Klebsiella pneumoniae and Vibrio alginolyticus - ETH E

DISS.ETH Nr. 11385
The
Na+-dependent NADH:ubiquinone oxidoreductases
Klebsiella pneumoniae and Vibrio alginolyticus
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH
for the
degree of
DOCTOR OF NATURAL SCIENCES
presented by
XIAO DAN PFENNINGER-LI
Dipl. Ing. AgrVdipl.
Microbiol.
born June 3,1965
in Xian
(Shannxi Province), People's Republic of China
accepted
on
the recommendation of
Prof. Dr. P. Dimroth, examiner
Prof. Dr. T.
Leisinger,
coexaminer
Zürich, 1995
from
5
Zusammenfassung/Summary
1.
1.1
Zusammenfassung
Klebsiella
als
pneumoniae benötigt Natriumionen
Kohlenstoff-
einziger
Symporter
in die Zelle
Oxalacetat
wird
und mit Hilfe der
transportiert
Acetat
zu
gebildet wird,
welches für
Formiat und 1.2 CO2. Die
darauf
weist
Bildung
hin,
Reduktionsäquivalente
dass
von
in Oxalacetat und
die
Durch weitere Reaktionen
ATP
durch
Substratketten-
NADH-Synthese
Elektonenakzeptor
Reaktionen verwendet werden kann.
eine
1 Citrat entstehen
aus
Teiloxidation
Elektronen
solcher Zellen involviert. Die
die
Formiat
von
CO2
zu
Citrat in den Zellkohlenstoff
von
membrangebundene
Oxidation
dient. In
2 Acetat, 0.5
als 1 Formiat und mehr als 1 CO2 pro
weniger
für die Assimilation
Dehydrogenase katalysiert
Ubichinon als
ergibt:
durch
werden. Eine
Verfugung gestellt
offenbar in die
ein
biosynthetische
Die Stöchiometrie der Citratfermentation
Formiat
Citrat-Lyase
Na+-Citrat
membrangebundene Na+-Pumpe,
wobei
umgesetzt,
durch einen
gewonnen wird. Ein Problem der Citratfermentation ist, dass kein
phosphorylierung
Citrat
Citrat wird
Decarboxylase, in Pyruvat und CO2 umgewandelt.
Pyruvat
NADH
Energiequelle.
Oxalacetat wird durch eine
gespalten.
Acetat
und
für das anaerobe Wachstum auf Citrat
von
Gegenwart
zur
Transportkette
ist
membrangebundene
Formiat
CO2,
zu
wobei
eines elektrochemischen Na+-
Gradienten, kann Chinol seine Elektronen auf NAD+ übertragen. Dabei wird NAD+
NADH reduziert
(umgekehrter Elektonentransfer).
einem chemischen Na+-Gradient
Niveau
NADH
von
K.
wurde
(ApNa+)
pneumoniae in Gegenwart
in
Gegenwart
Hydroxyquinoline-N-Oxid
von
(HQNO),
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase,
die Reduktion
man
von
von
NAD+
zu
waren
und
Ay
von
Die
von
einem
aufgehoben.
oder
durch
die
Bildung.
NADH-Bildung
Bildung
Zugabe
von
von
für
Inside-out Membranvesikel konnten
katalysieren,
wenn
anlegte.
Dieser setzt sich
aus
zusammen.
Sowohl
ApNa+
A\|f
Sauerstoff oder
durch
NADH-
Hemmstoff
spezifischen
bei
120 mV
von
gleicher Grössenordnung
endogene
Formiat zunahm. Die
NADH mit Formiat als Elektrondonor
essentiell für die NADH
inaktivieren.
gezeigt werden, dass
mehr als -100 mV das
Sauerstoff
einen elektrochemischen Na+-Gradienten
ApNa+
Es konnte
zu
den
HQNO
umgekehrten
als auch
konnten die Reaktion
A|lNa+-gekoppelten
6
Elektronentransfer in anaeroben K. pneumoniae Zellen ist eine essentielle
Synthese
für die
Vibrio
von
Zellmaterial
alginolyticus
sein Wachstum
aus
Citrat.
ist ein fakultativ anaerob, marines Bakterium, das Na+ Ionen für
benötigt.
Dieser
Organismus
kann bei alkalischem
Carbonylcyanid m-Chlorophenylhydrazon (CCCP),
diesem
NQR)
Organismus
als
wurde eine
Komponente
bekannt war, bestand
der
Na+-abhägige
Enzym
aus nur
aus
Schwefel
Cluster
von
Untereinheitenkomposition
Gegenwart
Protononophor,
Wie bereits
aus
von
wachsen. In
(Na+-
früheren Arbeiten
gereinigten IT-abhängigen
Da alle
eukaryotischen
prosthetische
und die
in
drei Untereinheiten und enthielt sowohl
mehreren Untereinheiten bestehen und
als
pH
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase
prosthetische Gruppen.
Oxidoreduktasen
Organismen
einem
Atmungskette gefunden.
dieses
FAD als auch FMN als
NADH:Ubichinon
Anforderrung
nur
Gruppen
und
prokaryotischen
FMN und mehrere Eisen-
besitzen,
wurden
die
Na+-NQR
für die
Na+-NQR
prosthetischen Gruppen
die
genauer
untersucht.
In dieser Arbeit wurde ein
alginolyticus
dominante
mit dem
Banden,
als
Reinigungsverfahren
von
Detergenz Lauryldimethylamin N-Oxid (LDAO) etabliert.
V.
Vier
sowie mehrere Nebenbanden konnten mittels SDS-PAGE einer
gereinigten Preparation
wurden
neues
sichtbar
Genprodukte
des
identifiziert. Das gereinigte
werden. Drei der vier dominanten
gemacht
nqr
Operons,
Enzym zeigt
welches
für
sowohl NADH
die
Polypeptide
Na+-NQR kodiert,
Dehydrogenase
Chinon Reduktase Aktivität. Die beiden Aktivitäten konnten wirksam durch
als auch
AgMonen
(Kj 0.2 JIM) gehemmt werden. Die Chinon Reduktase Aktivität wurde durch HQNO (Ki
0.4
p.M) gehemmt
und durch Nationen
spektroskopische Analysen
einen
haben
[2Fe-2S] Typ Eisen-Schwefel
Funktionen der
gereinigte
Octylglucosid,
in
dass das
Cluster als
prosthetischen Gruppen
Modell für den Elektronentransfer
Die
gezeigt,
(K„, 10 mM) aktiviert. Chemische und
gereinigte Enzym
ein FAD und
prosthetische Gruppen
wurden untersucht und ein
enthält. Die
hypotethisches
vorgeschlagen.
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase wurde durch
Liposomen eingebaut
und der
Na+-Transport
Verdünnung
in die
mit
entsprechenden
7
Proteoliposomen
Proteoliposomen
untersucht.
die Na+-Aufnähme in
Stöchiometrie des Na+-Einstromes
Ionen
wurde
geeigneten
Unter
durch
lag
HQNO oder
Bedingungen katalysierten
Gegenwart
von
diese
NADH und Ubichinon-1. Die
bei 0.5 Na+ pro NADH. Der
Transport
Monensin
durch
gehemmt,
und
von
Na+-
CCCP
und
Valinomycin
stimuliert. Diese Daten beweisen, dass die
Na*-NQR
primäre Na+ Pumpe ist. Ein indirekter Na+-Transportmechanisrnus durch
eine
ein
IT-abhängige
NADH:Ubichinon
aus
Oxidoreduktase in
Na7H+ Antiporter ist dadurch ausgeschlossen.
V.
alginolyticus isolierte
Kombination
mit
einem
8
1.2
Summary
Klebsiella pneumoniae needs sodium ions when grown under anaerobic condition
with citrate
as
sole carbon and energy
Citrate is
source.
Na+-citrate symporter and is then cleaved by citrate lyase
Oxaloacetate is
oxaloacetate
forming
degraded
ATP
by
a
and acetate.
Na+-pump
further reactions, pyruvate is converted to acetate
phosphorylation.
Substrate level
by
to oxaloacetate
pyruvate and CO2 by the membrane-bound
to
decarboxylase. Through
one
into the cell
transported
problem
A
of the
NADH is formed which could be used for
citrate
fermentation pathway is that
no
reactions. The
of citrate fermentation is 1 citrate fermented to 2 acetate,
stoichiometry
0.5 formale and 1.2 C02. The formation of less than 1 formate and
citrate
can
be accounted for
by
provide reducing equivalent
for
the
these cells. Membrane-bound formate
C02 with ubiquinone
gradient (Ap:Na+),
the
as
assimilation of citrate
apparently
can
into
the oxidation of formate
dehydrogenase catalyses
was
found that the
an
electrochemical Na+
endogenous
pneumoniae increased in the presence of formate and in response
of
more
than -100 mV. NADH formation
the presence of oxygen
inhibitor for
application
ApNa+
after addition of
NADH:ubiquinone
pneumoniae catalysed
after
or
of
was
to a chemical
completely
same
NADH formation and oxygen
or
Na+
abolished in
hydroxyquinoline-N-oxide,
a
specific
oxidoreductase. Inverted membrane vesicles of K.
electrochemical Na+
and AH-* of about the
to
NADH level of K.
the reduction of NAD* to NADH with formate
an
A
synthesis by
further deliver its electrons to NAD+ and reduce it
NADH (reversed electron transfer). It
gradient (ApNa+)
carbon.
cell
involved in NADH
electron acceptor. In the presence of
quinol
that 1 CO2 per
the oxidation part of the formate to C02 in order to
membrane-bound electron transport chain is
to
more
biosynthetic
gradient
magnitude.
Both
electron donor
of about 120 mV
ApNa+
and t^V
hydroxyquinoline-N-oxide
A(iNa+-coupled
as
were
consisting
of
essential for
inactivated the reaction.
The NADH formation
by
pneumoniae cells is
essential requirement for the synthesis of cell material from the
highly
an
oxidised citrate.
reversed
electron transfer in anaerobic K.
9
Vibrio
ions for
is
alginolyticus
a
falcutative anaerobic marine bacterium that
growth. Remarkably,
the proton
this
organism
grow at alkaline
can
chain component.
According
containing
are
both FMN and FAD
sulfur Clusters
composed
as
prosthetic
as
oxidoreductases
of much
respiratory
as a
groups. Since all
from
purified H*-
and
eukaryotic
three
prokaryotic
subunits and contain FMN and several iron-
more
groups, the subunit
prosthetic
found
was
A Na*-
previous work, the enzyme is composed of
to
translocating NADH:ubiquinone
organisms
pH
ionophore carbonyl Cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP).
dependent NADH:ubiquinone oxidoreductase (Na*-NQR)
subunits
requires Na*
in the presence of
compositum
and the
prosthetic
groups
present in this enzyme have been re-examined.
In this
the
work,
a
preparation.
products
inhibited
number of minor bands
dehydrogenase
quinone
by Ag+ ions (K,
inhibited
by HQNO (K,
JIM)
0.4
spectroscopic analyses
[2Fe-2S] type
a
and
and
visible
groups have been studied and
as
an
the
of V.
alginolyticus
purified
have been identified
The
purified
gene
as
enzyme showed
reductase activities. The two activities
The
|iM).
activated
quinone
by Na*
with
established. Four dominant
SDS-PAGE of the
on
Na+-NQR.
have revealed that the
iron-sulfur Cluster
was
Polypeptides
0.2
was
Na*-NQR
(LDAO)
were
the nqr Operon which encodes
both NADH
effectively
N-oxide
Three of the four dominant
of
for the
purification procedura
detergent lauryldimethylamine
bands and
and
a new
ions
reductase
were
activity
was
(K„ 10 mM). Chemical
purified enzyme
contained
prosthetic groups. Functions
a
of the
FAD and
prosthetic
model of electron transfer has been
hypothetical
proposed.
Purified
detergent
dilution
proteoliposomes
with
was
catalysed Na* uptake
stoichiometry
or
octyl
glucoside
investigated.
Under
was
incorporated
Na+
and
Na*-NQR
CCCP
isolated from V.
or
valinomycin.
alginolyticus is
a
liposomes by
into
the
ubiquinone-1
of 0.5 Na+ per NADH. The transport of Na* ions
by
into
transport
proper conditions,
in the presence of NADH and
monensin and stimulated
that the
oxidoreductase
NADH:ubiquinone
the
derived
proteoliposomes
with
an
apparent
was
inhibited
by HQNO
These data
provided
firm
primary Na* pump.
proof
An indirect Na*
10
transport mechanism by
combination with
a
a
H^translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase
Na+/H* antiporter has therefore been excluded.
in