Identifikation und Analyse unbekannter und seltener Mutationen des

Identifikation und Analyse unbekannter und seltener Mutationen des ‐1‐Antitrypsin Gens
Herr C1, Kotke V2, Greulich T2, Koczulla R2, Beißwenger C1, Vogelmeier C2, Bals R1
1Klinik für Innere Medizin V, Pneumologie, Allergologie und Beatmungsmedizin, Universität des Saarlandes, 66424 Homburg / Saar
2Klinik für Innere Medizin, Abteilung Pneumologie, Philipps Universität Marburg, 35043 Marburg
Einleitung: Alpha‐1‐Antitrypsin‐Mangel (AAT‐Mangel) ist eine genetische Mutation und stellt einen Risikofaktor für die Entstehung einer
chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) dar. Die Häufigkeit in Nordamerika und Nordeuropa ist mit der Mukoviszidose vergleichbar.
Neben den häufigsten pathologischen Allelen, dem Z‐ und S‐Allel, existieren eine Vielzahl seltener Mutationen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, in
einem laufenden AAT‐Screening‐Programm Personen mit seltenen oder unbekannten Mutationen zu identifizieren.
Methoden: Personen mit AAT‐Mangel (n=16180) wurden durch PCR‐Analyse eines „dried‐blood‐spot“ (DBS) und isoelektrischer Fokussierung (IEF)
genotypisiert. Konnte der Genotyp nicht eindeutig dem S‐ oder Z‐Allel zugeordnet werden, erfolgte eine Exonsequenzierung aller 7 Exons des AAT‐
Gens. Die Analyse und Auswertung erfolgte durch einen Vergleich der Sequenzdaten mit einer Referenzsequenz und bis dahin publizierten
bekannten Mutationen.
Abb.3
Abb.1
kein S‐, kein Z‐Allel; n=10322; 65.19%
(A)
(B)
SS; n=51; 0.32%
Erstes Allel: Z, zweites Allel: kein S / Z; n=3095; 19.55%
SZ; n=257; 1.62%
ZZ; n=1058; 6.68%
Sequenziert; n=261; 1.65%
Erstes Allel: S, zweites Allel: kein S / Z; n=789; 4.98%
N=16180
Abb.1: (A) Das SERPIN‐A1 Gen beinhaltet 4 Proteinkodierende Exons
(II‐V) und 3 nicht‐kodierende Exons (IA‐C).
(B) Die Nomenklatur der Mutationen erfolgt nach dem Laufverhalten
des Proteins bei der Isoelektrischen Fokussierung und einer
Ortsangabe (Geburtsort des Trägers).
Abb.2
(A)
Basis‐Allele
Abb.3: Zusammensetzung der Genotpyen, die durch Isoelektrische
Fokussierung und PCR Analyse identifiziert werden konnten. Nur etwa
1,65 % der Proben mussten durch Exon‐Sequenzierung identifiziert
werden.
Abb.4
(A)
“At‐Risk Allele”
Stop‐Mutationen
(B)
P‐StLouis; n=1
M‐Malton;n= 2
P‐Brescia; n=2
M‐Nichinan; n=7
M‐Würzburg; n=9
P‐Lowell; n=14
Q0‐Saarbrücken; n=1
Q0‐Lisbon; n=1
Q0‐Bolton; n=1
Q0‐Kowloon; n=1
Q0‐Granite‐Falls; n=4
M‐Procida; n=24
Q0‐Bellingham; n=5
M‐Heerlen; n=46
Q0‐Clayton;n= 8
Q0; n=21
(B)
(C)
M2/Q0; n=1
M1/Q0; n=4
M3/Rare at risk; n=10
Z/Q0; n=14
Abb.2: (A) Die Mutationen werden in Basis‐Allel, „At‐Risk Allele“ und Stop‐
Mutationen unterteilt. Basis‐Allele verursachen keine Veränderung des
Serum‐AAT‐Spiegels, während „At‐Risk Allele“ zu unterschiedlich starker
Verringerung des Serum‐AAT‐Spiegels führen und damit das Risiko für eine
Leber‐ oder Lungenerkrankung erhöhen. Stop‐Mutationen führen dazu,
dass auf Grund eines Stop‐Codons zu einem vorzeitigen Abbruch der
Proteinsynthese kommt. (B) AAT‐Mangel ist in Europa etwa so häufig wie
Mukoviszidose.
M2/Rare at risk; n=22
M1/Rare at risk; n=44
Z/Rare at risk; n=91
Abb.3: Die Ergebnisse der Sequenzierung
zeigen, dass (A) M‐Heerlen und M‐
Procida die beiden häufigsten seltenen
„At‐Risk“ Mutationen sind. (B) Unter den
Stop‐Mutationen kommen Q0‐Clayton
und Q0‐Belingham am häufigsten vor.
(C) Die Kombination von einem Z‐Allel
und einem seltenen „At‐Risk“ Allel ist am
häufigsten zu finden, gefolgt von der
Kombination aus einem normalen (M1)
Allel mit einem seltenen „At‐Risk“ Allel.
Zusamenfassung: Die Diagnose von AAT‐Mangel Patienten durch DBS PCR‐
Analyse und isoelektrischer Fokussierung stellt eine zuverlässige Methode zur
Diagnose dar. Die genomische Sequenzierung und genetische Analyse ist eine
wertvolle Ergänzung und liefert wichtige Daten zur Identifikation unbekannter
Mutationen. Des Weiteren ermöglicht die umfassende Identifikation der
Mutationen eines laufenden Screening‐Programmes eine genauere Analyse
der Verteilung und Häufung bekannter und bislang nicht erkannter
Mutationen.