VL Nucleinsäure 2
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Nukleinsäuren Teil 2 Prof. Dr. Barbara Krammer Dr. Thomas Verwanger Nicole Maeding, B.Sc. Lisa Meiseleder Programm 1) Restriktionsverdau des im Teil Nukleinsäuren 1 isolierten Plasmids 2) Gelelektrophorese zur Trennung v. Plasmid und Insert 3) Aufreinigung der Fragmente aus Agarose 4) Ligation des Plasmids 5) Transformation von kompetenten Bakterien mit dem ligierten Plasmid Restriktionsverdau Nukleasen • Enzyme, die Nukleinsäuren abbauen: RNasen und DNasen • Phosphodiesterasen: katalysieren hydrolytische Spaltung zwischen der 5'-Phosphatgruppe eines Nukleotids und der 3'-Hydroxylgruppe des benachbarten Nukleotids. Typ “a" Nukleasen schneiden an der 3' Seite der Phosphodiesterbindung und belässt das Phosphat am 5' Ende des verbleibenden Polynukleotids. 3' Typ a Typ b 5' Typ “b" Nukleasen schneiden an der 5' Seite der Phosphodiesterbindung und belässt das Phosphat am 3' Ende des Polynukleotids. Restriktionsverdau 2 Klassen von Nukleasen: Exonukleasen: Abbau der Nukleinsäure von ihrem Ende her (beginnend am 3'- od. 5'-Ende je nach Typ); kann unbegrenzt weiterlaufen; z.B. Abbau fehlerhafter Basen während DNAReplikation Endonukleasen: Spalten eine Nukleinsäure in ihrem Inneren unspezifisch (z.B: DNase I) oder an einer bestimmten Erkennungssequenz bzw. bei bestimmten Methylierungsmustern (Restriktionsenzyme); schneiden solange es möglich ist; dient z.B. der Phagenabwehr in Bakterien od. Verdau von DNA während Apoptose. Apoptoseleiter Links: „apopotische Leiter“ aus Rattenleberzellen; 180-185 bp Fragmente und Vielfache davon; entstanden durch Verdau der internukleosomalen Linkerregionen genomischer DNA durch „caspaseactivated DNases“ (CAD) Mitte: Längenmarker Rechts: intakte genomische DNA aus Rattenleberzellen Source: wikipedia.org Restriktionsverdau Restriktionsenzymtypen: Typ I: schneiden an zufälliger Stelle, mind. 1000 bp von Erkennungssequenz entfernt. Typ II: Homodimere, Erkennungs- und Schnittsequenz ident; brauchen Mg2+; Einsatz in Gentechnologie. Fragmente definierter Länge mit definierten Enden. Typ III: erkennen zwei getrennte Sequenzen auf einem DNAMolekül; schneiden 20–30 bp hinter Erkennungsstelle. Typ IV: erkennen und schneiden nur modifizierte (methylierte) DNA. Restriktionsverdau Charakterisierung der Typ II-Restriktionsenzyme: Über 3000 bekannt, über 600 kommerziell erhältlich. Erkennen fremde DNA und hydrolysieren sie. Jedes Restriktionsenzym = Restriktionsendonuklease (REN) erkennt eine bestimmte DNA-Basensequenz. Erkennungssequenzen: meist zw. 4 – 8 Basen lang; Wahrscheinlichkeit des Auftretens im Genom bei 4 Basen: 1x in 44=256 bp bis 48≈65000 bp; 5‘···GTAATG···3‘ meist Palindrome (spiegelbildlich): z.B: 3‘···GTAATG···5‘ oder gegenläufig sich wiederholend („inverted repeats“): 5‘···GTATAC···3‘ 3‘···CATATG···5‘ Restriktionsverdau Nomenklatur der Typ II-Restriktionsenzyme Bakteriengattung|Art|Stamm|Reihenfolge d. Entdeckung EcoRI: Escherichia coli; Stamm RY13; als erstes (I) identifiziert EcoRV: Escherichia coli; Stamm RY13; als fünftes (V) identifiziert BamHI: als erstes Enzym aus Bacillus amyloliquefaciens, Stamm H isoliert Isoschizomere: Restriktionsenzyme mit gleicher Erkennungssequenz, aber aus verschiedenen Organismen; Schnittstelle identisch oder verschieden Restriktionsverdau, Typ II-REN Kohäsive Enden („Sticky“ ends): 5‘-Überhänge: z.B. EcoRI: 5‘···GAATTC···3‘ 3‘···CTTAAG···5‘ 5‘···G-OH 3‘···CTTAA-PO4 PO4-AATTC···3‘ HO-G···5‘ 3‘-Überhänge: z.B. PstI: 5‘···CTGCAG···3‘ 3‘···GACGTC···5‘ 5‘···CTGCA-OH 3‘···G-PO4 PO4-G···3‘ HO-ACGTC···5‘ Stumpfe Enden („Blunt“ ends): z.B. SmaI: 5‘ ···CCCGGG···3‘ 3‘···GGGCCC···5‘ 5‘ ···CCC-OH 3‘···GGG-PO4 PO4-GGG···3‘ HO- CCC···5‘ Restriktionsverdau Typ II-REN EcoRI Source: wikipedia.org BamHI: Source: University of Arizona Restriktionsverdau (Praxis) Maßeinheit eines REN: 1 Unit (U); entspricht der Menge, die benötigt wird, um bei optimalen Reaktionsbedingungen 1 μg der DNA des Bakteriophagen λ in einem Reaktionsansatz von 50 μL innerhalb einer Stunde zu spalten. Im Allgemeinen benötigen Enzyme für ihre Aktivität ein divalentes Kation (meist Mg2+), optimalen pH (meist 7,5-8), optimale Temperatur (meist 37°C). Restriktionspuffer enthält: Tris-Puffer MgCl2 NaCl oder KCl Sulfhydrylreagens (Dithiothreitol (DTT), Dithioerythritol (DTE), oder 2-Mercaptoethanol) zum Schutz vor Oxidation Triton X-100 (reduziert Oberflächenspannung) Enzymlösung enthält DTT, Triton X-100, BSA, EDTA, 50% Glycerin Restriktionsverdau (Praxis) Probleme bei Typ II-REN : Unvollständiger Restriktionsverdau: • suboptimale Reaktionsbedingungen (zu wenig Enzym, zu kurze Inkubationszeit, falsche Pufferzusammensetzung (z.B. zu wenig MgCl2)) • Zu hohe Salzkonzentration in der DNA Probe (manche Enzyme sind sensitiv gegenüber Ionen wie Na+ oder K+): DNA sollte nicht mehr als 25% des Reaktionsansatzes ausmachen • Enzym ist durch Methylierung der DNA inhibiert Star Aktivität: das Enzym spaltet an einer anderen Stelle als der Standardsequenz • Zu viel Enzym • Zu hohe Glycerinkonzentration (>5% v/v) • Zu lange Inkubationszeit • Falscher Verdaupuffer Restriktionsverdau (Praktikum) Im Praktikum wird das Insert Bet v 1 (cDNA, die für das Haupt-Birkenpollen-Allergen kodiert) mittels der REN EcoRI und SalI aus dem Vektor pTNTBet v 1 herausgeschnitten. Im Anschluss werden Insert und Plasmid gelelektrophoretisch getrennt. Gelelektrophorese • Nukleinsäuren sind innerhalb eines großen pH Bereiches negativ geladen (Ladungsträger: negativ geladene Phosphatgruppen), daher können sie durch ein elektrisches Feld aufgetrennt werden. • Dabei hilft, dass im Gegensatz zu Proteinen bei Nukleinsäuren das Verhältnis von Molekulargewicht zu Ladung konstant ist → unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten in der Gelmatrix durch Größenunterschiede der Nukleinsäuremoleküle. • Zusätzliche Faktoren: Agarosekonzentration, Spannung, Laufpuffer, interkalierende Farbstoffe. • Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer: Vorteile: Fragmente können leichter aus Gel gereinigt werden, schärfere DNA-Banden, Nachteil: geringe Pufferkapazität. • Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer: für lange Elektrophoresen oder bei hohen Feldstärken, bessere Auftrennung kleiner Fragmente (<2kb). Gelelektrophorese • Nukleinsäuren werden auf das Gel mit Hilfe von Auftragspuffern (loading buffers) aufgetragen; sie erhöhen durch Glycerin, Ficoll, oder Saccharose die Dichte der Lösung und lassen dadurch die Lösung in die Geltaschen absinken. • Auftragspuffer enthalten Farbstoffe (Bromphenolblau, Xylencyanol) – Anhaltspunkt für Wanderung der DNA: Bromphenolblau wandert ungefähr so schnell wie ein DNA-Fragment mit 300 bp. • Längenstandards (Marker) zur Bestimmung der Fragmentgrößen; hergestellt durch gezielte Spaltung bestimmter Plasmid- oder PhagenDNA mit Restriktionsenzymen bzw. durch Ligationen oder PCR. Source: ThermoFisher Sci. Gelelektrophorese Färbemethoden für Nukleinsäuren: • Ethidiumbromid: – organischer Fluoreszenzfarbstoff, interkaliert bevorzugt in dsDNA, schwächer in ssDNA oder RNA starkes Mutagen! (Handling! Entsorgung?) – Reduziert Mobilität der DNA um ca. 15% – Durch UV-Licht (254-366 nm) anregbar, emittiert bei 590 nm (orange-rot) – Bindung an DNA verstärkt Fluoreszenz, Färbung trotz freiem Ethidiumbromid im Gel gut sichtbar – Kann direkt dem Gel und dem Laufpuffer zugesetzt werden – Alternativ: Färbung des Gels nach dem Lauf – Ermöglicht Nachweis von bis zu 10 ng dsDNA • Alternativen: Fluoreszenzfarbstoffe auf Cyaninbasis – z.B. SYBR-Green, TOTO, YOYO, JOJO, Midori Green… – Vorteile: Teilweise weniger mutagen aber sensitiver, Anregung mit blauen LEDarrays möglich keine Nukleinsäureschädigung im Gegensatz zu UV Gelelektrophorese (Praktikum) Wir verwenden ein 1%iges w/v Tris-Acetat-EDTA (TAE; 40 mM Tris, 20 mM Eisessig, 1 mM EDTA)-Agarosegel und tragen den gesamten Restriktionsverdau des pTNT-Bet v 1 sowie einen Größenstandard (Marker; 1 kb-Leiter) auf. Um die DNA zu färben benützen wir den Midori Green Advance DNA Stain (Nippon Genetics), ein Farbstoff der bereits vor dem Gießen direkt in die Gellösung gegeben wird. Dadurch kann auf ein Färben nach dem Gellauf verzichtet werden. Im Gegensatz zu Ethidiumbromid ist Midori Green weitgehend ungiftig, da es nicht mit DNA interkaliert; es kann mit dem Restmüll entsorgt werden. Der Gellauf erfolgt bei 100 V für ca. 15 min. Auf einem UV-Transilluminator werden dann die beiden Banden, die das restliche Plasmid (Länge: 2847 bp) und das Insert (Länge: 495 bp) darstellen (Vergleich mit Längenmarker), mit einem Skalpell ausgeschnitten. Im Anschluss wird die DNA aus den Agarosestückchen extrahiert. Aufreinigung von DNA aus Agarose Um DNA aus einem Agarosegel aufzureinigen, werden im Allgemeinen kommerzielle Kits verwendet: • hohe Konzentration des chaotropen Salzes Guanidinium Isothiocyanat denaturiert Proteine (Nukleasen) und zerstört die Hydrathülle der DNA aus dem ausgeschnittenen und schmelzenden Agarose-Gel-Stück Lyse Binden • Negativ geladene DNA bindet mit hoher Affinität über OH-Brücken an positiv geladene Silica-Partikel Waschen od. Glasfasermatrix • Verunreinigungen werden weggewaschen • Elution erfolgt in H2O oder Puffer mit niedrigem Salzgehalt Elution Source: biotechrabbit.com DNA-Aufreinigung aus Gel (Praktikum) Die beiden ausgeschnittenen Banden des Plasmids und des Insert werden jeweils in ein Reagenzröhrchen gegeben und die DNAs werden dann mittels des GenUPTM Gel Extraktionskit (Biotechrabbit) aus der Agarose extrahiert. Protokoll: • Schmelzen der Agarose für 10 min bei 50°C im DISSOLVING-Puffer. • Transferieren auf den Glasfaserfilter • Zentrifugation • Waschen mit Puffer • Elution der DNA vom Filter mit Elutionspuffer Bestimmung der DNA-Konzentrationen v. Plasmid und Insert an einem Photometer (Absorption bei 260 nm: OD=1 entspricht 50 µg/mL dsDNA). Das Insert soll im Anschluss wieder mit dem Plasmid ligiert werden. Ligation DNA Ligasen katalysieren die Verknüpfung v. dsDNA-Molekülen und reparieren Einzelstrangbrüche; benötigen ATP oder NAD+ als Kofaktoren. Humane DNA Ligase 1 gebunden an adenylierter Bruchstelle DBD: DNA binding domain OB: oligonucleotide binding domain Source: Nandakumar et al, Cell 2006 Ligaseaktivität: ATP → AMP und AMP katalysiert die Bildung einer Phosphodiesterbrücke zw. der 3‘Hydroxyl- Gruppe des einen DNAFragments und der 5‘-Phosphatgruppe des anderen. Source: addgene.org Source: biosyn.com Ligation Klonieren Einfügen einer Fremd-DNA - z.B. Insert (your gene of interest YGOI) eines Plasmids - in ein Empfängerplasmid mit den entsprechenden Schnittstellen mittels T4 DNA Ligase. Restriktionsverdau wird idealerweise mit 2 verschiedenen Restriktionsenzymen durchgeführt, damit bei der anschließenden Ligation das Insert in der richtigen Orientierung eingebaut wird und zudem die Möglichkeit eines Religierens des Vektors ohne Insert verringert wird (Ligieren zweier Vektormoleküle kann ja trotzdem noch vorkommen; Wahrscheinlichkeit dafür wird durch größeres molares Verhältnis Insert: Vektor verringert bzw. kann durch Dephosphorylierung des Empfängerplasmids ganz verhindert werden). Ligation nach Restriktionsverdau Ligation (Praktikum) Im Praktikum werden wir das Insert Bet v 1 (cDNA, die für das HauptBirkenpollenallergen kodiert), das zuvor aus dem Vektor pTNT-Bet v 1 herausgeschnitten wurde, wieder in das geöffnete Plasmid zurückligieren. Als Kontrolle setzen wir einen Ligationsansatz an, der nur den geöffneten Vektor enthält. Wenn der Restriktionsverdau vollständig war, sollte das Plasmid nicht/kaum religieren können. Wir werden die T4 DNA Ligase verwenden. Für die hier stattfindende „sticky ends“-Ligation soll das molare Verhältnis Insert:Vektor 3:1 betragen (wird aber üblicherweise vorher ausgetestet; bei „blunt end“-Ligation wird mehr Insert eingesetzt, z.B. 10:1). Ligation (Praktikum) © The University of Queensland, modified Transformation Veränderung der genetischen Eigenschaften einer prokaryotischen Zelle durch Aufnahme von genetischem Material (in unserem Fall einer Plasmid DNA) = Transformation; bei Eukaryoten: Transfektion Kompetente Bakterien Modifizierte Bakterienstämme, die leichter DNA über die Zellmembran aufnehmen können, z.B.: E.coli Stamm XL1-blue: − Derivat des E.coli Stammes K12 („Sicherheitsstamm“ – für die Pathogenität verantwortliche Gene für Adhäsionsfaktoren, Invasionsfaktoren, Toxine, Oberflächenstrukturen fehlen) − rekombinationsdefizient (recA-): keine unerwünschten Rekombinationen innerhalb der DNA − „blue“: Stamm besitzt keine aktive β-Galaktosidase → erlaubt „BlauWeiss-Selektion“ zum Nachweis eines gelungenen Klonierens Transformation Source: facebook.com/pedromics • Die meisten Bakterienstämme zumeist nicht kompetent → müssen artifiziell kompetent gemacht werden • Chemisch kompetente Bakterien • Elektrokompetente Bakterien Transformation Chemisch induzierte Kompetenz: • Kompetenz kann durch zweiwertige Kationen (Ca, Mg, Mn, Rb) erzeugt werden. Negativ geladene DNA wird von negativ geladenen Molekülen in der Zellmembran abgestoßen – diese Ladungen werden durch die Zugabe der Kationen ausgeglichen. DNA kann dann in die Nähe der Zellmembran kommen. • Durch Kühlung auf 4°C wird die Interaktion zwischen den zweiwertigen Kationen und der Zellmembran verstärkt und die Lipidmembran stabilisiert. • Durch einen anschließenden Hitzeschock (90 Sekunden bei 42°C) entsteht ein Temperaturgradient zwischen Umgebungsmedium und Innerem der Zelle, wodurch ein Flüssigkeitsstrom durch die sogenannten Adhäsionszonen ins Innere der Zelle entsteht. Transformation Source: study.com Elektrokompetente Bakterien f. Elektroporation: • Wichtig für gute Transformationsrate: hoher Widerstand der Zellsuspension/geringe Leitfähigkeit des Mediums. Dafür müssen Salze aus Bakterienmedium gewaschen und Medium durch Glycerin ersetzt werden. • Elektrische Pulse von 1 - 2 kV öffnen Membranporen und erlauben das Aufnehmen der DNA/des Plasmids. • Elektroporation erzielt höhere Transformationsraten als chemische Transformation. Transformation (Praktikum) Wir verwenden ein Protokoll von Inoue (Gene 96:23-28): • Bakterienzellen wachsen bis in die logarithmische Phase (viele Adhäsionszonen) und werden dann in Transformationspuffer (enthält MnCl2 und CaCl2) gewaschen, resuspendiert und eingefroren • Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit DNA (Ligationsansätze Plasmid+Insert sowie Plasmid ohne Insert) auf Eis für 10 min inkubiert • 90 Sekunden Heat Shock bei 42°C • Zugabe von LB Medium OHNE Antibiotikum • Inkubation auf Bakterienschüttler für 20 min, 37°C, 200 rpm (Antibiotikaresistenz wird ausgebildet) • Ausplattieren auf Agaroseplatten mit Antibiotikum (Ampicillin) → Selektion auf Amp-resistente weil β-Lactamase exprimierende Bakterien mit aufgenommenem, ligiertem Plasmid-Insert-Konstrukt • Inkubation über Nacht bei 37°C Transformation (Praktikum) Ansatz mit geschnittenem Vektor alleine Es konnte keine Ligation erfolgen, da EcoRI und SalI keine kompatiblen Enden erzeugen → keine Amp-Resistenz. Die wenigen hochgewachsenen Kolonien stammen von unvollständigem REN-Verdau zu Beginn bzw. von Ligation zweier Vektoren. Ansatz mit Plasmid + Insert Amp-Resistenz aufgrund des erfolgreich ligierten Konstrukts Plasmid+Insert.
