Poster F.O.M.-Konferenz 2016
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Hintergrund: Matrix-pH Korrekturen erhöhen die lineare Abhängigkeit von NADH Lifetime zu zellulärer Atmung Für eine Vielzahl von Krankheiten des höheren Lebensalters, und insbesondere für neurodegenerativen Erkrankungen, wurden Änderungen des Energiemetabolismus beschrieben. Bei der Alzheimer Demenz (AD) handelt es sich um eine volkswirtschaftlich äußerst kostenintensive Erkrankung, deren Folgekosten weltweit in die Milliarden gehen und gegen die bis heute keine ursächliche Therapie zur Verfügung steht. Aktuelle Daten sprechen dafür, dass komplexe Änderungen von Stoffwechselprozessen in den Mitochondrien, den sog. Kraftwerken der Zelle, dabei eine zentrale Rolle spielen. Die Aufklärung dieser Prozesse in lebenden Zellen stellt hohe Anforderungen an die Untersuchungsmethode, sowohl was Datenaufnahme als auch die simultane Erfassung verschiedener Stoffwechselparameter betrifft. Die strukturelle und metabolische Komplexität von Nervenzellen macht es notwendig diese Vorgänge für ein besseres Verständnis zu visualisieren. Zielsetzung: Entwicklung eines optischen in vitro und in vivo Screening Systems zum Monitoring mitochondrialer Stoffwechselveränderungen Abbildung 6: Die Korrektur auf den mitochondrialen Matrix-pH verbessert die Korrelation von NADH-Lifetime und zellulärer Atmung NADH-FLIM Glycolyse Antimycin A normaler Energiemetabolismus 2-DG mitochondriale Atmung Sauerstoff (pO2) Matrix pH NADPH NADH FLIM zeigt reduzierte mitochondriale Atmung nach APP Expression in HEK293 Zellen frei NADH gebunden freies NADH (400ps) n=6 gebundenes NADH (2500ps) verbesserte quantitative Analyse NADH FLIM verändert nach Garcia-Escudero et al., 2013 Abbildung 1: Bestimmung des mitochondrialen Energiemetabolismus durch Messung von NADH-Fluoreszenz mittels “Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy” (FLIM) n=8 Oroboros Oxygraph-2k Pixel number Photon number NADH FLIM Methode: NADH FLIM Abbildung 2: Messung der NADH-Fluoreszenzabklingzeit mittels FLIM und “Time correlated single photon counting” (TCSPC) FCCP n=7 n=7 NADH FLIM ** *** Abbildung 7: Detektion von reduzierter Atmung nach APP Expression in HEK293 Zellen mittels NADH-FLIM und Respirometrie. Aufhebung des Defekts durch GSI-Behandlung Ergebnisse: Korrelation von NADH-FLIM und Respirometrie respirometry *** τmean [ps] Time after excitation pulse [ns] Rotenone *** Anwendung des Protokolls bei primären hippocampalen Neuronen / hippocampalen Hirn-Schnitten n=3 n=4 Abbildung 3: Korrelation von NADH-FLIM und Respirometrie durch Verwendung von Entkoppler-Inhibitor Protokollen Abbildung 8: NADH-FLIM ermöglicht die Darstellung metabolischer Unterschiede in Nervenzellen und Nervengewebe Inhibitoren der Atmungskette verstärken den “uncoupling” effect von FCCP im NADH-FLIM Simultanes FLIM/PLIM von SCC-4 Zellen ohne und mit Antimycin A Behandlung untreated Antimycin A Abbildung 9: Parallele Messungen von NADH-FLIM und pO2 ermöglichen eine verbesserte Analyse der mitochondriellen Funktionen in Monolayer-Kulturen Outlook: MitoSkopie-MEtabox n=4 Abbildung 4: Vorbehandlung von HEK293 mit Inhibitoren der Atmungskette verstärkt den Entkopplungs-Effekt von FCCP im NADH-FLIM pH Änderungen beeinflussen die NADH-Lifetime n=3 Slope: -905,7±46,4 ps / pH unit Abbildung 5: Die Effektstärke von pH auf die NADH-Lifetime variiert in verschiedenen zellulären Kompartimenten
