eines 209 bp langen Fragments des P-Proteingens zu konstruieren. In einer Sequenzanalyse des PCR-Produkts [G1+/G6-] des Impfstoffstamms PL-21 (Nemovac®) (4.2, S. 42) wurde das Amplifikat zwar als Teil des Glykoproteingens des aMPVSubtyp B bestätigt, wies aber Unterschiede an der Primerbindungsstelle des Primer G5- auf (Abb. 9). Um Nemovac®-ähnliche Stämme zu detektieren, war es notwendig, einen Primer zu konstruieren, der 100%ig an dieser Stelle bindet. Dieser Primer wurde als G5-B konstruiert und in Kombination mit G8+A und G9+B in der nested PCR zur Amplifikation eines ca. 270 bzw. 350 bp langen Fragments eingesetzt (Tab. 4, S. 26). XXGXXXGGGCTTATTGGCTCTTTGTGAA 10 Majority M Nemovac Primer G5872 S (L34034) N G 8 20 1 CC.CCC....CC.CC.....CCC..... 1 ------...........Y...... 1 TT.TTT...................... Abbildung 9. Alignment des Nemovac-PCR-Produkts, des Primers G5- sowie einer ausgewählten aMPV-Subtyp-BSequenz aus der Genbank Database mit der ClustalW-Methode. Unterstrichen dargestellt ist die Position, an der der Primer G5- binden sollte und die als Primer G5-B Anwendung fand. Y: C oder T; Punkte: Übereinstimmung mit der Konsensussequenz. 4.2 Herstellung von Plasmiden Zur Durchführung von Sensitivitätsstudien und für die Herstellung von Positivkontrollen war es notwendig, zunächst verschiedene Plasmide zu generieren. Teile des G- bzw. des P-Gens der aMPV-Stämme BUT 1#8544, VCO3 und PL-21, welche entsprechend in den Impfstoffen Nobilis® TRT (Intervet, Unterschleißheim), Terivac® und Nemovac® (Merial, Hallbergmoos) enthalten sind, wurden mit den Primerpaaren G1+ und G6- (NAYLOR et al. 1997; CAVANAGH et al. 1999) bzw. P-s und P-as (Tab. 4, S. 26) in einer RT-PCR amplifiziert (Abb. 10). Die PCR-Produkte wurden mit 42 Kapitel 4 Ergebnisse Hilfe des TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing kloniert und wie in Abschnitt 3.2.6 (S. 32) analysiert (s. Beispiel Abb. 11). Ein Klon wurde entsprechend ausgewählt, angereichert und nach Aufreinigung der Plasmid-DNA mit Hilfe des Qiagen® Plasmid Mini Kits sequenziert. Die jeweiligen Inserts konnten als Teile des aMPV identifiziert werden. Die entsprechende Klone wurden, wie in Tabelle 6 (S. 44) beschrieben, bezeichnet und unter Zusatz von sterilem Glycerin (87%) in flüssigem Stickstoff eingefroren. Daneben wurden für die Herstellung von Positivkontrollen auch bereits am Institut für Virologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig, vorhandene Plasmide genutzt (Tab. 3, S. 24). A 1 2 3 B N M N 1 M 2 N M M 3 N * * 209 bp * *)440 bp Abbildung 10. (A) Elektrophorese der RT-PCR [P-s/P-as] der Impfstoffe Nemovac® (Bahn 1), Nobilis TRT® (Bahn 2) und Terivac® (Bahn 3); N: Negativkontrolle; M: Längenmarker. (B) Elektrophorese der RT-PCR [G1+/G6-] des Impfstoffes Nobilis TRT® (Bahn 1), Nemovac® (Bahn 2) und Terivac® (Bahn 3); N: Negativkontrolle; M: Längenmarker. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 460 bp Abbildung 11. Kontrolle der Länge des Inserts Nobilis G durch REA der isolierten Plasmid-DNA mit EcoRI: Die Klone 1-9 enthalten ein Fragment der entsprechenden Länge. Bahn 1-9: Klon 1-9; M: Längenmarker. 43 Kapitel 4 Ergebnisse Tabelle 6. Übersicht über die hergestellten Plasmide. Bezeichnung Vektor Insert Charakterisierung des Bakterienstamm Inserts pCR®4 TOPO pVL 669 RT-PCR-Produkt [G1+/G6-] Gen des Glykoproteins, des aMPV-Stamms BUT partiell ® pCR®4 TOPO pVL 670 pCR®4 TOPO pVL 807 1#8544 (Nobilis TRT) (442 bp) RT-PCR-Produkt [G1+/G6-] Gen des Glykoproteins, des aMPV-Stamms PL-21 partiell (Nemovac®) (442 bp) RT-PCR-Produkt [G1+/G6-] Gen des Glykoproteins, des aMPV-Stamms VCO3 partiell ® pCR®2.1 pVL 808 (Terivac ) (442 bp) RT-PCR-Produkt [P-s/P-as] Gen des Phosphoproteins, des aMPV-Stamms VCO3 partiell ® pCR®2.1 pVL 809 (Terivac ) (209 bp) RT-PCR-Produkt [P-s/P-as] Gen des Phosphoproteins, des aMPV-Stamms BUT partiell ® pCR®2.1 pVL 810 1#8544 (Nobilis TRT) (209 bp) RT-PCR-Produkt [P-s/P-as] Gen des Phosphoproteins, des aMPV-Stamms PL-21 partiell ® (Nemovac ) 4.3 Top 10 F` Top 10 F` Top 10 F` Top 10 F` Top 10 F` Top 10 F` (209 bp) Herstellung der Positivkontrollen aMPV-Subtyp A und B Um eine deutliche Unterscheidung zwischen den PCR-Produkten der Kontrollen und der Feldviren zu ermöglichen, wurden die Plasmide pVL 669 (Subtyp A) und pVL 670 (Subtyp B) (Tab. 6) durch Einführung einer zusätzlichen, fremden Sequenz (Insertion) um ca. 150 bp vergrößert (Abb. 12). Tabelle 7 zeigt die zu erwartenden Größen der PCR-Produkte von Feldisolaten sowie der modifizierten Positivkontrollen. Tabelle 7. Zu erwartende Größen der PCR-Produkte der Feldisolate und der modifizierten Positivkontrollen. Positivkontrolle A (aMPV A + IBDV) aMPV A Positivkontrolle B (aMPV B + APV) aMPV B RT-PCR 606 bp 440 bp 605 bp 445 bp Nested PCR 433 bp 267 bp 511 bp 351 bp 44 Kapitel 4 Ergebnisse Die Plasmide enthielten, wie oben beschrieben, einen Teil des Glykoproteingens des aMPVGenoms der Subtypen A bzw. B. Die Schnittstellen für die später einzubauenden fremden Sequenzen wurden so gewählt, dass weiterhin die Primer der RT- sowie der nested PCR binden konnten. Die Plasmide wurden mit Hilfe der Minilysat-Methode gereinigt und mit dem Restriktionsenzym HincII geschnitten. Dieses Enzym schnitt das Insert von pVL 669 nach 231 bp als blund end, d.h. beide DNA-Stränge wurden an der selben Stelle geschnitten. PVL 670 enthielt zwei HincII-Schnittstellen (247 bp und 397 bp), so dass ein 151 bp großes DNA-Stück aus dem Insert herausgeschnitten wurde. Um beide Positivkontrollen auf ca. 600 bp zu vergrößern, wurden unterschiedlich große Fragmente eingebaut, die mittels PCR hergestellt wurden (Abb. 13 A). Als template dienten die im Institut vorhandenen Plasmide pVL 84 und 281 (1:100 verdünnt), welche Genombereiche des aviären Polyomavirus (APV) bzw. des Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) enthielten. Durch Ligation des IBDV-Amplifikats (166 bp) bzw. des APV-Amplifikats (310 bp) mit dem entsprechend geschnittenen Klon pVL 669 bzw. pVL 670 und Klonierung in K12 XL1-Blue MRF wurde die DNA der Positivkontrolle des aMPV-Subtyp A bzw. Subtyp B hergestellt. Die erfolgreiche Ligation wurde durch eine REA mit EcoRI kontrolliert (s. Beispiel Abb. 13 B). Verdau mit Hinc II pVL 669 (aMPV Subtyp A) Insertion Hinc II + pVL 670 (aMPV Subtyp B) IBDV PCR Produkt (166 bp) HincII + APV PCR Produkt (310 bp) Modifizierte Positivkontrolle Subtyp B Modifizierte Positivkontrolle Subtyp A Abbildung 12. Schematische Darstellung der Herstellung der Positivkontrollen. 45 Kapitel 4 A Ergebnisse 1 2 M B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 600 bp 310 bp 460 bp 166 bp Abbildung 13. (A) Elektrophorese der PCR-Produkte der „Fremdsequenzen“ IBDV (Bahn 1) und APV (Bahn 2); M: Längenmarker. (B) Kontrolle der Ligation des Plasmids pVL 669 und des PCR-Produkts IBDV (166 bp) durch REA der isolierten Plasmid-DNA mit EcoRI nach der Ligation und Klonierung: Der Klone 7 enthält ein Fragment der entsprechenden Länge. Bahn 1-9: Klon 1-9, M: Längenmarker. Wie oben erwähnt, konnte jedoch der in der nested PCR verwendete Primer G5- nur teilweise an den Stamm PL-21 (Nemovac®) binden (4.1, S. 42). Daher war es notwendig, den Klon so zu modifizieren, dass eine exakte Bindung gewährleistet war. Die Bindungsstelle wurde mit Hilfe einer PCR unter Verwendung des Megaprimers Bkorr (Tab. 4, S. 26) und des Primers G1+ in das Insert des Klons pVL 806 eingefügt. Das entsprechende Produkt wurde wie oben beschrieben in den Vektor pCR®4 TOPO einkloniert und als pVL 806 eingefroren. Die Sequenzanalyse bestätigte den erfolgreichen Einbau der erforderlichen Primerbindungsstelle. Für die Herstellung der endgültigen Positivkontrollen wurde von den oben generierten Plasmiden (pVL 778 und 806) mit Hilfe der in vitro-Transkription RNA hergestellt. Die Plasmide wurden mit der Minilysatmethode gewonnen und mit Hilfe des Universalprimers M13rev und des Primers B19805 (Tab. 4, S. 26) auf eine Länge von ca. 740 bp bzw. 500 bp amplifiziert. Um einen höheren Reinigungsgrad zu erhalten, wurden die PCR-Produkte mit dem Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Kit gereinigt und anschließend mit Hilfe der T7-RNA-Polymerase in RNA umgeschrieben. Um noch restliche DNA zu entfernen wurde ein DNase-Verdau durchgeführt und anschließend der Erfolg der Transkription in einem 1,5%igem Agarose-Gel überprüft (Abb. 14). 46 Kapitel 4 A Ergebnisse B 1 1 2 2 3 3 4 4 P M a b a b a b a b 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b P M DNA transkribierte RNA Abbildung 14. Gel-Elektrophorese der Transkripte von pVL 779 (A) und pVL 806 (B). Bahn 1-4 a: vor DNAseVerdau; b: nach DNAse-Verdau; P: Transkript von pVL zur Überprüfung der in vitro-Transkription; M: RNALängenmarker. Die hergestellte RNA diente als endgültige Positivkontrolle für die RT-PCR zur Detektion von aMPV und wurde in 20 µl Aliquots bei –70°C gelagert. Abb. 15 zeigt ein Beispiel der Elektrophorese der PCR-Produkte der Herde 6 zum Zeitpunkt der Einstallung. Die Amplifikate der Kontrollen konnten eindeutig von den aMPV-PCR-Produkten unterschieden werden (Tab. 7, S. 44). Durch die Verwendung dieser modifizierten Positivkontrollen konnte eine Kontamination der Proben mit DNA der Positivkontrollen ausgeschlossen werden. A 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 N +A +B 600 bp 450 bp B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N M +A +B 510 bp 430 bp 350 bp 270 bp Abbildung 15. Elektrophorese der RT-PCR (A) und der nested PCR (B) Produkte des Betriebs Nr. 6 zum Zeitpunkt der Einstallung; Bahn 1-10 entsprechen Huhn 1-10; N: Negativkontrolle; M: Längenmarker; +A: Positivkontrolle Subtyp A; +B: Positivkontrolle Subtyp B. 47 Kapitel 4 Ergebnisse 4.4 Sensitivitätsstudien Vor Durchführung der eigentlichen diagnostischen Untersuchung wurden die PCRs auf ihre Sensitivität geprüft. 4.4.1 In vitro-Transkription Von den generierten Plasmiden pVL 669, 670, 807, 808, 809 und 810 wurde mit Hilfe der in vitro-Transkription RNA wie in Abschnitt 3.2.10 beschrieben hergestellt (Abb. 16). A B 1a DNA transkribierte RNA 1b 2a 2b M1 M2 3a 3b 1a 1b 2a 2b M1 3a 3b M2 DNA transkribierte RNA Abbildung 16. (A) Gel-Elektrophorese der Transkripte von pVL 808 (Bahn 1), pVL 809 (Bahn 2) und pVL 810 (Bahn 3); (B) Gel-Elektrophorese der Transkripte von pVL 669 (Bahn 1), pVL 670 (Bahn 2) und pVL 807 (Bahn 3); a: vor DNAse-Verdau; b: nach DNAse-Verdau; M1: RNA-Längenmarker; M2: DNA-Längenmarker. 4.4.2 Herstellung von RNA-Standards mit definierter Molekülmenge Nach der erfolgreich durchgeführten in vitro-Transkription wurde die hergestellte RNA mit Hilfe des RNeasy® Mini Kits aufgereinigt. Nach der anschließenden Konzentrationsbestimmung mittels eines UV-Spektrometers wurde die Molekülzahl berechnet und eine entsprechende Verdünnungsreihe für die Sensitivitätsstudien angefertigt. Die Berechnung erfolgte mit den Formeln nach SAMBROOK et al. (1989) (Abb. 4-6, S. 37f). Die Berechnung soll hier am Beispiel der Herstellung einer RNA-Verdünnungsreihe für aMPV-Subtyp B Stamm VCO3 erläutert werden: Die Konzentration der RNA-Präparation von pVL 807 (Insert entspricht PCR-Produkt [G1+/G6-] des Glykoproteingens) betrug gemäß photometrischer Messung 0,028 µg/µl. Die Anzahl der transkribierten Basen (Ntrans) von dem aMPV-Subtyp B Stamm VCO3 betrug 585 nt (441 nt Insert + 144 nt Vektor). Die Anzahl der Moleküle pro Gramm RNA-Präparation betrug gemäß genannter Formel 3,11 x 1018 Moleküle. Dies entspricht einem Wert von 3,11 x 1012 Moleküle/µg RNA. Bei einer Konzentration von 0,028 µg/µl enthielt die RNA-Präparation demnach 3,11 x 1012 Moleküle/µg x 0,028 µg/µl = 8,68 x 1010 Moleküle/µl. Folglich befanden sich in 1,15 µl der 48 Kapitel 4 Ergebnisse RNA-Präparation 1011 Moleküle. Die Konzentration der RNA-Präparation von pVL 808 (Insert entspricht PCR-Produkt [P-s/P-as] des Phosphoproteingens) betrug gemäß photometrischer Messung 0,028 µg/µl. Nach oben genannten Formeln befanden sich in 2,65 µl der RNA-Präparation 1011 Moleküle. Die Einstellung der RNA-Lösungen auf je 1010 Moleküle/20 µl erfolgte durch Mischung von 1,15 µl der RNA-Präparation von pVL 807 und 2,65 µl der RNA-Präparation von pVL 808 mit 196,20 µl Hefe-t-RNA (100 ng/µl). Für die nachfolgenden Verdünnungsstufen in 10er Schritten wurden jeweils 20 µl der vorherigen Verdünnungsstufe in 180 µl Hefe-t-RNA (100 ng/µl) pipettiert. Als Wert 0 Moleküle wurde reine Hefe-t-RNA (100 ng/µl) eingesetzt. Die Verdünnungsreihen wurden in 20 µl-Aliquots bei -70°C eingefroren. Die Verdünnungsreihen für die übrigen RNA-Präparationen wurden entsprechend hergestellt. Die Sensitivität der PCR wurde mit Hilfe der angefertigten Verdünnungsreihen unter den oben genannten Bedingungen überprüft. Die Nachweisgrenze der G-Gen-Amplifikate mittels RT-PCR lag bei 103, mittels nested PCR bei 101 Genomäquivalenten. Das P-Gen-Produkt der Stämme PL-21 und BUT 1#8544 konnte bis zu 102 und das Amplifikat des Stamms VCO3 bis zu 103 Genomäquivalenten nachgewiesen werden (Abb. 17). 49 Kapitel 4 Ergebnisse A1 1 2 3 4 5 6 N M A2 N M 1 2 3 4 5 6 7 450 bp 350 bp 210 bp 210 bp B1 B2 M N 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 N W M 450 bp 350 bp 210 bp 210 bp C1 M 1 2 3 4 5 6 C2 1 2 3 4 5 6 7 N M 270 bp 210 bp 450 bp 210 bp Abbildung 17. Sensitivitätstest der RT-PCR (A1-C1) und nested PCR (A2-C2). A: Stamm VCO3; B: Stamm PL-21; C: Stamm BUT 1#8544; Bahn 1-7: Verdünnungsreihe 105 bis 10-1 Genomäqivalente; N: Negativkontrolle; W: Nuklease-freies Wasser; M: DNA-Längenmarker. 50 Kapitel 4 4.5 Ergebnisse AMPV-Genomnachweis während der Legeperiode In 18 Legehennenherden wurden alle drei Monate beginnend mit der Einstallung von je zehn Tieren Pharyngeal-/ Trachealtupferproben entnommen und mittels duplex nested RT-PCR untersucht. In der Regel erfolgten fünf Probenentnahmen je Herde. In allen beteiligten Herden konnte mindestens einmal während der gesamten Legeperiode das aMPV-Genom nachgewiesen werden, wobei die Nachweisrate je Herde und Probenentnahme variierte: in positiven Herden konnte das Genom mindestens bei einem, aber auch bei allen zehn beprobten Tieren detektiert werden (Tab. 9). Kein Betrieb war bei allen fünf Probenentnahmen positiv; der erste GenomNachweis gelang zum Zeitpunkt der Einstallung in neun Herden (Nr. 4, 6, 7, 11-15, 18), nach drei Monaten in fünf Herden (Nr. 2, 5, 9, 10, 16), nach sechs Monaten in drei Herden (Nr. 1, 3, 8) und nach neun Monaten in einer Herde (Nr. 12). Das aMPV-Genom konnte maximal in vier Probenentnahmen detektiert werden, sowohl in mehreren aufeinanderfolgenden Entnahmen (in neun Herden: Nr. 2, 4, 8-10, 13, 15-17), als auch unterbrochen von negativen Ergebnissen (in fünf Herden: Nr. 1, 6, 7, 11, 14) (Tab. 9). Wie in Tabelle 8 dargestellt konnte in fünf Herden (Nr. 4, 6, 13, 15, 16) der Nachweis bei vier von fünf Entnahmen, in drei Herden (Nr. 2, 8, 14) bei drei von fünf Entnahmen, in drei Herden (Nr. 7, 11, 17) bei zwei von fünf Entnahmen und in drei Herden (Nr. 3, 5, 18) bei nur einer Entnahme beobachtet werden. Vier Herden können in diese Auswertung nicht mit einbezogen werden, da zum einen in zwei Herden (Nr. 1, 9) – infolge nicht korrekter Lagerung – von fünf Entnahmen nur zwei bzw. vier mittels PCR untersucht werden konnten. Zum anderen stallten zwei Herden (Nr. 10, 12) bereits nach sechs bzw. neun Monaten aus. Daher standen für diese Herden nur drei bzw. vier Probengruppen zur Verfügung. Der Nachweis gelang in diesen vier Herden in zwei Probenentnahmen (Nr. 1, 9, 10) bzw. einer Probenentnahme (Nr. 12). Tabelle 8. Anzahl der positiven Probenentnahmen im Vergleich zur Gesamtanzahl der Probenentnahmen in einer Herde. Ergebnisse (pos. /ges. Probe) 5/5 4/5 3/5 2/5 1/5 2/2 (5) Anzahl der Herden 0 5 3 3 3 1 pos., positiv; ges., gesamt; *) * 2/4 (5) 1 * 1/4 2/3 0/5 1 1 0 in Klammern ist die Anzahl der gesamten Probenentnahmen in den betroffenen Herden angegeben. Jedoch wurden nur zwei bzw. vier Entnahmen mittels PCR untersucht, da die übrigen Proben – infolge nicht korrekter Lagerung – nicht beurteilt werden konnten. 51 Kapitel 4 Ergebnisse Tabelle 9. Nachweis von aMPV in Legehennen (Herden 1 - 18) über die gesamte Legeperiode zu unterschiedlichen Entnahmezeitpunkten. Herde Probenentnahme Nr. aMPV A 1 K 1 2 3 4 5 n.d. n.d. 3/10 n.d. 1/10 aMPV B n.d. n.d. 0/10 n.d. 10/10 IDEXX 1/10 1/10 0/10 10/10 10/10 BioChek aMPV A 2 aMPV B K IDEXX BioChek + 1/10 ? 2/10 1/10 aMPV + + 1/10 ** 2/10 ? 3/10 + 0/10 + 0/10 ? 3/10 + 0/10 ? 5/10 + 10/10 ? 0/10 + 7/10 ? 2/10 8/10 2/10 0/10 0/10 1/10 0/10 1/10 0/10 0/10 0/10 1/10 0/10 ? 0/10 + 1/10 ? 1/10 + 0/10 ? 1/10 + 1/10 ? 0/10 aMPV A 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 3 aMPV B 0/10 0/10 10/10 0/10 0/10 K IDEXX 0/10 0/10 10/10 10/10 10/10 BioChek ? 2/10 + 0/10 + 0/10 ? 1/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 aMPV A 0/10 1/10 1/10 0/10 0/10 4 aMPV B 2/10 2/10 3/10 4/10 0/10 K IDEXX 1/10 10/10 9/10 10/10 10/10 BioChek ? 2/10 + 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 9/10 ? 1/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 aMPV A 0/10 1/10 0/10 0/10 0/10 5* aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 K IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 BioChek + 10/10 aMPV B K IDEXX BioChek + 10/10 10/10 aMPV A 6* ? 0/10 10/10 f, v 10/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 3/10 2/10 0/10 2/10 0/10 0/10 0/10 0/10 10/10 10/10 10/10 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 aMPV A 2/10 0/10 0/10 0/10 3/10 7* aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 1/10 B IDEXX BioChek 10/10 + 10/10 ? 0/10 10/10 + 10/10 ? 0/10 10/10 + 10/10 ? 0/10 10/10 + 10/10 ? 0/10 f 10/10 + 10/10 ? 0/10 aMPV A 0/10 0/10 6/10 1/10 0/10 8 aMPV B 0/10 0/10 2/10 0/10 2/10 B IDEXX 0/10 3/10 0/10 0/10 0/10 BioChek + 0/10 ? 0/10 + 2/10 ? 4/10 + 2/10 ? 4/10 + 2/10 ? 4/10 + 1/10 ? 3/10 aMPV A n.d. 9/10 4/10 0/10 0/10 9 aMPV B n.d. 1/10 0/10 0/10 0/10 B IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 BioChek + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 aMPV A 0/10 0/10 0/10 10 aMPV B 0/10 7/10 1/10 B IDEXX 1/10 0/10 0/10 BioChek + 0/10 ? 2/10 + 4/10 ? 1/10 + 4/10 52 ? 2/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 Kapitel 4 Ergebnisse (Fortsetzung Tabelle 9) Probenentnahme Herde 11 B 1 2 3 4 5 aMPV A 1/10 0/10 1/10 0/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 4/10 0/10 0/10 IDEXX 0/10 0/10 0/10 2/10 2/10 BioChek + 1/10 ? 3/10 + 1/10 ? 1/10 + 1/10 ? 1/10 + 4/10 ? 0/10 aMPV A 0/10 0/10 0/10 1/10 12 aMPV B 0/10 0/10 0/10 1/10 B IDEXX 0/10 0/10 0/10 0/10 BioChek + 2/10 ? 1/10 + 0/10 ? 0/10 + 2/10 ? 3/10 + 1/10 + 2/10 ? 0/10 ? 5/10 aMPV A 3/10 1/10 2/10 9/10 0/10 13 aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 F IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 BioChek + 9/10 ? 1/10 +10/10 ? 0/10 +10/10 ? 0/10 +10/10 ? 0/10 +10/10 ? 0/10 aMPV A 2/10 0/10 9/10 0/10 0/10 14 aMPV B 0/10 0/10 7/10 0/10 5/10 F IDEXX 0/10 2/10 10/10 8/10 10/10 BioChek 15 F + 0/10 ? 1/10 + 4/10 ? 1/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 aMPV A 2/10 2/10 4/10 1/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 IDEXX 0/10 0/10 2/10 1/10 1/10 BioChek + 1/10 ? 1/10 + 4/10 ? 2/10 + 7/10 ? 1/10 + 4/10 ? 4/10 + 1/10 ? 0/10 aMPV A 0/10 7/10 2/10 1/10 0/10 16 aMPV B 0/10 1/10 0/10 0/10 2/10 F IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 BioChek + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 + 10/10 ? 0/10 aMPV A 2/10 9/10 0/10 0/10 0/10 17 aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 F IDEXX 0/10 0/10 1/10 0/10 2/10 BioChek + 0/10 ? 6/10 + 2/10 ? 4/10 + 3/10 ? 2/10 + 1/10 ? 2/10 + 3/10 ? 3/10 aMPV A 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 18 aMPV B 10/10 0/10 0/10 0/10 0/10 F IDEXX BioChek 3/10 + 6/10 ? 0/10 10/10 + 10/10 ? 0/10 10/10 + 9/10 ? 1/10 9/10 + 9/10 ? 0/10 10/10 + 10/10 ? 0/10 Tupfer- und Serumproben wurden alle drei Monate gewonnen und mittels duplex nested RT-PCR und zweier kommerzieller ELISA-Tests untersucht. K: Käfig-; F: Freiland-; B: Bodenhaltung; aMPV A: nested RT-PCR, welche aMPV-Subtyp A detektiert; aMPV B: nested RT-PCR, welche aMPV-Subtyp B detektiert; IDEXX: aMPV-ELISA Flock Check® (IDEXX, Wörrstadt, Germany); Bio Check: the avian rhinotracheitis antibody test kit® (BioChek, Gouda, Niederlande); n.d.: nicht durchgeführt; x/10: positive Proben zu Gesamtprobe; +: positiv getestet; ?: fraglich getestet; v: Virus ähnlich dem Impfstamm PL-21 (Nemovac®, Merial, Hallbergmoos); f: Feldvirus; *: Herde wurde mit zwei unterschiedlichen Subtyp B-Impfstoffen während der Aufzuchtphase geimpft; **: in der RT-PCR aMPV-P-Proteingen positiv, aber in der nested PCR keine Differenzierung in Subtyp A und B möglich. 53 Kapitel 4 4.6 Ergebnisse Nachweis der aMPV-Subtypen Von insgesamt 83 untersuchten Probengruppen waren 45 (entspr. 54%) aMPV-RNA positiv. Mit einer Ausnahme konnten in der nested PCR alle positiven Befunde entweder dem Subtyp A oder dem Subtyp B zugeordnet werden. In der Herde Nr. 2 konnte zum Zeitpunkt der Einstallung ein positives Ergebnis der ersten PCR verzeichnet werden, welches auf die Primerpaare P-s und P-as zurückzuführen ist – eine Sequenzanalyse bestätigte Teile des Phosphoproteingens des aMPV (4.7.1, S. 57). Die Primerpaare, die auf dem Gen für das G-Protein lokalisiert sind, führten aber in diesem Fall zu keinen Ergebnissen (Abb. 18) – eine Unterscheidung in Subtyp A oder B konnte nicht erfolgen. A B 1 2 M 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N M +A +B 510 bp 430 bp 209 bp Abbildung 18. (A) Elektrophorese der RT-PCR des Betriebs Nr. 2; Bahn 1, 2, 3, 4 entsprechen Huhn 2, 5, 8 und 10 zum Zeitpunkt der Einstallung; M: Längenmarker. (B) Elektrophorese der nested PCR des Betriebs Nr. 2; Huhn 1-10 (Bahn 1-10); N: Negativkontrolle; M: Längenmarker; +A: Positivkontrolle Subtyp A; +B: Positivkontrolle Subtyp B. Die Sequenzanalyse der nested PCR-Produkte der Hühner 2 und 9 ergab Ähnlichkeiten mit Hühner-RNA. Die Sequenz des RT-PCR-Produkts von Huhn 5 bestätigte aMPV-RNA (S. 57). Bei 23 Probenentnahmen (51%) konnte nur der Subtyp A nachgewiesen werden, damit kam dieser alleine mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B (10 Probenentnahmen). Eine Doppelinfektion mit den Subtypen A und B (12 Probenentnahmen: 27%) wurde ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit dem Subtypen B (22%) (Abb. 19). In den 18 untersuchten Herden konnte sowohl während der gesamten Legeperiode nur ein Subtyp als auch ein Wechsel der Subtypen in dieser Zeit beobachtet werden. In vier von 18 Herden (Nr. 5, 13, 15, 17) wurde in allen positiven Probenentnahmen der entsprechenden Betriebe ausschließlich Subtyp A nachgewiesen, in drei Herden (Nr. 3, 10, 18) ausschließlich Subtyp B und in einer Herde (Nr. 12) Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B. Der Wechsel der Subtypen A und B während der Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) (Nr. 1, 2, 4, 6-9, 11, 14, 16) zeigten diesen Verlauf. 54 Kapitel 4 Ergebnisse aMPV positive Befunde 27% 54% 45 12 23 51% 10 aMPV negative Befunde 46% 38 22% Positiv Subtyp A Positiv Subtyp B Positiv Subtyp A und B Abbildung 19. Nested PCR-Ergebnisse der beteiligten Legehennenbetriebe während der Legeperiode. Drei Herden (Nr. 5-7) wurden während der Aufzuchtphase mit dem aMPV-Subtyp B-Lebendimpfstoff Nemovac® (Merial, Hallbergmoos) und der Inaktivatvakzine Gallimune® 407 ND+IB+EDS+ART (Merial, Hallbergmoos) nach dem oben beschriebenen Schema geimpft (3.1.2, S. 21). In allen drei Herden wurde aMPV-RNA in bis zu vier Probenentnahmen nachgewiesen. Subtyp A dominierte, der Subtyp B-Nachweis gelang in zwei Herden jeweils einmal: einmal zum Zeitpunkt der Einstallung bzw. einmal zum Zeitpunkt der Ausstallung (Tab. 9). 4.7 Analyse der PCR-Produkte In der vorliegenden Studie waren nicht immer alle vier möglichen PCR-Produkte detektierbar. Am häufigsten erfolgte der Nachweis der nested PCR-Produkte. Konnten RT-PCR-Produkte nachgewiesen werden, so waren es in der Regel häufiger die Amplifikate des G-Gens. Nur in einem Fall (Herde Nr. 2 zum Zeitpunkt der Einstallung) wurde ein Produkt des P-Gens aber keins des G-Gens nachgewiesen. Zudem war in diesem Fall keine Subtypisierung aufgrund der nested PCRProdukte möglich. In manchen Fällen konnten zu den erwarteten auch noch zusätzliche PCR-Produkte nachgewiesen werden, zum einen auf der Höhe von ca. 200 bp aber auch von ca. 500 bp. In einer REA mit der Restriktionsendonuclease HincII konnten eindeutig aMPV-Produkte des G-Gens von nicht aMPV-Produkten unterschieden werden (Abb. 20). In Tabelle 10 sind die zu erwartenden Größen nach erfolgreichem Verdau entsprechender aMPV-Produkte aufgelistet. Die Sequenz der unverdauten, zusätzlichen Produkte konnten als Teile von Hühner-mRNA identifiziert werden. 55 Kapitel 4 Ergebnisse Tabelle 10. Größen der PCR-Produkte (G1+/G6- bzw. G8+A, G9+B/G5-, G5-b) nach Inkubation mit HincII. aMPV-Subtyp PCR-Produkt nach HincII Verdau aMPV A 441 bp 233 und 211 bp 268 bp 186 und 82 bp 444 bp 245 und 199 bp 361 bp 184 und 177 bp 450 bp 245, 151 und 48 bp 361 bp 184, 151 und 26 bp aMPV B Nemovac® A 450 bp 1a 1b M B 1a 1b 360 bp 180 bp 2a 2b 270 bp 190 bp 80 bp Abbildung 20. REA der PCR-Produkte mit HincII. (A) Auf Bahn 1 befindet sich das PCR-Produkt der Herde Nr. 11, Huhn 5, 5. Probenentnahme, das keine HincII-Schnittstelle besitzt. Die Sequenzanalyse des PCR-Produkts ergab Ähnlichkeiten mit Hühner-mRNA. (B) Die PCR-Produkte des Betriebs Nr. 4, 3. Probenentnahme, besitzen eine HincII-Schnittstelle. Bahn 1: Huhn 7; Bahn 2: Huhn 9; a: vor der Inkubation mit HincII; b: nach der Inkubation mit HincII. Die Sequenzanalysen der PCR-Produkte bestätigten aMPV-Subtyp B bzw. A. Um weitere Informationen über die detektierten aMPV-Genome zu gewinnen, wurde eine repräsentative Anzahl entsprechender Amplifikate mit Hilfe eines Gene Cleans aufgereinigt und sequenziert – ein kleiner Anteil wurde vorher kloniert. Von jeder positiven Probenenentnahme wurde mindestens ein PCR-Produkt analysiert. Insgesamt wurden 86 Amplifikate sequenziert: 13 der Größe 209 bp, 20 der Größe 450 bp, 31 der Größe 270 bp und 22 der Größe 350 bp. Drei PCR-Produkte der Größe 450 bp sowie neun der Größe 209 bp stellten sich als Teile von HühnermRNA heraus. 56 Kapitel 4 Ergebnisse Analyse der 209 bp-Amplifikate 4.7.1 13 PCR-Produkte der Größe 209 bp (Primerkombination P-s/P-as; Tab. 4, S. 26) wurden sequenziert und vier davon als Teile des P-Gens des aMPV identifiziert. Die vier aMPV-Produkte stammten aus drei verschiedenen Herden (Nr. 2, 10, 18), zwei dieser Produkte wurden in Herde 18 zum Zeitpunkt der Einstallung detektiert. Das Alignment der erhaltenen aMPV-Sequenzen mit den partiellen Sequenzen des P-Gens zweier aMPV-Stämme des Subtyps B (GenBank Zugangsnummern AM411375 und AF325443) bzw. des Impfstamms VCO3 (Terivac®, Gallimune 407®) zeigten eine Sequenzhomologie auf Nukleotidebene von 95,7% bis 99,5% und auf Aminosäureebene von 96,8% bis 100%. Dies entspricht einem bis acht Nukleotidaustauschen auf 188 nt (0,5-4,3%) (Abb. 21) und keinem bis zwei Aminosäureaustauschen auf 62 AS (0-3,2%) (Abb. 22). Die Produkte der betroffenen Herden unterschieden sich in nur wenigen Nukleotiden untereinander, die zwei Produkte der Herde 18 waren identisch. In den Herden 10 und 18 konnten zum gleichen Entnahmezeitpunkt neben den genannten PCR-Produkten des P-Gens auch Produkte des G-Gens detektiert und als Subtyp B identifiziert werden. In Herde 2 gelang zum Zeitpunkt der Einstallung mittels RT-PCR nur der Nachweis des P-Gens. Eine Differenzierung aufgrund des G-Gens konnte nicht erfolgen. Durch Alignment mit weiteren Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des P-Gens verschiedener Mitglieder des Genus Metapneumovirus konnten zwei phylogenetische Stammbäume erstellt werden. Die Nukleotidsequenzen aus den drei genannten Proben sind am nächsten verwandt mit den Sequenzen der Vertreter des aMPV-Subtyp B. Die aMPV-Subtyp A Isolate LAH (NAYLOR et al. 2004; Zugangsnummer AY640317), 8544 (CATELLI et al. 2006; Zugangsnummer DQ666911), CVL 14/1 und UK/3BV/85 (Ling et al. 1995; Zugangsnummer U22110) bilden einen separaten Ast. Weiter entfernt verwandt sind die Isolate des aMPV-Subtyp C. Der geringste Verwandtschaftsgrad konnte für das humane Metapneumovirus 97-83 (BIACCHESI et al. 2003; Zugangsnummer AY297749) festgestellt werden (Abb. 23). Die phylogenetischen Untersuchungen der Nukleotidsequenzen wurde durch die der Aminosäurensequenzen bestätigt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der drei genannten Proben waren wiederum am engsten mit den bereits genannten aMPV-Subtyp B Stämmen verwandt (Abb. 24). Die übrigen neun analysierten Amplifikate der Größe 209 bp zeigten keine Ähnlichkeit mit bekannten aMPV-Sequenzen, waren aber identisch mit Teilen des Gallus gallus Chromosoms. 57 Kapitel 4 Ergebnisse T G A A G A A A A G T T G A G C A T G A T A T T G G G G A T G T T A A A G A C C C T G A G C A T A G C C A C C G C A G G Majority 10 1 1 1 1 1 1 20 30 40 50 60 ............................................................ ............................................................ ............C............................................... ............................................................ A..G.....AC.C............................................... A..G.....AC.C............................................... 2-5-1 10-4-2 18-1-1 VCO3 (Terivac) 98103 (AM411375) 657-4 (AF325443) G C C A A C C G C A G C G A G A G A T G G A A T A C G T G A T G C A A T G G T G G G A G T T A G A G A A G A G T T G A T Majority 70 61 61 61 61 61 61 80 90 100 110 120 ............................................................ ..............................C............................. ..............................C............................. ............................................................ ............................................................ ............................................................ 2-5-1 10-4-2 18-1-1 VCO3 (Terivac) 98103 (AM411375) 657-4 (AF325443) C A A T A G C A T T A T G G C G G A A G C T A A A G G G A A G A T T G C A G A G A T G A T A A A G G A A G A A G A T G C Majority 130 140 150 160 170 180 121 . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . ACAGAGGG 2-5-1 10-4-2 18-1-1 VCO3 (Terivac) 98103 (AM411375) 657-4 (AF325443) Majority 181 . . . . . . . . 181 . . . . . . . . 181 . . . . . . . . 181 . . . . . . . . 181 . . . A . . . . 181 . . . . . . . . 2-5-1 10-4-2 18-1-1 VCO3 (Terivac) 98103 (AM411375) 657-4 (AF325443) Abbildung 21. Alignment der Nukleotidsequenzen der PCR-Produkte (P-s/P-as) der Betriebe 2, 10 und 18 und des Impfstoffes Terivac® mit aMPV-Subtyp-B-Sequenzen der GenBank Database: maximal acht Nukleotidaustausche (schwarze Pfeile) auf 188 nt konnten gefunden werden. Punkte: Übereinstimmung mit der Konsensussequenz. Zur Systematik der Probenbezeichnung s. 3.2.1, S. 27 . EEKLSMILGMLKTLSIATAGPTAARDGIRDAMVGVREELINSIMAEAKGKIAEMIKEEDAQR M a j o r i t y 10 1 1 1 1 1 1 20 30 40 50 60 .............................................................. .............................................................. ...F.......................................................... .............................................................. .............................................................. .....................................................I........ 2-5-1 10-4-2 18-1-1 VCO3 (Terivac) 98103 (CAL69599) 657-4 (AAG42500) Abbildung 22. Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Fragmente des P-Gens des aMPV-Subtyp B aus Abbildung 18. Lediglich zwei Aminosäureaustausche (schwarze Pfeile) zur Konsensussequenz sind auf 62 AS vorhanden. Punkte: Übereinstimmung mit der Konsensussequenz. Zur Systematik der Probenbezeichnung s. 3.2.1, S. 27. 58 Majorit 2-5-1 10-4-2 18-1-1 Terivac 98103 ( 657-4 ( Kapitel 4 Ergebnisse MN9 (AY028580) MN11 (AY028582) MN5 (AY028576) 15a (AY028569) MN10 (AY028581) MN6 (AY028577) MN4C (AY028575) MN4A (AY028573) MN4B (AY028574) MN8 (AY028579) MN7 (AY028578) Colorado (AF176591) MN1A (AY028569) MN1B (AY028570) MN12 (AF368174) MN2A (AY028571) MN2B (AY028572) PL-1 (EF199771) PL-2 (EF199772) 99350 (AM411376) B 10-4-2 B 18-1-1 VCO3 (Terivac) 657-4 (L34033) 98103 (AM411375) 2-5-1 * LAH (AY640317) CVL 14/1, UK/3BV/85 (U22110) 8544 (DQ666911) 97-83 (AY297749) 29.7 25 20 15 10 Nucleotide Substitutions (x100) 5 Subtyp C Subtyp B Subtyp A hMPV 0 Abbildung 23. Phylogenetischer Stammbaum der sequenzierten aMPV-Isolate basierend auf einem partiellen Nukleotidvergleich des P-Gens; graue Boxen: Sequenzen der Genbank Database. B: Betriebe 10 und 18 zeigten in den gleichen Hühnern zur selben Zeit Amplifikate des G-Gens eines aMPV-Subtyp B. *: Eine Differenzierung in Subtyp A oder B war an Hand von G-Gen-Amplifikaten im Betrieb 2 nicht möglich; hMPV: humanes Metapneumovirus. Zur Systematik der Probenbezeichnung s. 3.2.1, S. 27. 59 Kapitel 4 Ergebnisse MN-4A (AAK38407) Mn-4b (AAK38408) 15a (YP443844) Mn-1B (AAK38404) Mn-6 (AAK38411) Mn-12 (AAK54156) Mn-2A (AAK38405) Mn-9 (AAK38414) Mn-7 (AAK38412) PL-1 (ABO42287) PL-2 (ABO42296) Colorado (AAF05910) Mn-8 (AAK38413) Mn-1A (AAK38403) Mn-4c (AAK38409) Mn-11 (AAK38416) Mn-10 (AAK38415) Mn-2b (AAK38406) 99350 (CAL69600) (AAT58237) Mn-5 (AAK38410) 97-83 (AAQ67693) B 18-1-1 657-4 (AAG42500) Terivac VCO3 2-5-1 B 10-4-2 98103 (CAL69599) Nobilis TRT 211 (2115433A) CVL14-1 (AAA82751) LAH (AAT68644) * 15.4 14 12 10 8 6 4 Nucleotide Substitutions (x100) 2 Subtyp C hMPV Subtyp B Subtyp A 0 Abbildung 24. Phylogenetischer Stammbaum der sequenzierten aMPV-Isolate basierend auf einem Vergleich der abgeleiteten partiellen Aminosäuresequenzen des P-Gens; hMPV: humanes Metapenumovirus; graue Boxen: Sequenzen der Genbank Database. B: Betriebe 10 und 18 zeigten in den gleichen Hühnern zur selben Zeit Amplifikate des G-Gens eines aMPV-Subtyp B. *: Differenzierung in Subtyp A oder B war an Hand von G-GenAmplifikaten im Betrieb 2 nicht möglich. Zur Systematik der Probenbezeichnung s. 3.2.1, S. 27. 4.7.2 Analyse der PCR-Produkte des aMPV-Subtyp A 41 PCR-Produkte des aMPV-Subtyp A (10 mit der Primerkombination G1+/G6- und 31 mit der Primerkombination G8+A/G5-; Tab. 4, S. 26), die in den beteiligten Herden amplifiziert werden konnten, wurden sequenziert. Mit Ausnahme von vier PCR-Produkten sind die Sequenzen der übrigen Produkte untereinander und mit den kürzlich publizierten Sequenzen aus China, CHN-2763 (OWOADE et al. 2008; Zugangsnummer: AM778580) und CHN-663 (OWOADE et al. 2008; Zugangsnummer: AM778587), und aus Nigeria NI389 (OWOADE et al. 2008; Zugangsnummer: AM490059) identisch. Der amplifizierte Bereich ist hoch konserviert und zeigt auch zu den übrigen publizierten Sequenzen eine nahezu 100%ige Nukleotidübereinstimmung, vor allem in dem Bereich 60 Kapitel 4 Ergebnisse der kürzeren Amplifikate [G8+A/G5-] (Nukleotidpositionen 152 bis 419 in Anlehnung an die Nummerierung nach JUHASZ und EASTON 1994). Vier PCR-Produkte zeigten je einen Nukleotidaustausch zu den übrigen Produkten. Bei dem Austausch von drei Proben (16-2-2, 15-7-4, 17-4-1) handelte es sich um stille Mutationen, nur der Nukleotidaustausch der Probe 16-8-3 führte zu einem Aminosäureaustausch (Threonin zu Alanin) (Abb. 25). - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Majority 10 1 1 1 1 1 - - - - - - - - - - - 20 C C - T T - C A - G G - A A - T T - G G - G G - G G - G G - 30 T T - C C - C C - A A - A A - A A - C C - T T - A A - T T - 40 A A - T T - A A - T T - G G - G G - T T - T T - C C - A A - 50 G G - G G - G G - C C - A A - C C - C C - A A - G G - T T - 60 G G - C C - A A - T T - A A - T T - C C - A A - A A - 8-10-4 3-10-4 10-2-2 16-2-2 5-7-4 15-7-4 16-8-3 16-8-3 12-4-1 17-4-1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Majority 70 50 50 1 1 1 A A - C C - T T - G G - C C - A A - G G - T T - G G - G G - G G - 80 G G - T T - T T - C C - T T - G G - G G - C C - T T - G G - 90 G G - A A - C C - A A - T T - C C - G G - G G - G G - A A - 100 G G - G G - A A - G G - G G - T T - A A - C C - A A - T T - 110 A A - T T - T T - G G - G G - C C - T T - A A - T T - A A - 120 G G - T T - C C - C C - T T - A A - T T - C C - A A - 8-10-4 3-10-4 10-2-2 16-2-2 5-7-4 15-7-4 16-8-3 16-8-3 12-4-1 17-4-1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C A C T C A C T G T T A G C G T C A T A A T T G A A C A G Majority 130 110 G 110 G 1 1 1 - C C - T T - T T - T T - C C - G G - G G - G G - C C - T T - 140 G G - A A - C C - C C - T T - G G - C C - A A - C C - A A - 150 G G - T T - C C - A A - C C - T T - A A - T T - T T - G G - 160 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10-4 8-10-4 10-2-2 16-2-2 5-7-4 15-7-4 16-8-3 16-8-3 12-4-1 17-4-1 T C A G T G T T A G A G G A G T G C A G A A A C T A C A A T G G A G G A G A T A G A G A T T G G T G G T C A A C C A C C Majority 190 170 . 170 . 30 . 30 . 30 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . 240 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10-4 8-10-4 10-2-2 16-2-2 5-7-4 15-7-4 16-8-3 16-8-3 12-4-1 17-4-1 C A G G A G C A G C C A A C T A C T G C A C C A A G T G C G A C T C C A G C A G G A A A T T A T G G A G G A T T A C A A Majority 250 230 . 230 . 90 . 90 . 90 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 260 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300 . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10-4 8-10-4 10-2-2 16-2-2 5-7-4 15-7-4 16-8-3 16-8-3 12-4-1 17-4-1 A C G G C T C G A A C A A G A A A G T C T G A A A G C T G T T T G C A T G T G C A A A T T T C T T A T G G T G A T A T G Majority 310 290 . 290 . 150 . 150 . 150 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 330 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 340 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 360 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . TA TAGCCGC AGTGATACT GTAC TGG GTGG TTT TGA 370 350 . 350 . 210 . 210 . 210 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 380 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10-4 8-10-4 10-2-2 16-2-2 5-7-4 15-7-4 16-8-3 16-8-3 12-4-1 17-4-1 Majority 390 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8-10-4 3-10-4 16-2-2 10-2-2 5-7-4 15-7-4 16-8-3 16-8-3 12-4-1 17-4-1 Abbildung 25: Alignment der partiellen Nukleotidsequenzen der PCR-Produkte [G1+/G6- bzw. G8+A/G5-] der Betriebe 8, 15, 16 und 17. Im Vergleich zur Probe 8-10-4 (steht stellvertretend für die restlich analysierten Proben des Subtyps A) zeigen die Proben 16-2-2, 15-7-4, 16-8-3 und 17-4-1 je einen Nukleotidaustausch (schwarze Pfeile). Graue Box: Mutation, die zu einem Aminosäureaustausch geführt hat (Threonin zu Alanin); Punkte: Übereinstimmung mit der Konsensussequenz. Zur Systematik der Probenbezeichnung s. 3.2.1, S. 27. 61 Kapitel 4 Ergebnisse In 13 Herden (Nr. 1, 2, 4, 6-9, 11, 13-17) wurde der Subtyp A mindestens zu zwei Probenentnahmen nachgewiesen. In drei Herden (Nr. 15-17) konnten unterschiedliche Sequenzen zu verschiedenen Probenentnahmen nachgewiesen werden. In Herde 16 erfolgte der Nachweis von je zwei unterschiedlichen Sequenzen in zwei Entnahmen. In den übrigen zehn Herden wurden während der Legeperiode jeweils identische Sequenzen nachgewiesen. 4.7.3 Analyse der aMPV-Produkte des Subtyps B 29 PCR-Produkte des aMPV-Subtyp B (7 mit der Primerkombination G1+/G6- und 22 mit der Primerkombination G9+B/G5-; Tab. 4, S. 26), die in den beteiligten Herden amplifiziert werden konnten, wurden sequenziert. Es konnten nur wenige Austausche zu publizierten Sequenzen gefunden werden, wobei es sich zum Teil um stille Mutationen handelte. Teils konnten ähnliche bzw. übereinstimmende Sequenzen in unterschiedlichen Herden gefunden werden, teils zeigten die PCR-Produkte deutliche Unterschiede zu Produkten anderer Herden bzw. in einer Herde zwischen den Probenentnahmen. Von den 29 analysierten Produkten sind sechs, sieben bzw. neun Proben jeweils identisch (sechs Proben: Nr. 2-1-2, 4-7-3, 8-6-3, 8-2-3, 16-4-5, 16-7-5; sieben Proben: Nr. 1-6-5, 1-8-5, 1-10-5, 3-6-3, 6-5-1, 11-6-3, 14-7-5; neun Proben: Nr. 2-4-4, 4-7-4, 8-2-5, 10-6-2, 10-7-2, 10-2-3, 14-3-3, 18-1-1, 18-9-1). Sieben Produkte (Proben 4-3-1, 6-2-1, 7-5-5, 9-7-2, 16-1-2, 11-3-3, 12-5-4) zeigten deutliche Unterschiede untereinander, zu allen anderen Proben und den publizierten Sequenzen. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen folgender Proben sind identisch: Nr. 2-1-2, 4-7-3, 8-6-3, 8-2-3, 16-4-5, 16-7-5; Nr. 1-6-5, 1-8-5, 1-10-5, 3-6-3, 6-5-1, 11-6-3, 14-7-5. Die neun identischen Proben (Nr. 2-4-4, 4-7-4, 8-2-5, 10-6-2, 10-7-2, 10-2-3, 14-3-3, 18-1-1, 18-9-1) zeigen nur geringe Unterschiede zu folgenden Proben: Nr. 4-3-1, 6-2-1, 7-5-5, 9-7-2, 16-1-2, 11-3-3, 12-5-4. In Tabelle 11 bzw. 12 sind die Nukleotid- bzw. Aminosäureaustausche von ausgewählten Proben dargestellt, bei identischen Produkten wurde jeweils nur ein Vertreter der Gruppe abgebildet. Der Subtyp B konnte in sechs Herden (Nr. 2, 4, 8, 10, 14, 16) mehrmals während der Legeperiode nachgewiesen werden: in vier bzw. in zwei aufeinanderfolgenden Probenentnahmen in je einer Herde (Nr. 4 bzw. 10) und zu unterschiedlichen Zeiten in vier Herden (Nr. 2, 8, 14, 16). In acht Herden (Nr. 1, 3, 6, 7, 9, 11, 12, 18) wurde eine Infektion mit Subtyp B nur einmal über den gesamten Untersuchungszeitraum beobachtet. Der Vergleich der PCR-Produkte der gesamten Legeperiode einer Herde ergab deutlich unterschiedliche Sequenzen in den Herden, die zu verschiedenen Zeiten bzw. in vier aufeinanderfolgende Probenentnahmen positiv getestet wurden. Die Sequenzen der PCR-Produkte, die in zwei aufeinanderfolgenden Probenentnahmen detektiert wurden, waren identisch. In Herde 11 und in der geimpften Herde 6 wurden jeweils zwei 62 Kapitel 4 Ergebnisse unterschiedliche Sequenzen des Subtyps B in einer Probenentnahme nachgewiesen. In Herde 11 unterschieden sich die zwei analysierten PCR-Produkte in nur einem Nukleotid bzw. einer Aminosäure (Y/H). In Herde 6 waren zum Zeitpunkt der Einstallung die Sequenzen einer der PCRProdukte (Huhn 2) und die des Impfstoffes Nemovac® nahezu identisch (Abb. 26). Es konnte nur ein Nukleotidaustausch auf 384 nt festgestellt werden, der zu einem Aminosäureaustausch von Arginin gegen Glycin führte (Tab. 12). Das zweite analysierte PCR-Produkt (Huhn 5) der Herde 6 unterschied sich zum Teil deutlich von den Sequenzen der Impfstoffstämme PL-21 (Nemovac®) oder VCO3 (Gallimune® 407 ND+IB+EDS+ART und Terivac®). Das Alignment ergab eine Homologie auf Nukleotidebene von 93,3% bzw. 99,1% und auf Aminosäureebene von 92% bzw. 98,2%. Dies entspricht 21 bzw. drei Nukleotidaustauschen auf 334 nt im Vergleich zu PL-21 (Nemovac®) bzw. VCO3 (Gallimune® 407 ND+IB+EDS+ART und Terivac®) (Abb. 26) und von neun bzw. zwei Aminosäureaustauschen auf 112 AS (vgl. identische Probe 3-6-3 Tab. 12). In einer anderen geimpften Herde (Nr. 7) wurde zum Zeitpunkt der Ausstallung ein Subtyp B nachgewiesen, dessen Sequenz sich ebenfalls von den Sequenzen der Impfstoffe Nemovac® bzw. Gallimune® 407 ND+IB+EDS+ART unterscheidet (Abb. 26). Das Alignment ergab eine Homologie auf Nukleotidebene von 92,8% bzw. 99,4% und auf Aminosäureebene von 91% bzw. 98,2%. Dies entspricht 24 bzw. zwei Nukleotidaustauschen auf 334 nt im Vergleich zu PL-21 (Nemovac®) bzw. VCO3 (Gallimune® 407 ND+IB+EDS+ART und Terivac®) (Abb. 26) und von zehn bzw. zwei Aminosäureaustauschen auf 112 AS (Tab. 12). 63 Kapitel 4 Ergebnisse Tabelle 11. Nukleotidaustausche des G-Gens ausgewählter aMPV-Subtyp B der GenBank Database und der Proben. 74 91 106 121 122 172 192 207 216 221 240 258 264 1708-02 (AY728268) A A G AT G G C G A A T A 872 S (L34034) A C A GC G A T G A A T A 2119 (L34031) A C G GC G A T G A A T A 6574 (L34033) A C G GC G A T G A A T A Terivac [VCO3] A A A GC G A T G A A T A Nemovac [PL-21] A A G GC G A T A A A C A 3-6-3 A A G GC G A T A A A T A 4-3-1 C A A GC G A T G A A T A 6-2-1 A A G GC G A T A A A C A 7-5-5 A A A GC G A T G A A T A 8-2-5 A A G GC G A T T A A T G 9-7-2 A A A GC G A T G A A T A 11-3-3 A A G GC G A T A A A T A 12-5-4 C A A GC G A T G A G T A 16-1-2 A A A GC A A T G G A T A 16-4-5 A A A GC G A T G A A T A 269 284 291 292 298 299 302 322 323 324 328 331 337 1708-02 (AY728268) A A T A TT A TT T A T T 872 S (L34034) G A T A TT A TT T A T T 2119 (L34031) A A T A TT A TT T A T T 6574 (L34033) G A T A TT A TT T A T T Terivac [VCO3] G A T A TT A TT T A T T Nemovac [PL-21] A A C G CC A CC C A C T 3-6-3 A A T A TT A TT T A T T 4-3-1 G A T A TT A TT T A T T 6-2-1 A A C A CC A CC C A C T 7-5-5 G A T G TT A TT T A T T 8-2-5 A A T A TT A TT T G T T 9-7-2 G A T A TT G TT T A T T 11-3-3 A A T A TT A TT T A T C 12-5-4 G G T A TT A TT T A T T 16-1-2 G A T A TT A TT T A T T 16-4-5 G A T A TT A TT T A T T Isolat Isolat Position Position Alignment der nt 62 bis 337 in Anlehnung an die Nummerierung nach JUHASZ und EASTON (1994); graue Boxen: stille Mutationen; in runden Klammern: GenBank Database Nummern; in eckigen Klammern: Stammbezeichnungen. Zur Systematik der Probenbezeichnung s. 3.2.1, S. 27. 64 Kapitel 4 Ergebnisse Tabelle 12. Aminosäureaustausche des Glykoproteins ausgewählter aMPV-Subtyp B der GenBank Database und der Proben. 20 26 31 36 53 69 85 90 93 85 96 103 1708-02 (AY728268) Q K R I V N D K R L Q F 872 S (L34034) Q Q G A V N G K R L Q F 2119 (L34031) Q Q R A V N D K R L Q F 6574 (L34033) Q Q R A V N G K R L Q F Terivac [VCO3] Q K G A V N G K R L Q F Nemovac [PL-21] Q K R A V N D K G P Q P 3-6-3 Q K R A V N D K R L Q F 4-3-1 P K G A V N G K R L Q F 6-2-1 Q K R A V N D K R P Q P 7-5-5 Q K G A V N G K G L Q F 8-2-5 Q K R A V N D K R L Q F 9-7-2 Q K G A V N G K R L R F 11-3-3 Q K R A V N D K R L Q F 12-5-4 P K G A V N G R R L Q F 16-1-2 Q K G A I S G K R L Q F 16-4-5 Q K G A V N G K R L Q F 105 106 108 109 111/ 112 121 123 129 130 132/ 133 135 136 1708-02 (AY728268) S C Y V VV Y V C L LL L C 872 S (L34034) S C Y V VV Y V C L LL L C 2119 (L34031) S C Y V VV Y V C L LL L C 6574 (L34033) S C Y V VV Y V C L LL L C Terivac [VCO3] S C Y V VV Y V C L LL L C Nemovac [PL-21] S R Y A AA H A R P PP P R 3-6-3 S C Y V VV Y V n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 4-3-1 S C Y V VV Y V n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 6-2-1 S R Y A AA H A R P PP P R 7-5-5 S C Y V VV Y V n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 8-2-5 G C Y V VV Y V n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 9-7-2 S C Y V VV Y V n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 11-3-3 S C H V VV Y V n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 12-5-4 S C Y V VV Y V n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 16-1-2 S C Y V VV Y V C L LL L n.d. 16-4-5 S C Y V VV Y V n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Isolat Isolat Position Position Alignment der abgeleiteten Aminosäuren 17 bis 136 in Anlehnung an die Nummerierung nach JUHASZ und EASTON (1994); in runden Klammern: GenBank Database Nummern; in eckigen Klammern: Stammbezeichnungen; n.d. nicht analysiert. Zur Systematik der Probenbezeichnung s. 3.2.1, S. 27. 65 Kapitel 4 Ergebnisse T A G T C C T C A A G C A A G T C C T C A G A A G G A G C A A A A A A A T A C T G T T A G G A C T G G T G T T A T C A G Majority 10 1 1 1 1 1 . . . . . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 . . . . . . . . . . . . . . . A . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . VCO3 PL-21 6-2-1 6-5-1 7-5-5 C C T T A G G C T T G A C G C T C A C T A G C A C T A T T G T T A T A T C T A T T T G T A T T A G T G T A G A A C A G G Majority 70 61 61 61 61 61 . . . . . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . VCO3 PL-21 6-2-1 6-5-1 7-5-5 T C A A A T T A C G A C A G T G T G T G G A C A C T T A T T G G G C A G A A A A T G G A T C C T T A C A T C C A G G A C Majority 130 121 . 121 . 121 . 121 . 121 . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 . . . . . . . . . . . . . . . G . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . VCO3 PL-21 6-2-1 6-5-1 7-5-5 A G T C A A C A G A A A A T A C T T C A A C A A G A G A T A A G A C T A C A A C A A A A G A C C C T A G A A G A T T A C Majority 190 181 . 181 . 181 . 181 . 181 . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210 .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . G . . . . . . . . . . . . . . . 220 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230 . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C . . . G . . G 240 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C . . .. C. C. .. .. . . . . . VCO3 PL-21 6-2-1 6-5-1 7-5-5 A G G C G A C T G G A G C A G G A A A G T T T G A G A G C T G T G G G T A T G T G C A A G T T G T T G A T G G T G A T A Majority 250 241 . 241 . 241 . 241 . 241 . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 260 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C . . 270 .. CC CC .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C . . . . . . . 280 . . . . . . . . . . . . . . . TGCATGATCGCAGTTATGCTGTACTGGGTGGTGT 310 301 . 301 . 301 . 301 . 301 . . . . . . . . . . . .. .. .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 . . . . . . . . . . . C C . . . C C . . . . . . . . C C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C . . . . . . . . C C . . . . . . . 290 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C . . . C C . . . . . . . . C C . . . C C . . . . . . . 300 . . . . . . C C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .C .C .. .. . . . . . VCO3 PL-21 6-2-1 6-5-1 7-5-5 Majority 330 .. C. C. .. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VCO3 PL-21 6-2-1 6-5-1 7-5-5 Abbildung 26. Alignment der partiellen Nukleotidsequenzen der PCR-Produkte (G1+/G6-) der geimpften Betriebe 6 und 7, der Impfstoffe Terivac® [VCO3] und Nemovac® [PL-21]. Dargestellt sind die Nukleotidpositionen 62 bis 396 in Anlehnung an die Nummerierung nach JUHASZ und EASTON (1994). Schwarze Pfeile: Nukleotidaustausche; graue Kästchen: stille Mutationen; Punkte: Übereinstimmung mit der Konsensussequenz. Zur Systematik der Probenbezeichnung s. 3.2.1, S. 27. 66 Kapitel 4 4.8 Ergebnisse PCR-Ergebnisse unter Einbeziehung des Alters der Legehennen Anzahl 12 der Herden Einstallung 2. PE 10 3. PE 8 4. PE 6 5. PE 4 2 0 16 17 18 19 29 30 31 32 33 43 44 45 46 54 56 57 59 61 64 65 66 67 69 70 71 72 73 Lebenswoche Abbildung 27. Alter der Legehennenherden zu den einzelnen Probenentnahmen; PE: Probenentnahme. Zur Einstallung waren die Herden 16 bis 19 Wochen alt (Abb. 27). Ein Zusammenhang zwischen Probenentnahme mit entsprechendem Alter und PCR-Befund ist statistisch nicht erkennbar. Am häufigsten gelang der aMPV-Nachweis zur dritten Probenentnahme (entspr. 43.-46. LW) mit 13 positiven Herden, am seltensten zur Ausstallung (64.-73. LW) mit sechs positive Herden. Zu den übrigen Terminen wurden zwischen sieben und zehn Herden aMPV-RNA positiv getestet (Abb. 28). Anzahl der Herden positiv aMPV negativ aMPV 20 18 16 14 12 5 7 7 10 8 6 4 9 10 1. Legemonat 4. Legemonat 9 10 7 6 10. Legemonat Ausstallung 13 2 0 7. Legemonat Abbildung 28. Positive Herden in Abhängigkeit von dem Alter der Herden. 67 Alter der Herden Kapitel 4 4.9 Ergebnisse PCR-Ergebnisse unter Einbeziehung der Jahreszeit Das aMPV-Genom wurde in den Sommermonaten (Juni bis August) signifikant seltener nachgewiesen (Abb. 29): 15 von 38 negativen Probengruppen (39%) wurden im Sommer gefunden (p = 0,031). Am häufigsten gelang der aMPV-Genomnachweis im Herbst (September bis November): 17 von insgesamt 46 positiven Probenentnahmen (37%) wurden zu dieser Jahreszeit gefunden (p = 0,031). Anzahl der Herden positiv aMPV negativ aMPV 25 * * 20 6 8 15 9 15 10 17 12 5 * p = 0,031 11 5 0 Frühjahr (März-Mai) Sommer (Juni-August) Herbst (SeptemberNovember) Winter (DezemberFebruar) Jahreszeit Abbildung 29. PCR-Ergebnisse der Herden in Abhängigkeit der Jahreszeit. 4.10 PCR-Ergebnisse unter Einbeziehung der Haltungsform Das aMPV-Genom wurde am häufigsten in der Freilandhaltung gefunden (18 von 45 positiven Befunden: 40%), gefolgt von der Käfighaltung (33%) und der Bodenhaltung (27%). Statistisch ist kein Zusammenhang zwischen dem Vorkommen des aMPV-Genoms und der Haltungsform erkennbar: ca. 50-60% der untersuchten Probengruppen je Haltungsform waren aMPV-positiv (Abb. 30). Anzahl der Herden positiv aM PV negativ aM PV 100% 80% 44% 54% 40% 60% 40% 20% 56% 46% 60% 0% Käfighaltung Bodenhaltung Freilandhaltung Haltungsform Abbildung 30. PCR-Ergebnisse der Herden (prozentual) in Abhängigkeit von der Haltungsform. 68 Kapitel 4 Ergebnisse 4.11 Antikörper-Nachweis gegen aMPV 4.11.1 Vergleich zweier kommerzieller ELISAs Während der gesamten Studie wurden in den beteiligten Herden 870 Serumproben entnommen und zunächst mit dem kommerziellen ELISA-Kit der Firma IDEXX analysiert. Obwohl in manchen Herden in mehreren Probenentnahmen aMPV-Genom nachgewiesen werden konnte, verlief jedoch der Antikörpernachweis in diesen Betrieben in den darauffolgenden Probenentnahmen teilweise negativ oder mit nur einer geringen Nachweisrate. Daher wurde zur Überprüfung der Ergebnisse ein zweiter kommerzieller ELISA-Test der Firma BioChek verwendet. Der ELISA-Test von IDEXX teilt die Ergebnisse in positiv und negativ ein, der Test von BioChek hat zusätzlich die Kategorie fraglich. 711 Ergebnisse (82%) waren identisch in beiden Tests. 159 Ergebnisse (18%) wichen voneinander ab: 86 Serumproben (10%) wurden mit dem BioChek-Test fraglich getestet; in 76 dieser Fälle bewertete das IDEXX-System den Test als negativ und in zehn Fällen als positiv; 73 Serumproben (8%) ergaben konträre Ergebnisse (negativ/positiv) (Tab. 13). Tabelle 13. Vergleich der Ergebnisse zweier aMPV-ELISAs im Bezug auf Einzelproben. Ergebnisse der Serumproben abweichend identisch Testsystem IDEXX + - + - - + BioChek + - - + ? ? 461 (53%) 250 (29%) 11 (1%) 62 (7%) 76 (9%) 10 (1%) Anzahl der Proben Gesamtanzahl 711 (82%) 159 (18%) +: positiv; -: negativ; ?: fraglich. Wenn eine Herde als aMPV-positiv angesehen wird, sobald mindestens eine Serumprobe pro Herde und Probenentnahme positiv getestet wurde, dann wurden 61 von 87 Probenentnahmen (70%) mit beiden Tests identisch analysiert. Die Ergebnisse von 26 Probenentnahmen (30%) wichen voneinander ab: neun Probenentnahmen (10%) wurden mit dem Test der Firma BioChek fraglich getestet, in fünf dieser Fälle bewertete das IDEXX-System den Test als negativ und in vier Fällen als positiv. 17 Probenentnahmen (20%) ergaben mit beiden Tests konträre Ergebnisse (negativ/positiv) (Tab. 14). In den geimpften Herden wurden zu allen Entnahmen mit beiden ELISA-Tests aMPV-Antikörper nachgewiesen. 69 Kapitel 4 Ergebnisse Tabelle 14. Vergleich der Ergebnisse zweier aMPV-ELISA-Test im Bezug auf die Probenentnahmen. Ergebnisse identisch Testsystem abweichend IDEXX + - + - - + BioChek + - - + ? ? 58 (67%) 3 (3%) 0 (0%) 17 (19,5%) 5 (6%) 4 (4,5%) Anzahl der Probenentnahmen Gesamtanzahl 61 (70%) 26 (30%) +: positiv; -: negativ; ?: fraglich. 4.11.2 Antikörperstatus zum Zeitpunkt der Einstallung Am Tag der Einstallung wurden acht Herden (Nr. 1, 5, 6, 7, 9, 13, 16, 18) positiv und eine Herde (Nr. 8) negativ mit beiden ELISA-Tests auf aMPV-Antikörper getestet. Drei Herden (Nr. 11, 12, 15) zeigten mit beiden Test konträre Ergebnisse. Die übrigen sechs Herden wurden fraglich mit dem BioChek-System getestet, in drei Fällen (Herden Nr. 2, 4, 10) verlief der IDEXX-Test positiv und in drei Fällen (Herden Nr. 3, 14, 17) negativ. Vergleicht man die PCR-Ergebnisse mit den ELISA-Ergebnissen zum Zeitpunkt der Einstallung so konnte in insgesamt 14 Herden aMPV-RNA und/oder mit beiden ELISA-Tests aMPV-spezifische Antikörper nachgewiesen werden. In vier Herden (Nr. 1, 5, 9, 16) wurden keine aMPV-RNA aber aMPV-Antikörper (mit beiden Tests) und in zehn Herden (Nr. 2, 4, 6, 7, 11, 13, 14, 15, 17, 18) wurden aMPV-RNA und teilweise auch zusätzlich aMPV-Antikörper mit beiden ELISA-Tests (Herden Nr. 6, 7, 13, 18) detektiert. In den übrigen vier Herden verlief die nested RTPCR negativ zu diesem Zeitpunkt. In einer dieser Herden wurden keine aMPV-spezifischen Antikörper nachgewiesen und in drei Herden (Nr. 3, 10, 12) zeigten die Tests unterschiedliche Ergebnisse: zwei Herden wurden mit dem BioChek-Test fraglich getestet, der IDEXX-Test verlief jeweils in einer Herde als positiv bzw. negativ. Eine Herde wurde mittels IDEXX-System als negativ und mittels BioChek-System als positiv bewertet (Tab. 9, S. 52f). In den geimpften Herden wurden mit beiden Tests Antikörper nachgewiesen, die PCR verlief in Herde 5 negativ und in den anderen beiden Herden (Nr. 6 und 7) jeweils positiv. 4.11.3 Antikörpernachweis während der Legeperiode Mit Hilfe des IDEXX ELISAs konnten in allen Herden mit Ausnahme der Herde 12 mindestens zu einer Probenentnahme aMPV-spezifische Antikörper nachgewiesen werden. Der BioChek-Test wies dagegen in allen Herden Antikörper nach; in Herde 12 konnte er bei keinen bis 70 Kapitel 4 Ergebnisse wenigen Tieren Antikörper detektieren. Zum Teil wurden fragliche Ergebnisse beobachtet (Tab. 9, S. 52f). Alle geimpften Herden waren während der gesamten Beprobung serologisch positiv, der mittlere S/P Quotient stieg in diesen Herden ab der ersten Probenentnahme an und fiel zur letzten Entnahme wieder leicht ab (Anhang C, S. 120). In acht der 15 ungeimpften Herden konnten ab einer bestimmten Probenentnahme bis zur Ausstallung bei 10/10 Tieren Antikörper detektiert werden. In drei Herden (Nr. 9, 13, 16) konnte dies ab der ersten Probenentnahme beobachtet werden. In den Herden 9 und 16 fiel der mittlere S/P-Quotient bis zur letzten Probenentnahme leicht ab, in Herde 13 stieg er zunächst und fiel dann ebenfalls leicht ab. In vier Herden (Nr. 1, 4, 14, 18) wurden Antikörper zunächst bei nur wenigen, in Herde 14 zu den ersten Probenentnahmen trotz Genomnachweises sogar bei keinen der beprobten Tiere nachgewiesen. Ein bzw. zwei Probenentnahmen später waren dann alle untersuchten Tiere serologisch positiv. Der mittlere S/P-Quotient stieg in diesen Herden bis zu der Probenentnahme, bei der 10/10 Tiere positiv waren und blieb dann ungefähr gleich in den Herden 1 und 4 bzw. stieg an in der Herde 18 und fiel leicht ab in der Herde 14. In Herde 3 konnten zusammen mit dem Genom-Nachweis ab der 3. Probenentnahme Antikörper nachgewiesen werden, der mittlere S/P-Quotient stieg in diesem Fall bis zur Ausstallung. In den übrigen sieben ungeimpften Herden konnten bei nur wenigen und zu manchen Probenentnahmen auch bei keinen der beprobten Hühner aMPV-spezifische Antikörper nachgewiesen werden. In sechs Herden (Nr. 2, 8, 10, 11, 15, 17) erfolgte dies trotz mehrfachen Genom-Nachweises. In diesen Betrieben zeigte der BioChek-Test in der Regel mehr positive Tiere an als der IDEXX-Test. Der BioChek-Test detektierte in Herde 10 bei teilweise 4/10 Hühnern Antikörper, der IDEXX-Test wies nur bei der Einstallung in einem Huhn Antikörper nach, in den darauffolgenden Probenentnahmen war der Betrieb serologisch negativ. In Herde 15 waren mittels BioChek-Test teilweise 7/10 Hühner serologisch positiv, mittels IDEXX-Test maximal 2/10 Hühner. In Herde 12 war der IDEXX-Test immer negativ, der BioChek-Test wies wenige positive Hühner nach; aMPV-Genom wurde in diesem Fall erst zur Ausstallung detektiert. 4.12 Wirtschaftliche Parameter Um beurteilen zu können, ob eine aMPV-Infektion einen Einfluss auf die Legleistung oder die Abgänge hatte, wurden diese Parameter in den Zeiträumen sieben Wochen vor bzw. nach einer Probenentnahme mit den entsprechenden PCR-Ergebnissen verglichen. 71 Kapitel 4 Ergebnisse Klinische Befunde 4.12.1 Klinische Bilder wie respiratorische Symptome oder fehlende Legetätigkeit konnten sowohl in den mittels PCR negativ als auch positiv getesteten Tieren vereinzelt beobachtet werden (Anhang C, S. 120). Zentralnervöse Symptome wurden nicht gesehen. Ein Zusammenhang zwischen den klinischen Befunden (Herden- oder Einzeltieruntersuchung) und positiven PCR-Befunden ist nicht erkennbar. 4.12.2 Legeleistung In allen Herden konnte bis zur Ausstallung mindestens einmal ein Abfall der wöchentlichen Legeleistung um mehr als 2% verzeichnet werden (Anhang C, S. 120). Der maximale Abfall der Legeleistung betrug 11% in einer Woche (Herde Nr. 5, 13) und die niedrigste Legeleistung während der gesamten Legeperiode 59% (Herde Nr. 16). Bei 21 PCR-positiven Probenentnahmen war sieben Wochen vor bzw. nach deren Entnahmezeitpunkt ein Rückgang der Legeleistung zu beobachten, jedoch auch bei 22 PCR-negativen. Eine normal verlaufende Legekurve in den entsprechenden Zeiträumen war bei 21 PCR-positiven und 14 PCR-negativen Probeentnahmen festzustellen. Statistisch ist kein Zusammenhang – auch im Hinblick auf die Subtypen – zwischen einer aMPVInfektion und der Legeleistung zu erkennen (Abb. 31). Abfall der Legeleistung Anzahl der Probenentnahmen 25 kein Abfall der Legeleistung 20 15 10 22 21 21 14 5 11 11 0 aM PV negativ aM PV positiv Subtyp A 3 6 7 4 Subtyp B Subtyp A und B PCRBefund Abbildung 31. Abfall der Legeleistung um mehr als 2% sieben Wochen vor bzw. nach einer Probenentnahme unter Einbeziehung des PCR-Befundes. 72 Kapitel 4 Ergebnisse Abgänge 4.12.3 Ein Anstieg in der wöchentlichen Mortalitätsrate um mehr als 0,2% konnte in neun der 18 Herden beobachtet werden (Anhang C, S. 120). Bei 17 PCR-positiven Probenentnahmen war sieben Wochen vor bzw. nach deren Entnahmezeitpunkt ein Anstieg der wöchentlichen Abgänge zu beobachten, jedoch auch bei zehn PCR-negativen. 11 dieser 17 positiven Probenentnahmen zeigten eine Monoinfektion mit Subtyp A, eine Entnahme zeigte eine Monoinfektion mit Subtyp B und fünf Entnahmen eine Doppelinfektion mit beiden Subtypen. Eine zu erwartende Mortalitätsrate in den entsprechenden Zeiträumen war bei 28 PCR-positiven und 23 PCR-negativen Probeentnahmen festzustellen. Zwölf der 28 positiven Probenentnahmen zeigten eine Monoinfektion mit Subtyp A, neun eine Monoinfektion mit Subtyp B und sieben eine Doppelinfektion mit beiden Subtypen. Statistisch ist kein Zusammenhang zwischen Mortalitätsrate und einer aMPV-Infektion zu erkennen (Abb. 32). Anzahl der Probenentnahmen 30 Anstieg der M ortalitätsrate kein Anstieg der M ortalitätsrate 25 20 15 23 10 5 10 28 17 11 12 0 aM PV negativ aM PV positiv Subtyp A 1 9 5 7 Subtyp B Subtyp A und B PCRBefund Abbildung 32. Anstieg der Mortalitätsrate vor bzw. nach einer Probenentnahme unter Einbeziehung des PCRBefundes. 73 Kapitel 5 5 Diskussion Diskussion Legleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger sind daher weit verbreitet. Dies gilt auch für das aviäre Metapneumovirus, welches seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt ist. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, erstmals Legehennenherden alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifische Antikörper zu untersuchen, um so Rückschlüsse auf die Verbreitung und Bedeutung des Virus für die Leghennenbetriebe zu erhalten. Mit der angewandten PCR konnten nicht nur die aMPV-Subtypen A und B detektiert und differenziert werden, sondern mittels einer internen Kontrolle ebenfalls auch andere Subtypen nachgewiesen werden. Die Sequenzen der nachgewiesenen aMPV-RNA wurden analysiert. Da jede einzelne Tupfer- und Serumprobe separat untersucht wurde, konnte außerdem das Huhn der Probe und dem Infektionsstatus und auftretenden Symptomen zugeordnet werden. Um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können, wurden verschiedene Haltungssysteme berücksichtigt. 5.1 Kritische Betrachtung der Methodik 5.1.1 PCR Am Anfang der geplanten epidemiologischen Untersuchung in Sachsen stand die Entwicklung einer nested RT-PCR für den aMPV-Nachweis. Diese hatte zusätzlich die Aufgabe, zwischen den Subtypen A und B zu unterscheiden und evtl. andere Subtypen bzw. Stämme zu detektieren. Da das Vorkommen der Subtypen sich stetig ändern kann, wurde auch der Subtyp C berücksichtigt. Bis 1999 wurde vermutet, dass der Subtyp C nicht in Europa vorkommt. TOQUIN et al. (1999a) konnten jedoch erstmalig in Frankreich aus Moschusenten ein dem Subtyp C ähnliches Virus isolieren. Durch Sequenzanalysen konnte es diesem auch später zugeordnet werden (TOQUIN et al. 2006). Dies zeigt, dass es durchaus sinnvoll ist, nach allen bekannten Subtypen in Europa zu suchen. Jedoch könnten mit der falschen Primerwahl bestimmte Stämme und Subtypen unentdeckt bleiben. Anhand der bekannten Nukleotidsequenzen des P-Gens der aMPV-Subtypen wurden zwei Primer entwickelt, die den Anforderungen gerecht werden sollten, möglichst viele Subtypen und Stämme detektieren zu können. Diese wurden zusammen mit publizierten Primern (NAYLOR et al. 74 Kapitel 5 Diskussion 1997; CAVANAGH et al. 1999), die eine Unterscheidung der Subtypen A und B in einer nested PCR erlauben, in einer duplex nested RT-PCR angewandt. Die duplex RT-PCR detektiert die Gene, die für das P- und G-Protein kodieren und diente zum allgemeinen Nachweis des aMPV. Das PCRProdukt des G-Gens wurde, wie bei NAYLOR et al. (1997) und CAVANAGH et al. (1999) beschrieben, mittels der nested PCR subtypisiert. Um das PCR-Produkt des P-Gens einem aMPVSubtyp zuordnen zu können, musste immer eine Sequenzanalyse folgen. Mit der entwickelten duplex nested RT-PCR konnten erfolgreich alle drei zu erwartenden Banden bei dem Nachweis der Impfstoff-Stämme BUT 1#8544 (Subtyp A; Nobilis® TRT) und VCO3 (Subtyp B; Terivac®) beobachtet werden. Der Impfstoff-Stamm PL-21 (Nemovac®) hatte überraschenderweise Sequenzunterschiede an der Bindungsstelle des Primer G5-, so dass das nested PCR-Produkt nicht amplifiziert werden konnte. CAVANAGH et al. (1999) verwendeten in der Evaluierung ihrer PCR ebenfalls den Impfstoff Nemovac®, berichteten aber in ihrer Sequenzanalyse nicht von diesen Problemen. Laut ihrer Studie zeigte der Nemovac®-Stamm v.a. im F-Gen deutliche Unterschiede zu Feldviren gleichen Subtyps. Die PCR von Nemovac® wurde in unserer Studie mehrmals wiederholt und analysiert – mit jeweils gleichem Ergebnis. Ob es sich evtl. um einen anderen Impfstamm in der Studie von CAVANAGH et al. (1999) handelte oder ob evtl. verschiedene Stämme in einem Impfstoff von Nemovac® vorhanden waren, ist nicht nachzuvollziehen. Da unsere Ergebnisse immer wieder rekonstruiert werden konnten, wurde ein neuer Primer (G5-B) zur Detektion von Nemovac®-ähnlichen Stämmen konstruiert. So konnten die drei zu erwartenden Banden auch bei dem Impfstamm PL-21 (Nemovac®) mittels modifizierter duplex nested RT-PCR nachgewiesen werden. Wie zu erwarten, konnten in der Sensitivitätsstudie schon wenige Genomäquivalente der Subtypen A und B nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze des G-Gen-Amplifikats war bei allen untersuchten Stämmen identisch und in der RT-PCR bei zwei Stämmen empfindlicher als die des P-Gen-Amplifikats. Dies würde auch erklären, warum in der Feldstudie ein PCR-Produkt des PGens nicht immer nachgewiesen werden konnte, obwohl zur gleichen Zeit Produkte des G-Gens detektiert wurden. Evtl. liegen aber auch deutliche Sequenzunterschiede der nachgewiesenen Feldstämme am P-Gen vor, so dass die Primer nicht oder nur schlecht binden konnten. Die nested PCR war, wie in anderen Studien (CAVANAGH et al. 1999; HESS et al. 2004a) schon beschrieben, weitaus sensitiver als die RT-PCR allein. Daher konnten in der Feldstudie sehr häufig keine Amplifikate mittels RT-PCR, aber entsprechende Produkte mittels nested PCR nachgewiesen werden. Die PCR ist eine sehr schnell durchzuführende und sehr sensitive Methode, jedoch ist die Kontamination mit Produkten vorangegangener PCRs eine große und reelle Gefahr (COOK und 75 Kapitel 5 Diskussion CAVANAGH 2002). Um falsch positive Ergebnisse auszuschließen, wurden zum einen bei allen Proben Negativkontrollen mitgeführt. Zum anderen wurden modifizierte Positivkontrollen konstruiert, die aufgrund des Größenunterschieds eindeutig von positiven Feldproben unterschieden werden konnten. In der Feldstudie konnten in der Gel-Elektrophorese öfters Banden gesehen werden, die die zu erwartenden Größen der PCR-Produkte hatten. Im Falle der Amplifikate der Größe 210 bp erfolgte eine Analyse nur über eine Sequenzierung, die Amplifikate der Größe 450, 350 und 270 bp wurden zusätzlich mittels REA analysiert, wobei ein Teil nicht verdaut werden konnte. In einer Sequenzanalyse stellten letztere sich nicht als aMPV, sondern als Teile von Hühner-mRNA heraus. Gleiches gilt für die Mehrzahl der PCR-Produkte der Größe 210 bp. NAYLOR et al. (1997) und CAVANAGH et al. (1999) verwendeten in ihrer PCR nur die Primer für das G-Gen und berichteten nicht von diesem Problem. Es ist daher davon auszugehen, dass aufgrund des zusätzlich verwendeten Primerpaares [P-s/P-as] es entweder zu unspezifischen Anlagerungen von Primern oder zu Fehlamplifikaten kam. Ohne weitere Analysen wäre es daher zu einigen falsch positiven Ergebnissen gekommen. Sollte diese PCR erneut eingesetzt werden, sind die PCR-Produkte der Größe 210 bp immer zu sequenzieren und die Produkte der Größe 440, 350 und 270 bp mindestens mittels REA zu überprüfen, um falsch positive Ergebnisse herauszufiltern. In der vorliegenden Studie erfolgte eine REA mit dem Restriktionsenzym HincII, da eine Überprüfung der Genbank Database zeigte, dass alle zu der Zeit (2003) vorhandenen Stämme der Subtypen A und B mit diesem Enzym verdaut werden können. Neuere Analysen widerlegen dies aber. AMPV-Isolate aus Brasilien können nicht verdaut werden. Vom heutigen Standpunkt aus ist daher von dieser Methode alleine abzuraten. Zur eindeutigen Zuordnung des aMPV-Isolats müsste eine adäquate REA durchgeführt werden oder eine Sequenzanalyse folgen. Da es nicht praktikabel ist, die Sequenz von jedem PCR-Produkt zu analysieren, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, ist die verwendete PCR daher nur unter Vorbehalt anzuwenden. Da mit der verwendeten PCR jedoch ein neuer Stamm mittels P-Primer detektiert werden konnte, sollten evtl. die P-Primer allein in einer RT-PCR mit anschließender Sequenzierung angewandt werden. Die aufgetretenen Probleme bestätigen die Aussage von COOK und CAVANAGH (2002), dass es sehr schwer ist, eine RT-PCR zu generieren, die alle bekannten und evtl. neue Subtypen bzw. Stämme detektieren kann. Da die Subtypen C und D erst in den letzten zehn Jahren klassifiziert wurden, ist nicht auszuschließen, dass in Zukunft weitere Subtypen auftreten, die nicht durch die etablierte RT-PCR detektiert werden können. Um gezielt neue Subtypen nachzuweisen, ist es wichtig, unterschiedliche Methoden, wie z.B. Antikörper-Nachweis, Virusisolierung und RT-PCR miteinander zu kombinieren, v.a. wenn eine Methode ungewöhnliche Ergebnisse, wie z.B. sehr niedrige Antikörpertiter im ELISA liefert. 76 Kapitel 5 Diskussion In jedem Fall sollte man sich nicht auf eine einzige Methode verlassen (COOK und CAVANAGH 2002). 5.1.2 ELISA Nach bisherigen Studien konnte das aMPV-Genom mindestens vier Wochen nach einer Infektion detektiert werden (HESS et al. 2004a; WENZEL und HAFEZ 2002). Über einen Nachweis über drei Monate gibt es jedoch keinen Hinweis. Da die Herden aus Kostengründen nur alle drei Monate beprobt wurden, hätte es also vorkommen können, dass eine Probe kurz vor einer aMPV-Infektion entnommen wurde und drei Monate später mittels PCR übersehen worden wäre. Daher wurde zusätzlich die serologische Untersuchung mittels ELISA hinzugezogen. Der ELISATest diente somit zur Absicherung des Nachweises von aMPV-Kontakt. Kürzere Probenentnahmezeitpunkte (z.B. alle 2-3 Wochen) wären notwendig gewesen, um anhand des Anstieges oder Abfalls des OD-Wertes den Infektionszeitpunkt zu ermitteln. Dies war aber aus Kostengründen nicht möglich. Zunächst wurde der kommerzielle ELISA-Test von IDEXX verwendet, der laut Hersteller die Subtypen A-C detektieren soll. Da jedoch in manchen Herden trotz vorangegangener positiver PCR-Ergebnisse nur ein geringer oder sogar kein AntikörperNachweis möglich war, wurde zur Absicherung ein zweiter kommerzieller ELISA-Test der Firma BioChek verwendet. Beide Test sollen laut Hersteller die Subtypen A bis C nachweisen können. Während der gesamten Studie wurden 867 Serumproben gewonnen und mit zwei kommerziellen ELISA Kits mit zum Teil konträren Ergebnissen analysiert. Es konnten mehr Proben mit dem BioChek-Test positiv bzw. fraglich getestet werden als mit dem IDEXX-System. Dies war v.a. der Fall, wenn trotz mehrfachen Genom-Nachweises nur wenige der untersuchten Tiere Antikörper aufwiesen. Die Diskrepanz beider Tests könnte auf erhebliche Unterschiede bezüglich Spezifität und/oder Sensitivität weisen. Die Wahl des aMPV-Stamms, welcher als Antigen in einem ELISA verwendet wird, scheint von entscheidender Bedeutung zu sein, sonst kann es entsprechend zu falsch negativen Ergebnissen kommen (BAXTER-JONES et al. 1987; HAFEZ 1991, 1992; ETERRADOSSI et al. 1992, 1995). Dies ist von praktischer Relevanz, da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur auf den Ergebnissen kommerzieller ELISAs basiert. Zur Evaluierung des kommerziellen ELISA-Tests mit der höchsten Sensitivität und Spezifität sind weitere Untersuchungen nötig. Eine weitere mögliche Ursache für einen Antikörpernachweis bei nur wenigen der beprobten Tiere kann die gleichzeitige Impfung gegen ND oder IB sein. Diese können zu einer verminderten Replikationsfähigkeit von aMPV und somit zu einer verminderten serologischen Antwort führen (CAVANAGH et al. 1999; COOK et al. 2001; GANAPTHY et al. 2005, 2006, 2007; TARPEY et 77 Kapitel 5 Diskussion al. 2007). Zehn Herden wurden während der Legeperiode gegen IB geimpft, vier Herden zusätzlich gegen ND. Drei dieser Herden hatten zusätzlich einen aMPV-Impfschutz. Vier bzw. drei Herden mit wenigen serologisch positiven Tieren wurden bzw. wurden nicht zusätzlich während der Legeperiode geimpft. In weiteren drei Herden, die mehrmals IB- bzw. ND-Vakzine während der Legeperiode erhalten hatten, konnten bei allen Tieren aMPV-spezifische Antikörper nachgewiesen werden. Somit kann der Einfluss der IB- bzw. ND-Impfung auf die serologische Antwort auf aMPV nicht ausgeschlossen, aber auch nicht bestätigt werden. Zusätzliche Faktoren wie der allgemeine Gesundheitszustand der Herden, Management, Wahl des Probezeitpunkts nach einer Infektion, Immunantwort der Tiere, die schlechte Replikation mancher aMPV-Stämme und der generelle Unterschied in der Empfänglichkeit der verschiedenen Wirtsspezies können das serologische Ergebnis beeinflussen. Weitere Untersuchungen zu geringen serologischen Antworten sind notwendig. COOK und CAVANAGH (2002) weisen andererseits daraufhin, dass ungewöhnliche Ergebnisse der ELISA-Tests, wie z.B. nur schwach positive Befunde, immer hinterfragt werden sollten, da evtl. ein neuer Stamm oder Subtyp die Ursache für einen geringen Antikörpertiter mit herkömmlichen ELISA-Tests sein kann. In der Feldstudie wurde mit hoher Wahrscheinlichkeit ein neuer Stamm mittels P-Primer entdeckt, der mit der PCR nach CAVANAGH et al. (1999) unentdeckt geblieben wäre. Wenn man die konträren Ergebnisse der zwei ELISA-Tests in Betracht zieht, ist es möglich, dass mit der verwendeten PCR bestimmte Stämme oder gar andere Subtypen nicht nachgewiesen werden konnten. Möglich ist aber auch, dass es sich in den PCR-positiven Fällen bereits um neue Stämme oder Varianten handelte, da in den meisten Herden mit wenig serologisch positiven Tieren ein häufiger Genom-Nachweis erfolgte und die Nukleotidsequenzen einiger dieser Isolate sich deutlich von den publizierten Stämmen unterschieden. 5.2 Verbreitung des aviären Metapneumovirus (aMPV) in Legehennenbetrieben Über die Gesamtdauer der Studie erwiesen sich alle Herden mindestens einmal als aMPV- infiziert (100%), d.h., das Virus kam bei Legehennen häufiger vor als zunächst angenommen bzw. in früheren Studien gezeigt wurde: HAARLÄNDER (2005) konnte in fünf von acht (62%) Legehennenherden aMPV-Genom nachweisen. Während in serologischen Untersuchungen von ARNS und HAFEZ (1992) in Brasilien nur 50% der Herden positiv waren, lag der Anteil der positiven Herden bei COOK et al. (1988) bei 82% und bei WEMMER (1993) bei 78%. Im Gegensatz zu der vorliegenden Studie erfolgten diese Untersuchungen allerdings nur einmalig und mit einem geringeren Stichprobenumfang. Langzeit-Feldstudien existieren nur für Broiler: CAVANAGH et al. (1999) konnten in sieben von 13 untersuchten Broilerherden (54%) FeldaMPV-RNA und in weiteren sechs Herden Impfstoff (Nemovac®)-ähnliche RNA nachweisen. 78 Kapitel 5 Diskussion Bei der vorliegenden Studie ist auch zu beachten, dass keine der beteiligten Herden bei allen Probenentnahmen positiv getestet wurde. Die hohe Präsenz des Virus ergab sich erst aus der Verlaufsuntersuchung. Je Probeentnahmezeitpunkt lag die Nachweisrate des aMPV-Genoms zwischen 38 und 72% der Herden, die der aMPV-Antikörper in ungeimpften Herden mittels IDEXX-System zwischen 53 und 85%. Das BioChek-System verzeichnete bei 53 bis 100% der Herden positive Ergebnisse und bei 6-33% zusätzlich fragliche Ergebnisse. Die Ergebnisse der PCR und des IDEXX-Tests ähneln denen der oben genannten Studien. Der BioChek-Test zeigte, wie oben schon erwähnt, mehr positive und fragliche Ergebnisse. Es ist daher anzunehmen, dass eine geringere Präsenz des Virus während der Nutzungsperiode je nach ELISA vorgetäuscht werden kann, wenn eine Herde nur einmalig untersucht wird. Um den Infektionsstatus der Herden vor Beginn der Legeperiode bestimmen zu können, wurden die erste Probenentnahmen zum Zeitpunkt der Einstallung (16.-18.LW) durchgeführt. Für die Auswertung wurden sowohl das PCR-Ergebnis als auch die beiden ELISA-Tests hinzugezogen. Bei positiven ELISA-Ergebnissen zum Zeitpunkt der Einstallung ist nicht davon auszugehen, dass es sich um maternale Antikörper handelte. WEMMER (1993) konnte bei Broilerküken nachweisen, dass die maternalen Antikörper bis zur 4. Lebenswoche absinken und danach nicht mehr vorhanden sind. In der vorliegenden Studie ist nur bei einer Herde eindeutig davon auszugehen, dass in der Aufzuchtphase keine aMPV-Infektion vorlag, da am Tag der Einstallung beide ELISA-Tests und die PCR negative Ergebnisse brachten. Bei drei Herden ist der Infektionsstatus unklar, da die Ergebnisse beider ELISA Systeme unterschiedlich ausfielen und gleichzeitig kein aMPV-Genom nachgewiesen werden konnte. Eine geimpfte Herde zeigte nur Antikörper, aber kein aMPV-Genom. Obwohl zu vermuten ist, dass der Antikörpertiter auf die erfolgten Impfungen zurückzuführen ist, ist eine vorausgegangene Infektion jedoch nicht auszuschließen. Demgegenüber haben sich sehr wahrscheinlich 13 Herden mit aMPV während der Aufzuchtphase zu unterschiedlichen Zeitpunkten infiziert. Eine aMPV ungeimpfte Herde zeigte nur Antikörper mit beiden ELISA-Tests, jedoch kein aMPV-Genom, d.h. die Infektion ereignete sich vor längerer Zeit (> 4 Wochen), so dass das Virus sehr wahrscheinlich bereits aus der Herde eliminiert worden war. Zwei weitere ungeimpfte Herden, zeigten mit beiden Tests Antikörper, der PCR-Nachweis konnte aber wegen unsachgemäßer Lagerung nicht durchgeführt werden. Es kann also keine Aussage getroffen werden, ob das Virus bereits aus der Herde eliminiert war. In zehn Herden gelang der aMPV-Genomnachweis, d.h. diese Herden befanden sich entweder im Stadium einer akuten Infektion, in der sich das Virus gerade ausbreitete (keine Antikörper nachweisbar) bzw. vom Immunsystem bekämpft wurde (Antikörper nachweisbar), oder die Tiere waren chronische aMPV-Träger. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um den genauen Infektionszeitpunkt während der Aufzuchtphase zu bestimmen. Die 79 Kapitel 5 Diskussion vorliegende Studie ist die erste Untersuchung dieser Art bei Legehennen, bisher existierte nur eine Langzeit-Feldstudie bei Broilern (CAVANAGH et al. 1999). Der Nachweis des Feldvirus erfolgte in dieser Studie in der Regel ab dem 35. Lebenstag, die des Impfstamms 1-3 Wochen nach Gabe des Subtyp B-Impfstoffes. PELETEIRO (1991) kam zu dem Schluss, dass Legehennenherden v.a. kurz vor dem Produktionsbeginn und in der Zeit der Leistungsspitze mit einer aMPV-Infektion betroffen zu sein scheinen. Mit unserer Studie kann bestätigt werden, dass die meisten beteiligten Herden vor Beginn der Legetätigkeit mindestens einen aMPV-Kontakt hatten; sehr wahrscheinlich gab es in vielen Herden aber noch weitere während der Legeperiode. In dieser Zeit konnten aMPVGenom und/oder aMPV-spezifische Antikörper über mehrere Probenentnahmen verteilt nachgewiesen werden. Da der Genomnachweis allein nur den aMPV-Kontakt nachweist und die Entnahmezeitpunkte relativ weit auseinander liegen, ist eine genauere Aussage über die Infektionszeitpunkte nicht möglich. Aufgrund der hohen Nachweisrate während der Legeperiode scheint es sich entweder um eine hohe Persistenz des Virus bzw. regelmäßige Reinfektionen oder wiederkehrende Neuinfektionen mit aMPV zu handeln. Bei Broilerelterntieren wurden bereits bis zu zwei Reinfektionen innerhalb einer Nutzungsperiode beschrieben (PROUS 1984). Die genaue Dauer der Persistenz des Virus ist noch unbekannt. Untersuchungen von NAGARAJA et al. (2001) zeigten jedoch, dass das Virus bei Puten bis zu sechs Wochen in einem Stall persistieren kann. HESS et al. (2004a) konnte Subtyp B Virus in ungeimpften Legehennen mindestens vier Wochen (Ende der Studie) mittels PCR nachweisen. In der vorliegenden Studie konnten identische Sequenzen eines Subtyps in zwei Probenentnahmen hintereinander nachgewiesen werden. Sollte es sich in diesen Fällen um die selben Stämme handeln, könnte die Dauer der Persistenz sogar länger als bisher angenommen sein, da die Probenentnahmen ca. zwölf Wochen auseinander lagen. Leider wurde nur ein kleiner Genomabschnitt des aMPV in dieser Studie analysiert, so dass keine endgültige Aussage über die Länge der Persistenz des Virus getroffen werden kann. Als gesichert gilt jedoch, dass die nachgewiesenen unterschiedliche Sequenzen und Subtypen auf Neuinfektionen hinweisen. Es konnten auch Doppelinfektionen mit mindestens zwei aMPV-Stämmen zur gleichen Zeit nachgewiesen werden, da in einer Probenentnahme zwei verschiedene Sequenzen eines Subtyps detektiert wurden. 5.3 Vorherrschende Subtypen Die Nachweisgrenzen der G-Gen-Amplifikate der Subtypen A und B waren in der Sensitivitätsstudie identisch, sodass unsere Ergebnisse der Feldstudie das Vorkommen der Subtypen A und B in den Betrieben wiederspiegeln sollten. Sollten die Subtypen unterschiedlich lange und vor allem länger als drei Monate im Stall persistieren, so könnte dies die Aussage über die 80 Kapitel 5 Diskussion Dominanz der Subtypen verfälschen. Im folgenden wird davon ausgegangen, dass die Ergebnisse das Vorkommen wiederspiegeln. Mit einer Nachweisrate von 51% war der Subtyp A der am häufigsten vorkommende Subtyp in den sächsischen Legehennenbeständen. Die Dominanz des Subtyps A bei Puten in Deutschland in den 80er Jahren wurde bereits beschrieben (HAFEZ et al. 2000). HAARLÄNDER konnte 2005 ebenfalls eine Dominanz des Subtyps A bei Legehennen feststellen. Die Nachweisrate von Subtyp B betrug 22% in der vorliegenden Studie. Dieser Befund widerlegt das Ergebnis von HAARLÄNDER (2005), die in ihren Untersuchungen diesen Subtyp nur in einer Doppelinfektion, aber nicht ausschließlich bei Legehennen nachweisen konnte. Die Häufigkeit von Doppelinfektionen in sächsischen Legehennenherden lag bei 27%. Doppelinfektionen wurden erstmals von HAARLÄNDER (2005) in Putenbeständen nachgewiesen. Einen Wechsel von Subtypen in der Population hat es jedoch schon früher in England, Belgien oder Israel gegeben (NAYLOR et al. 1997; VAN de ZANDE et al. 1998; BANET-NOACH et al. 2005). In England war Ende der 90er Jahre bei Broilern der Subtyp B vorherrschend. In LangzeitFeldstudien konnte Subtyp A in keiner der 13 untersuchten Broilerherden detektiert werden (CAVANAGH et al. 1999). Die unterschiedliche Dominanz der Subtypen auf dem europäischen Festland und England könnte ein geographisches Phänomen sein oder eine Verschiebung der Subtypen bedeuten. Letzteres könnte eine Folge der durchgeführten Impfungen sein. So wird in Deutschland häufig die Subtyp B-Vakzine eingesetzt. In der vorliegenden Studie konnte zu einer Probenentnahme in der RT-PCR ein P-GenProdukt, aber kein G-Gen-Produkt nachgewiesen werden. Eine Subtypisierung mittels nested PCR war nicht möglich und die kommerziellen ELISA-Tests lieferten unterschiedliche Ergebnisse zu diesem Zeitpunkt. Das Vorhandensein dieses PCR-Produkts nur mittels P-Primer weist entweder auf einen anderen Subtyp als A oder B hin, oder dass es sich um einen Stamm des Subtyps A oder B mit Nukleotidunterschieden an den Primerbindungsstellen handelt. Da auf Nukleotidebene eine hohe Übereinstimmung zu anderen Subtyp B Stämmen besteht und die abgeleitete Aminosäuresequenz identisch mit anderen Subtyp B Stämmen ist, ist davon auszugehen, dass es sich bei dem detektierten P-Gen-Produkt um Produkt eines aMPV-Subtyp B handelte. Das bedeutet, dass wahrscheinlich im G-Gen dieses aMPV-Stamms deutliche Sequenzunterschiede an den Primerbindungsstellen bestehen und somit kein G-Gen-Produkt mit den verwendeten Primer amplifiziert werden konnte. Dies bestätigt die Aussage von COOK and CAVANAGH (2002), dass die Strategie der RT-PCR u.a. mitentscheidend sein kann, aMPV und evtl. neue Subtypen oder Stämme nachzuweisen. Das heißt, dass evtl. mehrere Subtypen oder Varianten des aMPV vorhanden sein können, aber nicht nachgewiesen werden, wenn nur eine RT-PCR und evtl. nur eine 81 Kapitel 5 Diskussion speziesspezifische PCR zur Detektion von aMPV eingesetzt werden sollte. Es kann daher spekuliert werden, dass evtl. noch mehr aMPV-Stämme in den beteiligten Betrieben vorhanden gewesen wären, aber nur die bekannten Stämme detektiert wurden. Der Nachweis des P-Gen-Amplifikats ohne den gleichzeitigen Nachweis eines G-Gen-Amplifikats unterstützt diese Hypothese. Vorausgesetzt, das oben erwähnte P-Gen-Produkt ist ein PCR-Produkt eines aMPV-Subtyp B, konnten nur die Subtypen A und B in dieser Studie nachgewiesen werden. Dies entspricht der aktuellen Situation bei Hühnern, da der Subtyp C in Europa bisher nur in Enten (TOQUIN et al. 1999a, 2006) und der Subtyp D bisher nur zweimal bei Puten in Frankreich (BÄYON-AUBOYER et al. 2000) nachgewiesen wurde. 5.4 AMPV-Nachweis in aMPV-geimpften Betrieben Drei der 18 Herden wurden während der Aufzuchtphase gegen aMPV geimpft. Zwischen den Subtypen A und B besteht eine Kreuzimmunität (COOK et al. 1995, 1996, 1999, 2000; ETERRADOSSI et al. 1995; TOQUIN et al. 1996, 1999b), so dass ein Impfstoff (Subtyp A oder B) bei entsprechend durchgeführtem Impfprogramm vor einer Infektion mit beiden Subtypen schützen sollte. Obwohl die Tiere geimpft waren, konnte auch in diesen Herden das aMPV-Genom nachgewiesen werden, was zeigt, dass die Impfung nicht vor einer Infektion schützt. War es in der Herde 5 nur ein einmaliger Nachweis des Subtyps A, so gelang in der Herde 6 der Nachweis dieses Genoms mit Ausnahme einer Probenentnahme während der gesamten Legeperiode. Diese Herde wurde bereits mit einer Doppelinfektion eingestallt – sowohl Feldviren des Subtyps A und Subtyps B als auch ein dem Subtyp B-Impfstamm ähnliches Virus konnten detektiert werden. Zu den späteren Zeitpunkten war nur noch der Subtyp A nachweisbar. Sollte es sich bei dem häufig nachgewiesenen Subtyp A um ein entsprechend lang persistierendes Virus handeln, würde dies der Annahme von HESS et al. (2004a) widersprechen, dass eine aMPV-Impfung effektiv gegen eine Virusausscheidung schützt. In der Herde 7 wurde eine Monoinfektion mit Subtyp A zum Zeitpunkt der Einstallung, jedoch eine Doppelinfektion zum Zeitpunkt der Ausstallung nachgewiesen. Bei dem nachgewiesenen Subtyp B handelt es sich um ein Feldvirus. So ist anzunehmen, dass das angewandte Impfprogramm gut gegen eine Zirkulierung des Subtyps B schützt, es aber in zwei Herden eine Infektion mit diesem Subtyp nicht verhindern konnte. Vor einer heterologen Infektion mit Subtyp A und dessen Zirkulation scheint dieses Impfprogramm in allen drei Herden nicht zu schützen. Untersuchungen bei Puten haben ebenfalls einen unvollständigen Infektionsschutz vor einer heterologen Infektion nachgewiesen (HAARLÄNDER 2005; VAN DE ZANDE et al. 2000). Bisher konnte Subtyp B-Lebendimpfvirus bei Hühnern für mindestens 14 Tagen nach Applikation nachgewiesen werden (GANAPATHY und JONES 2007). Es ist zu bemerken, dass im 82 Kapitel 5 Diskussion Feld Impfviren oft länger nachgewiesen werden können als unter experimentellen Bedingungen. So konnte Subtyp B-Impfvirus bis zu fünf Wochen nach einer Impfung im Feld detektiert werden (NAYLOR et al. 2002). CAVANAGH et al. (1999) gelang der erste Impfvirusnachweis erst 1-3 Wochen nach Applikation des Impfstoffes. In der vorliegenden Studie konnte in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung ein dem Impfstamm ähnliches Virus nachgewiesen werden. Es zeigte im Vergleich zu dem Impfstamm der Vakzine Nemovac® ein Nukleotidaustausch, der zu einem Aminosäureaustausch (Glycin gegen Arginin) führte. Es kann sich demnach möglicherweise um ein Impfvirus handeln, welches sich veränderte und persistierte. Da jedoch ein nur sehr kurzer Abschnitt des aMPV-Genoms analysiert und verglichen werden konnte, kann nicht mit Sicherheit davon ausgegangen werden, dass es sich hierbei um einen mutierten Nemovac®-Impfstamm gehandelt hat. Eine lange Persistenz und Veränderung der Virulenz wurde jedoch bereits bei einem Subtyp A-Impfstoff beschrieben (CATELLI et al. 2006). Weiterführende Untersuchungen sind nötig, um zu zeigen, dass die nachgewiesene Mutation zu einer Virulenzveränderung geführt hat. 5.5 AMPV in unterschiedlichen Haltungsformen Um das Infektionsrisiko in Beständen mit unterschiedlichem seuchenhygienischem Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können, wurden verschiedene Haltungssysteme untersucht. Statistisch konnte kein Unterschied in der Nachweisrate des aMPV-Genoms festgestellt werden. Dies widerspricht der Annahme, dass in der Freilandhaltung das höchste und in der Käfighaltung das geringste Infektionsrisiko vorliegt. In diesen Haltungsformen wurden ungefähr gleich viele positive (15-18) und negative (12) Probenentnahmen verzeichnet. Überraschenderweise wurden die meisten negativen Befunde (14) in den Herden mit Bodenhaltung beobachtet. Dies lässt vermuten, dass das Risiko eines aMPV-Kontakts in allen drei Haltungsformen nahezu gleich ist. Dies ist die erste epidemiologische Studie, in der Herden unter Berücksichtigung der Haltungsform in regelmäßigen Abständen während der gesamten Legeperiode mittels PCR und ELISA auf aMPV untersucht wurden. Für eine statistisch gesicherte Abklärung dieser Annahme sind jedoch weitere Studien, mit einer höheren Herdenzahl und kürzeren Entnahmezeitpunkten, nötig. 5.6 Jahreszeitliche Schwankungen Da in den Sommermonaten statistisch weniger Virus nachgewiesen wurde, ist davon auszugehen, dass zu diesem Zeitpunkt ein geringerer Infektionsdruck herrschte. Eine mögliche Ursache dafür sind die entsprechend hohen Temperaturen im Sommer, welche zu einer schnelleren Inaktivierung des Virus führen können. In 83 früheren Untersuchungen konnte eine Kapitel 5 Diskussion Hitzeempfindlichkeit des aMPV demonstriert werden. Bei Raumtemperatur bleibt es nur zwei Wochen stabil und wird bei 56°C innerhalb von 30 min inaktiviert (COLLINS et al. 1986; GIRAUD et al. 1986a; HAFEZ und WEILAND 1990). In den Herbstmonaten wurde deutlich mehr Virus detektiert; der Infektionsdruck scheint daher zu dieser Zeit am höchsten zu sein. In den USA konnte ebenfalls eine saisonale Häufung von aMPV-Infektionen beobachtet werden. Im Frühling (April, Mai) sowie im Herbst (Oktober bis Dezember) stieg die Anzahl der infizierten Herden an (SHIN et al. 2002c; GOYAL et al. 2003). 5.7 Wirtschaftliche Bedeutung des aMPV Ein Zusammenhang zwischen Klinik, Legeleistung, Abgängen und aMPV-Infektionen konnte nicht hergestellt werden. Nur in einem Huhn mit einem positiven PCR-Befund konnten die klassischen Symptome des Swollen Head Syndromes beobachtet werden. Da in der vorliegenden epidemiologischen Feldstudie beobachtete Symptome nicht differentialdiagnostisch abgeklärt wurden, ist das berichtete Ergebnis kritisch zu betrachten. Zeitgleiche Infektionen mit anderen Erregern können die Klinik einer aMPV-Infektion verstärken (COOK et al. 1991; NAYLOR et al. 1992; KHEHRA und JONES 1999; JIRJIS et al. 2004). In zwei Herden wurden im Vorbericht Probleme mit E. coli erwähnt. Entsprechende Symptome und Auswirkungen auf Abgänge und Legeleistung wurden beobachtet. Mit einer Ausnahme erfolgte in allen untersuchten Herden zeitgleich der Nachweis von Mycoplasma synoviae. Obwohl E. coli nachgewiesen wurden, wurde keine stärkere Klinik, wie z.B. auch ZNS-Symptome, beobachtet. In dieser Studie wurden in relativ großen Abständen Herden- und Einzeltiergesundheit dokumentiert und Proben gewonnen. Die Inkubationszeit des aMPV liegt bei ca. 3-7 Tagen (JONES et al. 1987; COOK et al. 2000; HESS et al. 2004a), gefolgt von einer Krankheitsdauer von ca. sieben Tagen bei Leghennen (COOK et al. 2000; HESS et al. 2004a) bzw. 1-3 Wochen bei Broilern bzw. Broilerelterntieren (MORLEY und THOMSON 1984; O`BRIEN 1985). Es ist bei der Beurteilung der Herden- bzw. Einzeltiergesundheit daher wichtig zu klären, ob es sich bei der nachgewiesenen Infektion um eine akute handelt. Dies ist aber mittels PCR nicht möglich, da mit dieser Methode nicht lebendes Virus nachgewiesen wird und daher keine Aussage über den Zeitpunkt der Infektion zulässt (COOK 2000a). Die Betriebe wurden zwar aufgefordert, klinische Symptome zu dokumentieren und zu melden, jedoch sind die Ergebnisse kritisch zu betrachten, da sie nicht unabhängig überprüft wurden. Das vermeintliche Fehlen einer Klinik kann daher auch versehentlich vorgetäuscht werden. Des Weiteren wiesen COOK et al. (1988) darauf hin, dass eine aMPV-Infektion bei Hühnern trotz spezifischer Immunantwort nicht immer mit klinischer Symptomatik verbunden sein muss (COOK et al. 1988). Unsere Ergebnisse würden dies bestätigen. 84 Kapitel 5 Diskussion Auch wird beschrieben, dass eine Reinfektion in der Regel mit einem Titeranstieg ohne klinische Erscheinungen verbunden ist. Unabhängig von der Klinik konnten in Seren von Elterntier-, Broiler-, Legehennen- und Perlhuhnherden aMPV-spezifische Antikörper festgestellt werden (PICAULT et al. 1987a, b; COOK et al. 1988; PATTISON et al. 1989). Legeleistungseinbrüche assoziiert mit aMPV-Infektionen wurden mehrmals im Feld beobachtet (O`BRIEN 1985; PATTISON et al. 1989; HAFEZ 1993). Experimentell konnten diese aber bisher nur durch intravenöse Belastungsinfektionsversuche ausgelöst werden (COOK et al. 2000; HESS et al. 2004a; SUGIYAMA et al. 2006). Eine wichtige Rolle scheint die Art des die Infektion auslösenden aMPV-Stamms für das Auftreten klinischer Symptome zu spielen. So wird angenommen, dass Puten-Isolate keine respiratorischen Symptome in Broilern oder Legehühnern hervorrufen (BUYS et al. 1989a). Auch scheinen verschiedene aMPV-Stämme einen unterschiedlichen Tropismus bei Puten und Hühnern zu haben (COOK et al. 1993b). Des Weiteren sind evtl. die unterschiedlichen Zuchtlinien nicht gleich empfänglich für aMPV, so dass es zu ungleicher Ausprägung der Klinik kommt (COOK et al. 2000). So vermuten diese Autoren, dass der leichte Legetyp evtl. eine höhere Resistenz gegen aMPV besitzt als die schwereren Rassen. Für das klinische Auftreten des SHS wurde neben der Rolle des aMPV weiteren Faktoren großes Gewicht beigemessen (COOK 2000a). Es ist nicht auszuschließen, dass dies auch für das Auftreten von Legeleistungseinbußen und den möglichen Symptomen infolge einer aMPVInfektion bei Legehennen gilt. In unseren Studien konnten wir trotz aMPV-Infektion die besten Legeleistungen und die wenigsten Abgänge in den Herden mit bestem Management beobachten. Dagegen verzeichneten die Herden mit schlechtem Management hohe Abgänge und schlechte Legeleistung, unabhängig von einer aMPV-Infektion. Differentialdiagnosen wurden jedoch nicht abgeklärt. Statistisch ist kein Zusammenhang zwischen einer aMPV-Infektion, klinischen Symptomen und der Legeleistung hergestellt worden, aber auszuschließen ist dieser trotzdem nicht. Das Management spielt eine entscheidende Rolle, ob Infektionen zu klinischen Symptomen führen können. 5.8 Schlussbetrachtung und zukünftige Fragestellungen Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit kann zusammenfassend festgestellt werden, dass das aMPV in den Legehennenbetrieben weit verbreitet ist. Die Übertragungswege und der Infektionszeitpunkt während der Aufzucht sind noch nicht geklärt und bedürfen weiterer, umfassender epidemiologischer Untersuchungen sowie Vergleiche der Virusisolate verschiedener Länder. Weiterhin zeigt die Arbeit deutlich die Möglichkeiten und Grenzen der RT-PCR in der 85 Kapitel 5 Diskussion Virusdiagnostik. Die PCR ist einerseits eine sehr schnelle und sensitive Methode; durch die Wahl falscher Primer können aber andererseits bestimmte Stämme und Subtypen übersehen werden. Auch ist die Kontaminationsgefahr nicht zu unterschätzen und entsprechende Vorsichtsmaßnahmen sind zu treffen. In Zukunft sollte ein großes Augenmerk auf die Entwicklung sogenannter Breitspektrum aMPV-PCRs, die möglichst viele aMPV-Subtypen und Stämme erfassen kann, und neuer speziesspezifischer PCRs gelegt werden, um keine falsch negativen Ergebnisse zu erhalten. Der Vergleich der üblicherweise verwendeten kommerziellen ELISA-Tests zeigte deutlich, dass mit diesem Verfahren innerhalb kurzer Zeit eine große Probenzahl untersucht werden kann, und die Ergebnisse einen guten Überblick über zurückliegende Infektionen liefern können. Eine Aussage über den aktuellen Status kann jedoch mit dieser Methode nicht getroffen werden. Aufgrund der konträren Ergebnisse wurde deutlich, dass beide Tests im Vergleich schwer zu interpretieren sind. Die Spezifität und Sensitivität der kommerziellen Tests sollten daher v.a. im Hinblick auf neue aMPV-Stämme oder Subtypen evaluiert werden. Obwohl es viele Beobachtungen zu den klinischen Erscheinungen und der wirtschaftlichen Bedeutung von aMPV-Infektionen gibt, konnten diese anhand dieser Studie nicht eindeutig reproduziert werden. Weitere epidemiologische Untersuchungen, v.a. im Vergleich der Empfänglichkeit der verschiedenen Legehennenzuchtlinien, der unterschiedlichen aMPV-Stämme und der Bedeutung von zusätzlichen Faktoren für die Ausbildung klinischer Symptome sind notwendig. Da trotz Impfung mehrfach aMPV-Subtyp A Infektionen nachgewiesen werden konnten, sind geeignete Impfschemata zu erstellen und die Wirksamkeit zu überprüfen. Weiterhin ist die Notwendigkeit einer aMPV-Impfung generell zu eruieren. 86 Kapitel 6 6 Zusammenfassung Zusammenfassung Nemecek, Britt Vorkommen aviärer Metapneumoviren in sächsischen Legehennenbeständen während der Legeperiode Klinik für Vögel und Reptilien und Institut für Virologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2011 90 Seiten, 32 Abbildungen, 14 Tabellen, 198 Literaturangaben, drei Anhänge Schlüsselwörter: aviäres Metapneumovirus, Legehennen, duplex nested RT-PCR, ELISA Legeleistungseinbußen – vor allem mit verminderter Eischalenqualität – stellen in einem Legehennenbetrieb hohe wirtschaftliche Verluste dar. Impfungen gegen entsprechende Erreger, u.a. gegen das aviäre Metapneumovirus (aMPV), sind daher weit verbreitet. AMPV ist seit den 70er Jahren als Auslöser der Rhinotracheitis der Puten (Turkey Rhinotracheitis; TRT) und des sogenannten Swollen Head Syndroms (SHS) der Hühner bekannt. Jedoch liegen nur wenige epidemiologische Studien zu der Verbreitung des Virus und dessen Subtypen in Legehennenbetrieben vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Verbreitung des aMPV, vor allem der Subtypen A und B, zu unterschiedlichen Zeiten der Legeperiode zu untersuchen, um ein besseres Verständnis über den Zeitpunkt der Erstinfektionen sowie evtl. Re- oder Neuinfektionen zu erhalten. Dafür wurden erstmals 18 Legehennenherden in Sachsen alle drei Monate über die gesamte Legeperiode auf das Vorkommen von aMPV-RNA und aMPV-spezifischer Antikörper untersucht. Verschiedene Haltungssysteme wurden berücksichtigt, um ein unterschiedliches seuchenhygienisches Risiko unter Praxisbedingungen bewerten zu können. Pro Herde wurden von je zehn Hühnern Trachealtupfer und Serumproben entnommen. Die Tupferproben wurden mittels duplex nested RTPCR untersucht, die Serumproben mittels zweier kommerzieller ELISA-Tests. In jeder Herde gelang der aMPV-RNA-Nachweis mindestens einmal zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Bereits bei der Einstallung konnten in 17 Herden aMPV-spezifische Antikörper und/oder aMPV-RNA nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen die hohe Verbreitungsrate des aMPV in Legehennenbetrieben. Bereits in der Aufzucht fand in der Mehrzahl der Herden eine aMPVInfektion statt; während der Legeperiode kam es zu häufigen Re- oder Neuinfektionen bzw. zu einer langen Persistenz des Virus. Subtyp A kam alleine (51%) mehr als doppelt so häufig vor wie ausschließlich Subtyp B 87 Kapitel 6 Zusammenfassung (22%). Doppelinfektionen mit den Subtypen A und B (27%) wurden ungefähr so häufig gefunden wie eine Infektion ausschließlich mit Subtyp B. Ein Wechsel der Subtypen A und B während einer Legeperiode wurde am häufigsten beobachtet: zehn der 18 Herden (56%) zeigten diesen Verlauf. Ausschließlich Subtyp A in allen positiven Entnahmen pro Betrieb wurde in vier von 18 Herden gefunden, ausschließlich Subtyp B in drei von 18 Herden, Subtyp A gemeinsam mit Subtyp B in einer von 18 Herden. Dies verdeutlicht die Dominanz des Subtyps A in Legehennenbetrieben. Obwohl drei Herden während der Aufzucht mit einer Subtyp B-Vakzine geimpft wurden, gelang der aMPV-RNA Nachweis in bis zu vier Probenentnahmen. Der Subtyp A dominierte auch in den geimpften Herden. Neben dem Subtyp B Feldvirus wurde in einer Herde zum Zeitpunkt der Einstallung auch ein Subtyp B ähnlich dem Impfstamm nachgewiesen. Es ist daher davon auszugehen, dass trotz bekannter Kreuzimmunität eine Impfung nicht vor Infektionen schützt, aber die Persistenz von Subtyp B vermindert. Die Analyse der Serumproben mit zwei kommerziellen ELISA-Tests ergab zum Teil konträre Ergebnisse. Da die Diagnose einer aMPV-Infektion häufig nur über diese Methode gestellt wird, ist dies von praktischer Relevanz. Eine Evaluierung des ELISA-Tests mit der höchsten Spezifität und Sensitivität sollte daher folgen. 88 Kapitel 7 7 Summary Summary Nemecek, Britt Detection of avian Metapneumovirus in laying hens in Sachsonia at various time-points during the period of lay Clinic for Avian and Reptile Medicine and Institute for Virology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in February 2011 90 pages, 32 figures, 14 tables, 198 references, three appendices keywords: avian metapneumovirus, laying hen, duplex nested RT-PCR, ELISA Poor egg laying performance and a high incidence of poor-quality eggs are the main reasons for economic losses in farming laying hens. Vaccination against the known agents e.g. avian Metapneumovirus (aMPV) is common. AMPV is known as the agent of turkey rhinotracheitis (TRT) in turkeys since the late 1970s and is associated with outbreaks of swollen head syndrome (SHS) in chickens. There are only a few epidemiological studies published investigating the virus and its subtypes in laying hens. The objective of this study was to identify the incidence of aMPV in laying hens, especially its subtypes A and B, at various time-points of the period of lay to get a better understanding about the time-point of the first infection as well as the occurrence of repeated infections. Swabs and blood samples were taken from 18 flocks in Sachsonia during the period of lay every three month. The flocks were kept either in cages, floor housing or free range systems. Samples were taken from ten birds per flock. The swabs were analysed by duplex nested RT-PCR, the serum samples by two commercial ELISAs. Field infections with aMPV were detected in everey flock at least once during the study. On arrival either aMPV antibodies with both ELISA kits and/or aMPV RNA were detected 17 flocks. The results of this study show a high incidence of aMPV in laying hens. Most of the flocks were already infected by aMPV during the growing period; infections and even reinfections are events occurring frequently in laying hen flocks during period of lay or the genom is persisting for at least three month. The percentage of an aMPV monoinfection with subtype A or B was 51% and 22% respectively. Double infections (27%) were detected almost as often as monoinfection with subtype B. Both subtypes were detected either at the same time or at different occasions in 11 flocks during the period of lay. Subtype B alone was detected in three flocks and subtype A in four flocks. The result indicate the dominance of subtype A in laying hens. 89 Kapitel 7 Summary Although three flocks were vaccinated with a subtype B vaccine at the hatchery, aMPV RNA was detected up to four times. Subtype A was most often detected in these samples, whereas Subtype B field and vaccine like strains were found in one vaccinated flock on arrival. Taken the findings in the vaccinated flocks into consideration it can be concluded that the vaccination does not protect the hens for an aMPV infection, but reduce the amount of aMPV subtype B persistence in a flock. The two commercial ELISA kits used seem to have considerable variation in specifity and sensitivity. This is of practical importance as the diagnosis of aMPV field infections are often based on commercial ELISAs. However, more controlled clinical studies are needed to investigate this further. 90 Kapitel 8 8 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis Alkahalaf AN, Ward LA, Dearth RN, Saif YM. Pathogenicity, transmissibility and tissue distribution of avian pneumovirus in turkey poults. Avian Dis. 2002; 46: 650-9. Alvarez R, Lwamba HM, Kapczynski DR, Njenga MK, Seal BS. Nucleotide and predicted amino acid sequence-based analysis of the avian metapneumovirus type C cell attachment glycoprotein gene: phylogenetic analysis and molecular epidemiology of U.S. pneumoviruses. 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Salpetersäure, Überstand nach 30 min Sedimentation IPTG 100 mM LB-Agar 1% (w/v) Agar in LB-Medium LB-Medium Casein, hydrolisiert 1% (w/v) NaCl 1% (w/v) Hefeextrakt 0,5% (w/v) Lösung 1 (Resuspensionspuffer) RNase A 100 µg/ml Glucose 50 mM Tris-Base 25 mM EDTA 10 mM pH 8,0 Lösung 2 (Lysispuffer) NaOH 200 mM SDS 1% (w/v) 113 Anhang A Lösung 3 (Neutralisationspuffer) Natriumacetat 3M Eisessig 11,5% (v/v) pH 4,8 Natriumacetat 3M pH 5,6 Nariumiodid-Lösung NaI 6M Na2O3S 40 mM New-Waschpuffer Ethanol 50% Tris/HCl, pH 7,5 10 mM NaCl 10 mM EDTA 1 mM Proteinase K in Tris/HCL 100 mg/ml pH 7,4 S.O.C.-Medium Trypton 2% (w/v) Hefeextrakt 0,5% (w/v) Glukose 20 mM NaCL 10 mM KCL 2,5 mM MgCL2 10 mM MgSO4 10 mM 114 Anhang A TAE, 50 x Tris-Base 2M Eisessig 5,7% (v/v) EDTA 100 mM pH 8,5 X-gal 100 mM 10 x PCR-Puffer Tris/HCL 200 mM (NH4)2SO4 160 mM MgCl2 20 mM pH 8,5 115 Anhang B Anhang B 1 Grunddaten der einzelnen Betriebe Betrieb: Datum: Betriebsgröße Standort Geflügel am gleichen Standort Haltungsform Freilandhaltung Bodenhaltung Käfighaltung Einstallungsdatum Alter der Tiere Zahl der Tiere Herkunft der Tiere Impfprogramm während der Aufzucht Zuchtlinie 116 Anhang B 2 Vorbericht Betrieb: Herde: Datum: betreffend drei Monate seit letzter Probenentnahme: Impfungen Arzneimittelgabe Maßnahmen im Stall (z.B. Ektoparasitenbekämpfung) Besonderheiten 117 Anhang B 3 Herdenuntersuchung Betrieb: Herde: Untersuchung Datum: Befund/Häufigkeit Herdenverhalten Verteilung im Stall Bewertungsschlüssel 0: normal; 1: schreckhaft; 2: apathisch; 3: somnolent 0: gleichmäßig über den gesamten Raum; 1: Ansammlung in bestimmten Stallbereichen; 2: vereinzelte Tiere separat Symptomenkomplexe betreffend: GIT: Durchfall 0: keine; 1:<5%; 2: <50%; 3: >50% Respiratorischer Trakt: 0: keine; 1:<5%; 2: <50%; 3: >50% - erschwerte Atmung - Atemgeräusche/ Niesen - Nasen- /Augenausfluss - geschwollene Sinus ZNS: 0: keine; 1:<5%; 2: <50%; 3: >50% - Torticollis - Opisthotonus - Tremor - Parese/Paralyse Bewegungsapparat: 0: keine; 1:<5%; 2: <50%; 3: >50% - Stellungs-/ Bewegungsanomalien - Tiere sitzen viel - geschwollene Gelenke Einheitlichkeit der Herde 0: Ausgeglichenheit; 118 1: Auseinanderwachsen Anhang B 4 Einzeltieruntersuchung Herde: Ernährungszustand: Datum: Huhn Nr. gut mäßig schlecht Atmung o.b.B. Schnabelatmung Atemgeräusche Niesen Augen o.b.B. Konjunktivitis Schaumiger Augenausfluss Nase/Nebenhöhlen o.b.B. Schwellungen Ausfluss Legetätigkeit produktiv nicht produktiv ZNS o.b.B. Torticollis Opisthotonus Tremor Paralyse Parese 119 Kommentar Anhang C Anhang C Übersicht der Daten der einzelnen Herden x/10 x Tiere von 10 positiv + positiv getestet ? fraglich getestet n.d. nicht durchgeführt aMPV A nested PCR, welche aMPV-Subtyp A detektiert aMPV B nested PCR, welche aMPV-Subtyp B detektiert IDEXX aMPV ELISA Flock Check® (IDEXX, Wörrstadt) BioChek the avian rhinotracheitis antibody test kit® (BioChek, Gouda, Niederlande) s Standardabweichung S/P mittlere S/P-Verhältnis der ELISA Proben aMPV-PCR positiv Hühner bzw. Herden, bei denen aMPV-Genom detektiert wurden zeigten klinische Symptome aMPV-PCR negativ Hühner bzw. Herden, bei denen kein aMPV-Genom detektiert wurden zeigten klinische Symptome 120 Anhang C Herde 1 - Haltungsform Käfighaltung - Standort Lommatzsch - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 25 350 - Zuchtlinie Lohmann Brown - Alter bei Einstallung 18 Wochen 1 Tag - während der Legeperiode Probleme mit plötzlichen Legeleistungseinbußen, vermehrt helle, dünnschalige Eier Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A n.d. n.d. 3/10 n.d. 1/10 aMPV B n.d. n.d. 0/10 n.d. 10/10 IDEXX 1/10 1/10 0/10 10/10 10/10 1/10 + 1/10 + 0/10 ? 10/10 + 7/10 + 2/10 ? 3/10 ? 5/10 ? 0/10 ? 2/10 ? Alter (Wochen) 18 31 45 58 64 Monat Juni September Januar April Mai BioChek ELISA Probenentnahmen ELISA-Test IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P -0,05 -0,05 -0,15 2,76 2,87 s 0,18 0,14 0,06 1,27 1,92 S/P 0,25 0,31 0,35 2,47 1,48 s 0,18 0,14 0,09 1,01 1,02 Klinik Herdenuntersuchung: 5. Probenentnahme (64. LW): aMPV-PCR positiv: <5% Durchfall <5% Störung des Bewegungsapparates Einzeltieruntersuchung: ohne besonderen Befund 121 122 1 2 3 4 IDEXX -0,05 5 BioChek 0,18 PCR 0/10 A/B *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % 6 8 IDEXX -0,15 BioChek 0,06 PCR 3/10 A BioChek 1,27 IDEXX 2,76 PCR 0/10 A/B BioChek 1,92 IDEXX 2,87 PCR 1/10 A 10/10 B 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert ELISA IDEXX S/P Mittelwert ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge 0,00 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Legewoche *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung 7 IDEXX -0,05 BioChek 0,14 PCR 0/10 A/B Daten der Herde 1 Anhang C Anhang C Herde 2 - Haltungsform Käfighaltung - Standort Neukirchen - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 27 399 - Zuchtlinie Lohmann Brown - Alter bei Einstallung 17 Wochen 1 Tag Probenentnahmen 1 2 3 4 5 8/10 2/10 0/10 0/10 aMPV B 0/10 aMPV 1/10** 0/10 1/10 0/10 1/10 0/10 IDEXX 2/10 0/10 0/10 1/10 0/10 0/10 + 0/10 + 1/10 ? 0/10 + 1/10 + 3/10 ? 0/10 ? 1/10 ? 1/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 17 32 45 59 71 Monat Juli Oktober Januar April Juli aMPV A BioChek ** RT-PCR: aMPV-P-Proteingen positiv; nested PCR: negativ, daher keine Differenzierung in Subtyp A und B möglich ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P 0,08 -0,1 -0,07 -0,08 -0,02 s 0,16 0,04 0,05 0,11 0,09 S/P 0,25 0,13 0,25 0,19 0,23 s 0,08 0,08 0,2 0,11 0,2 Klinik Herdenuntersuchung: ohne besonderen Befund Einzeltieruntersuchung: 5. Probenentnahme (71. LW): aMPV-PCR negativ: 123 1 x keine Legetätigkeit 124 *1 *6 *1 IDEXX -0,10 BioChek 0,13 PCR 8/10 A 1/10 B *1 PCR 2/10 A IDEXX -0,07 BioChek 0,25 *1 Daten der Herde 2 *6 *1 *6 IDEXX -0,08 BioChek 0,19 PCR 1/10 B *1 BioChek 0,23 PCR 0/10 A/B 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA IDEXX S/P Mittelwert ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW IDEXX -0,02 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Legewoche IDEXX 0,08 BioChek 0,25 PCR 1/10 aMPV *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % Anhang C Anhang C Herde 3 - Haltungsform Käfighaltung - Standort Lommatzsch - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 17 360 - Zuchtlinie Lohmann LSL - Alter bei Einstallung 18 Wochen 2 Tage Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 10/10 0/10 0/10 IDEXX 0/10 0/10 10/10 10/10 10/10 0/10 + 0/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 2/10 ? 1/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 18 31 46 59 69 Monat November Februar Mai August Oktober BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P -0,16 -0,1 4,95 7,82 6,71 s 0,14 0,15 1,82 2,59 1,40 S/P 0,23 0,28 3,46 5,9 5,69 s 0,11 0,2 1,32 1,54 1,31 Klinik Herdenuntersuchung: ohne besonderen Befund Einzeltieruntersuchung: 4. Probenentnahme (59. LW) aMPV-PCR negativ: 1x erschwerte Atmung 2x Nasenausfluss 125 126 1 2 3 4 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 5 IDEXX -0,16 BioChek 0,23 PCR 0/10 A/B 20 40 60 80 100 % 6 8 BioChek 3,46 BioChek 5,90 PCR 0/10 A/B IDEXX 7,82 2,00 4,00 6,00 PCR 0/10 A/B BioChek 5,69 IDEXX 6,71 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 0,00 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Legewoche BioChek 0,28 ELISA IDEXX S/P Mittelwert 7 IDEXX -0,10 PCR 0/10 A/B IDEXX 4,95 PCR 10/10 B Daten der Herde 3 Anhang C Anhang C Herde 4 - Haltungsform Käfighaltung - Standort Eppendorf - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 19 500 - Zuchtlinie Lohmann LSL - Alter bei Einstallung 18 Wochen 2 Tage Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 0/10 1/10 1/10 0/10 0/10 aMPV B 2/10 2/10 3/10 4/10 0/10 IDEXX 1/10 10/10 9/10 10/10 10/10 0/10 + 10/10 + 9/10 + 10/10 + 10/10 + 2/10 ? 1/10 ? 1/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 18 33 46 59 69 Monat November März Mai August Dezember BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P -0,12 5,06 4,65 4,99 5,31 s 0,13 1,08 2,48 1,55 1,10 S/P 0,20 4,53 4,19 4,59 5,06 s 0,11 1,97 2,38 1,31 0,94 Klinik Herdenuntersuchung: ohne besonderen Befund Einzeltieruntersuchung: 5. Probenentnahme (69. LW): aMPV-PCR negativ: 127 1x Nasenausfluss 128 1 2 3 4 IDEXX -0,12 5 BioChek 0,20 PCR 2/10 B *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % 6 *1 7 *1 BioChek 4,53 *1 IDEXX 4,65 BioChek 4,19 PCR 1/10 A 3/10 B *1 *1 *1 BioChek 4,59 PCR 4/10 B IDEXX 4,99 *1 2,00 4,00 6,00 PCR 0/10 A/B BioChek 5,06 IDEXX 5,31 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 0,00 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 Lebenswoche PCR 1/10 A 2/10 B IDEXX 5,06 ELISA IDEXX S/P Mittelwert 8 *1 Daten der Herde 4 Anhang C Anhang C Herde 5 - Haltungsform Käfighaltung - Standort Taucha - aMPV-Impfstatus geimpft - Herdengröße 19500 - Zuchtlinie Hisex weiß, Lohmann LSL - Alter bei der Einstallung 16 Wochen 6 Tage - während der Legeperiode E. coli- und Milben-Probleme; E. coli-Therapie mit Colistin/Neomycin und Essigsäure Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 0/10 1/10 0/10 0/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 17 31 45 59 73 Monat September Dezember März Juni Oktober BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P 7,52 9,61 8,35 10,06 9,12 s 2,87 3,47 4,77 4,01 3,72 S/P 5,12 6,29 5,63 5,64 6,53 s 1,84 2,16 2,61 1,72 2,14 129 Anhang C Klinik Herdenuntersuchung: 4. Probenentnahme (59. LW): aMPV-PCR negativ: <5% Durchfall 2. Probenentnahme (31. LW): aMPV-PCR negativ: 1x Schwellung der Nasennebenhöhlen 3. Probenentnahme (45. LW): aMPV-PCR negativ: 1x Schwellung der Nasennebenhöhlen Einzeltieruntersuchung: 1x ohne Legetätigkeit 4. Probenentnahme (59. LW): aMPV-PCR negativ: 1x Schwellung der Nasennebenhöhlen 5. Probenentnahme (73. LW): aMPV-PCR negativ: 2x geschwollene Sinus 1x Konjunktivitis und keine Legetätigkeit 130 131 *1 PCR 1/10 A BioChek 6,29 IDEXX 9,61 *5 *5 PCR 0/10 A/B BioChek 5,63 IDEXX 8,35 Daten der Herde 5 *5 PCR 0/10 A/B BioChek 5,64 IDEXX 10,06 *4 8,00 10,00 PCR 0/10 A/B 2,00 4,00 6,00 BioChek 6,53 IDEXX 9,12 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA IDEXX S/P Mittelwert ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Lebenswoche PCR 0/10 A/B BioChek 5,12 IDEXX 7,52 *5 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % Anhang C Anhang C Herde 6 - Haltungsform Käfighaltung - Standort Neuensalz - aMPV-Impfstatus geimpft - Herdengröße 84 040 - Zuchtlinie Lohmann LSL - Alter bei Einstallung 17 Wochen Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 10/10 3/10 2/10 0/10 2/10 aMPV B 10/10 0/10 0/10 0/10 0/10 IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 17 31 45 57 72 Monat November März Mai August Dezember BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P 4,84 11,39 11,62 11,58 10,08 s 1,93 2,03 1,28 0,77 0,93 S/P 3,77 7,21 6,70 7,57 6,30 s 1,53 0,92 0,23 0,04 0,06 Klinik Herdenuntersuchung: 3. Probenentnahme (45. LW): aMPV-PCR positiv <5% Durchfall <5% respiratorische Symptome <5% Störung des Bewegungsapparates Einzeltieruntersuchung: 3. Probenentnahme (45. LW): aMPV-PCR negativ 1x keine Legetätigkeit 132 133 1 2 3 4 5 BioChek 3,77 IDEXX 4,84 PCR 10/10 A 10/10 B *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % 6 7 PCR 2/10 A BioChek 6,70 IDEXX 11,62 *6 PCR 0/10 A/B BioChek 7,57 IDEXX 11,58 *1 PCR 2/10 A BioChek 6,30 IDEXX 10,08 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Lebenswoche ELISA IDEXX S/P Mittelwert 8 PCR 3/10 A BioChek 7,21 IDEXX 11,39 *1 Daten der Herde 6 Anhang C Anhang C Herde 7 - Haltungsform Bodenhaltung - Standort Neuensalz - aMPV-Impfstatus geimpft - Herdengröße 21 500 - Zuchtlinie Hisex braun - Alter bei Einstallung 17 Wochen Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 2/10 0/10 0/10 0/10 3/10 aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 1/10 IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 16 31 45 56 71 Monat November März Mai August Dezember BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P 4,85 6,41 10,05 8,23 8,82 s 2,23 2,73 1,65 2,04 2,19 S/P 3,69 4,99 7,12 6,44 6,74 s 1,60 1,87 0,72 1,37 1,31 Klinik Herdenuntersuchung: 5. Probenentnahme (71. LW): aMPV-PCR positiv: <5% Durchfall <5% Störung des Bewegungsapparates Einzeltieruntersuchung: 4. Probenentnahme (56. LW): aMPV-PCR negativ 2x keine Legetätigkeit 5. Probenentnahme (71. LW): aMPV-PCR positiv 1x erschwerte Atmung mit Atemgeräuschen, geschwollene Sinus, Konjunktivitis und keine Legetätigkeit 134 135 PCR 0/10 A/B BioChek 4,99 IDEXX 6,41 *1 PCR 0/10 A/B BioChek 7,12 IDEXX 10,05 *1 Daten der Herde 7 PCR 0/10 A/B BioChek 6,44 IDEXX 8,23 *6 PCR 3/10 A 1/10 B BioChek 6,74 IDEXX 8,82 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA IDEXX S/P Mittelwert ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Lebenswoche PCR 2/10 A BioChek 3,69 IDEXX 4,85 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % Anhang C Anhang C Herde 8 - Haltungsform: Bodenhaltung - Standort: Krostitz - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße: 5 500 - Zuchtlinie: Lohmann Brown - während der Legeperiode Probleme mit hohen Abgängen und geringer Legeleistung (Maximalwert: 81%); E. coli-Infektion – behandelt mit Colistin und Vit AD3EC Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 0/10 0/10 6/10 1/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 2/10 0/10 2/10 IDEXX 0/10 3/10 0/10 0/10 0/10 0/10 + 2/10 + 2/10 + 2/10 + 1/10 + 0/10 ? 4/10 ? 4/10 ? 4/10 ? 3/10 ? Alter (Wochen) 18 30 43 56 67 Monat April Juli Oktober Januar April BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P -0,21 0,09 -0,09 -0,06 0,02 s 0,06 0,17 0,15 0,12 0,06 S/P 0,13 0,49 0,45 0,39 0,41 s 0,05 0,27 0,25 0,18 0,24 Klinik: Herdenuntersuchung: ohne besonderen Befund Einzeltieruntersuchung: 2. Probenentnahme (30. LW): aMPV-PCR negativ: 1x Schnabelatmung 3. Probenentnahme (43. LW): aMPV-PCR positiv: 1x ohne Legetätigkeit 4. Probenentnahme (56. LW): aMPV-PCR negativ: 1x geschwollene Sinus 5. Probenentnahme (67. LW): aMPV-PCR negativ: 1x geschwollene Sinus 1x Atemgeräusche 1x Konjunktivitis 136 137 3 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 1 2 IDEXX -0,21 0 PCR 0/10 A/B BioChek 0,13 20 40 60 80 100 % 4 5 6 8 BioChek 0,49 IDEXX -0,09 BioChek 0,45 PCR 6/10 A PCR2/10 6/10BA IDEXX -0,06 BioChek 0,39 PCR 1/10 A BioChek 0,41 0 IDEXX0,02 2 PCR 2/10 B 4 6 8 10 12 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung BioChek ELISA S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW *10 % 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Lebenswoche IDEXX 0,09 PCR 0/10 A/B IDEXX ELISA S/P Mittelwert 7 *5 Daten der Herde 8 Anhang C Anhang C Herde 9 - Haltungsform Bodenhaltung - Standort Rochlitz - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 2 485 braun, 400 weiß - Zuchtlinie: Lohmann LSL, Lohmann Brown - Alter bei Einstallung: 18 Wo (weiß), 18 Wo 3 Tage (braun) - während der Legeperiode gegen April (58. LW) Probleme mit dünnschaligen, helleren Eiern Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A n.d. 9/10 4/10 0/10 0/10 aMPV B n.d. 1/10 0/10 0/10 0/10 IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 18 31 45 59 71 Monat Juni September Januar April Juli BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P 6,70 4,11 5,66 6,52 4,68 s 2,28 2,15 2,28 3,09 1,08 S/P 5,67 3,36 4,13 4,64 4,17 s 1,40 1,84 1,74 1,48 0,98 Klinik Herdenuntersuchung: 5. Probenentnahme (71. LW): aMPV-PCR negativ: <5% Störung des Bewegungsapparates aMPV-PCR negativ: 1x Konjunktivitis Einzeltieruntersuchung: 5. Probenentnahme (71. LW): 138 139 1 2 3 4 PCR 0/10 A/B 5 BioChek 5,67 IDEXX 6,70 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % 6 8 BioChek 3,36 *1 *1 BioChek 4,13 IDEXX 5,66 PCR 4/10 A *1 PCR 0/10 A/B BioChek 4,64 IDEXX 6,52 *1 PCR 0/10 A/B BioChek 4,17 IDEXX 4,68 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Lebenswoche IDEXX 4,11 PCR 9/10 A 1/10 B ELISA IDEXX S/P Mittelwert 7 *1 Daten der Herde 9 Anhang C Anhang C Herde 10 - Haltungsform Bodenhaltung - Standort Priestewitz - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 8 444 - Zuchtlinie Lohmann Brown - Alter bei Einstallung 18 Wochen, 1 Tag Probenentnahmen 1 2 3 aMPV A 0/10 0/10 0/10 aMPV B 0/10 7/10 1/10 IDEXX 1/10 0/10 0/10 0/10 + 4/10 + 4/10 + 2/10 ? 1/10 ? 2/10 ? Alter (Wochen) 18 31 43 Monat Juli Oktober Januar BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChe k 1 2 3 S/P -0,04 -0,04 -0,06 s 0,11 0,08 0,06 0,26 0,43 0,48 0,10 0,19 0,20 S/P s Klinik Herdenuntersuchung: ohne besonderen Befund Einzeltieruntersuchung: ohne besonderen Befund 140 141 IDEXX -0,04 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 3 BioChek 0,26 PCR 0/10 A/B 0 1 2 20 40 60 80 100 % 4 5 8 9 10 11 ELISA IDEXX S/P Mittelwert 7 *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung 6 12 14 15 16 17 18 *1 ELISA BioChek S/P Mittelwert 13 BioChek 0,43 PCR 7/10 B IDEXX -0,04 *1 19 PCR % 20 21 Daten der Herde 10 23 24 25 26 27 Legeleistung wöchentlich % 22 29 30 *1 31 32 33 Abgänge Summe pro LW 28 BioChek 0,48 PCR 1/10 B IDEXX -0,06 *1 34 *1 0,00 35 Lebenswoche 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert Anhang C Anhang C Herde 11 - Haltungsform Bodenhaltung - Standort Gaunitz - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 3 973 - Zuchtlinie Lohmann Brown - Alter bei Einstallung 18 Wochen 1Tag - während der Legeperiode schlechtes Stallklima: hohe Ammoniak-, Staub- und Luftfeuchtigkeitsbelastung; Maden, Mäuse, rote Vogelmilbe Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 1/10 0/10 1/10 0/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 4/10 0/10 0/10 IDEXX 0/10 0/10 0/10 2/10 2/10 1/10 + 1/10 + 1/10 + 4/10 + 2/10 + 3/10 ? 1/10 ? 1/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 18 31 45 60 66 Monat November Februar Mai September Oktober BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P -0,09 -0,19 -0,13 0,06 0,04 s 0,07 0,10 0,11 0,19 0,13 S/P 0,31 0,27 0,28 0,47 0,30 s 0,17 0,13 0,14 0,27 0,18 Klinik Herdenuntersuchung: 3. Probenentnahme (45. LW): aMPV-PCR positiv: <5% respiratorische Symptome 4. Probenentnahme (60. LW): aMPV-PCR negativ: <5% respiratorische Symptome <5% Störung des Bewegungsapparates 5. Probenentnahme (66. LW): aMPV-PCR negativ: <5% Durchfall <5% Störung des Bewegungsapparates Einzeltieruntersuchung: 4. Probenentnahme (60. LW): aMPV-PCR negativ: 142 2x keine Legetätigkeit 143 1 3 4 5 6 7 IDEXX -0,13 *6 BioChek 0,28 PCR 1/10 A 4/10 B *1 Daten der Herde 11 *1 *1 BioChek 0,47 PCR 0/10 A/B *6 IDEXX 0,06 *1 IDEXX 0,04 2,00 0,00 BioChek 0,30 PCR 0/10 A/B 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Lebenswoche ELISA IDEXX S/P Mittelwert 8 IDEXX -0,19 BioChek 0,27 IDEXX -0,09 2 PCR 0/10 A/B BioChek 0,31 PCR 1/10 A *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % # Anhang C Anhang C Herde 12 - Haltungsform Bodenhaltung - Standort Krostitz - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 8 000 - Zuchtlinie Lohmann Brown - Alter bei Einstallung 18 Wochen 2 Tage - während der Legeperiode leichte Probleme mit hellen/ dünnschaligen Eiern Probenentnahmen 1 2 3 4 aMPV A 0/10 0/10 0/10 1/10 aMPV B 0/10 0/10 0/10 1/10 IDEXX 0/10 0/10 0/10 0/10 2/10 + 0/10 + 2/10 + 1/10 + 1/10 ? 0/10 ? 3/10 ? 5/10 ? Alter (Wochen) 18 30 43 56 Monat Februar April Juli Oktober BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 S/P -0,11 -0,07 -0,06 -0,04 s 0,06 0,05 0,09 0,10 S/P 0,49 0,17 0,35 0,33 s 0,63 0,07 0,19 0,13 Klinik Herdenuntersuchung: 3. Probenentnahme (43. LW): aMPV-PCR negativ: <5% Durchfall <5% Störung des Bewegungsapparates Einzeltieruntersuchung: ohne besonderen Befund 144 145 1 2 3 4 IDEXX -0,11 BioChek 0,49 PCR 0/10 A/B *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % 5 7 8 9 10 11 12 *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA IDEXX S/P Mittelwert 6 17 18 19 20 ELISA BioChek S/P Mittelwert 15 16 BioChek 0,17 13 14 IDEXX -0,07 PCR 0/10 A/B 21 PCR % 22 23 26 27 28 29 30 31 Legeleistung wöchentlich % 24 25 BioChek 0,35 PCR 0/10 A/B IDEXX -0,06 Daten der Herde 12 34 35 36 37 38 Abgänge Summe pro LW 32 33 IDEXX -0,04 2,00 39 40 0,00 41 Lebenswoche BioChek 0,33 PCR 1/10 A 1/10 B 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert Anhang C Anhang C Herde 13 - Haltungsform: Freilandhaltung - Standort: Kurzwalde - aMPV-Impfstatus: nicht geimpft aMPV - Herdengröße: 15 000 - Zuchtlinie: Lohmann Brown - Alter bei der Einstallung: 18 Wochen 5 Tage Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 3/10 1/10 2/10 9/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 BioChek 9/10 + 1/10 ? Alter (Wochen) 18 31 44 57 70 Monat März Juni September Dezember Februar ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P 1,61 2,73 3,82 3,42 3,21 s 0,80 1,33 1,45 1,56 1,17 S/P 1,28 1,63 2,32 2,13 1,71 s 0,55 0,91 1,16 1,24 0,73 Klinik: Herdenuntersuchung: ohne besonderen Befund Einzeltieruntersuchung: 4. Probenentnahme (57. LW): aMPV-PCR positiv: 1x keine Legetätigkeit aMPV-PCR negativ: 1x keine Legetätigkeit 146 147 1 2 3 4 5 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 BioChek 1,28 20 IDEXX 1,61 PCR 3/10A 40 60 80 100 % 6 7 PCR 1/10 A BioChek 1,63 IDEXX 2,73 *2 *3 *3 *4 PCR 2/10 A *4 BioChek 2,32 IDEXX 3,82 *1 *2 *3 *1 BioChek 2,13 IDEXX 3,42 PCR 9/10 A *2 BioChek 1,71 2,00 4,00 IDEXX 3,21 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung IDEXX ELISA S/P Mittelwert BioChek ELISA S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW *10 % PCR 0/10 A/B 0,00 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Legewoche *1 Daten der Herde 13 Anhang C Anhang C Herde 14 - Haltungsform Freilandhaltung - Standort Schildau - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 4 200 - Zuchtlinie Lohmann Brown - Alter bei Einstallung 18 Wochen, 1 Tag - Bemerkung vom Betrieb wurde keine Legeleistung übermittelt Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 2/10 0/10 9/10 0/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 7/10 0/10 5/10 IDEXX 0/10 2/10 10/10 8/10 10/10 0/10 + 1/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 1/10 ? 4/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 18 31 44 57 69 Monat Mai August November Februar Mai BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P -0,10 0,03 2,33 0,95 1,69 s 0,08 0,14 1,70 0,81 0,69 S/P 0,17 0,40 2,43 1,25 1,51 s 0,11 0,23 1,61 0,49 0,57 Klinik: Herdenuntersuchung: ohne besonderen Befund Einzeltieruntersuchung: 4. Probenentnahme (57. LW): aMPV-PCR negativ: 148 1x Konjunktivitis 149 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 5 6 BioChek 0,17 PCR 2/10 A 1 2 3 4 IDEXX -0,10 0 20 40 60 80 100 % BioChek 0,40 BioChek 2,43 IDEXX 0,95 BioChek 1,25 PCR 0/10 A/B BioChek 1,51 IDEXX 1,69 PCR 5/10 B 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA IDEXX S/P Mittelwert ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge 0,00 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Lebenswoche IDEXX 0,03 PCR 0/10 A/B IDEXX 2,33 PCR 9/10 A 7/10 B Daten der Herde 14 Anhang C Anhang C Herde 15 - Haltungsform Freilandhaltung - Standort Wermsdorf - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße: 5 300 Hennen, 15 Hähne - Zuchtlinie: Lohmann Brown - Alter bei Einstallung: 16 Wochen - während der Legeperiode Probleme mit E. coli, hohe Verluste, Kannibalismus; starkes Ratten- /Mäuseproblem Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 2/10 2/10 4/10 1/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 IDEXX 0/10 0/10 2/10 1/10 1/10 1/10 + 4/10 + 7/10 + 4/10 + 1/10 + 1/10 ? 2/10 ? 1/10 ? 4/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 16 29 43 57 64 Monat Juni September Dezember März Mai BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P -0,10 0,05 0,04 -0,03 -0,08 s 0,06 0,08 0,12 0,12 0,13 S/P 0,24 0,44 2,11 0,47 0,27 s 0,14 0,15 1,85 0,15 0,19 150 Anhang C Klinik: Herdenuntersuchung: 3. Probenentnahme (43. LW): aMPV-PCR positiv: >50% Durchfall 4. Probenentnahme (57. LW): aMPV-PCR positiv: <5% Durchfall 5. Probenentnahme (64. LW): aMPV-PCR negativ: <5% Durchfall <5% respiratorische Symptome >50% Störung des Bewegungsapparates Einzeltieruntersuchung: 4. Probenentnahme (57. LW) aMPV-PCR positiv: 1x Schwellung der Nasennebenhöhlen 1x keine Legetätigkeit aMPV-PCR negativ: 3x geschwollene Sinus 1x Konjunktivitis und keine Legetätigkeit 5. Probenentnahme (64. LW): aMPV-PCR negativ 2x keine Legetätigkeit 1x Konjunktivitis 1x Nasenausfluss 151 152 4 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 1 2 3 IDEXX -0,10 0 BioChek 0,24 PCR 2/10 A 20 40 60 80 100 % 5 6 7 BioChek 0,44 IDEXX 0,04 BioChek 2,11 IDEXX -0,03 BioChek 0,47 PCR 1/10 A IDEXX -0,08 PCR 0/10 A/B 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert ELISA IDEXX S/P Mittelwert ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge 0,00 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Lebenswoche *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung 8 IDEXX 0,05 PCR 2/10 A PCR 4/10 A Daten der Herde 15 Anhang C Anhang C Herde 16 - Haltungsform Freilandhaltung - Standort Liptitz - aMPV-Impfstatus: nicht geimpft - Herdengröße 2 400 - Zuchtlinie Lohmann Tradition - Alter bei Einstallung 18 Wochen, 6 Tage - während der Legeperiode Durchschnittswert Knickeier pro Jahr: 60 Stück pro Jahr Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 0/10 7/10 2/10 1/10 0/10 aMPV B 0/10 1/10 0/10 0/10 2/10 IDEXX 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 10/10 + 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 19 33 46 61 67 Monat Juli Oktober Januar April Juni BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P 7,37 3,86 3,77 3,84 4,05 s 0,72 1,93 1,59 1,61 1,65 S/P 6,19 3,23 3,13 3,78 3,99 s 0,64 1,34 1,23 1,27 1,53 153 Anhang C Klinik Herdenuntersuchung: 4. Probenentnahme (61. LW): aMPV-PCR positiv: <5% Durchfall aMPV-PCR positiv: 1x Atemgeräusche Einzeltieruntersuchung: 2. Probenentnahme (33. LW): 1x keine Legetätigkeit aMPV-PCR negativ: 1x keine Legetätigkeit 3. Probenentnahme (46. LW): aMPV-PCR positiv: 1x Nasenausfluss 4. Probenentnahme (61. LW): aMPV-PCR positiv: 1x keine Legetätigkeit 5. Probenentnahme (67. LW): aMPV-PCR negativ: 1x erschwerte Atmung 4x Konjunktivits 154 155 1 2 3 4 PCR 0/10 A/B BioChek 6,19 IDEXX 7,37 *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % 5 6 PCR 2/10 A BioChek 3,13 IDEXX 3,77 PCR 1/10 A BioChek 3,78 IDEXX 3,84 2,00 PCR 2/10 B IDEXX 4,05 4,00 BioChek 3,99 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 0,00 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Lebenswoche ELISA IDEXX S/P Mittelwert 8 *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung 7 IDEXX 3,86 PCR 7/10 A 1/10 B Daten der Herde 16 Anhang C Anhang C Herde 17 - Haltungsform Freilandhaltung - Standort Belgern - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 3 800 - Zuchtlinie Lohmann Brown - Alter bei Einstallung 17 Wochen, 1 Tag Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 2/10 9/10 0/10 0/10 0/10 aMPV B 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 IDEXX 0/10 0/10 1/10 0/10 2/10 0/10 + 2/10 + 3/10 + 1/10 + 3/10 + 6/10 ? 4/10 ? 2/10 ? 2/10 ? 3/10 ? Alter (Wochen) 18 30 44 54 67 Monat August November Februar Mai August BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P -0,12 -0,18 -0,17 -0,15 0,00 s 0,07 0,07 0,21 0,10 0,18 S/P 0,30 0,40 0,54 0,30 0,41 s 0,09 0,18 0,43 0,09 0,15 Klinik Herdenuntersuchung: 4. Probenentnahme (54. LW): aMPV-PCR negativ: <5% Störung des Bewegungsapparates 2. Probenentnahme (30. LW): aMPV-PCR negativ: 1x Konjunktivitis 3. Probenentnahme (44. LW): aMPV-PCR negativ: 2x erschwerte Atmung 5. Probenentnahme (67. LW): aMPV-PCR negativ: 1x keine Legetätigkeit Einzeltieruntersuchung: 156 157 1 2 3 4 IDEXX -0,12 BioChek 0,30 PCR 2/10 A *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % 5 6 8 *1 IDEXX -0,17 BioChek 0,54 PCR 0/10 A/B *1 IDEXX -0,15 BioChek 0,30 PCR 0/10 A/B *1 *1 BioChek 0,00 BioChek 0,41 PCR 0/10 A/B 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert ELISA IDEXX S/P Mittelwert ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 0,00 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Lebenswoche *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung 7 *1 BioChek 0,40 PCR 9/10 A IDEXX -0,18 *1 Daten der Herde 17 Anhang C Anhang C Herde 18 - Haltungsform Freilandhaltung; Volierenhaltung - Standort Großenhain - aMPV-Impfstatus nicht geimpft - Herdengröße 18 500 - Zuchtlinie Lohmann Brown - Alter bei Einstallung 18 Wochen 1 Tag - während der Legeperiode sehr gutes Management; Tiere in sehr gutem Zustand Probenentnahmen 1 2 3 4 5 aMPV A 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 aMPV B 10/10 0/10 0/10 0/10 0/10 IDEXX 3/10 10/10 10/10 9/10 10/10 6/10 + 10/10 + 9/10 + 9/10 + 10/10 + 0/10 ? 0/10 ? 1/10 ? 0/10 ? 0/10 ? Alter (Wochen) 18 30 44 57 65 Monat Oktober Januar April Juli September BioChek ELISA Probenentnahmen ELISATest IDEXX BioChek 1 2 3 4 5 S/P 0,21 3,09 3,50 3,56 4,53 s 0,60 1,48 2,56 2,73 2,15 S/P 0,66 2,89 3,28 3,16 3,94 s 0,48 1,37 1,49 1,94 1,52 Klinik Herdenuntersuchung: ohne besonderen Befund Einzeltieruntersuchung: 2. Probenentnahme (30. LW): aMPV-PCR negativ: 1x keine Legetätigkeit 3. Probenentnahme (44. LW): aMPV-PCR negativ: 4x Konjunktivitis 1x Nasenausfluss 4. Probenentnahme (57. LW): aMPV-PCR negativ: 158 1x keine Legetätigkeit 159 1 2 3 4 IDEXX 0,21 BioChek 0,66 PCR 10/10 B *1 IB-Impfung *2 Stromausfall *3 kein Wasser 0 20 40 60 80 100 % 5 6 8 PCR 0/10 A/B BioChek 3,28 2,00 4,00 0,00 PCR 0/10 A/B BioChek 3,16 BioChek 3,94 PCR 0/10 A/B IDEXX 3,56 IDEXX 4,53 6,00 8,00 10,00 12,00 S/P Mittelwert *4 kein Futter *5 E. coli-Infektion *6 ND-Impfung ELISA BioChek S/P Mittelwert PCR % Legeleistung wöchentlich % Abgänge Summe pro LW 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Lebenswoche ELISA IDEXX S/P Mittelwert 7 BioChek 2,89 PCR 0/10 A/B IDEXX 3,09 IDEXX 3,50 Daten der Herde 18 Anhang C Danksagung Danksagung Nach Abschluss der Arbeit möchte ich allen herzlich danken, die mich bei der Anfertigung der Arbeit hilfreich unterstützt haben. Frau Prof. Dr. Krautwald-Junghanns und Herrn Prof. Dr. Müller danke ich für die freundliche Aufnahme in der Klinik für Vögel und Reptilien und dem Institut für Virologie, für die Überlassung des interessanten Themas sowie die jederzeit gewährte Unterstützung bei der Planung und Durchführung der Arbeit. Ein großer Dank gilt zum einen Herrn Dr. Raue für seine Geduld bei der Einarbeitung in das umfangreiche Gebiet der Molekularbiologie, seine Bereitschaft zur Hilfe und Diskussion, und zum anderen Frau Dr. Ahlers, die mir die Türen zu den Geflügelbetrieben öffnete und mich in das Gebiet der Geflügelmedizin und des Herdenmanagements einarbeitete. Beide gaben mir mit durchgehendem Engagement sehr interessante Anregungen und hatten immer ein offenes Ohr für mich. Herrn Richter möchte ich für seine Geduld, mir die Statistik näher zu bringen, danken. Natürlich wäre diese Arbeit nicht ohne Hilfe aller Mitarbeiter und Mitarbeiterinnen beider Institute möglich gewesen, bei denen ich mich herzlich bedanke. Stellvertretend seien hier Jens Böttner, Dr. Barbara Chmilewicz, Kathrin Erfurt, Acsinia Freter, Iris Ringel, Dr. Reimar Johne, Stefan Pestner, Roland Pichel, Dr. Michael Pees und Tina Trümper genannt. Für die freundschaftliche Atmosphäre und die hilfreichen Gespräche danke auch den Doktoranden: Anja, Caroline, Dirk, Eva, Kerstin, Kathrin, Olga, Silke, Nicole und Volker. Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für ihre Unterstützung. Hier sei v.a. Stefan Käs genannt, der mir bei Computerproblemen jeder Zeit geholfen hat. Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Mann, Michael Nemecek, bedanken, der ganz nah alle Höhen und Tiefen während der Promotion miterlebte. Er schaffte es aber durch seine unendliche Geduld und Beharrlichkeit mich in entscheidenden Momenten zu motivieren und zum Gelingen dieser Arbeit maßgeblich beizutragen. Schließlich bin ich der Firma Lohmann Tierzucht für die finanzielle Unterstützung und als kompetenten Ansprechpartner insbesondere Herrn Dr. Voss sowie allen beteiligten Betrieben für ihr entgegengebrachtes Vertrauen und Mitarbeit zu Dank verpflichtet. 160
