AufderSuchenachdereuploidenEizelle: AneuploidiescreeningdurchrobustePolkörperdiagnostikmit MolecularCopynumberCounting(MCC) MartinSchorsch1,2,ThomasHahn1,2,HeikoTurley1,ElisabethMüller2,MelanieSchranz2, DagmarSeifert2,CorneliaVogt2,PaulH.Dear3,AngelikaDaser2 Zusammenfassung ChromosomaleFehlverteilungenindenEizellensindeinwesentlicherGrundfürdieniedrige Erfolgsrate von IVF und ICSI in der Reproduktionsmedizin. Verschiedene Techniken zur AnalysedesPloidiestatusvonEizelleoderEmbryowerdenhiervorgestelltunddiskutiert.Die von uns entwickelte Methode des Molecular Copy Countings durch digitale PCR (MCC) erweist sich als besonders geeignet für die Polkörperdiagnostik und ist im KinderwunschzentrumWiesbadenerfolgreicherBestandteilderICSI-Behandlung.Vorallem ältereKinderwunschpaareprofitierenimmensvonderPKD:(i)diewenigeeuploidenEizellen könnenidentifiziertwerden;(ii)esbestehtkeinRisikoEizellenmitTrisomie13,18oder21zu transferierenund(iii)einsinnloserTransferwegenausschließlichaneuploiderEizellenkann vermieden werden. Die geringere Belastung durch vergebliche ICSI-Zyklen führt zu einem deutlichenAnstiegvonWiederholungszyklenundgesteigertenSchwangerschaftsraten. Einleitung Im Jahr 2014 wurden in Deutschland 49.212 extrakorporale Befruchtungen (IVF, ICSI) durchgeführt. Es traten 13.724 Schwangerschaften ein, das entspricht einer Schwangerschaftsrate von 28% (1). Die Wahrscheinlichkeit, im ersten Zyklus ohne medizinische Unterstützung eine Schwangerschaft zu erlangen, liegt bei einer 25-jährigen Fraubei23%undbeieiner35-jährigenFraubei16%(2). Das„DeutscheIVF-Register“(DIR)(1)weistaktuellSchwangerschaftsratenvonüber40%pro Embryotransfer bei 25-jährigen, aber weniger als 25% bei 40-jährigen aus. Internationale Zahlen aus den USA von 18.000 ICSI-Zyklen zeigen ein noch drastischeres Bild: Schwangerschaftsratenvonunter10%beiFrauenüber39Jahrenundunter5%beiFrauen über42Jahren(3). Das Alter der Patientin spielt also sowohl bei spontaner als auch bei der extrakorporalen BefruchtungeineentscheidendeRolle.UntersuchungenanAbortmaterialzeigten,dassmit zunehmendem Alter der Frau chromosomale Fehlverteilungen (Aneuploidien) als Ursache von Fehlgeburten deutlich zunehmen (4-6). Zurückzuführen sind diese chromosomalen Fehlverteilungen auf Alterungsprozesse der Eizelle (7-10). Sie führen zu einer gestörten 1 Embryonalentwicklung und somit zu fehlender Implantation, Frühabort oder der Geburt einesKindesmiteinerBehinderung. Gerade die Gruppe mit den geringsten Erfolgsaussichten stellt mittlerweile den größten Anteil an reproduktionsmedizinischen Behandlungen: war 1996 nur jede dritte behandelte Frau älter als 35 Jahre, so waren es 2014 mehr als die Hälfte der behandelten Frauen (1). Entsprechend muss die Reproduktionsmedizin immer wieder nach neuen Lösungsansätzen suchen,umdieErfolgsratenderaufwendigenundbelastendenBehandlungenzuverbessern. Ein Hauptverantwortlicher für die Erfolgsrate ist die Eizelle – die Aneuploidierate steigt ab dem 35. Lebensjahr der Frau exponentiell an (7-9, 11). Entsprechend werden seit vielen Jahren Methoden entwickelt und angewandt, die die Identifikation euploider Eizellen oder intakterEmbryonenermöglichen(12). WährendindenmeistenLänderndieUntersuchungdesEmbryosdurchBlastomerenbiopsie am Tag 3 oder Trophektodermbiopsie (TE) am Tag 5 gestattet ist, ist nach dem deutschen Embryonenschutzgesetz (ESchG) die Untersuchung des Embryos nur für wenige genetische Erkrankungen durch Präimplantationsdiagnostik (PID) nach Genehmigung durch eine Ethikkommissionmöglich. Die Untersuchung der Eizelle hingegen ist regulatorisch nicht eingeschränkt und wird deshalbinDeutschlandseitvielenJahreninFormderPolkörperdiagnostik(PKD)favorisiert. AufderSuchenachdereuploidenEizelle-PKD BeiderPolkörperdiagnostikwirdderChromosomengehaltderbefruchtetenEizelleüberprüft und zwar indirekt durch Analyse der beiden Polkörper, die als „Abfallprodukte“ bei der Eizellreifungund–befruchtungentstehen.WährendderReifungdurchläuftdieEizellezwei Reduktionteilungen (Meiosen). Ursprünglich ist jedes Chromosom durch 4 Kopien (Chromatiden) repräsentiert; bei 23 Chromosomen summiert sich das zu 92 Chromatiden. Am Ende des Befruchtungsvorgangs soll nur noch 1 Kopie für jedes Chromosom aus der Eizellestammen,d.h.dieEizellemussdieAnzahlderChromatidenvon92auf23reduzieren. Umdieszuerreichen,werdenindenbeidenMeiosendie„überschüssigen“Chromatidenin Polkörper1und2ausgeschleust(Abbildung1).DurchAnalysederPolkörperkannmanauf die Anzahl der verbliebenen Chromatiden in der Eizelle schließen – die Polkörper spiegeln den Chromosomengehalt der Eizelle wider, die Eizelle kann also nicht-invasiv auf einen korrekten (Euploidie) bzw. fehlerhaften Chromosomensatz (Aneuploidie) untersucht werden. Altersbedingt kommt es während der beiden Reduktionsteilungen sehr häufig (altersabhängig zwischen 40% und 90%) zu Störungen bei der Verteilung der Chromatiden (Trisomie,Monosomie).DieseFehlverteilungenwerdenanalleZellendessichentwickelnden EmbryosweitergegebenundführenzuImplantationsversagen,FehlgeburtoderMissbildung. 2 Abbildung1:BefruchteteEizellemiterstem(PK1)undzweitemPolkörper(PK2).Währendderersten Reduktionsteilung(MeioseI)werden46ChromatidenüberdenerstenPolkörperindenperivitellinenRaum ausgeschleust.NachFertilisationdurchdasSpermiumwerdenweitere23Chromatidenüberdenzweiten PolkörperausderEizelleausgeschleust. AufderSuchenachdemeuploidenEmbryo-PGS Alternativ zur PKD wird das Präimplantationsscreening (PGS) am sehr frühen Embryo durchgeführt. Da Untersuchungen an Embryonen in sehr vielen Ländern gesetzlich nicht eingeschränkt sind, ist PGS an Tag 3-Blastomeren oder Trophektoderm von Tag 5Blastozysten die bei weitem häufigste Analytik des Aneuploidiescreenings. Argumente für die PGS sind die Erfassung des väterlichen Anteils an Chromosomenfehlverteilungen (ca. 10%)(13)unddiegezielteAuswahlsichgutentwickelnderEmbryonen(14). AktuelleVerfahrenfürPGS DieheuteweltweitamhäufigsteneingesetztenTechnologienfürPGSsind: • FluoreszenzinsituHybridisierung(FISH) • ArrayComparativeGenomicHybridrisation(aCGH) • NextGenerationSequencing(NGS) IndenUSAwerdendieseVerfahrenmitfolgenderHäufigkeitangewandt:FISHimmernochin hundertenvonLaboren,aCGHin180Laboren,NGSin4Laboren(15). Im Folgenden werden die Methoden vorgestellt und die technischen Herausforderungen bzw.Problemegeschildert. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH): Noch immer wird die FISH-Methode am häufigsten eingesetzt, nicht zuletzt weil sie mit relativgeringemtechnischenAufwandetabliertunddurchgeführtwerdenkann.Vorteilhaft ist, dass es eine direkte Nachweismethode ist, d.h. die einzelnen Chromatiden und 3 Chromosomen werden mikroskopisch beurteilt. Dazu werden sie durch chromosomenspezifischeFluoreszenssondenmarkiertunddieAnzahlderFluoreszenssignale ausgezählt (12, 16, 17). In der Regel werden nur fünf, in Einzelfällen bis zu zehn Chromosomen markiert. Zu der eingeschränkten Zahl der beurteilbaren Chromosomen kommt als weiterer gravierender Nachteil Materialverlust und Überlagerung mit entsprechendhoherFehlerquote(biszu25%)hinzu.DieserSachverhaltspiegeltsichinden Schwangerschaftsraten wider – diese können mit FISH-Diagnostik niedriger sein als ohne (18-20). Array Comparative Genomic Hybridrisation (aCGH) und Next Generation Sequencing (NGS): Entsprechend suchte man nach neuen Verfahren, bei denen alle Chromosomen möglichst fehlerfrei beurteilt werden können (21, 22). Durchgesetzt hat sich Array Comparative GenomicHybridrisation(aCGH)(11,13,14,23,24)undaufdenMarktdrängtneuerdingsdas NachfolgeverfahrenNextGenerationSequencing(NGS)(25-28).BeibeidenTechnikenmuss die Ausgangsmenge des Probenmaterials vermillionenfacht werden. Dies geschieht durch die sogenannte „whole genome amplification“ (WGA), bei der die gesamte chromosomale DNAungezieltwillkürlichmassivvermehrtwird.JenachDNA-Beschaffenheitkönnendabei unterschiedlich große Regionen der Chromosomen unter- oder überdurchschnittlich vermehrt werden. Im Ergebnis kann dies wie eine biologische Unter- oder Überrepräsentation,alsoeineAneuploidieaussehen(13,29).DiesesProblembetrifftsowohl die aCGH als auch NGS und ist umso größer, je geringer die Ausgangsmenge ist. Bei Blastomeren und Polkörpern ist dies besonders kritisch, da nur eine einzige Zelle für die DNA-VermehrungzurVerfügungsteht(30). AusserdemsindbeideVerfahrenindirekt:BeiaCGHwirddieMengeanvermillionenfachter DNA pro Chromosom im Vergleich zu einer Referenz abgeschätzt. Das erfordert komplexe AlgorithmenundNormalisierungsschritte;direkteInformationenüberdasAusgangsmaterial sindnichtmehrzuerhalten. Bei NGS werden statt eines Mengenvergleichs zu einer Referenz-DNA willkürlich viele chromosomale Abschnitte des ebenfalls durch WGA vervielfältigten Ausgangsmaterials sequenziert und die relative Anzahl der Sequenzen pro Chromosom im Verhältnis zu allen Chromosomen bestimmt. Auch hier ist nur durch mehrere komplexe Algorithmen eine Ergebnisinterpretation möglich, direkte Aussagen über die Qualität des Ausgangsmaterials sind nicht möglich. Entsprechend werden Materialprobleme wie degradierte DNA oder KontaminationenmitanderenZellennichtnotwendigerkannt. Hinzukommt,dassdieerheblicheSensitivitätssteigerungbeiNGSgegenüberaCGH(27,28, 30)zueinerdeutlichenZunahmederDiagnose„Mosaikembryo“geführthat;obdiesinallen Fällen der Biologie entspricht oder zu einem signifikanten Teil der angewandten Methode geschuldetist,kannbislangnichtdurchpublizierteDatenbeurteiltwerden–dieerheblichen biologischenKonsequenzenwerdenweiteruntendiskutiert. 4 DieneueMethode-MCC AlsAlternativehabenwirfürEinzelzellen,alsoPolkörper(undtheoretischauchBlastomeren) ein robustes, direktes Analyseverfahren etabliert: Molecular Copy number Counting mit digitaler PCR (MCC). Untersucht werden klar definierte Produkte, die aus den beiden meiotischenTeilungeneinerUrsprungszelle,derEizelle,hervorgegangensind. MCCbasiertaufdemeinfachenPrinzipderEndpunktverdünnung(31),wodurchohnewhole genome amplification und ohne Algorithmen die Anzahl der Chromatiden pro Chromosom einfach abgezählt werden kann. Ausgangsmaterial sind erster und zweiter Polkörper mit 2 Kopien bzw. 1 Kopie von jedem Chromosom. Durch die Endpunktverdünnung werden die Kopien der Chromosomen in kleinen Reaktionsgefäßen vereinzelt und dann die Anzahl der Reaktionsgefäßeabgezählt,dieeineKopiederChromosomenenthalten,dieDatenwerden also direkt und digital als Rohdaten erhoben - die Vorgehensweise ist in Abbildung 2 Methode'–'Endpunktverdünnung'und'PCR schematischdargestellt. Polkörper#lysieren# # # # Chroma+den#verteilen# DNA#Vervielfäl+gung:# PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4 PCR 5 PCR 6 PCR 7 PCR 8 Σ + PCR PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4 PCR 5 PCR 6 PCR 7 PCR 8 Σ + PCR Chrom. ROT 2 Chrom. GRAU 2 PCR 1 PCR 2 PCR 3 PCR 4 PCR 5 PCR 6 PCR 7 PCR 8 Σ + PCR Chrom. BLAU 1.#Runde# Mul+plex.PCR# # # # 2.#Runde# Einzel.PCR# ! 2 Digitale#Ergebniserfassung:######PCR#Produkte#zählen# Zahl#der#PCR#Produkte###=##Produkte#der#Chroma+den##### Abbildung2:SchematischeDarstellung vonMCCdurchEndpunktverdünnungundchromosomenspezifische Research! DNA-Vervielfältigung mittels PCR. Das hier dargestellte Beispiel bezieht sich auf einen ersten Polkörper. Die DNA von PK1 (oder PK2) wird durch Zelllyse präpariert/zugänglich gemacht und auf acht Reaktionsgefäße verteilt.DamitenthaltenzweiGefäßejeeineKopieeinesChromosoms–hierdargestelltals„ChromosomRot“, „Grau“ und „Blau“; sechs Gefäße bleiben für das jeweilige Chromosom leer, enthalten keine Kopie. Auch bei MCC muss die DNA vervielfältigt werden, das geschieht chromosomenspezifisch durch einfache PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion). In der ersten Runde wird die DNA mit chromosomenspezifischen Sonden vorangereichert(multiplexPCR).InderzweitenRundewerdendieSondeneinzelnanalysiert.Manerhältnurin denjenigen Reaktionsgefäßen ein PCR-Produkt, in die bei der Endpunktverdünnung eine Kopie des Chromosoms gelangt ist. Durch simples Abzählen der PCR Produkte ermittelt man die Anzahl der Kopien = ChromatidenderChromosomen. 5 MitMCCgibtesaufdemMarktjetztvierMethodenfürdiePKDbzw.PGS.DieEignungfür dieunterschiedlichenAusgangsmaterialienistinTabelle1zusammengefasst. Tabelle1:UntersuchungsmaterialundMethodenfürdasAuffindenvonAneuploidienvorderImplantation– PKDundPGS Methoden Material Herkunft FISH aCGH NGS MCC Polkörper 2Einzelzellen Eizelle + + n.d.** +++ Blastomeren 1Einzelzelle Tag3Embryo + + n.d.** +++ Zellverband* Tag5Embryo - +++ ++?*** - TE *ca.5-15ZellenausdemTrophektoderm,nichtderinnerenZellmasse,diedenEmbryobildet **nichtdurchgeführt ***bislangnichthinreichendevaluiert Tabelle1:UntersuchungsmaterialundMethodenfürdasAuffindenvonAneuploidienvorderImplantation– PKDundPGS.EinzelzellanalysewirdanPolkörpernundBlastomerenvonTag3-Embryonendurchgeführt.FISH und MCC sind ausschließlich dafür ausgelegt, FISH kann allerdings nur eine Auswahl von Chromosomen untersuchen und hat eine Fehlerrate von bis zu 25%. MCC analysiert alle Chromosomen und die bislang ermittelte Fehlerrate liegt unter 5%. Array CGH ist wegen des extrem geringen Ausgangsmaterials für die Einzelzellanalyse nicht gut geeignet und für NGS gibt es keine publizierten Daten. Für die Trophektodermanalyse sind beide Verfahren geeignet, allerdings kommt es besonders bei NGS wegen der hohenSensitivitätbeinochunklarerSpezifitätsehrhäufigzuDiagnosen,dieschwerzuinterpretierensindund zumVerwerfenmöglicherweiseguterEmbryonenführt. PolkörperdiagnostikmitMCC–Ergebnisse Wirhabeninzwischen375ICSI-Zyklenvon275PatientinnenmitMCCuntersucht.Diegrößte NachfragebestehtinderAltersgruppemitdenmeistenzuerwartendenAneuploidienbzw. niedrigsten Schwangerschaftsraten, nämlich 38 Jahre und älter mit 62% aller Zyklen. Die Ergebnisse sind in drei Altersgruppen unterteilt, die sich reproduktionsbiologisch unterschiedlich verhalten: die jüngste Gruppe (34 Jahre und jünger) mit zu erwartender guter Schwangerschaftsrate, die mittlere Gruppe (35 bis 37 Jahre) mit bereits deutlich abfallender Fruchtbarkeit und die älteste Gruppe (38 Jahre und älter) mit dem geringsten Behandlungserfolg. Korrespondierend ist die Anzahl euploider Eizellen (Abbildung 3A+B): WährendjungePatientinneninjedemZyklusimSchnitt3,6euploideEizellenhaben,sindes beiüber37-jährigennurnoch1,1Euploide/Zyklus(Abbildung3A)undbeiüber41-jährigen liegtdiedurchschnittlicheZahldereuploidenEizellenimmerunter1(Abbildung3B). 6 AnzahldereuploidenEizelleninden3Altersgruppen 1400 AnzahlEizellen 1200 1000 800 #analysierteEizellen #aneuploid 600 #euploid 400 45% 200 0 18% 37% 34Jahreundjünger 35-37Jahre 3,6 2,9 38Jahreundälter 1,1 euploid/Zyklus Abbildung3A:AnzahleuploiderEizellenindreiAltersgruppen.InderjüngstenGruppe(34Jahreundjünger) Research sind durchschnittlich 45% der untersuchten Eizellen euploid und es stehen für den Transfer 3,6 geeignete Embryonen zur Verfügung; die mittlere Gruppe hat noch 37% euploide Eizellen und entsprechend gute AussichtenfüreinenEmbryotransfer;beiderältestenGruppestehtmit18%euploidenEizellenimSchnittnur nocheinEmbryofürdenTransferzurVerfügung. Abbildung3B:AltersbedingteAbnahmeeuploiderEizellen.WährendbiszueinemAltervonetwa41Jahrenim SchnittmindestenseineeuploideEizelleproZyklusdiagnostiziertwerdenkann,istab42Jahrennichtmehrin jedem Zyklus eine euploide Eizelle vorhanden. Die Anzahl der MCC Zyklen pro Geburtsjahr ist in Klammern hinterderJahreszahlangegeben. 7 Entsprechend häufig führt die PKD in den älteren Gruppen auch zu Zyklen ohne 375MCCZyklenvon275pa;ents–AltersgruppenundTransfers Embryotransfer(Abbildung4). 250 225 200 AnzahlZyklen 175 150 #Zyklen 125 keinTransfer 100 81 75 50 25 5 0 34Jahreundjünger 35-37Jahre 38Jahreundälter Abbildung4:AnzahlvonICSI-ZyklenundTransfersindendreiAltersgruppen34Jahreundjünger,35bis37 Research Jahre,38Jahreundälter.EntsprechendderNachfragesindinderjüngstenGruppenur63der375Zyklen;in allen Zyklen gab es euploide Eizellen und entsprechend wurde in allen Zyklen ein Transfer durchgeführt. Die mittlere Gruppe hatte 78 Zyklen, hier waren 5 Zyklen ohne euploide Eizellen und ohne Transfer. Den Löwenanteil stellt die älteste Gruppe: 234 Zyklen, 81 davon (35%) ohne Transfer wegen ausschließlich aneuploiderEizellen. Interessanterweise führt das Ergebnis der PKD gerade bei diesen Patientinnen zu wiederholtenICSI-Zyklen:fastdieHälfteder375ZyklenwarenMehrfachzyklen,nämlich177 Zyklen bei 77 Patientinnen (44%), mit guter Erfolgsquote in Zyklus 2 und 3 (Tabelle 2 und Abbildung5). Tabelle2:AltersverteilungbeiwiederholtenICSI-Zyklen Altersgruppe #Frauen #Zyklen ≤34Jahre 1981-1989 14 30 17% 35-37Jahre 1978-1980 12 27 15% ≥38Jahre 1966-1977 51 120 68% Σ 77 177 100% 8 Schwangerscha,sratenacheinemodermehrerenZyklenmitMCC 60% Schwangerscha,srate 50% 40% Zyklus1mitMCC 30% Zyklus2+3mitMCC 20% 10% 0% 10 0 26-30Jahre 49 64 20 39 14 36-39Jahre 40Jahreundälter 6 31-35Jahre #Zyklen Abbildung5:SchwangerschaftsratennacheinemodermehrerenICSI-ZyklenmitPKDdurchMCC.Zyklus2 Research undZyklus3wurdenzusammengefaßt,dadieZahlenzumjetzigenZeitpunktnochsehrniedrigsind. Betrachtet man die Schwangerschaftsraten in allen Altersgruppen für Zyklen, in denen ein Embryotransferstattgefundenhat,sonähernsichdiesezwischendenAltersgruppenanund liegen für alle über 30% (Abbildung 6), d.h. das Auffinden der seltenen, euploiden Eizellen kann auch in einem Alter deutlich über 40 Jahre noch zu einer Schwangerschaft führen EmbryotransferrateundSchwangerscha5sratevonMCC-ZyklenmitET (Abbildung6). Embryotransfer-undSchwangerscha5srate 80% 70% 60% 50% Embryotransfer-Rate 40% Schwangerscha5srate 30% 20% 10% 0% 34Jahreundjünger 35-37Jahre 38Jahreundälter Abbildung 6: Embryotransfer- und Schwangerschaftsrate nach ICSI-Zyklen mit PKD und MCC. in den beiden Research jüngerenGruppenwurdein70%derZykleneinodermehrereEmbryonentransferiert(dierestlichenca.30% waren Einfrierzyklen); in der ältesten Gruppe lag die Transferrate nur knapp über 50% wegen der hohen Aneuploidierate(s.auchAbb.4). 9 Diskussion In vielen Ländern wird die Suche nach chromosomalen Fehlverteilungen am Embryo vorgenommen,entwederaneinzelnenBlastomeren(sehrfrühenembryonalenEinzelzellen) oder an Trophektoderm (einem Zellverband, der später die Plazenta bildet und nicht BestandteildesEmbryoist). InDeutschlandistdiePolkörperanalyseunddamitdieAnalysederEizelledasVerfahrender Wahl. Der Vorteil der PKD gegenüber der Diagnose am Embryo ist das Ausgangsmaterial – zwei Polkörper, die nacheinander von ein und derselben Eizelle abgetrennt werden und nichtauseinemZellgemischstammen,dasgenetischuneinheitlichseinkann. EinProblemwarimmer,dasseskeineakkurateMethodefürEinzelzellanalysegab.Durchdie EtablierungvonMCCstehtjetzteinrobustesundeinfachesVerfahrenzurVerfügung,dasmit hoher Präzision im Hochdurchsatz die Kopien aller Chromosomen in beiden Polkörpern digitalbestimmtunddamitdenPloidiestatusderEizelleeindeutigdefiniert. Die PKD erweist sich gerade bei älteren Patientinnen (40 Jahre und älter) als besonders sinnvoll. In dieser Altersgruppe ist die Schwangerschaftsrate ohne PKD 10% und kleiner. Wenn PKD mit MCC durchgeführt wird, können wir selbst bei deutlich über 40-jährigen Schwangerschaftsraten von über 25% erzielen. Ein weiterer, nicht zu unterschätzender Effekt ist die Transparenz, die eine robuste Polkörperdiagnostik schafft: die biologische Qualität eines Zyklus kann genau beurteilt und dem Kinderwunschpaar kommuniziert werden – Vorhandensein oder Nichtvorhandensein euploider Eizellen mit der Konsequenz Transfer oder kein Transfer. Wenn wegen ausschließlich aneuploider Eizellen kein Transfer möglich ist, dann besteht immer die Option in einem Nachfolgezyklus euploide Eizellen zu identifizieren und nach erfolgreichem Transfer zu einer Schwangerschaft zu kommen. Entsprechend sind fast 50% unserer ICSI-Zyklen mit MCC Wiederholungszyklen mit Schwangerschaftsraten von über 30% auch in der höchsten Altersgruppe. Und da keine frustranen Transfers durchgeführt werden, ist das Intervall bis zum nächsten Zyklus in der Regelkurz,eswirdalsokeinekostbareZeitverschenkt. Nachteile der PKD sind zum einen, dass pro sich entwickelndem Embryo immer zwei Analysen anfallen – PK1 und PK2. Durch die Entwicklung von MCC als schnellem Hochdurchsatzverfahren haben wir aber auch diesem Sachverhalt Rechnung getragen. Der andere Nachteil, dass der paternale Anteil nicht diagnostiziert wird, schlägt nur mit etwa 10% zu Buche, da 90% aller Chromosomenfehlverteilungen von der Eizelle kommen und durchdiePKDerfasstwerden(13). Das Präimplantationsscreening - PGS - am sehr frühen Embryo ist aus unserer Sicht neben denbereitsgeschildertentechnischenauchmitgroßenbiologischenProblemenbehaftet. DasgrößtebiologischeProblemistbedingtdurchdashäufigeAuftretenvonpostzygotischen mitotischenFehlverteilungen:indenfrühenembryonalenZellenpassierenhäufigFehlerbei der Zellteilung, sodass die frühen Embryonen aus Zellen mit unterschiedlicher genetischer Ausstattung(genomischeMosaike)bestehen(32-34).ImLaufederEntwicklungkönnensich 10 diese Mosaike zurückbilden (35), allerdings ist es zur Zeit noch völlig unklar, wie und in welchem Umfang die Mosaike korrigiert werden. Das bedeutet natürlich für das Präimplantationsscreening,dasseseinMaterialuntersucht,dessenRelevanzunklarist(36, 37): bei der Tag 3-Biopsie von einer oder mehreren Blastomeren repräsentiert das PGSErgebnis nicht notwendig den Ploidiestatus der anderen, sich weiter entwickelnden Blastomeren des Embryos. Bei der TE-Biopsie am Tag 5 wird nicht der Embryo (innere Zellmasse), sondern das Trophektoderm biopsiert. Damit ist die PGS-Diagnose gleich mit zwei großen Unsicherheiten behaftet: wird der Embryo durch die TE Zellen wirklich repräsentiert; und ist bei Vorliegen eines Mosaikembryos der Chromosomengehalt der biopsierten Zellen repräsentativ für den Chromosomengehalt des Gesamtembryos. Man kannsomitnichtsichersein,obmaneinfürdenEmbryorelevantesBiopsatuntersuchthat und damit eine sichere Diagnose gestellt hat. Konsequenzen können sein, dass man einen vermeintlich euploiden Embryo transferiert, der aber eine Aneuploidie in der inneren Zellmasse hat oder einen vermeintlich aneuploiden Embryo verwirft, dessen innere Zellmasseabereuploidist. Gerade durch die hohe Sensitivität von aCGH und NGS kommen sehr viele Diagnosen „Mosaikembryo“ zustande. Nachdem man diese Embryonen lange Zeit verworfen hat, entschließtmansichneuerdingsineinigenZentrenzumTransfer(38,39)undessindbereits 11Kindernach61Transfersgeborenworden.WieMosaikembryonenindiesenZentrenals transferierbar ausgewählt werden, ist bislang nicht bekannt und es konnten noch keine sicherenKriterienfüreineAuswahldefiniertwerden(39). In Deutschland sind wir mit der PKD in einer komfortablen, weil eindeutigen Situation: die PKDkannimmereinesichereAussageüberdenPloidiestatusdesMajorPlayers„befruchtete Eizelle“ machen (13, 36). Major Player deshalb, weil 90% aller Aneuploidien durch Meiosefehler der Eizelle bedingt sind und weil diese Meiosefehler sich in allen Zellen des Embryos wiederfinden und somit für alle Kompartimente des Embryos relevant sind. Das heißt,dassdieDiagnose„euploideEizelle“einensicherenTransfererlaubtunddieDiagnose „aneuploideEizelle“einenTransferverbietet.MCCstelltsicher,dassdieseDiagnosenschnell und präzise gestellt werden können. Und Schwangerschaftsraten um 30% auch bei über 40jährigen Frauen zeigen, dass PKD mit MCC den Kinderwunsch auch bei älteren Paaren erfüllenkann. Literaturverzeichnis 1 DIRJahrbuch2014,JReproduktionsmedEndokrinol2015;12 2 Bundesgesundheitsblatt2013;56:1633-1641 3 MunneS,COGENParis2015, http://www.comtecmed.com/cogen/2015/webcasts.aspx 4 Hassold T, Chen N, Funkhouser J, Jooss T, Manuel B, Matsuura J, Matsuyama A, Wilson C, Yamane JA, Jacobs PA. 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