Vorkommen und Bedeutung zirkulierender dendritischer Zellen bei

Universitätsklinik für Anästhesiologie
Prof. Dr. M. Georgieff
Vorkommen und Bedeutung zirkulierender dendritischer Zellen bei
intensivtherapiepflichtigen, postoperativen Patienten mit schwerer Sepsis oder
septischem Schock
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der
Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
von
Michaela Maria Elfriede Appel,
geboren in: Ingolstadt
2005
amtierender Dekan: Herr Prof. Dr. med. Klaus-Michael Debatin
1.Berichterstatter: Frau Prof. Dr. Marion Schneider
2.Berichterstatter: Herr Prof. Dr. med. Dietmar Abendroth
Tag der Promotion: 25.11.2005
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
2
EINLEITUNG
5
SEPSIS
DENDRITISCHE ZELLEN
HÄMOPHAGOZYTISCHE LYMPHOHISTIOZYTOSE
CD 2
CD86
SIL-2R
INTERFERON GAMMA
FRAGESTELLUNG
MATERIAL UND METHODEN
5
9
10
12
13
13
14
15
17
2.1 PATIENTENGUT
2.2 DATENGEWINNUNG DC
2.2.1 DURCHFLUSSZYTOMETRIE
2.2.1.1 Probengewinnung
2.2.1.2 Probenaufbereitung
2.2.1.3 Messung
2.3 DATENGEWINNUNG ZYTOKINE
2.4 DATENGEWINNUNG KLINISCH-CHEMISCHE PARAMETER
2.5 STATISTISCHE AUSWERTUNG UND ETHIKKOMMISSION
17
20
20
20
20
22
25
25
26
3
27
ERGEBNISSE
3.1 VORKOMMEN DENDRITISCHER ZELLEN
3.1.1 ALLGEMEINES
3.1.2 BEI NORMALSPENDERN
3.1.3 BEI PATIENTEN
3.2 TYPISCHE HLH-PARAMETER BEI SEPSISPATIENTEN
3.2.1 SIL2-R
3.2.2 IFNG
3.2.3 LEUKOZYTEN
3.2.4 THROMBOZYTEN
3.3 FALLDARSTELLUNG DC-PATIENTEN
3.3.1 FALL 1
3.3.2 FALL 2
3.3.3 FALL 3
3.3.4 FALL 4
27
27
27
27
30
30
32
33
35
37
37
39
41
43
4
45
DISKUSSION
4.1
4.2
4.3
CD86/CD2 ALS MARKER FÜR APC
DENDRITISCHE ZELLEN
WERTIGKEIT DER UNTERSUCHTEN HISTIOZYTOSE-PARAMETER FÜR PATIENTEN MIT
SEPTISCHEM SCHOCK
4.3.1 SIL-2R
4.3.2 IFN GAMMA
4.3.3 LEUKOZYTEN UND THROMBOZYTEN
51
51
52
53
5
55
ZUSAMMENFASSUNG
1
45
47
6
LITERATURVERZEICHNIS
57
7
LEBENSLAUF
65
2
Abkürzungsverzeichnis
APC
Antigen presenting cells (antigenpräsentierende Zellen)
BAA
Bauchaortenaneurysma
BSA
bovines Serumalbumin (Rinderserumalbumin)
BWK
Brustwirbelkörper
Ca
Carcinom
CARS
combined antiinflammatory response syndrome
CD
cluster of differentiation
CDC
centers for disease control
COPD
chronic obstructive pulmonary disease (chronisch obstruktive
Lungenerkrankung)
DC
dendritische Zellen
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
FACS
Fluorescence-activated cell sorter
FAS-L
FAS Ligand
FHL
Familiäre hämophagozytische Lymphohistiozytose
FITC
Fluorescein-Isothiocyanat
FSC
forward scatter; Vorwärtsstreulicht
GI
gastrointestinal
GM-CSF
Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor
HLH
Hämophagozytische Lymphohistiozytose
HPS
Hämophagozytisches Syndrom
IAHS
infektassoziiertes hämophagozytisches Syndrom
IFN g
Interferon gamma
IL
Interleukin
KM
Knochenmark
LDH
Laktatdehydrogenase
LPS
Lipopolysaccharid
MARS
mixed antagonistic response syndrome
MOF
multiple organ failure (Multiorganversagen)
NK-Zellen
natural killer-Zellen
PAF
plättchenaktivierender Faktor
PBMC
peripheral blood mononuclear cells
PHA
Phythämagglutinin
3
PBS
phosphate buffered saline
R-PE
Red-Phycoerythrin
sIL-2R
soluble (löslicher) IL-2 Rezeptor
SIRS
systemic inflammatory response syndrome
SSC
sideward scatter; Seitwärtsstreulicht
TAA
Tachyarrhythmia absoluta
TH
T-Helfer-Zellen
TNFa
tumor necrosis factor alpha
4
1 Einleitung
1
1.1
Einleitung
Sepsis
Epidemiologie:
Sepsis ist nach wie vor eine Erkrankung mit hoher Morbidität und Mortalität. Dies betrifft
vor allem ältere Menschen, Immunkompromitierte und kritisch Kranke. [15]Nach einer
Untersuchung von Angus et al in den USA von 2001 gibt es schätzungsweise 751.000
Fälle von schwerer Sepsis, von denen etwa 383.000 intensivtherapiepflichtig waren. [6]In
Deutschland liegt die Inzidenz für die schwere Sepsis bei etwa 90.000 Patienten/Jahr,
wobei mit ca. 35.000 Todesfällen gerechnet werden muss. [23]
Nach den Centers for disease control (CDC) stieg die Inzidenz für Septikämien zwischen
1979 und 1987 um 139 % und liegt damit auf Rang 13 bei den häufigsten Todesursachen
in den USA. [2, 7, 79]Auch die Inzidenz des septischen Schockes ist in den letzten Jahren
aufgrund verbesserter technischer Voraussetzungen und invasiver Maßnahmen auf
Intensivstationen deutlich angestiegen. Der Fortschritt supportiver Maßnahmen und neue
effektive Therapien führten zu einer Reduzierung der Mortalität des septischen Schockes
in den letzten 10 Jahren. [32]Die Mortalität der schweren Sepsis liegt derzeit bei etwa 30
%, beim septischen Schock ca. bei 50 %. [5, 6, 32]
Die schwere Sepsis immer noch die häufigste Todesursache auf nichtkardiologischen
Stationen.
Definitionen:
Die erste Definition für Sepsis geht auf Schottmüller aus dem Jahre 1914 zurück. Dieser
geht davon aus, dass eine Sepsis dann vorliegt, wenn sich innerhalb des Körpers ein Herd
gebildet hat, von dem aus konstant oder periodisch pathogene Bakterien in den
Blutkreislauf gelangen und zwar derart, dass durch diese Invasion subjektive und objektive
Krankheitserscheinungen ausgelöst werden. Bis heute hat diese Definition mit kleinen
Veränderungen Gültigkeit. [76]
Analog zur Konsensus-Konferenz von 1992, die es sich zur Aufgabe gemacht hat,
allgemeingültige Definitionen für Sepsis und verschiedene septische Zustandsbilder
aufzustellen, wird Sepsis als systemische Reaktion des Körpers auf eine Infektion definiert.
Dabei müssen zwei oder mehr der folgenden Kriterien zutreffen[1]:
5
1 Einleitung
• Temperatur <36°C oder >38°C
• Herzfrequenz >90/min
• Atemfrequenz >20/min oder paCO2 <32 mmHg
• Leukozyten <4.000 oder >12.000/mm3
• zusätzlich eine nachgewiesene Infektion
Diese Kriterien wurden in einer Sepsis Definitions Conference im Jahr 2001 etwas
verändert. [52a]
Da es auch zu septischen Reaktionen ohne Nachweis einer Infektion, z.B. durch Trauma,
Verbrennungen oder Pankreatitis, kommen kann, hat man den Begriff des systemic
inflammatory response syndrome (SIRS) eingeführt. Diesem Zustand liegen zwei oder
mehr der folgenden Symptome zugrunde[1]:
• Temperatur <36°C oder >38°C
• Herzfrequenz >90/min
• Atemfrequenz >20/min oder paCO2 <32 mmHg
• Leukozyten <4.000 oder >12.000/mm3
Um den Schweregrad einer Sepsis bestimmen zu können, teilt man die Sepsis in schwere
Sepsis und septischen Schock ein. Unter schwerer Sepsis definiert die KonsensusKonferenz eine Sepsis, die mit Organdysfunktion, Hypoperfusion oder Hypotension
assoziiert ist. [1]
Der Zustand des septischen Schockes beinhaltet eine Sepsis mit Hypotension trotz
ausreichender Flüssigkeitszufuhr. [1]
Pathophysiologie:
Im gesunden Organismus liegen pro- und antiinflammatorische Zytokine im Gleichgewicht
vor. Bei Sepsis oder SIRS kommt es, als Reaktion auf das Eindringen von
Mikroorganismen oder auf Trauma und Verbrennungen, zu einer unkontrollierten
inflammatorischen Reaktion mit Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren wie
TNFa, IL-1, IL-6 und platelet activating factor (PAF). [14, 15]
6
1 Einleitung
Daraus resultiert ein Ungleichgewicht mit Überwiegen der proinflammatorischen Seite. Es
kommt zu Gewebedefekten, die ihrerseits verantwortlich für die Aktivierung der
Gerinnungskaskade
sind.
Durch
positive
Feedback-Mechanismen
zwischen
der
inflammatorischen Antwort und den Gewebedefekten werden beide Komponenten
weiterhin gefördert und es resultieren Hypoperfusion, Ischämie und Organversagen. Die
Aktivierung der Entzündungs- und der Gerinnungskaskade führt schließlich zur
Gegenaktivierung des fibrinolytischen Systems und somit zur Verbrauchskoagulopathie.
[39]
Nicht immer dominiert dieser proinflammatorische Zustand bei septischen Patienten.
Immer öfter konnte festgestellt werden, dass es durch die Zunahme antiinflammatorischer
Zytokine, wie IL-4, IL-5 oder auch IL-10, zur Immunsuppression und einer verminderten
Anzahl von Lymphozytenpopulationen kommt. [15, 56]Dieser Zustand wird von Bone als
compensatory antiinflammatory response syndrome (CARS) bezeichnet. [15]Der Verlust
von Lymphozyten entsteht vor allem durch gesteigerte Apoptose dieser Zellen. Welche
Mechanismen dafür verantwortlich sind, konnte noch nicht vollständig geklärt werden.
Wahrscheinlich sind daran sowohl direkte als auch indirekte Mechanismen beteiligt. Es
könnte durch das Eindringen der Mikroorganismen selbst zur Verminderung der
zellvermittelten Immunität kommen. Andererseits könnte die Phagozytose apoptotischer
Zellen durch Makrophagen und unreife dendritische Zellen zur Immunsuppression führen.
[56]
Ebenso gibt es Patienten, bei denen Phasen des SIRS und des CARS immer wieder
abwechseln. Bei diesem Zustand wird von einem MARS, dem mixed antagonistic response
syndrome, gesprochen. [15]
Therapie:
Zunächst galt die Aufmerksamkeit in Bezug auf die Therapie der Sepsis der
Entzündungsreaktion als dominierenden Prozess. Durch weitere, umfassendere Forschung
kam man zu der Erkenntnis, dass die Sepsis durch einen Verlust des Gleichgewichts
zwischen Entzündung, Gerinnung und Fibrinolyse ausgelöst wird. [39]
Mehr als 25 Phase-III-Studien, welche Substanzen wie Anti-Endotoxin-Antikörper, AntiTumornekrosefaktor-Antikörper, IL-1R-Antikörper, PAF-Antagonisten, Steroide und
Prostaglandininhibitoren untersuchten, führten zu enttäuschenden Ergebnissen. [12, 39,
85]Dies wirft die Frage auf, warum es zu einer solchen Vielzahl an negativen Ergebnissen
gekommen ist.
7
1 Einleitung
Es gibt Gründe dafür, zu glauben, dass die verwendeten Substanzen nur unzureichend
fähig waren, die interessierenden Mediatoren zu blockieren oder sie zielten auf Mediatoren
ab, die nur eine relativ unbedeutende Rolle für das outcome der Sepsis spielten. Weiterhin
fand man heraus, dass viele der immunmodulatorischen Therapien eine deutliche Effizienz
in Tiermodellen zeigten, aber zu keinerlei Erfolgen in klinischen Studien führten.
Möglicherweise spielt dabei die Tatsache eine Rolle, dass es Unterschiede zwischen den
biochemischen und immunologischen Reaktionen von Sepsispatienten und Versuchstieren
mit bekannten bakteriellen Infektionen gibt. [3]
Außerdem stellt sich die Frage, ob in den bisherigen Studien nicht zu weit gefasste
Definitionen für Sepsis verwendet wurden, wo sich bei Patienten mit stärker limitierten
Einschlusskriterien bzw. Erkrankungen mehr positive Ergebnisse gezeigt hätten. Denn in
den meisten Fällen wurden in die Studien Patienten mit dem Nachweis einer Infektion
assoziiert mit der (bevorstehenden) Entwicklung eines Multiorganversagens gemäß der
Konsensus-Konferenz [1]eingeschlossen. Um den frühen Einschluss in die Studie zu
gewährleisten, wurde auf den mikrobiologischen Nachweis verzichtet. [3]
Weiterhin wurde bei immunmodulatorischen Therapiestudien meist nicht berücksichtigt,
ob bei den Patienten überhaupt erhöhte Spiegel der entsprechenden Mediatoren
nachgewiesen werden konnten. [3]
Ein Beispiel dafür ist die NORASEPT (North American Sepsis Trial)-II-Studie, eine
Studie mit monoklonalen anti-TNF-Antikörpern. Hier konnte kein Effekt der Therapie bei
Patienten ohne erhöhte TNF-Spiegel erzielt werden, während es bei Patienten mit erhöhten
Spiegeln zu einer Reduktion der 28-Tage-Mortalität um 18% im Vergleich zu Placebo
kam. [3]
Auch war bisher immer nur ein System (Inflammation, Koagulation oder Fibrinolyse) Ziel
der Therapie. Eine Phase-III-Studie, die alle drei Systeme beinhaltet, ist die PROWESS
(recombinant human activated protein C worldwide evaluation in severe sepsis)-Studie.
Diese beurteilt die Effektivität und Sicherheit von rekombinantem humanen Protein C
(Drotrecogin alfa activated) für schwere Sepsis im Vergleich zu Placebo. Eine 4-tägige
Infusion von Drotrecogin alfa führte bei 850 Patienten zu einer absoluten Reduktion der
Mortalität von 6,1% gegenüber Placebo. Bei dieser Studie wurden neben Geschlecht,
Alter, Voroperationen, Apache-II-Score und Anzahl der Organe beim MOF auch die
Protein C-, Plasma-D-Dimer- und IL-6-Konzentration berücksichtigt. [39]
Wegen der deutlichen Verbesserung der Prognose wurde diese Studie vorzeitig beendet.
Seit November 2001 ist Drotrecogin alfa in Europa zur Behandlung der schweren Sepsis
bei Erwachsenen mit multiplem Organversagen als Zusatzbehandlung zugelassen.
8
1 Einleitung
Seit August 2002 ist Drotrecogin alfa activated (Xigris®) auch in Deutschland als
Medikament zur zusätzlichen Behandlung der schweren Sepsis zugelassen.
1.2
Dendritische Zellen
Dendritische Zellen (DC) stellen die wichtigste Gruppe von antigenpräsentierenden Zellen
dar. Bisher wurden sie in nicht-lymphoiden Organen, wie z.B. der Epidermis, dem Herz,
der Leber oder der Lunge, in lymphoiden Organen, wie z.B. den Tonsillen, den TZellregionen der peripheren lymphoiden Organe und im Thymus, und in der Zirkulation
(Blut und afferente Lymphe) gefunden. Sie besitzen die Fähigkeit, die T-Zell vermittelte
Immunantwort einzuleiten, indem sie den T-Zellen über MHC-Moleküle Informationen
über die molekulare Identität des Pathogens und über kostimulatorische Moleküle (CD80,
CD86) Botschaften über das pathogene Potential übermitteln. [48]
Im Blut sind < 0,1% der Leukozyten DC. [79]Dort kann man sie aufgrund ihrer
Oberflächenmoleküle durchflusszytometrisch von den anderen Leukozytenpoulationen
isolieren. Charakteristisch für DC ist, dass sie für HLA-DR positiv und für andere
zelllinienspezifische Marker (CD14 für Monozyten, CD16 und CD56 für NK-Zellen,
CD19 und CD20 für B-Zellen und CD3 für T-Zellen) negativ sind. [31]
Bisher sind zwei verschiedene Arten von DC im menschlichen Blut bekannt. [16, 58, 65,
79]Dies sind einerseits die „myeloiden“ DC (DC1) und andererseits die „lymphoiden“ DC
(DC2). Über deren Ursprung besteht in der Literatur noch keine Einigkeit. Da sich die zwei
DC-Subpopulationen im Blut in ihrer Morphologie, ihrem Phänotyp und ihrer
antigenpräsentierenden Kapazität deutlich voneinander unterscheiden, kann man davon
ausgehen, dass es sich um zwei verschiedene Zelllinien von APC handelt. [66]
Die DC1 scheinen aufgrund ihrer morphologischen und funktionellen Eigenschaften
entweder aus Blutmonozyten [80]oder aus CD34+-Vorläuferzellen aus dem Knochenmark
(KM) [68, 72]hervorzugehen, während die DC2 wegen des plasmazytoiden Aussehens
ihrer unreifen Vorstufe von CD4+ CD3- CD11c-Zellen des KM’s zu stammen scheinen.
[38, 61, 65, 66]Diese Vorläuferzellen können sich in vitro durch Kultivierung in
verschiedenen Medien wie z.B. GM-CSF und TNFa [66, 72]oder monocyte-conditioned
medium [58, 80, 83]zu reifen dendritischen Zellen entwickeln. Dabei entstehen aus pDC1
reife DC1, die folgende charakteristische Merkmale aufweisen. Phänotypisch exprimieren
sie neben den bereits erwähnten MHC-II- Antigenen noch CD11c, CD80, CD86, CD54
und CD58. An funktionellen Eigenschaften findet man bei den DC1 die Fähigkeit zu
9
1 Einleitung
Antigen-Aufnahme, Prozessierung und Präsentation, was zu einer ausgeprägten Induktion
der T-Zellaktivierung führt. [19, 58, 72, 80, 83]
Die pDC2 differenzieren sich durch o.g. Medien weiter zu reifen DC2. Wie auch die DC1
exprimieren sie MHC-II. Man findet aber eine deutliche geringere Expression z.B.
kostimulatorischer Moleküle (CD80, CD86, CD54, CD58), ebenso kein CD11c. [58,
79]Stattdessen weist die Oberfläche von DC2 eine hohe Expression von CD8α, CD123 und
FasL auf. [19, 29, 53, 61, 80, 82]Dies impliziert auch ihre Funktion. Es kommt, wie auch
bei DC1 zur Ag-Aufnahme (Phagozytose), jedoch in deutlich geringerem Maße zur
Prozessierung und Präsentation. Typisch für DC2 ist die Fähigkeit zur Induktion des
programmierten Zelltodes (Apoptose) durch die Expression des FasL.
Vor allem die unreifen lymphoiden DC scheinen in der Pathophysiologie der
hämophagozytischen Lymphohistiozytose eine große Rolle zu spielen.
1.3
Hämophagozytische Lymphohistiozytose
Definition:
Die
hämophagozytische
Lymphohistionzytose
(HLH)
ist
eine
Erkrankung
des
mononukleären phagozytischen Systems, welche auf einer Überaktivierung von T-Zellen
und Histiozyten (Makrophagen und dendritischen Zellen) beruht. Man unterscheidet bei
der HLH eine primäre, genetisch bedingte von einer sekundären, infekt- oder
malignitätsassoziierten Form. Zusammengefasst werden diese Erkrankungen auch als
Hämophagozytisches Syndrom (HPS). [28, 47]
Bei der primären HLH handelt es sich um eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung,
die zum ersten Mal 1952 von Farquar beschrieben wurde. Ihre Häufigkeit wird auf eine
von 50.000 Geburten geschätzt. [47]Typischerweise treten die ersten Symptome der HLH
bereits innerhalb des ersten Lebensjahres auf und führen unbehandelt zum Tode.
Die sekundäre HLH ist oft nur durch den Verlauf von der primären Form abzugrenzen und
tritt häufig im Erwachsenenalter unter immunsuppressiver Therapie auf. Der Erkrankung
liegt eine Infektion meist durch Viren, aber auch durch Bakterien oder Pilze zugrunde. [47]
10
1 Einleitung
Klinik:
Die Symptome von primärer und sekundärer HLH sind identisch. Kardinalsymptome sind
Fieber,
Hepatosplenomegalie
und
Zytopenien.
Es
kann
auch
zu
Lymphknotenschwellungen, Ikterus, Lungeninfiltration, Ödemen und Hautausschlägen
kommen. [44, 47]Im Blut finden sich erhöhte Transaminasen, Hypertriglyzeridämie und
Hypofibrinogenämie. Zusätzlich kann es vor allem bei der sekundären HLH zu
Hyperferritinämie und LDH-Anstieg kommen. [44]Im Knochenmark, in der Milz und in
den Lymphknoten findet man histologisch Infiltrationen mit morphologisch benignen
Histiozyten mit hoher Phagozytoseaktivität von Erythrozyten, Thrombozyten und
Granulozyten.
Um die Diagnose zu erleichtern wurden von Henter et al Diagnostische Richtlinien für die
HLH aufgestellt. [41]
Klinische und laborchemische Kriterien:
• Fieber
• Splenomegalie
• Zytopenie
• Hb < 90g/l
• Neutrophile < 1.0 * 109 g/l
• Hypertriglyzeridämie und/oder Hypofibrinogenämie
Histopathologische Kriterien
• Hämophagozytose in KM, Milz oder Lymphknoten (ohne Malignitätsnachweis)
Für die HLH müssen alle der o.g. Kriterien erfüllt sein. Bei der FHL erfordert die Diagnose
zusätzlich eine positive Familienananmese.
Pathophysiologie:
Durch eine unkontrollierte Hypersekretion von Zytokinen produziert von aktivierten TLymphozyten und Histiozyten kommt es zu den bereits erwähnten klinischen Symptomen.
11
1 Einleitung
Bereits 1986 gab es Hinweise darauf, dass es sich um immunologisch unreife Elemente
von Histiozyten handelt. [35]
Erhöht sind vor allem Zytokine wie IFNg, IL-6 und IL-10, was zu einer weiteren
Aktivierung von T-Zellen und Monozyten/Makrophagen führt. [62, 78]Ebenfalls finden
sich bei HLH-Patienten erhöhte Spiegel an sIL-2R. [40, 44, 46]
IFNg verursacht bei HLH vor allem eine Myelosuppression, die Induktion der
Phagozytoseaktivität ist nur leicht erhöht. [44]Weitere Mechanismen sind bisher noch
nicht bekannt.
Einer der Hauptfaktoren der HLH scheinen extrem erhöhte Levels an sIL-2R zu sein. Es
wird vermutet, dass sIL-2R als „blocking factor“ agiert und die normale Immunantwort
durch Bindung von IL-2 verhindert wird. Daraus resultiert eine sekundäre Immundefizienz.
[44, 45, 71]
Eine typische Eigenschaft bei HLH ist der Verlust der NK-Zellfunktion. [78]Dieser Verlust
ist bei der primären HLH stärker ausgeprägt als bei der sekundären. Dadurch kommt es zur
Störung der zellulären Zytotoxizität, da es nicht mehr zur Produktion von
Effektormolekülen, wie z.B. Granulozyten, durch NK-Zellen kommen kann. Die NK-Zell
Anergie kann aber auch durch Anergie von APC, v.a. von dendritischen Zellen entstehen.
Die DC verlagern ihre Tätigkeit eher auf Phagozytose von apoptotischen Zellen und
nehmen ihre antigenpräsentierende Tätigkeit nicht mehr wahr. [46]
Therapie:
Die primäre HLH lässt sich lediglich durch Knochenmarkstransplantation kurativ
behandeln. Andere Therapieoptionen sind Etoposid, Kortikoide und Ciclosporin A. Bei der
sekundären HLH steht die Behandlung des Erregers durch Antibiotika, Antimykotika oder
Virustatika im Vordergrund. [46, 47]
1.4
CD 2
CD 2, auch bezeichnet als LFA-2, sheep red blood cell (SRBC) receptor oder T11, ist ein
transmembranes 50 kDa Glykoprotein mit 327 AS und gehört zur Ig-Superfamilie. Es wird
in hohem Maße auf T- und NK-Zellen exprimiert, [10, 22, 49, 63] in geringerer Expression
auch auf Thymus B-Zellen, Monozyten/Makrophagen und DC. [22, 49, 79]Es konnten drei
verschiedene Epitope (T111, T112 und T113) für die Bindung an CD2 auf T-Zellen
12
1 Einleitung
nachgewiesen werden. Bei Bindung an T112 und T113 resultiert eine Proliferation von TZellen sowie die Produktion von IL-2. [55]Crawford und Takamizawa konnten
nachweisen, dass CD2+-Monozyten im Blut sowohl phänotypisch, morphologisch als auch
funktionell zirkulierenden DC entsprechen. [22, 83]Somit könnte CD2 einen
entscheidenden Marker zur Identifizierung von myeloiden DC darstellen. [22, 83]
CD2 ist der Ligand für CD58(LFA-3), CD59 und CD48 auf APC und spielt eine Rolle bei
der T-Zellaktivierung und der Adhäsion von T-Zellen an APC. [18]
1.5
CD86
CD86 ist ein 80 kDa Zelloberflächenprotein, das im Wesentlichen auf der Oberfläche von
APC, wie B-Zellen, Monozyten/Makrophagen und DC vorkommt. Ryncarz et al konnten
auf einer geringen Anzahl von CD34+ Knochenmarkszellen ebenfalls CD86 nachweisen.
[72]
Der Genort liegt auf Chromosom 3 (q13-23). Andere Bezeichnungen für CD86 sind FUN1, B7-2 und BU-63. [11]Die Expression von CD86 auf den verschiedenen APC ist
unterschiedlich. Während das Molekül auf DC in hohem Maße exprimiert wird, findet man
auf der Oberfläche von Monozyten/Makrophagen nur wenige dieser Proteine. Nach
Aktivierung wird CD86 auf Monozyten/Makrophagen wie auch auf B-Zellen
hochreguliert. [72]
CD86 stellt neben CD80 den wichtigsten Liganden für CD28 und CTLA-4 (CD152) dar.
Diese T-Zell-Proteine legen fest, ob es im Organismus zur Immunität oder zur Toleranz
kommt. Neben dem T-Zell-Rezeptor (TCR), dem das Antigen im MHC-Molekül der APC
präsentiert wird, sind für die Induktion der T-Zellantwort außerdem so genannte
kostimulatorische Moleküle (CD86/CD80) auf der APC notwendig. Binden CD86/CD80
an CD28, kommt es zur Einleitung der T-Zell-Aktivierung. Auf den aktivierten T-Zellen
wird nach 24-48h das CTLA-4-Molekül hochreguliert. Kommt es zur Interaktion von
CD86 mit CTLA-4 ist dies für die T-Zelle ein negatives Signal und die Aktivierung wird
beendet. So kann eine überschießende Immunantwort verhindert werden. [17]
1.6
sIL-2R
sIL-2R ist die lösliche Form der α-Kette des Interleukin-2 Rezeptors (IL-2R). Der IL-2R
ist ein 55 kDa membranassoziiertes Protein, welches auch als anti Tac oder CD25
bezeichnet wird.
13
1 Einleitung
IL-2R wird auf der Oberfläche von aktivierten T-Zellen und B-Zellen exprimiert. Er
alleine besitzt keine signalübertragenden Fähigkeiten. Nur in Verbindung mit der β- und
der γ-Kette dieses Rezeptors zeigt sich eine hohe Affinität zu IL-2 und nur dann kommt es
zum Wachstum und zur Differenzierung von T-Zellen. [49, 50]
Nach Aktivierung der T-Zellen z.B. durch Fremdantigene kommt es zur erhöhten
Expression von IL-2R auf der T-Zelloberfläche. Fehlt eine weitere Stimulation, wird der
Rezeptor von der Zelle abgekoppelt und erscheint als sIL-2R im Serum. [36]
Im Vergleich zum membrangebundenen IL-2R ist der lösliche IL-2R mit 40-45 kDa etwas
kleiner. Es hat sich gezeigt, dass beide Formen an IL-2 binden können. [37]
Auch bei gesunden Kontrollgruppen lässt sich sIL-2R nachweisen. Dieser scheint sowohl
von normalen PBMC [37]als auch manchen B- und T-Zelllinien [70, 71]produziert zu
werden. Die Serumspiegel beim Erwachsenen schwanken den Angaben entsprechend.
Burmester schreibt von 200-1000 U/ml, bei Komp et al liegen die Normwerte zwischen 80
und 600 U/ml, bei Kindern etwas höher (je nach Alter zwischen 267 und 2337 U/ml). [17,
50]
Erhöhte Spiegel für sIL-2R finden sich bei Patienten mit Asthma, HLH, Leukämien oder
Lymphomen. [36, 50]
1.7
Interferon gamma
Interferon gamma (IFNg) ist ein Typ II Interferon, das bereits 1965 erstmals in PHAaktivierten Lymphozyten identifiziert wurde. Es wurde ursprünglich als Molekül mit
antiviraler Aktivität definiert.
Biologisch aktives IFN g ist ein nicht-kovalentes 34 kDa Homodimer, das vor allem von
aktivierten T-Zellen und NK-Zellen sezerniert wird. [27]In T-Zellen, vor allem in CD4+Zellen vom TH1-Typ und CD8+-Zellen vom TC1-Typ wird die IFNg-Produktion durch
die Bindung des T-Zell-Rezeptors (TCR) induziert. In den NK-Zellen stimulieren
makrophagentypische Zytokine wie TNFa und IL-12 die Sekretion von IFN g. [13]
Neben der ursprünglichen antiviralen Aktivität wurden IFNg noch verschiedene andere
Regulationsmechanismen für die Immunantwort zugeschrieben.
Durch IFNg wird in B-Zellen die LPS-induzierte B-Zellproliferation, wie auch die
Produktion von IgG1 und IgE unterdrückt. Dies führt zu einem Ungleichgewicht der
Produktion von Ig-Subtypen. [86]
14
1 Einleitung
Welcher T-Helferzell-Phänotyp im Organismus vorherrscht, wird im Wesentlichen durch
zwei Zytokine bestimmt. Dies ist zum einen IFNg, zum anderen IL-4. IFNg fördert dabei
die Entwicklung von IFNg und IL-2-produzierenden TH1-Zellen und blockiert gleichzeitig
das Wachstum der TH2-Population. [27]Diese TH1-Antwort ist assoziiert mit der
zellvermittelten Immunität und wird durch intrazelluläre Bakterien und Protozoen
induziert. Durch die Sekretion von IFN γ wird eine proinflammatorische Immunantwort
ausgelöst. [13]Das Gleichgewicht dieser beiden Zelltypen ist entscheidend für
Rekonvaleszenz oder Fortschreiten einer Erkrankung. [86]
IFNg allein kann ebenfalls die Apoptose von T-Zellen induzieren, was jedoch durch IL-2,
welches normalerweise parallel mit IFNg im Organismus vorkommt, blockiert wird.
Weiterhin induziert IFNg die Expression von IL-2R auf aktivierten T-Zellen. [86]
In erster Reihe bei der Immunantwort stehen die Monozyten/Makrophagen. Für sie scheint
IFNγ als makrophagenaktivierender Faktor in der Zirkulation zu fungieren. Dies ruft die
Aktivierung
verschiedener
Makrophagenfunktionen
hervor,
wie
z.B.
Tumorzellzytotoxizität, antimikrobielle Aktivität, vermehrtes Abtöten intrazellulärer
Pathogene und die Antigenprozessierung und-präsentierung gegenüber Lymphozyten. [86]
Bei polymorphkernigen Neutrophilen (PMN) löst IFNg eine gesteigerte Phagozytose und
Zytotoxizität aus. [86]
1.8
Fragestellung
Bei der Sepsis werden in hohem Maße pro- und auch antiinflammatorische Zytokine
freigesetzt.
Diese
Immundefektsyndroms
Hyperzytokinämie
assoziiert
sein
kann
und
mit
beeinflußt
der
die
Entwicklung
Differenzierung
eines
von
dendritischen Zellen. Analog zu dieser Situation kennt man bei Kindern die
hämophagozytische Lymphohistiozytose (HLH), bei der es, genetisch oder infektbedingt,
zu einer Überaktivierung von T-Zellen und vermutlich auch dendritischen Zellen kommt.
Im Rahmen dieser Überaktivierung können die DC eine Anämie, eine Leukozytopenie und
eine Thrombozytopenie hervorrufen, indem sie in Leber und Milz als Histiozyten
hämatopoetische Zellen phagozytieren. Bei der HLH werden hohe Spiegel an lymphoiden
Vorläufer-DC bereits im Blut nachgewiesen. [74]
Nachdem es laut Bone et al. auch bei der Sepsis zu Hyperzytokinämien sowohl pro- als
auch antiinflammatorischer Zytokine kommen kann, beschäftigt sich diese Arbeit mit der
15
1 Einleitung
Frage, ob analog zur HLH auch bei der Sepsis dendritische Zellen im Blut vorkommen und
ob diese eine entscheidende Rolle bei Immunantwort spielen.
Dazu wurde über einen Zeitraum von 6 Monaten von Patienten der Anästhesiologischen
Intensivstation im septischen Schock täglich eine Blutprobe entnommen und auf
spezifische Oberflächenantigene und Zytokine untersucht.
16
2 Material und Methoden
2
2.1
Bei
Material und Methoden
Patientengut
den
untersuchten
Patienten
handelte
es
sich
um
postoperative,
intensivtherapiepflichtige Patienten der Anästhesiologischen Intensivstation der Uniklinik
Ulm, welche in Tabelle 1 aufgelistet sind.
Als Einschlusskriterien galten das Vorliegen einer schweren Sepsis mit einem hohen
Risiko für einen septischen Schock, eines septischen Schockes und eine Liegedauer von
mehr als 3 Tagen.
Ausgeschlossen wurden Patienten mit immunmodulatorischen Medikamenten wie z. B. GCSF, Zytostatika oder ein Alter unter 18 Jahre.
Als Negativkontrolle wurde von 12 gesunden Probanden im Alter zwischen 20 und 52
Jahren jeweils einmal venöses Blut abgenommen und untersucht.
Tabelle 1: Patientengut
Nr.
1
Alter Geschlecht Outcome Messdauer Hauptdiagnose Komplikationen
58
m=männlich
g=gestorben in Tagen
w=weiblich
ü=überlebt
m
g
7
frei rupturiertes hämorrhagischer
BAA
Schock,
Massentransfusion
2
79
m
ü
5
mediastinales
intraoperativ
Sarkom
diffuse Blutung aus
hinterem und
unterem
Mediastinum
3
72
m
ü
8
Magenulcus,
obere GIBlutung
17
2 Material und Methoden
Nr.
4
Alter Geschlecht Outcome Messdauer Hauptdiagnose Komplikationen
69
m=männlich
g=gestorben in Tagen
w=weiblich
ü=überlebt
w
g
12
COPD, art.
SaO2-Abfall bei
Hypertonie, Z.n. Tubusfehllage
UL-Resektion
bei BronchialCa
5
66
m
ü
6
pulmonale Fistel
6
73
m
ü
30
Mediastinitis,
septischer Schock
Pleuraempyem
7
72
m
ü
9
Platzbauch
Pneumonie, akutes
Nierenversagen
8
55
m
ü
9
nekrot.
septische
Pankreatitis,
Einschwemmung
respiratorische
Insuffizienz
9
34
w
ü
13
Ileumfistel mit
respiratorische
Psoasabszeß bei Insuffizienz
M.Crohn
10
68
m
ü
9
Rektum-Ca
substitutionsbedürft
ige Nachblutung
11
69
w
g
16
septische Hüfte septische
bds.
12
65
w
g
4
Einschwemmung
retroperitoneales akutes
Hämatom bei
intermittierender
TAA
18
Nierenversagen,
2 Material und Methoden
Nr.
13
Alter Geschlecht Outcome Messdauer Hauptdiagnose Komplikationen
73
m=männlich
g=gestorben in Tagen
w=weiblich
ü=überlebt
m
g
9
gedeckt
septischer Schock
rupturiertes
infra- und
suprarenales
BAA
14
55
m
ü
11
Darmperforation 4 Qu.-Peritonitis,
septische
Einschwemmung
15
16
68
68
m
w
g
ü
11
32
Sturz mit
hypovolämischer
Extremitäten-
Schock, akutes
Frakturen
Nierenversagen
Barrett-Ca des
Ösophagus
17
47
m
ü
25
Rektumperforati Becken-und
on
Flankenphlegmone
18
55
m
ü
12
Ösophagus-Ca
19
58
w
ü
21
Fraktur BWK 7, sensibler
Spondylodiszitis Querschnitt, SaO2
20
64
m
ü
19
, beginnender
unter Raumluft:
Querschnitt
88%
Anastomosenin- Z.n. 4 Qu.suff. nach
Peritonitis, sept.
Sigmaresektion Schock mit MOF
21
23
m
ü
11
Bronchial-Ca
PseudomonasPneumonie
22
78
w
g
15
frei rupturiertes, hämorrhagischer
infrarenales
BAA
Geschlecht: m = männlich, w = weiblich; outcome: ü = überlebt, g = gestorben;
19
Schock, MOF
2 Material und Methoden
2.2
Datengewinnung DC
2.2.1
2.2.1.1
Durchflusszytometrie
Probengewinnung
Die Blutentnahme erfolgte täglich um 10 Uhr ± 1h über eine arterielle Kanüle. Zunächst
wurden 2ml Blut abgezogen und verworfen, um Verdünnungsfehler auszuschließen.
Anschließend wurde eine Monovette (2,7ml) der Firma Becton-Dickinson, die als
Antikoagulanz
K-EDTA
enthielt,
befüllt
und
mit
einem
Patientenaufkleber
gekennzeichnet. Bis zur endgültigen Verarbeitung wurden die Proben auf Eis gelagert.
2.2.1.2
Probenaufbereitung
Ziel der Analyse war es, die Leukozyten aus dem Patientenblut zu isolieren und spezifische
Oberflächenantigene mittels Farbstoff-markierter Antikörper im Durchflußzytometer
messbar zu machen.
Materialien zur Gewinnung und Markierung der Leukozyten:
• 5ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen der Firma Becton-Dickinson
• Pipetten der Firma Eppendorf
• Zentrifuge: Heraeus Sepatech Megafuge 1.0 R
• Vortexgerät der Firma Juchheim zum Aufschütteln der Antikörperröhrchen
• FACS Lysing Solution der Firma Becton Dickinson 10fach konzentriert;
Verdünnung 1:10; 1ml Lyselösung auf 10ml Aqua dest.
• Waschpuffer zur Erhöhung der Probestabilität: PBS Dulbecco´s + BSA 0,1% + Acid
(NaN3) 0,1%
Waschvorgang: 2 ml Waschlösung zugeben, mischen, zentrifugieren,
Überstand abpipettieren
• verwendete Antikörper siehe Tabelle 2
20
2 Material und Methoden
Tabelle 2: Angaben zu den verwendeten Antikörpern
Isotypen
Klon
Andere
Isotyp
Bezeichnungen
Antigen-
Hersteller
exprimierende
Zellen
IgG1
679.1Mc7
unspezifische
Coulter
Bindung an FcTeil
IgG2a
U7.27
unspezifische
Coulter
Bindung an FcRezeptoren
FITCmarkierte
Antikörper
antiCD25
ACT –1
Tac,
IL2- IgG1, kappa aktivierte
α-
Rezeptor
Zellen,
T- DAKO
B-
Zellen,
Kette
Monozyten
antiCD86
B-T7
B7.2,
FUN-1, IgG1
GR65
Monozyten,
aktivierte
Diaclone
B-
Zellen, unreife
dendritische
Zellen
PE-markierte
Antikörper
antiCD2
MT 910
T11, LFA-2
IgG1, kappa T-Zellen, NK- DAKO
Zellen.
Thymozyten
Zunächst wurde eine Kombination aus je 5 µl FITC (Fluoresceinisothiocyanat)- und R-PE
(Red Phycoerythrin)-markierten Antikörpern in jedes, mit dem Namen des Patienten
beschriftete, Röhrchen pipettiert, 100 µl Patientenblut zugegeben, gevortext und für 25 min
in 4°C kaltem Eiswasser inkubiert.
Die Erythrozytenlyse erfolgte anschließend durch Zugabe von je 1ml verdünntem
Lysereagenz für 10 min.
21
2 Material und Methoden
Es folgten Zentrifugation (1000U/min für 5min bei 4°C) und Absaugen des Überstandes.
Um eventuelle Reste der Erythrozytenlyse zu beseitigen und das Signal-zu-RauschVerhältnis der Antikörpermarkierung zu verbessern, wurden zwei Waschvorgänge
durchgeführt. Dabei wurde in jedes Röhrchen je 2ml Waschpuffer gegeben, gevortext,
zentrifugiert und anschließend der Überstand abgesaugt. Nach Wiederholung dieses
Vorganges wurde mit je 400 µl Waschpuffer resuspendiert.
2.2.1.3
Messung
Die durch die Aufbereitung erhaltenen Proben wurden unmittelbar danach mit dem
Fluorescence Activated Cell Sorter FACSCalibur der Firma Becton Dickinson gemessen.
Dieses Verfahren beruht auf der simultanen Analyse
von Fluoreszenzsignalen im
Vorwärtsstreulicht (Zellgröße), Seitwärtsstreulicht (Zellgranularität) und bis zu vier
verschiedenen
Fluoreszenzsignalen
hydrodynamisch
fokussierter
Zellen
in
Einzelzellsuspensionen, die sequentiell an einem Messpunkt vorbeigeführt werden. Als
Fluorochrome wurden Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und Red-Phycoerythrin (R-PE)
eingesetzt, welche bei einer Wellenlänge von 488nm angeregt werden, jedoch
unterschiedliche Emissionswellenlängen aufweisen und deshalb zur Mehrfarbenanalyse
geeignet sind.
Als Software wurde für Analyse und Auswertung, wie von Becton Dickinson empfohlen,
CellQuest™ version 3.0 für Macintosh verwendet.
Vor der eigentlichen Messung wurden zur Justierung der Instrumenteneinstellung, zur
Überprüfung
der
Instrumentenempfindlichkeit
und
zur
Einstellung
der
Fluoreszenzkompensation über die Software FACSComp™ Mikropartikel („beads“), in
diesem Fall CaliBRITE Beads der Firma Becton Dickinson, gemessen.
An diese Qualitätssicherung anschließend wurde die Probenmessung in folgender
Reihenfolge vorgenommen:
• Leerwert
• Isotyp
• CD86 FITC/CD2 PE
• CD25 FITC/CD2 PE
22
2 Material und Methoden
Um die Messergebnisse richtig interpretieren zu können, wurden vor der Messung der
spezifischen Antikörper so genannte Isotypen (siehe Tabelle 2) gemessen. Das sind
farbmarkierte, monoklonale Antikörper, die unspezifisch an hämatopoetische Zellen
binden können.
Dafür wurden die Proben in der dafür vorgesehenen Halterung platziert und die Messung
gestartet.
Zur Überprüfung der Messung bediente man sich eines Punktehistogramms (dot plots), das
die Zellen auf der x-Achse nach Größe und auf der y-Achse nach Granularität trennt. Um
den Zellschrott auszugrenzen, wurde und diesen dot plot ein Fenster (gate) gelegt, das als
R1 bezeichnet wurde. Die Messung wurde automatisch beendet, wenn in diesem gate
10.000 Ereignisse gezählt wurde.
Abb. 1: Punktehistogramm: Vorwärtsstreulicht = x-Achse, Seitwärtsstreulicht = y-Achse, zur Ausgrenzung
des Zellschrotts = R1, Lymphozyten = Lym, Monozyten = Mon, Granulozyten = GRA
Auswertung der Messdaten
Die Auswertung der Messergebnisse erfolgte über zweiparametrige, logarithmische
Darstellungen in Punktehistogrammen, den so genannten dot plots. Bei diesen wurde die
Intensität der Fluoreszenz 1 (FL-1 entspricht FITC) auf der x-Achse und die Fluoreszenz 2
(FL-2 entspricht R-PE) auf der y-Achse aufgetragen.
Zunächst wurde in das Punktehistogramm des Isotypen ein Fadenkreuz gelegt, welches den
Isotyp im linken unteren Quadranten gegenüber den antigenpositiven Zellen abgrenzen
sollte. Dieses Fadenkreuz wurde für alle anderen Messungen für den entsprechenden
Patienten nicht wieder verändert.
23
2 Material und Methoden
Abb. 2: Isotyp: Punktehistogramm, FL1 = x-Achse, FL2 = y-Achse
Um Aussagen über die für die Arbeit wesentlichen Zellpopulationen treffen zu können,
wurden diese durch weitere „gates“ eingegrenzt und mit Rx bezeichnet. Die in diesen gates
gezählten Ereignisse wurden dann von der software in die relative Anzahl bezogen auf alle
gezählten Ereignisse umgerechnet. Diese Daten sind ebenfalls auf dem Messprotokoll
abgebildet.
Für diese Arbeit relevant war die Ak-Kombination antiCD 86FITC/antiCD 2PE und
antiCD25FITC/antiCD2 PE.
Abb. 3: CD86/CD2: Punktehistogramm, CD86 = x-Achse, CD2 = y-Achse, DC = CD86 und CD2 doppelt
positive Zellen = dendritische Zellen
24
2 Material und Methoden
Abb. 4: CD25/CD2-Punktehoistogramm: CD25 = x-Achse, CD2 = y-Achse, DC = CD25/CD2 doppelt
positive Zellen = dendritische Zellen
2.3
Datengewinnung Zytokine
Die Zytokinmessungen für sIL-2R und IFNγ wurden von Mitarbeitern des Labors für
Experimentelle Anästhesiologie an der Universitätsklinik Ulm durch ELISA durchgeführt.
Dabei wurde für sIL-2R der Testkit der Firma Immulite und für IFNg der OptEIATest für
sandwich ELISA der Firma Pharmingen verwendet.
Beim ELISA handelt es sich um heterogenes Testverfahren, bei dem die gegen das zu
bestimmende Antigen gerichteten spezifischen Antikörper an eine Trägersubstanz
gebunden vorliegen. An diese Antikörper lagern sich nach Inkubation mit der Probe die zu
detektierenden Antigene an, die anschließend durch Enzym-markierte Antikörper nach
Substratzugabe sichtbar gemacht werden können. Im Photometer kann so der
Farbumschlag gemessen und die Konzentration des Antigens in der Probe berechnet
werden. [77]
2.4
Datengewinnung klinisch-chemische Parameter
Die
Leukozyten-
und
Thrombozytenwerte
wurden
im
Rahmen
der
täglichen
Routineuntersuchung der Anästhesiologischen Intensivstation im Zentrallabor der
Uniklinik Ulm gemessen.
Normwerte:
Leukozyten: 4,3 bis 10,8 G/l
Thrombozyten: 150 bis 350 G/l
25
2 Material und Methoden
2.5
Statistische Auswertung und Ethikkommission
Für die statistischen Analysen wurde das Programm SPSS 10.0 for Windows verwendet.
Die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden über den t-Test für unabhängige
Stichproben berechnet. Bei den Verlaufsdarstellungen der Gruppe DC konnten keine
statistischen Tests angewendet werden, da in diesem Fall die Fallzahl zu gering war.
Für die Verlaufswerte der Patienten der Gruppe DC konnte für die einzelnen Tage kein
statistischer Test angewendet werden, da die Fallzahl mit n=3 bzw. n=4 zu gering war.
Vor Beginn der Studie wurde das Vorhaben von der Ethikkommission genehmigt.
26
3 Ergebnisse
3
Ergebnisse
3.1
3.1.1
Vorkommen dendritischer Zellen
Allgemeines
Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte zum einen durch Diagramme, bei denen auf der xAchse die Messtage und auf der y-Achse die CD86+/CD2+- Werte in % positiven
aufgetragen wurde. Zum anderen wurden Vergleichs- und Verlaufswerte als boxplots
dargestellt. Auf der x-Achse wurde bei Vergleichdarstellungen die Gruppe, bei
Verlaufsdarstellungen die Zeit in Tagen aufgetragen und auf der y-Achse die jeweiligen
Werte für CD86+/CD2+, sIL-2R, IFNg, Leukozyten und Thrombozyten in den
entsprechenden Einheiten. Als Tag 1 wurde der 1. Tag der schweren Sepsis oder des
septischen Schockes definiert.
3.1.2
Bei Normalspendern
Bei den 12 gesunden Normalspendern lag die relative Häufigkeit CD86+/CD2+-Zellen
zwischen 0,11 und 0,96%. Es ergab sich ein Mittelwert von 0,37%.
3.1.3
Bei Patienten
Es wurden insgesamt 22 Patienten in die Studie mit aufgenommen, die über einen
Zeitraum von 14 Tagen beobachtet wurden. Bei der Auswahl der Gruppen hat man sich an
den Werten für die Normalspender orientiert. Dabei wurde festgestellt, dass man die
Patienten nach ihren CD86+/CD2+-Werten in 2 Gruppen aufteilen kann.
Gruppe 1 umfasst 18 Patienten, bei denen weniger als 3 Messwerte für CD86+CD2+ über
1% lagen. Diese Gruppe wird im weiteren Verlauf des Textes als nonDC bezeichnet.
27
3 Ergebnisse
Verlauf von CD86/CD2 bei nonDC
% pos
6
5
4
3
2
1
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10
D11
D12
D13
D14
Tage
Abb. 5: Verlauf des Anteils an CD86/CD2 doppelt positiven Zellen während der ersten 14 Tage nach Eintritt
in den septischen Schock, dargestellt in Einzelverläufen, bei nicht CD86/CD2-positiven Patienten, n=18
In Gruppe 2 befinden sich 5 Patienten, bei denen mindestens 3 Messwerte über 1% lagen.
Die Anzahl der Messwerte über 1% schwankt dabei zwischen 20 und 95,6%. Der
Einfachheit halber wird diese Gruppe als DC bezeichnet.
Verlauf von CD86/CD2 bei DC
% pos
6
5
4
3
2
1
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
Tage
D9
D10
D11
D12
D13
D14
Abb. 6: Verlauf des Anteils von CD86/CD2 doppelt positiven Zellen während der ersten 14 Tage nach
Eintritt in den septischen Schock, dargestellt in Einzelverläufen, bei DC-positiven Patienten, n=5
28
3 Ergebnisse
Vergleicht man nun die Gruppe nonDC mit der Gruppe DC, zeigt sich ein deutlicher
Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Dieser Unterschied ist auch statistisch
signifikant.
6
CD86/CD2 in % pos
5
4
3
2
1
0
N=
180
57
nonDC
DC
Gruppe
Abb. 7: Vergleich aller gemessenen Werte von CD86/CD2 von DC- und nonDC-Patienten, n=Fallzahl
Betrachtet man nun die Gruppe DC im Verlauf, steigen die Werte für CD86/CD2 von Tag
1 auf Tag 4 deutlich an und fallen dann bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes fast
stetig ab. Im Vergleich zur Kontrollgruppe ist nur der Wert an Tag 1 etwas niedriger, sonst
zeigen sich deutlich höhere Werte.
29
3 Ergebnisse
6
CD86/CD2 in % pos
5
4
3
2
1
0
N=
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
3
3
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
K
Tage
Abb. 8: Darstellung des Verlaufs der CD86/CD2 doppelt positiven Werte während der ersten 14 Tage nach
Eintritt in den septischen Schock, n=Fallzahl
3.2
Typische HLH-Parameter bei Sepsispatienten
Da es Hinweise darauf gibt, dass bei Sepsispatienten HLH-ähnliche Zytokinmuster
auftreten können, wurden zusätzlich zur FACS-Messung noch sIL-2R, IFNg, Leukozyten
und Thrombozyten untersucht.
3.2.1
sIL2-R
Vergleicht man die sIL-2R-Werte von nonDC mit denen von DC-Patienten, zeigen sich
Unterschiede, die jedoch nicht signifikant sind.
30
3 Ergebnisse
4000
sIL-2R in U/ml
3000
2000
1000
0
N=
58
50
nonDC
DC
Gruppe
Abb. 9: Vergleich aller sIL-2R- Werte von DC- und nonDC-Patienten, n=Fallzahl
Um die Bedeutung der erhöhten sIL-2R- Werte zu klären, wurde zusätzlich, mittels FACSMessung, der membrangebundene IL-2R (mCD25) auf aktivierten T-Zellen über die AkKombination CD25/CD2 untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass mCD25 sowohl bei
nonDC als auch bei DC im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich herunterreguliert wurde.
31
3 Ergebnisse
5
CD25/CD2 in % pos
4
3
2
1
0
N=
175
52
12
nonDC
DC
Kontrolle
Gruppe
Abb. 10: Vergleich des Anteils der CD25/CD2 doppelt positiven Zellen zwischen nonDC, DC und einer
gesunden Kontrollgruppe, n = Fallzahl
3.2.2
IFNg
Betrachtet man sich die Mittelwerte für IFNg, zeigt sich kein eindeutiger Unterschied
zwischen der Gruppe nonDC und der Gruppe DC.
32
3 Ergebnisse
50
IFN gamma in pg/ml
40
30
20
10
0
N=
169
56
nonDC
DC
Gruppe
Abb. 11: Vergleich der IFNg-Werte von nonDC und DC-Patienten, n=Fallzahl
3.2.3
Leukozyten
Bei den Leukozytenwerten zeigt sich, dass das Niveau bei nonDC mit einem Median von
20 pg/ml (entspricht 1U/ml) höher ist als bei DC. Dieser Unterschied ist auch statistisch
signifikant (p<0,05)
33
3 Ergebnisse
40
Leukozyten in G/l
30
20
10
0
N=
180
57
nonDC
DC
Gruppe
Abb. 12: Vergleich aller Leukozytenwerte von nonDC- und DC-Patienten, n=Fallzahl
Betrachtet man sich nun den Verlauf der Leukozyten bei DC, sieht man, dass die Werte zu
Beginn des septischen Schockes zunächst bis Tag 3 deutlich abfallen und sich dann auf
einem konstanten Niveau zwischen ca. 9 und 11 G/l bewegen.
40
Leukozyten in G/l
30
20
10
0
N=
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
3
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Tage
Abb. 13: Darstellung des Verlaufs der Leukozytenwerte in G/l während der ersten 14 Tage nach Eintritt in
den septischen Schock, n=Fallzahl
34
3 Ergebnisse
3.2.4
Thrombozyten
Für die Thrombozytenwerte zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den beiden
Gruppen, wobei der Mittelwert für die Gruppen nonDC höher liegt als der für DC.
600
Thrombozyten in G/l
500
400
300
200
100
0
N=
180
57
nonDC
DC
Gruppe
Abb. 14: Vergleich aller Thrombozytenwerte der Gruppe nonDC und DC, n=Fallzahl
Der Verlauf der Thrombozytenwerte beginnt mit einem Wert von etwas über 100 G/l und
steigt dann langsam bis zu Tag 11 an. Es folgt ein Abfall bis Tag 14, der etwa bis zum
Niveau von Tag 7 reicht.
35
3 Ergebnisse
700
Thrombozyten in G/l
600
500
400
300
200
100
0
N=
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
3
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Tage
Abb. 15: Darstellung des Verlaufs der Thrombozytenwerte in G/l während der ersten 14 Tage nach Eintritt in
den septischen Schock, n=Fallzahl
36
3 Ergebnisse
3.3
Falldarstellung DC-Patienten
3.3.1
Fall 1
CD86+/CD2+
% pos
86+/2+
6
5
4
3
2
1
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10 D11 D12 D13 D14
Tage
sIL-2R und IFN gamma
sIL-2R
U/ml
3000
IFN gamma
pg/ml
90
2500
75
2000
60
1500
45
1000
30
500
15
0
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10 D11 D12 D13 D14
Tage
Leukozyten und Thrombozyten
laLemin
laThmin
G/l
40
G/l
800
30
600
20
400
10
200
0
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10 D11 D12 D13 D14
Tage
Abb. 16: Darstellung des Verlaufs von CD86/CD2, sIL-2R, IFNg, Leukozyten und
Thrombozyten innerhalb der ersten 14 Tage des septischen Schockes bei Fall Nr.1
37
3 Ergebnisse
Bei Fall 1 handelt es sich um Patient Nr.:19. Die Aufnahmediagnose war eine Fraktur von
BWK 7. Im Verlauf entwickelte sich ein septischer Schock vermutlich aufgrund einer
Spondylodiszitis.
Die CD86+/CD2+-Werte über den gesamten Messzeitraum deutlich erhöht. Der höchste
Wert von 5,69% fällt auf D1. Es folgt ein kontinuierlicher Abfall bis D5 mit
anschließendem Wiederanstieg bis D11.
Vergleicht man dazu den Verlauf von sIL-2R zeigen sich keine Parallelen im Vergleich zu
CD86+/CD2+. Die Werte von sIL-2R bleiben relativ konstant zwischen 422 und 977 U/ml.
Bei IFNg zeigt sich ein peak von 46,8 pg/ml an D7, der etwa mit dem ersten Minimalwert
von CD86+/CD2+ zusammenfällt. Auch der zweite, etwas niedrigere, Anstieg von IFNγ
(auf 32,9 pg/ml) am Ende der Messperiode fällt mit dem Abfall der CD86+/CD2+-Werte
zusammen.
Die Leukozyten- und Thrombozytenwerte beginnen parallel zueinander auf einem relativ
niedrigen Niveau und steigen zum Ende des Beobachtungszeitraumes hin stetig auf Werte
oberhalb des Normbereichs an.
38
3 Ergebnisse
3.3.2
Fall 2
CD86+/CD2+
86+/2+
% pos
6
5
4
3
2
1
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10 D11 D12 D13 D14
Tage
sIL-2R und IFN gamma
sIL-2R
U/ml
3000
2500
2000
IFN gamma
pg/ml
90
75
60
1500
1000
500
0
45
30
15
0
D1
D2 D3 D4
D5 D6 D7
D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
Tage
Leukozyten und Thrombozyten
Leukozyten
Thrombozyten
G/l
40
G/l
800
30
600
20
400
10
200
0
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10 D11 D12 D13 D14
Tage
Abb. 17: Darstellung des Verlaufs von CD86/CD2, sIL-2R, IFNg, Leukozyten und
Thrombozyten innerhalb der ersten 14 Tage des septischen Schockes bei Fall Nr.2
39
3 Ergebnisse
Fall 2 (Patient Nr.:20) ist ein 64-jähriger Mann mit Anastomoseninsuffizienz nach einer
Sigmaresektion. Aufgrund einer 4-Quadranten-Peritonitis erlitt er einen septischen Schock
mit Multiorgandysfunktion.
Die Werte für CD86+/CD2+ befanden sich bis D11 im Normbereich und stiegen bis D14
auf einen Maximalwert von 1,89% an.
Wie auch bei Fall 1 zeigen sich für sIL-2R Werte im Bereich zwischen 613 und 1036
U/ml, die im Verlauf nur geringen Schwankungen unterliegen.
Die IFNg-Werte zeigen einen leichten Abfall an D5 und D6, sonst ist hier ebenfalls ein
relativ konstanter Verlauf zwischen 17,2 und 31,9 pg/ml zu verzeichnen.
Bei den Leukozyten- und Thrombozytenwerten zeigt sich wiederum ein paralleler Verlauf
der beiden Parameter. Am Beginn des Messzeitraumes liegen die höchsten Werte (14,4 G/l
bei Leukozyten und 500 G/l bei Thrombozyten). Dann fallen sie konstant ab und pendeln
sich auf ein Niveau von etwa 200G/l bei Thrombozyten und 10 G/l bei Leukozyten ein.
40
3 Ergebnisse
3.3.3
Fall 3
CD86+/CD2+
% pos
86+/2+
6
5
4
3
2
1
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10 D11 D12 D13 D14
sIL-2R und IFN gamma
sIL-2R
IFN gamma
U/ml
pg/ml
3000
90
2500
75
2000
60
1500
45
1000
30
500
15
0
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9 D10 D11 D12 D13 D14
Leukozyten und Thrombozyten
G/l
Leukozyten
Thrombozyten
G/l
40
800
30
600
20
400
10
200
0
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10 D11 D12 D13 D14
Abb. 18: Darstellung des Verlaufs von CD86/CD2, sIL-2R, IFNg, Leukozyten und
Thrombozyten innerhalb der ersten 14 Tage des septischen Schockes bei Fall Nr.3
41
3 Ergebnisse
Fall 3 entspricht Patient Nr. 21 und dabei handelt es sich um einen 21-jährigen Mann mit
Bronchial-Ca, der an einer Pseudomonas-Pneumonie erkrankte und aufgrunddessen einen
septischen Schock erlitt.
Bei diesem Patienten liegen alle Werte mit Ausnahme des Wertes an D2 oberhalb des
Normbereiches. Am Beginn des septischen Schockes liegen die Werte relativ knapp
oberhalb der Norm und steigen dann bis D5 zum Maximalwert von 4,11% an. Es schließt
sich ein kontinuierlicher Abfall der Werte bis auf den Ausgangswert an D12 an.
Der Höchstwert für den sIL-2R liegt gleich zu Beginn des septischen Schockes an D2 mit
1892 U/ml. Anschließend fallen die Werte stetig bis D7 ab.
IFNg beginnt wie sIL-2R mit einem Maximalwert von 61,7 pg/ml. Parallel zu sIL-2R folgt
auch hier ein Absinken der Werte bis D7. Dann pendeln sich die Werte zwischen 10,4 und
13,3 pg/ml ein.
Thrombozyten und Leukozyten verlaufen zu Beginn bis D6 parallel. Dabei steigen sie
leicht von einem Niveau unterhalb der Norm (Leukozyten: 1,6 G/l und Thrombozyten: 81
G/l) auf Werte im Normbereich an. Während die Leukozyten dann konstant auf etwa dem
gleichen Niveau bleiben, kommt es bei den Thrombozyten zu einem Anstieg ab D6 mit
einem Höhepunkt an D9 (604 G/l). Es schließt sich ein Abfall der Werte bis zum Ende der
Messperiode an.
42
3 Ergebnisse
3.3.4
Fall 4
CD86+/CD2+
86+/2+
% pos
6
5
4
3
2
1
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9
D10 D11 D12 D13 D14
Tage
sIL-2R und IFN gamma
sIL-2R
U/ml
3000
IFN gamma
pg/ml
90
2500
75
2000
60
1500
45
1000
30
500
15
0
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9 D10 D11 D12 D13 D14
Tage
Leukozyten und Thrombozyten
Leukozyten
Thrombozyten
G/l
40
G/l
800
30
600
20
400
10
200
0
0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D8
D9 D10 D11 D12 D13 D14
Tage
Abb. 19: Darstellung des Verlaufs von CD86/CD2, sIL-2R, IFNg, Leukozyten und
Thrombozyten innerhalb der ersten 14 Tage des septischen Schockes bei Fall Nr.4
43
3 Ergebnisse
Bei Fall 4 handelt es sich um Patientin Nr. 22, bei der ein frei rupturiertes
Bauchaortenaneurysma diagnostiziert wurde. Es entwickelte sich ein hämorrhagischer
Schock mit Multiorganversagen.
Die CD86+/CD2+-Werte sind zu Beginn des Beobachtungszeitraumes im Normbereich
und steigen dann bis zu einem Wert von 2,18% an D5 an, um anschließend bis zum Ende
der Messperiode wieder in den Referenzbereich abzusinken.
Die Werte für sIL-2R beginnen auf einem niedrigen Niveau von 567 U/ml und steigen
dann langsam bis D7 auf den Höchstwert von 1633 U/ml an. Es folgt ein Abfall auf Werte
zwischen 978 und 1095 U/ml (mit Ausnahme von D10) bis zum Ende des Messzeitraumes.
Bei IFNg ist zuerst ein Abfall der Werte von 30,0 pg/ml auf 19,3 pg/ml zu verzeichnen.
Dieser ist gefolgt von einem Anstieg bis 78,0 pg/ml an D10. Es erfolgt ein weitere Abfall
auf einen Wert von 25,8 pg/ml an D13.
Die
Leukozyten-
und
Thrombozytenwerte
verlaufen
annähernd
parallel.
Die
Thrombozytenwerte liegen zu Beginn des septischen Schockes unterhalb des
Normbereiches mit einem Minimalwert von 88 G/l an D2. Sie steigen dann bis zu einem
Maximalwert von 327 G/l an D9 an, um anschließend wieder auf ein Niveau von etwa 200
G/l abzufallen. Bei den Leukozyten verhält es sich ähnlich. Der Beginn liegt jedoch
oberhalb des Normbereiches und fällt zunächst auf einen Minimalwert von 9,5 G/l ab.
Dann folgt ein starker Anstiegt auf einen Maximalwert von 32,7 G/l an D8. Es folgt ein
Abfall auf Werte unterhalb des Ausgangsniveaus, die im Normbereich liegen.
44
4 Diskussion
4
4.1
Diskussion
CD86/CD2 als Marker für APC
Da es keinen spezifischen Marker gibt, der DC im Blut eindeutig identifizieren könnte und
die DC, meist als unreife Vorläuferzellen, nur in sehr geringer Menge (0,01-1%)
vorkommen, wurden in den letzten Jahren verschiedene Methoden entwickelt, um diese
Probleme zu lösen. [20, 31, 59, 83]
In der vorliegenden Studie kam es weniger darauf an, große Mengen an DC zu
produzieren, als vielmehr Oberflächenmarker zu finden, die, allein oder in Kombination
mit anderen Markern, DC eindeutig nachweisbar machen können.
Außerdem ging es nicht nur darum, das Vorkommen von DC bei Patienten im septischen
Schock nachzuweisen, sondern auch um den Verlauf der DC bei diesen Patienten über
einen längeren Zeitraum. Man wählte daher als Messverfahren die Durchflusszytometrie,
da dies ein relativ wenig aufwändiges Verfahren ist und eine leichte und schnelle
Auswertung von Oberflächenmarkern in vitro zulässt. Es würde sich auch gut für einen
eventuellen klinisch diagnostischen Einsatz eignen.
Bisher hat man noch keinen adäquaten Marker zum Nachweis zirkulierender DC in vitro
gefunden. Es wurde jedoch eine Koexpression von CD86 als Marker von dendritischen
Zellen mit einer stark positiven CD 2 Expression identifiziert. [25]Aufgrund der folgenden
Voraussetzungen bestand die Hypothese, dass man mit der Ak-Kombination CD86/CD2
zirkulierende dendritische Zellen mittels Durchflusszytometrie nachweisen könnte.
CD86 als kostimulatorisches Molekül konnte auf DC regelmäßig nachgewiesen werden.
[16, 52, 57, 64, 66, 80, 83]Dabei zeigte sich, dass CD86 sowohl auf unreifen als auch auf
reifen DC vorhanden war. [20, 52, 83]Auch zwischen myeloiden und nicht-myeloiden DC
zeigte sich lediglich ein Unterschied in der Quantität der Expression von CD86. Während
auf myeloiden DC große Mengen an CD86 exprimiert wurden, war die Anzahl auf nichtmyeloiden DC deutlich geringer. [72]
CD2 konnte neben T- und NK-Zellen auch auf Monozyten und DC nachgewiesen werden.
Crawford et al konnte zeigen, dass sich frisch isolierte CD2+-Monozyten in ihrer Form und
Oberfläche nicht von CD2--Monozyten unterscheiden. Nach Kultivierung zeigten die
CD2+-Monozyten die typische Form dendritischer Zellen. Sie waren unregelmäßig
45
4 Diskussion
-
geformt mit prominenten dendritischen Fortsätzen, während CD2 -Monozyten eher rund
bis oval waren und mehr wie typische Monozyten aussahen. [22]
Takamizawa et al konnte bereits 1997 CD2+-DC-Vorläufer im peripheren Blut
nachweisen. Er stützte sich dabei auf die Hypothese, die bereits von anderen [31,
58]verwendet wurde, nämlich, dass DC-Vorläufer in großer Menge HLA-DR exprimieren,
aber zugleich für andere zelllinienspezifische Marker (siehe Kap. 1.2.) negativ sind. Er
stellte fest, dass 75-95% dieser Zellen CD2 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Wie auch bei
Crawford et al waren die frisch isolierten Zellen, ob CD2+ oder CD2- rund und hatten
keine dendritische Morphologie. Nach Kultivierung zeigten beide Zellpopulationen das
typische Aussehen von DC wie unregelmäßige Form und dendritische Fortsätze. Bei den
CD2+-Zellen waren jedoch die Fortsätze deutlich prominenter als bei CD2-. Zusätzlich
konnte auch Takamizawa et al CD86 sowohl auf CD2+ als auch auf CD2- -DC
nachweisen. [83]Bei Sepsis- und auch Histiozytosepatienten scheint CD2 stärker positiv zu
sein als in T-Zellen. [73]
In der Literatur wurden DC meist über die Eigenschaften isoliert, dass sie für HLA-DR
stark positiv und für zelllinienspezifische Marker wie CD3 (T-Zellen), CD19/20 (BZellen), CD14 (Monozyten/Makrophagen) oder CD56/57 (NK-Zellen) negativ waren (im
weiteren Verlauf des Textes mit lin- bezeichnet). [16, 20, 29, 31, 38, 51, 58, 66, 68, 69, 83]
Wie bereits in der Einleitung erwähnt, wurden im Blut bisher zwei Subpopulationen
dendritischer Zellen identifiziert, DC1 und DC2. Da für die vorliegende Arbeit nur die DCIdentifizierung aus dem peripheren Blut eine Rolle spielt, wird auf die Diskussion von
Isolationsmethoden aus anderen Geweben verzichtet.
Als typische Marker, um verschiedene DC-Untergruppen im peripheren Blut zu
identifizieren, werden hauptsächlich CD11c und CD8α beschrieben.
CD11c ist ein β2-Integrin, das auf myeloiden Zellen vorkommt. Borras et al, O’Doherty et
al und Robinson et al konnten durch o.g. Isolationsmethode unter den DC zwei
Subpopulationen unterscheiden, von denen die eine für CD11c positiv und die andere für
CD11c negativ war. [16, 58, 66]
Betrachtet man die Morphologie der frisch isolierten DC zeigte sich, dass CD11c- DC eher
rund und mittelgroß mit ovalem Kern waren, CD11c+ DC dagegen waren weniger rund
und leicht gewellt mit lobuliertem Kern. Nach Kultivierung mit GM-CSF und TNFα
[66]oder monocyte-conditioned medium [58]kam es zur Vergrößerung der DC und es
entwickelten sich dendritische Fortsätze bei CD11c+-Zellen, die wesentlich länger waren
als die von CD11c--DC[58, 66]. Die Morphologie konnte also bestätigen, dass es sich bei
46
4 Diskussion
-
CD11c±HLA-DR+lin - Zellen um DC im peripheren Blut bzw. Nabelschnurblut handelt.
[16, 58, 66]
Phänotypisch exprimieren CD11c+ DC auf ihrer Oberfläche typische myeloide Marker wie
CD13 und CD33. [20]Im Gegensatz dazu findet man auf der Zelloberfläche von CD11cDC keine myeloiden Marker, dafür zeigen diese eine stärkere Expression lymphoider
Antigene wie CD4 und CD123 (IL-3R). [66]
Aufgrund dieser morphologischen und phänotypischen Erkenntnisse stellte man die
Hypothese auf, dass es sich bei den verschiedenen DC-Subpopulationen um DC aus
verschiedenen Zelllinien handelt. CD11c+-DC stammen von myeloiden Vorläufern ab,
während CD11c- -DC von plasmazytoiden Vorläufern abzustammen scheinen. [16, 20, 66]
In Mäusen konnten zwei Subklassen von DC aufgrund ihrer CD8α-Expression
differenziert werden. CD8α+-DC scheinen lymphoiden Ursprungs zu sein und exprimieren
zusätzlich FasL auf ihrer Oberfläche. Dies schreibt ihnen die Fähigkeit zur Apoptose zu,
was wiederum zur Toleranz des Immunsystems führt. CD8α- -DC, welche wohl myeloiden
Ursprungs sind, besitzen die Fähigkeit, eine adäquate Immunantwort zu initiieren. Dies
führt zur Aktivierung von T-Zellen. [53, 82]
4.2
Dendritische Zellen
Im Blut kommen im Wesentlichen die unreifen Vorläuferzellen der DC vor. Deshalb ging
es in der vorliegenden Studie um das Vorkommen und die Bedeutung dieser zirkulierenden
precursor DC (pDC).
Da myeloide und lymphoide DC von unterschiedlichen Zelllinien abzustammen scheinen,
differenziert man auch verschiedene pDC im peripheren Blut. Die myeloiden pDC (pDC1)
leiten sich einerseits von den myeloiden CD34+-Stammzellen des KM ab, können aber in
vitro auch aus Blutmonozyten durch Zugabe von GM-CSF, IL-4 [80]bzw. TNFa
[65]generiert werden. [8, 80]
Vorläufer der lymphoiden pDC (pDC2) sind nach Rissoan, Grouard und Steinman
CD4+CD3-CD11c-
-
plasmazytoide
Zellen,
die
in
ihrer
Morphologie
den
antikörperproduzierenden Plasmazellen sehr ähnlich sind und sich von lymphoiden
Stammzellen aus dem KM ableiten.
Nach dem Aussehen haben sowohl pDC1 als auch pDC2 sehr viel Ähnlichkeit mit ihren
Vorläufern.
47
4 Diskussion
pDC1 sind morphologisch kleine runde bis ovale Zellen mit lobuliertem Kern
entsprechend dem Aussehen von Monozyten. [58]Auch die Expression von bestimmten
Oberflächenmarkern weist auf die Zugehörigkeit der pDC1 zur myeloiden Zelllinie hin.
Sie exprimieren in hohem Maße CD11c, CD13 und CD33. [58, 80]
Betrachtet man im Vergleich dazu die Morphologie und den Phänotyp von pDC2, findet
man deutliche Unterschiede zwischen diesen beiden Subgruppen. pDC2 erscheinen unter
dem Mikroskop als mittelgroße, runde Zellen mit ovalem, leicht eingedelltem Kern. [58,
66]
Im Gegensatz zu pDC1 zeigen sich auf der Oberfläche von pDC2 keine oder nur wenige
myeloide Marker. Stattdessen exprimieren pDC2 CD36 und CD123 (IL-3Rα). [20]Beide
Subpopulationen exprimieren geringe Levels an CD40, CD80, CD86 und CD54 [20, 58,
80]und haben eine hohe Expression des MHC-II-Moleküls HLA-DR.
Unreife DC kommen neben dem Blut auch noch in anderen Geweben, wie z.B. der Haut
(Langerhans-DC), vor. In diesem unreifen Zustand besitzen DC viele Fcγ- und FcεRezeptoren zur Antigenaufnahme über Phagozytose und Endozytose, jedoch wenig
akzessorische Signale für die T-Zellaktivierung, wie CD40, CD54, CD58, CD80 und
CD86. Damit können sie zwar extrazelluläre Antigene aufnehmen, allerdings erfolgt keine
Stimulierung von T-Zellen. Dies führt zunächst zur Toleranz und schützt den Organismus
vor pathologischen Autoimmunprozessen. [54]
Die Aktivierung der DC zur Reifung erfolgt über exogene (LPS, bakterielle DNA, virale
dsRNA) oder endogene (Zytokine, Prostanoide, Adeninnukleotide) Stimuli. Diese Stimuli
sind ausschlaggebend dafür, welche Subgruppe von DC bevorzugt an den Ort der Infektion
angelockt werden. Hat die aktivierte unreife DC einmal ein Antigen aufgenommen,
nehmen die antigenpräsentierenden Eigenschaften der pDC rasch ab und sie verlagern ihre
Tätigkeit auf die Herstellung von MHC-II- Antigen-Komplexen, die nach der
Antigenprozessierung an die Zelloberfläche transportiert und T-Zellen präsentiert werden.
Dort verbleiben sie für mehrere Tage. Gleichzeitig mit der Antigenpräsentation an der
Zelloberfläche von DC kommt es zur Erhöhung der Expression der kostimulatorischen
Moleküle. [9]
Mit der Aktivierung wandern DC vom Ort der Entzündung über das Blut und die afferente
Lymphe in Milz und Lymphknoten. Aus diesem Zusammenhang ist erklärlich, warum reife
DC nicht im peripheren Blut nachweisbar sind. Damit unterscheiden sie sich von
Monozyten/Makrophagen, die einen Anteil von etwa 5-10 % aller zirkulierender
Leukozyten ausmachen (FSC/SSC). DC binden im Lymphknoten über MHC-II-Moleküle
48
4 Diskussion
an den TCR und mit ihren kostimulatorischen Molekülen an die jeweiligen Liganden
(CD28/CTLA-4 für CD80/CD86, CD11a/CD18 für CD54, CD2 für CD58 und CD40L für
CD40), was zur Aktivierung der T-Zellen führt. Durch MHC-II auf DC werden vor allem
T-Helfer-(TH)Zellen aktiviert. Dabei unterscheidet man ebenfalls zwei Subpopulationen,
TH1 und TH2. Rissoan et al konnte nachweisen, dass DC1 zu einer überwiegenden
Entwicklung von TH1 führen, während DC2 für die Stimulation von TH2 verantwortlich
sind. [65]Diese Tatsache scheint darauf zurückzuführen zu sein, dass DC1 in großer
Menge IL-12 produzieren und damit die Entwicklung von TH1-Zellen bevorzugt auftritt.
[24, 43]Für die TH2-Entwicklung scheint es laut Rissoan et al und Kalinski et al kein
spezifisches Zytokin zu geben. [48, 65]Kalinski entwickelte daraus die Hypothese, dass es
verschiedene Faktoren gibt, die die IL-12-Produktion reduzieren und es so zur
Entwicklung von TH2 kommt. [48]
Als Konsequenz müsste man bei der schweren Sepsis bzw. dem septischen Schock und
einer entsprechend hohen Infektionsrate eine proinflammatorische und im Fortgang der
Erkrankung eine antiinflammatorische Reaktion im lymphatischen Gewebe finden. Efron
weist in diesem Zusammenhang auch darauf hin, dass es durch das Fehlen von MHC-IIRezeptoren auf DC zu einer nur geringen oder keiner Kostimulation und in der Folge zu
einer anergen Immunitätslage kommt, wodurch die DC in einem unreifen Status
verbleiben.
Dieser
Immundefekt
bzw.
DC-Defekt
geht
mit
einer
erhöhten
Plasmakonzentration von IL10 einher. [26]Nach Untersuchungen von Cottrez et al führt
dies zur Differenzierung von TH-Zellen in regulatorische T-Zellen (Tr), die für CD4 und
CD25 positiv sind [21]und die Immunantwort in vivo modulieren. Bei Sepsis (Abb.10)wie auch bei HLH-Patienten [73]konnte neben der vermehrten Anzahl an CD86/CD2
positiven Zellen eine Verminderung CD25 positiver Zellen nachgewiesen werden. Bei der
HLH ist der vermehrte Nachweis von CD86/CD2 positiven pDC im Blut mit einer
unvollständigen Aktivierung von TH1-Zellen assoziiert. Es kommt ausschließlich zur
Aktivierung von TH0-Zellen. [74]Es wäre wichtig, in diesem Patientengut die IL10Plasmakonzentration nachzuuntersuchen.
Erstmalig zeigt diese Arbeit, dass DC-Differenzierungsdefekte bei Sepsis nachgewiesen
werden können und mit einem neuen Phänotyp charakterisiert werden können, der für
CD86/CD2 positiv, aber für CD80/CD2 negativ ist.
In der gesunden Immunantwort produzieren die TH1-Zellen vor allem IFNg und IL-2. In
dieser Arbeit waren nur einzelne Patienten für die IFN γ-Plasmakonzentrationen positiv
(Abb.11). Eine eindeutige Zuordnung zur Prävalenz von CD86/CD2 positiven Zellen
49
4 Diskussion
konnte nicht hergeleitet werden. Das Resultat der ineffizienten DC-Differenzierung bei
Sepsispatienten würde nicht dazu führen, dass zytotoxische Effektorzellen (CTL, NKZellen) aktiviert werden. Auch eine B-Zell-vermittelte Produktion von IgM, IgG und IgA
würde nur unzureichend unterstützt werden. [67]Von TH2-Zellen werden bevorzugt
antiinflammatorische Zytokine wie IL-4, IL-5 und IL-13 freigesetzt. Romagnani konnte für
TH2-Zellen nur eine geringe zytolytische Aktivität (18%) gegenüber TH1-Zellen (77%)
nachweisen. Die Funktion der TH2-Zellen beruht im Wesentlichen auf der Induktion der
Produktion von IgA, IgM, IgG und vor allem IgE. [67]
Bei den Patienten der vorliegenden Studie kann man nach der CD86/CD2-Expression zwei
Gruppen unterscheiden. Die Gruppe nonDC (n=18) umfasst drei Untergruppen, nämlich
die Gruppen CD86-/CD2-, CD86+/CD2- und CD86-/CD2+. In der Gruppe der DC (n=4)
waren beide Marker positiv (CD86+/CD2+). Diese Zellgruppe zeigte eine starke Intensität
für CD2 (mean intensity: 968.3) und eine eher schwächere Intensität (mean intensity:
35,91) für CD86. Bei der Gruppe DC konnte diese Studie eine relative Anzahl von bis zu
5,69% der CD86+/CD2+-Zellen nachweisen. Normalspender und nonDC lagen bei < 1%.
Jetzt stellt sich natürlich die Frage, um welche DC-Subgruppe es sich dabei handelt,
warum gerade bei dieser Patientengruppe eine größere Anzahl dieser Zellen vorkommt und
welche Konsequenz dies für die Immunantwort haben könnte.
Bei den HLH-Patienten konnten Schäfer et al zeigen, dass CD86+/CD2+-Zellen dort
ebenfalls vorkommen und bis zu 50% der zirkulierenden Lymphozyten ausmachen. Dabei
unterscheidet sich auch das Expressionsmuster deutlich von dem der Sepsispatienten. Man
kann eine höhere mittlere Intensität für CD86 feststellen, während die Intensität für CD2
ungefähr gleich bleibt.
Bisher ist bekannt, dass es bei der HLH zur Defizienz der NK-Zellen gegen MHC-negative
Zielzellen kommt. [46]Eine mögliche Ursache dafür könnte die Nichtexpression von
Effektormolekülen der zellulären Zytotoxizität (wie z.B. Perforin[81]oder auch
Granzymen) sein. Dies kann entweder vererbt (FHL) oder eine vorübergehende Störung
(IAHS) sein. [46]Weiterhin könnte die NK-Zellanergie aus einem Defekt der DC
resultieren. [75]Dies geschieht vor allem, wenn DC als APC sich im Wesentlichen mit der
Phagozytose apoptotischer und überalterter Zellen beschäftigen und dadurch keine TZellaktivierung erfolgt. [46]Dies führt zur Toleranz der zellulären Immunantwort bzw. zur
Anergie. Nimmt man letztere Theorie, so würde es bei HLH-Patienten zu einer deutlichen
Vermehrung der DC kommen. Dies würde eine anerge Immunantwort zur Folge haben.
Überträgt man diese Theorie auf die Studienpatienten, sieht man eine deutlich geringere
50
4 Diskussion
Anzahl an DC und es ist sehr unwahrscheinlich, dass es ausschliesslich über diesen
Mechanismus zu einer ausgeprägten antiinflammatorischen Immunitätslage kommt.
4.3
Wertigkeit der untersuchten Histiozytose-Parameter für Patienten mit septischem
Schock
Um zu überprüfen, ob es, trotz der geringen Anzahl an DC, zu ähnlichen
pathophysiologischen Reaktionen kommt wie bei der HLH, hat man einzelne Parameter
ausgewählt und untersucht.
4.3.1
sIL-2R
In Abb. 5.2.1.1. sind die Ergebnisse der sIL2R-Plasmaspiegel zusammengefasst. Es lassen
sich Unterschiede in der Höhe der Plasmaspiegel zwischen der Gruppe DC und nonDC
feststellen. Die sIL-2R-Plasmaspiegel lagen bezüglich der Referenzwerte von Komp (80600 U/ml) zu 70,9% oberhalb der Norm. Trotzdem waren sie deutlich niedriger als bei
HLH-Patienten. [73]Durchschnittlich fand sich bei nonDC ein Wert von 1441,79 U/ml und
bei DC von 1630,82 U/ml, wobei der Maximalwert unter allen Patienten bei 3836 U/ml
lag. Zwischen diesen beiden Gruppen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt
werden. Somit kann dieser Parameter nicht zur weiteren Differenzierung zwischen DC
positiven und DC negativen Patienten herangezogen werden.
Komp et al stellten bei HPS-Patienten deutlich erhöhte Plasmaspiegel an sIL-2R fest. Bei
unbehandelten Patienten reichten die Werte von 23.600 bis 75.200 U/ml. Mit adäquater
Therapie fielen die Werte im Verlauf der Erkrankung bis zur Remission deutlich ab, lagen
aber immer noch oberhalb der Norm. [50]
Ursächlich liegt dieser Tatsache zugrunde, dass es bei der HLH zu einer unkontrollierten
Proliferation aktivierter T-Lymphozyten und Histiozyten kommt. [47]Dies führt bei
aktivierten T-Zellen zur Überproduktion verschiedener Zytokine, wobei der lösliche IL-2R
eine wichtige Rolle spielt. IL-2, welches normalerweise von T-Lymphozyten, vor allem
TH1-Zellen produziert wird, bindet vermutlich an sIL-2R. Dieser Komplex fungiert als
„blocking factor“, indem er die normale Immunantwort unterbindet. Dies führt zu einer
sekundären Immundefizienz und somit zur Anergie der T-Zellen. [44, 50]Tomaske et al
51
4 Diskussion
konnten mit einer adjuvanten Gabe von αCD 25-Antikörpern bei einem Kind mit HLH
eine Verbesserung des Verlaufs der Erkrankung erreichen. [84]
Es könnte auch bei diesen Patienten zu einem shedding des membrangebundenen IL-2R
gekommen zu sein, wenn auch nicht in so exzessivem Maße wie bei HLH-Patienten.
In dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass, während sich die CD25Expression in der Kontrollgruppe im Referenzbereich befand, sie bei den Studienpatienten
deutlich vermindert war. Dies deutet darauf hin, dass weniger regulatorische T-Zellen
vorhanden sind und die APC in ihrer Funktion beeinträchtigt sind. [26]
Andererseits könnte es aber auch bei Patienten im septischen Schock zu einer übermäßigen
T-Zellaktivierung kommen, die aber immer noch weniger deutlich ausgeprägt ist als bei
HLH und dadurch auch hier eine anerge Immunitätslage vorhanden sein könnte.
4.3.2
IFN gamma
Die IFNg-Plasmaspiegel sind bei Sepsispatienten in Einzelfällen deutlich erhöht, wobei
sich ein Mittelwert von 1,25 U/ml ergibt. Erhöhtes IFNg konnte bisher keiner eindeutigen
klinischen Situation zugeordnet werden. (Kap 3.2.2.)
Bei der Histiozytose erweist sich IFNg als guter diagnostischer und auch prognostischer
Parameter.
In der Literatur findet man durchweg Angaben für eine deutliche Erhöhung von IFNgWerten während der aktiven Phase der HLH mit Fieber, Hyperzytokinämie und
fehlerhafter DC-Reifung. [4, 33, 42, 60]Dabei zeigt sich zwischen den Untergruppen
MAHS, IAHS und FHL kein Unterschied in der Höhe der IFNg-Konzentrationen. Bei
effektiver
Therapie
fallen
die
IFNg-Plasmaspiegel
auf
Werte
unterhalb
der
Nachweisgrenze ab. Ohga konnte bei einem Wiederanstieg von IFNg gemeinsam mit
Fieberspitzen einen frühen Nachweis für einen Rückfall zeigen. [60]
Somit kann IFNg bei der Histiozytose als guter prognostischer Faktor verwendet werden.
Ursächlich für die hohen IFNg-Werte beim HPS ist vermutlich eine unkontrollierte
Proliferation von T-Zellen, vor allem CD8+-zytotoxischen T-Zellen und eine
Verminderung der Hämatopoese sowie allgemeiner Entzündungsmarker. IFNg vermittelt
auch eine vermehrte Phagozytoseaktivität von Monozyten und Histiozyten, was mit einer
Hämophagozytose einhergeht. [4]
52
4 Diskussion
Differentialdiagnostisch kommt es auch bei Autoimmunerkrankungen und vor allem bei
viralen Infektionen zu einem Anstieg der IFNg-Plasmakonzentrationen. Dies würde für die
Sepsispatienten dieser Studie bedeuten, dass es einen Anstieg der IFNg-Werte bei
Nachweis oder vermuteter viraler Infektion geben könnte, weniger bei bakteriellen
Infektionen. Um eine weiterführende Aussage treffen zu können, müsste bei den
Studienpatienten der Hinweis auf eine Virusinfektion bzw. eine Virusreaktivierung
nachuntersucht werden.
4.3.3
Leukozyten und Thrombozyten
Bei den meisten Sepsispatienten kommt es zur Veränderung der Hämatopoese, die sich in
einer gesteigerten Myelopoese durch bakterielle Infektionen erklären lässt. Im septischen
Schock ist nicht selten eine massive Lymphopenie, aber auch Granulopenie zu beobachten,
welche molekular nicht verstanden wird. Eine Beteiligung inflammatorischer Zytokine als
verantwortliche Parameter für die Knochenmarksdepression ist nur für IFNg und TNFa
beschrieben worden. Ein erstes Zeichen einer Histiozytose ist bei der kindlichen
Erkrankung eine Thrombopenie. Von den hier untersuchten Patienten war die
Beeinträchtigung der Thrombozytenzahlen nur transient und korrelierte nicht präzise mit
dem Nachweis von CD86/CD2 und IFNg. (Kapitel 3.2.4)
Der HLH liegt definitionsgemäß eine Anämie, eine Thrombozytopenie und eine
Neutropenie zugrunde. Bei der FHL kommt es bei 82 % bzw. bei 89 % der Patienten zu
einer Thrombozytopenie bzw. zu einer Anämie. Neutropenien treten nur in etwa 58 % der
Fälle auf. [40]
Histologisch können lymphohistiozytäre Infiltrationen v.a. von Leber, Milz und
Lymphknoten nachgewiesen werden. Es handelt sich dabei um morphologisch benigne
Zellen, die eine aktive Phagozytose hämatopoetischer Zellen, v.a. Erythrozyten, aber auch
Thrombozyten und Neutrophilen zeigen. [40, 47]
Auch die Zytopenien sind ein wertvoller diagnostischer Indikator für die Aktivität der
Erkrankung. [40]
In der Literatur wurden vereinzelt Fälle von schwerer Sepsis bzw. septischem Schock mit
Multiorganversagen beschrieben, bei denen Hämophagozytosen als Ursache für
Thrombozytopenien nachgewiesen werden konnten. [30]Dies lässt den Schluss zu, dass ein
53
4 Diskussion
reaktives hämophagozytisches Syndrom einen nicht unwesentlichen Anteil zur
Entwicklung einer Multiorgandysfunktion beiträgt. [34]
Schlussfolgerung
Durch die Ak-Kombination CD86/CD2 konnte bei einigen Patienten mit schwerer Sepsis
oder septischem Schock ein erhöhter Anteil an dendritischen Zellen im Blut nachgewiesen
werden, wenn auch in deutlich geringerer Anzahl als bei HLH-Patienten.
Für die sIL-2R-Plasmaspiegel konnten bei diesem Patientengut nur leicht erhöhte Werte
nachweisen, die nicht mit CD86/CD2 positiven Patienten assoziiert sind.
Nur transient erhöht waren die gemessenen IFNg-Plasmakonzentrationen. Eine Korrelation
zum Nachweis von dendritischen Zellen bei Patienten im septischen Schock konnte nicht
gefunden werden.
Thrombozytopenien zeigten sich lediglich vereinzelt bei wenigen Patienten, wobei keine
weitere Differenzierung zwischen CD86/CD2 positiven bzw. negativen Patienten möglich
war.
Die untersuchten Parameter können in hohem Maße bei Histiozytosesyndromen
identifiziert werden. Histiozytosen sind mit Defekten der DC-Reifung wie auch der TZellaktivierung assoziiert, welche bei einem geringen Anteil von Patienten mit septischem
Schock gefunden werden.
Demnach können für CARS und MARS in der Sepsis DC-Funktionsdefekte konzeptionell
diskutiert werden.
Eines der wichtigsten Ergebnisse scheint die fast konsequente Verminderung von CD25
auf Leukozyten zu sein. Da CD25 u.a. auch auf regulatorischen T-Zellen nachgewiesen
werden kann, scheint es bei Patienten mit schwerer Sepsis bzw. septischem Schock zu
einer deutlichen Verminderung dieser regulatorischen T-Zellen zu kommen. Dies weist
darauf hin, dass IL-10 eine große Rolle bei der Immunantwort einer Sepsis bzw. eines
SIRS zu spielen scheint. Dieser Parameter wurde in dieser Arbeit nicht bestimmt, da sich
der Zusammenhang zwischen Sepsis/SIRS und IL-10 erst ergab, nachdem die Experimente
dieser Arbeit bereits abgeschlossen waren.
54
5 Zusammenfassung
5
Zusammenfassung
Die schwere Sepsis ist mit einer Sterblichkeit von ca. 35.000/Jahr noch immer die
häufigste Todesursache auf nichtkardiologischen Stationen in Deutschland. Kritisch
Kranke, Immunkompromitierte und multimorbide Patienten sind am meisten gefährdet,
eine schwere Sepsis oder einen septischen Schock zu erleiden.
Sepsis wird nach der Konsensus-Konferenz von 1991 als systemic inflammatory response
syndrome (SIRS) assoziiert mit einer nachweisbaren bzw. wahrscheinlichen Infektion
definiert.
Die größte Schwierigkeit bei der Diagnose einer Sepsis besteht in einem frühzeitigen
Übergang in eine schwere Sepsis oder einen septischen Schock, was mit einer zu einer
deutlichen Zunahme der Sterblichkeitsrate assoziiert ist.
Im gesunden Organismus liegen pro- und antiinflammatorische Zytokine im Gleichgewicht
vor. Stellt sich eine Dysbalance mit Betonung der proinflammatorischen Seite ein, spricht
man von SIRS. Überwiegen antiinflammatorische Zytokine wie Interleukin(IL)-4 und IL10 wird dieser Zustand als combined antiinflammatory response syndrome (CARS)
bezeichnet. Wechseln sich beide Zustände innerhalb des Organismus ab, spricht man vom
mixed antagonistic response syndrome (MARS).
Diese hyperinflammatorische SIRS/Sepsisphase kann mit der Entwicklung eines
Immundefektsyndromes, insbesondere eines Defekts der dendritischen Zellen (DC)
assoziiert sein, welches zur Beeinflussung der zellulären Immunität führt und mit einer
Hyperzytokinämie einhergeht.
In der Pädiatrie ist analog dazu die Hämophagozytische Lymphohistiozytose (HLH)
bekannt. Die HLH ist eine Erkrankung, bei welcher es, genetisch (FHL, familiäre
hämophagozytische Lymphohistiozytose)oder infektbedingt (IAHS, infektassoziiertes
hämophagozytisches Syndrom), zu einer Überaktivierung von T-Zellen und Histiozyten
(Makrophagen, dendritische Zellen) kommt. Aus dieser vermehrten Aktivierung resultiert
einerseits die bereits erwähnte Hyperzytokinämie v.a. proinflammatorischer Zytokine,
insbesondere Interferon gamma (IFNγ) und löslichem Interleukin 2-Rezeptor (sIL-2R),
andererseits führt die Aktivierung der Histiozyten, bei denen es sich vermutlich um
dendritische Zellen lymphoiden Ursprungs handelt, zu einer deutlich gesteigerten
Phagozytoseaktivität insbesondere hämatopoetischer Zellen.
55
5 Zusammenfassung
Diese beiden Vorgänge führen zu den typischen Kardinalsymptomen der HLH wie
Panzytopenie, Fieber und Hepatosplenomegalie.
Aufgrunddessen stellte sich uns die Frage, ob es auch bei Sepsispatienten zu einem
vermehrten Vorkommen dendritischer Zellen im Blut kommt und ob diese eine
entscheidende Rolle bei der Immunantwort spielen. In einem Zeitraum von 6 Monaten
wurde daraufhin von Patienten der Anästhesiologischen Intensivstation mit schwerer
Sepsis oder septischem Schock täglich zur gleichen Zeit eine Blutprobe entnommen. Ziel
war es, daraus die Leukozyten zu isolieren und bestimmte Oberflächenantigene mittels
farbstoffmarkierter Antikörper im Durchflusszytometer messbar zu machen. Für die
Fragestellung dieser Arbeit waren folgende Antikörperkombinationen von Bedeutung:
CD86/CD2 und CD25/CD2. Um zeigen zu können, ob bei Sepsispatienten dieselben
Zytokinmuster auftreten wie bei HLH-Patienten, wurden sIL-2R- und IFNg-Plasmaspiegel
gemessen. Zusätzlich wurden die Leukozyten- und Thrombozytenwerte bestimmt.
Es konnte festgestellt werden, dass bei 4 Patienten (Gruppe Dendritic cells, DC) eine
vermehrte Anzahl CD86+/CD2+-Zellen im Vergleich zur Kontrolle und den 18 weiteren
Patienten (Gruppe nonDC) (bis 1 %) aufgetreten ist. Diese konnten durch Kultivierung
eindeutig der Gruppe der dendritischen Zellen zugeordnet werden.
Betrachtet man sich die Plasmakonzentrationen für sIL-2R, sieht man bei Patienten mit
schwerer Sepsis, dass auch hier die sIL-2R-Werte erhöht sind, jedoch nicht so deutlich wie
dies bei HLH-Patienten der Fall ist. Im Vergleich dazu konnte festgestellt werden, dass der
membrangebundene IL-2R in Bezug auf die Kontrollgruppe deutlich herunterreguliert
wurde. Für die IFNg-Werte konnte keine eindeutige Zuordnung zu CD86+/CD2+-Zellen
bei Patienten im septischen Schock nachgewiesen werden.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Leukozyten- bzw. Thrombozytenwerte im
Verlauf der ersten 14 Tage des septischen Schockes nicht oder nur transient erniedrigt
waren und dies nicht mit dem Vorkommen CD86/CD2 positiver Zellen korreliert.
Die Antikörper-Kombination CD86/CD2 könnte einen Marker zur Identifizierung
zirkulierender dendritischer Zellen darstellen. Dies könnte für die in der Literatur als
schwierig beschriebene Isolierung dendritischer Zellen einen Fortschritt bedeuten.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass auch bei Sepsispatienten zirkulierende dendritische
Zellen vorkommen.
Es konnte jedoch nicht geklärt werden, ob es bei Patienten im septischen Schock zu
ähnlichen Mechanismen der Immundefizienz analog der Histiozyosen kommt
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64
7 Lebenslauf
7
Lebenslauf
Name:
Michaela Appel
Geburtsdatum:
2. Mai 1974
Geburtsort:
Ingolstadt
Familienstand:
ledig
Schulausbildung
1980-1985
Volksschule Friedrichshofen
1985-1994
Katharinen-Gymnasium Ingolstadt
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Berufsorientierende Tätigkeit
1994-1995
Freiwilliges Soziales Jahr, chirurgische Pflegestation, Klinikum Ingolstadt
Studium
1995-1998
Humanmedizin, vorklinischer Abschnitt, Universität Innsbruck
1998-2001
Humanmedizin, klinischer Abschnitt, Universität Ulm
2001-2002
Humanmedizin, Praktisches Jahr, Universität München
Famulaturen:
1999:
Unfallchirurgie am Klinikum Ingolstadt
1999:
Anästhesie an der Universitätsklinik Ulm
2000:
Praxisfamulatur HNO in Ingolstadt
2000:
Herzchirurgie am Royal Prince Alfred Hospital in Sydney
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7 Lebenslauf
Praktisches Jahr:
1.Tertial:
Chirurgie, Klinikum Ingolstadt
2.Tertial:
Innere Medizin, Klinikum Ingolstadt
3.Tertial:
Anästhesie, Zentralklinikum Augsburg
Berufliche Laufbahn:
15.11.2002-14.05.2004
Ärztin im Praktikum in der Abteilung für Anästhesiologie am
Klinikum Bamberg
Seit 15.05.2004
Assistenzärztin in der Abteilung für Anästhesiologie am
Klinikum Bamberg
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