VL Nucleinsäure 2

Nukleinsäuren Teil 2
Prof. Dr. Barbara Krammer
Dr. Thomas Verwanger
Nicole Maeding, B.Sc.
Lisa Meiseleder
Programm
1) Restriktionsverdau des im Teil Nukleinsäuren 1
isolierten Plasmids
2) Gelelektrophorese zur Trennung v. Plasmid und
Insert
3) Aufreinigung der Fragmente aus Agarose
4) Ligation des Plasmids
5) Transformation von kompetenten Bakterien mit
dem ligierten Plasmid
Restriktionsverdau
Nukleasen
• Enzyme, die Nukleinsäuren abbauen: RNasen und DNasen
• Phosphodiesterasen: katalysieren hydrolytische Spaltung zwischen
der 5'-Phosphatgruppe eines Nukleotids und der 3'-Hydroxylgruppe
des benachbarten Nukleotids.
Typ “a" Nukleasen schneiden an der 3'
Seite der Phosphodiesterbindung und
belässt das Phosphat am 5' Ende des
verbleibenden Polynukleotids.
3'
Typ a
Typ b
5'
Typ “b" Nukleasen schneiden an der 5'
Seite der Phosphodiesterbindung und
belässt das Phosphat am 3' Ende des
Polynukleotids.
Restriktionsverdau
2 Klassen von Nukleasen:
Exonukleasen: Abbau der Nukleinsäure von ihrem Ende her
(beginnend am 3'- od. 5'-Ende je nach Typ); kann unbegrenzt
weiterlaufen; z.B. Abbau fehlerhafter Basen während DNAReplikation
Endonukleasen: Spalten eine Nukleinsäure in ihrem Inneren
unspezifisch (z.B: DNase I) oder an einer bestimmten
Erkennungssequenz bzw. bei bestimmten Methylierungsmustern
(Restriktionsenzyme); schneiden solange es möglich ist; dient z.B.
der Phagenabwehr in Bakterien od. Verdau von DNA während
Apoptose.
Apoptoseleiter
Links: „apopotische Leiter“ aus
Rattenleberzellen; 180-185 bp
Fragmente und Vielfache davon;
entstanden durch Verdau der
internukleosomalen Linkerregionen
genomischer DNA durch „caspaseactivated DNases“ (CAD)
Mitte: Längenmarker
Rechts: intakte genomische DNA
aus Rattenleberzellen
Source: wikipedia.org
Restriktionsverdau
Restriktionsenzymtypen:
Typ I: schneiden an zufälliger Stelle, mind. 1000 bp von
Erkennungssequenz entfernt.
Typ II: Homodimere, Erkennungs- und Schnittsequenz ident;
brauchen Mg2+; Einsatz in Gentechnologie. Fragmente
definierter Länge mit definierten Enden.
Typ III: erkennen zwei getrennte Sequenzen auf einem DNAMolekül; schneiden 20–30 bp hinter Erkennungsstelle.
Typ IV: erkennen und schneiden nur modifizierte (methylierte)
DNA.
Restriktionsverdau
Charakterisierung der Typ II-Restriktionsenzyme:
Über 3000 bekannt, über 600 kommerziell erhältlich. Erkennen fremde
DNA und hydrolysieren sie. Jedes Restriktionsenzym = Restriktionsendonuklease (REN) erkennt eine bestimmte DNA-Basensequenz.
Erkennungssequenzen: meist zw. 4 – 8 Basen lang; Wahrscheinlichkeit
des Auftretens im Genom bei 4 Basen: 1x in 44=256 bp bis 48≈65000 bp;
5‘···GTAATG···3‘
meist Palindrome (spiegelbildlich): z.B: 3‘···GTAATG···5‘
oder gegenläufig sich wiederholend („inverted repeats“): 5‘···GTATAC···3‘
3‘···CATATG···5‘
Restriktionsverdau
Nomenklatur der Typ II-Restriktionsenzyme
Bakteriengattung|Art|Stamm|Reihenfolge d. Entdeckung
EcoRI: Escherichia coli; Stamm RY13; als erstes (I) identifiziert
EcoRV: Escherichia coli; Stamm RY13; als fünftes (V) identifiziert
BamHI: als erstes Enzym aus Bacillus amyloliquefaciens, Stamm
H isoliert
Isoschizomere: Restriktionsenzyme mit gleicher Erkennungssequenz, aber aus verschiedenen Organismen; Schnittstelle
identisch oder verschieden
Restriktionsverdau, Typ II-REN
Kohäsive Enden („Sticky“ ends):
5‘-Überhänge: z.B. EcoRI:
5‘···GAATTC···3‘
3‘···CTTAAG···5‘
5‘···G-OH
3‘···CTTAA-PO4
PO4-AATTC···3‘
HO-G···5‘
3‘-Überhänge: z.B. PstI:
5‘···CTGCAG···3‘
3‘···GACGTC···5‘
5‘···CTGCA-OH
3‘···G-PO4
PO4-G···3‘
HO-ACGTC···5‘
Stumpfe Enden („Blunt“ ends): z.B. SmaI:
5‘ ···CCCGGG···3‘
3‘···GGGCCC···5‘
5‘ ···CCC-OH
3‘···GGG-PO4
PO4-GGG···3‘
HO- CCC···5‘
Restriktionsverdau
Typ II-REN
EcoRI
Source: wikipedia.org
BamHI:
Source: University of Arizona
Restriktionsverdau (Praxis)
Maßeinheit eines REN: 1 Unit (U); entspricht der Menge, die benötigt wird,
um bei optimalen Reaktionsbedingungen 1 μg der DNA des Bakteriophagen λ
in einem Reaktionsansatz von 50 μL innerhalb einer Stunde zu spalten.
Im Allgemeinen benötigen Enzyme für ihre Aktivität ein divalentes Kation
(meist Mg2+), optimalen pH (meist 7,5-8), optimale Temperatur (meist 37°C).
Restriktionspuffer enthält:
Tris-Puffer
MgCl2
NaCl oder KCl
Sulfhydrylreagens (Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE), oder
2-Mercaptoethanol) zum Schutz vor Oxidation
Triton X-100 (reduziert Oberflächenspannung)
Enzymlösung enthält DTT, Triton X-100, BSA, EDTA, 50% Glycerin
Restriktionsverdau (Praxis)
Probleme bei Typ II-REN :
Unvollständiger Restriktionsverdau:
• suboptimale Reaktionsbedingungen (zu wenig Enzym, zu kurze
Inkubationszeit, falsche Pufferzusammensetzung (z.B. zu wenig MgCl2))
• Zu hohe Salzkonzentration in der DNA Probe (manche Enzyme sind
sensitiv gegenüber Ionen wie Na+ oder K+): DNA sollte nicht mehr als 25%
des Reaktionsansatzes ausmachen
• Enzym ist durch Methylierung der DNA inhibiert
Star Aktivität: das Enzym spaltet an einer anderen Stelle als der
Standardsequenz
• Zu viel Enzym
• Zu hohe Glycerinkonzentration (>5% v/v)
• Zu lange Inkubationszeit
• Falscher Verdaupuffer
Restriktionsverdau (Praktikum)
Im Praktikum wird das Insert
Bet v 1 (cDNA, die für das
Haupt-Birkenpollen-Allergen
kodiert) mittels der REN EcoRI
und SalI aus dem Vektor pTNTBet v 1 herausgeschnitten.
Im Anschluss werden Insert und
Plasmid gelelektrophoretisch
getrennt.
Gelelektrophorese
• Nukleinsäuren sind innerhalb eines großen pH Bereiches negativ geladen
(Ladungsträger: negativ geladene Phosphatgruppen), daher können sie
durch ein elektrisches Feld aufgetrennt werden.
• Dabei hilft, dass im Gegensatz zu Proteinen bei Nukleinsäuren das
Verhältnis von Molekulargewicht zu Ladung konstant ist →
unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten in der Gelmatrix durch
Größenunterschiede der Nukleinsäuremoleküle.
• Zusätzliche Faktoren: Agarosekonzentration, Spannung, Laufpuffer,
interkalierende Farbstoffe.
• Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer: Vorteile: Fragmente können leichter aus Gel
gereinigt werden, schärfere DNA-Banden, Nachteil: geringe
Pufferkapazität.
• Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer: für lange Elektrophoresen oder bei hohen
Feldstärken, bessere Auftrennung kleiner Fragmente (<2kb).
Gelelektrophorese
• Nukleinsäuren werden auf das Gel mit Hilfe von Auftragspuffern
(loading buffers) aufgetragen; sie erhöhen durch Glycerin, Ficoll,
oder Saccharose die Dichte der Lösung und lassen dadurch die
Lösung in die Geltaschen absinken.
• Auftragspuffer enthalten Farbstoffe (Bromphenolblau, Xylencyanol)
– Anhaltspunkt für Wanderung der DNA: Bromphenolblau wandert
ungefähr so schnell wie ein DNA-Fragment mit 300 bp.
• Längenstandards (Marker) zur
Bestimmung der Fragmentgrößen;
hergestellt durch gezielte Spaltung
bestimmter Plasmid- oder PhagenDNA mit Restriktionsenzymen bzw.
durch Ligationen oder PCR.
Source: ThermoFisher Sci.
Gelelektrophorese
Färbemethoden für Nukleinsäuren:
•
Ethidiumbromid:
– organischer Fluoreszenzfarbstoff, interkaliert bevorzugt in dsDNA, schwächer in
ssDNA oder RNA
starkes Mutagen! (Handling! Entsorgung?)
– Reduziert Mobilität der DNA um ca. 15%
– Durch UV-Licht (254-366 nm) anregbar, emittiert bei 590 nm (orange-rot)
– Bindung an DNA verstärkt Fluoreszenz, Färbung trotz freiem Ethidiumbromid im
Gel gut sichtbar
– Kann direkt dem Gel und dem Laufpuffer zugesetzt werden
– Alternativ: Färbung des Gels nach dem Lauf
– Ermöglicht Nachweis von bis zu 10 ng dsDNA
•
Alternativen: Fluoreszenzfarbstoffe auf Cyaninbasis
– z.B. SYBR-Green, TOTO, YOYO, JOJO, Midori Green…
– Vorteile: Teilweise weniger mutagen aber sensitiver, Anregung mit blauen LEDarrays möglich
keine Nukleinsäureschädigung im Gegensatz zu UV
Gelelektrophorese (Praktikum)
Wir verwenden ein 1%iges w/v Tris-Acetat-EDTA (TAE; 40 mM Tris, 20 mM
Eisessig, 1 mM EDTA)-Agarosegel und tragen den gesamten
Restriktionsverdau des pTNT-Bet v 1 sowie einen Größenstandard (Marker;
1 kb-Leiter) auf. Um die DNA zu färben benützen wir den Midori Green
Advance DNA Stain (Nippon Genetics), ein Farbstoff der bereits vor dem
Gießen direkt in die Gellösung gegeben wird. Dadurch kann auf ein Färben
nach dem Gellauf verzichtet werden. Im Gegensatz zu Ethidiumbromid ist
Midori Green weitgehend ungiftig, da es nicht mit DNA interkaliert; es kann
mit dem Restmüll entsorgt werden.
Der Gellauf erfolgt bei 100 V für ca. 15 min.
Auf einem UV-Transilluminator werden dann die beiden Banden, die das
restliche Plasmid (Länge: 2847 bp) und das Insert (Länge: 495 bp) darstellen
(Vergleich mit Längenmarker), mit einem Skalpell ausgeschnitten.
Im Anschluss wird die DNA aus den Agarosestückchen extrahiert.
Aufreinigung von DNA aus Agarose
Um DNA aus einem Agarosegel aufzureinigen, werden
im Allgemeinen kommerzielle Kits verwendet:
• hohe Konzentration des chaotropen Salzes
Guanidinium Isothiocyanat denaturiert Proteine
(Nukleasen) und zerstört die Hydrathülle der DNA
aus dem ausgeschnittenen und schmelzenden
Agarose-Gel-Stück
Lyse
Binden
• Negativ geladene DNA bindet mit hoher Affinität
über OH-Brücken an positiv geladene Silica-Partikel Waschen
od. Glasfasermatrix
• Verunreinigungen werden weggewaschen
• Elution erfolgt in H2O oder Puffer mit niedrigem
Salzgehalt
Elution
Source: biotechrabbit.com
DNA-Aufreinigung aus Gel (Praktikum)
Die beiden ausgeschnittenen Banden des Plasmids und des Insert werden
jeweils in ein Reagenzröhrchen gegeben und die DNAs werden dann mittels
des GenUPTM Gel Extraktionskit (Biotechrabbit) aus der Agarose extrahiert.
Protokoll:
• Schmelzen der Agarose für 10 min bei 50°C im DISSOLVING-Puffer.
• Transferieren auf den Glasfaserfilter
• Zentrifugation
• Waschen mit Puffer
• Elution der DNA vom Filter mit Elutionspuffer
Bestimmung der DNA-Konzentrationen v. Plasmid und Insert an einem
Photometer (Absorption bei 260 nm: OD=1 entspricht 50 µg/mL dsDNA).
Das Insert soll im Anschluss wieder mit dem Plasmid ligiert werden.
Ligation
DNA Ligasen katalysieren die
Verknüpfung v. dsDNA-Molekülen und
reparieren Einzelstrangbrüche; benötigen
ATP oder NAD+ als Kofaktoren.
Humane DNA
Ligase 1 gebunden
an adenylierter
Bruchstelle
DBD: DNA binding domain
OB: oligonucleotide binding domain
Source: Nandakumar et al, Cell 2006
Ligaseaktivität: ATP → AMP und AMP
katalysiert die Bildung einer
Phosphodiesterbrücke zw. der 3‘Hydroxyl- Gruppe des einen DNAFragments und der 5‘-Phosphatgruppe
des anderen.
Source: addgene.org
Source: biosyn.com
Ligation
Klonieren
Einfügen einer Fremd-DNA - z.B. Insert (your gene of interest YGOI)
eines Plasmids - in ein Empfängerplasmid mit den entsprechenden
Schnittstellen mittels T4 DNA Ligase.
Restriktionsverdau wird idealerweise mit 2 verschiedenen
Restriktionsenzymen durchgeführt, damit bei der anschließenden
Ligation das Insert in der richtigen Orientierung eingebaut wird und
zudem die Möglichkeit eines Religierens des Vektors ohne Insert
verringert wird (Ligieren zweier Vektormoleküle kann ja trotzdem noch
vorkommen; Wahrscheinlichkeit dafür wird durch größeres molares
Verhältnis Insert: Vektor verringert bzw. kann durch
Dephosphorylierung des Empfängerplasmids ganz verhindert werden).
Ligation nach Restriktionsverdau
Ligation (Praktikum)
Im Praktikum werden wir das Insert Bet v 1 (cDNA, die für das HauptBirkenpollenallergen kodiert), das zuvor aus dem Vektor pTNT-Bet v 1
herausgeschnitten wurde, wieder in das geöffnete Plasmid
zurückligieren.
Als Kontrolle setzen wir einen Ligationsansatz an, der nur den
geöffneten Vektor enthält. Wenn der Restriktionsverdau vollständig
war, sollte das Plasmid nicht/kaum religieren können.
Wir werden die T4 DNA Ligase verwenden. Für die hier stattfindende
„sticky ends“-Ligation soll das molare Verhältnis Insert:Vektor 3:1
betragen (wird aber üblicherweise vorher ausgetestet; bei „blunt
end“-Ligation wird mehr Insert eingesetzt, z.B. 10:1).
Ligation
(Praktikum)
© The University of Queensland, modified
Transformation
Veränderung der genetischen Eigenschaften einer prokaryotischen Zelle durch
Aufnahme von genetischem Material (in unserem Fall einer Plasmid DNA) =
Transformation; bei Eukaryoten: Transfektion
Kompetente Bakterien
Modifizierte Bakterienstämme, die leichter DNA über die Zellmembran
aufnehmen können, z.B.: E.coli Stamm XL1-blue:
− Derivat des E.coli Stammes K12 („Sicherheitsstamm“ – für die
Pathogenität verantwortliche Gene für Adhäsionsfaktoren,
Invasionsfaktoren, Toxine, Oberflächenstrukturen fehlen)
− rekombinationsdefizient (recA-): keine unerwünschten
Rekombinationen innerhalb der DNA
− „blue“: Stamm besitzt keine aktive β-Galaktosidase → erlaubt „BlauWeiss-Selektion“ zum Nachweis eines gelungenen Klonierens
Transformation
Source: facebook.com/pedromics
• Die meisten Bakterienstämme zumeist nicht kompetent →
müssen artifiziell kompetent gemacht werden
• Chemisch kompetente Bakterien
• Elektrokompetente Bakterien
Transformation
Chemisch induzierte Kompetenz:
• Kompetenz kann durch zweiwertige Kationen (Ca, Mg, Mn, Rb) erzeugt
werden. Negativ geladene DNA wird von negativ geladenen Molekülen in der
Zellmembran abgestoßen – diese Ladungen werden durch die Zugabe der
Kationen ausgeglichen. DNA kann dann in die Nähe der Zellmembran
kommen.
• Durch Kühlung auf 4°C wird die Interaktion zwischen den zweiwertigen
Kationen und der Zellmembran verstärkt und die Lipidmembran stabilisiert.
• Durch einen anschließenden Hitzeschock (90 Sekunden bei 42°C) entsteht
ein Temperaturgradient zwischen Umgebungsmedium und Innerem der
Zelle, wodurch ein Flüssigkeitsstrom durch die sogenannten Adhäsionszonen
ins Innere der Zelle entsteht.
Transformation
Source: study.com
Elektrokompetente Bakterien f. Elektroporation:
• Wichtig für gute Transformationsrate: hoher Widerstand der
Zellsuspension/geringe Leitfähigkeit des Mediums. Dafür müssen Salze
aus Bakterienmedium gewaschen und Medium durch Glycerin ersetzt
werden.
• Elektrische Pulse von 1 - 2 kV öffnen Membranporen und erlauben das
Aufnehmen der DNA/des Plasmids.
• Elektroporation erzielt höhere Transformationsraten als chemische
Transformation.
Transformation (Praktikum)
Wir verwenden ein Protokoll von Inoue (Gene 96:23-28):
• Bakterienzellen wachsen bis in die logarithmische Phase (viele
Adhäsionszonen) und werden dann in Transformationspuffer (enthält
MnCl2 und CaCl2) gewaschen, resuspendiert und eingefroren
• Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit DNA (Ligationsansätze
Plasmid+Insert sowie Plasmid ohne Insert) auf Eis für 10 min inkubiert
• 90 Sekunden Heat Shock bei 42°C
• Zugabe von LB Medium OHNE Antibiotikum
• Inkubation auf Bakterienschüttler für 20 min, 37°C, 200 rpm
(Antibiotikaresistenz wird ausgebildet)
• Ausplattieren auf Agaroseplatten mit Antibiotikum (Ampicillin) →
Selektion auf Amp-resistente weil β-Lactamase exprimierende
Bakterien mit aufgenommenem, ligiertem Plasmid-Insert-Konstrukt
• Inkubation über Nacht bei 37°C
Transformation (Praktikum)
Ansatz mit geschnittenem Vektor alleine
Es konnte keine Ligation erfolgen, da EcoRI
und SalI keine kompatiblen Enden erzeugen
→ keine Amp-Resistenz.
Die wenigen hochgewachsenen Kolonien
stammen von unvollständigem REN-Verdau
zu Beginn bzw. von Ligation zweier Vektoren.
Ansatz mit Plasmid + Insert
Amp-Resistenz aufgrund des
erfolgreich ligierten Konstrukts
Plasmid+Insert.