Next generation sequencing : vergleichende Mutationsanalyse bei
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Aus der Abteilung für Humangenetik der Ruhr-Universität Bochum Leiter: Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen Next Generation Sequencing: vergleichende Mutationsanalyse bei drei türkischen Patienten mit Retinitis Pigmentosa Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Ina-Janine Thiemann aus Recklinghausen 2014 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen Korreferent: PD Dr. med. Stephanie C. Joachim Tag der mündlichen Prüfung: 21.04.2015 Tobias und meinen Eltern gewidmet. Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung .............................................................................................................. 5 1.1 Die Retina ...................................................................................................... 5 1.2 Retinitis pigmentosa ...................................................................................... 6 1.3 1.2.1 Symptomatik, Diagnostik und Therapie ................................................ 6 1.2.2 Genetik ................................................................................................... 8 DNA-Sequenzanalyse ................................................................................. 10 2 Zielsetzung .......................................................................................................... 12 3 Methoden ............................................................................................................ 13 3.1 Patienten ...................................................................................................... 13 3.2 Next Generation Sequencing und Integrative Genomics Viewer................ 13 3.3 Online-Datenbänke und Vorhersageprogramme ......................................... 15 3.4 NextGENe®-Software ................................................................................. 15 3.5 Überprüfung der Pathogenität einer Variante.............................................. 17 3.6 Familienanalyse ........................................................................................... 18 4 Ergebnisse ........................................................................................................... 19 4.1 Stammbaumanalyse ..................................................................................... 19 4.2 Vergleichende Analyse der Exomdatensätze .............................................. 21 4.2.1 Pathogenes Potenzial der Mutationen .................................................. 21 4.2.2 Coverage .............................................................................................. 22 4.3 Unabhängige Analyse der einzelnen Exomdatensätze ................................ 23 4.4 Weiterführende Analyse bezüglich Stammbaum B .................................... 24 5 Diskussion........................................................................................................... 27 6 Zusammenfassung .............................................................................................. 33 7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 34 8 Anhang ................................................................................................................ 42 Danksagung Lebenslauf 1 Abkürzungsverzeichnis A Adenin A. Arteria ABCA4 ATP-binding cassette, sub-family A, member 4 ACVR2A activin A receptor, type IIA adRP autosomal dominant vererbte Retinitis pigmentosa Ala Alanin Arg Arginin arRP autosomal rezessiv vererbte Retinitis pigmentosa Asn Asparagin Asp Asparaginsäure bam binary version of sequence alignment map bp Basenpaar C Cytosin c. coding DNA sequence ca. circa CEP290 centrosomal protein 290kDa CNGB1 cyclic nucleotide gated channel beta 1 CROCC ciliary rootlet coiled-coil Cys Cystein del Deletion DHPLC denaturating high performance liquid chromatography DNA deoxyribonucleic acid el al. et alii, lat. für „und andere“ ERG Elektroretinogramm FLJ43860 full length long Japan 43860 FLT3 fms-related tyrosine kinase 3 fs frame shift G Guanin GAG Glykoaminoglykan Glu Glutaminsäure Gly Glycin 2 His Histidin IGV Integrative Genomics Viewer Ile Isoleucin IMPG2 interphotoreceptor matrix proteoglycan 2 ins Insertion IQCB1 IQ motif containing B1 Lys Lysin mm Millimeter mRNA messenger ribonucleic acid MS Microsoft NGS Next Generation Sequencing NPHP3 nephronophthisis 3 NPHP4 nephronophthisis 4 NPM1 nucleophosmin Nt Nukleotid NTP Nukleosidtriphosphat ORF open reading frame p. protein sequence PCR polymerase chain reaction PDE6A/D phosphodiesterase 6A/D Phe Phenylalanin PITPNM3 phosphatidylinositol transfer membrane associated family member 3 PLXNA2 plexin 2A PRPF3 pre-mRNA processing factor 3 PRPH2 Peripherin 2 RAB8A member RAS oncogene family RGS9BP regulator of G protein signaling 9 binding protein RHO Rhodopsin ROM1 retinal outer segment membrane protein 1 RP Retinitis pigmentosa RPE65 retinal pigment epithelium-specific protein 65 kDa RPGR retinitis pigmentosa GTPase regulator RPGRIP1(L) retinitis pigmentosa GTPase regulator interacting protein 1 (like) 3 rs reference SNP Ser Serin SMC1/SMC3 structural maintenance of chromosomes 1A/3 SNP single nucleotide polymorphism T Thymin USH2A Usher syndrome 2A UV unclassified variant Val Valin VCAN Versican WS Wagner-Syndrom 4 1 1.1 Einleitung Die Retina Die Retina (Netzhaut) bildet neben der Choroidea (Aderhaut) und der Sklera (Lederhaut) die innerste der drei Schichten des Augapfels. Sie wird selbst wiederum in elf Schichten unterteilt. In der von innen nach außen gezählten neunten retinalen Schicht befinden sich die lichtempfindlichen Photorezeptoren, die Stäbchen und Zapfen [34]. Die Retina umfasst ungefähr 120 Millionen Stäbchen. Sie besitzen besonders hohe Lichtempfindlichkeit und sind daher für das Dämmerungs- und Nachtsehen (skotopisches Sehen) zuständig [7]. Die 6 Millionen Zapfen befinden sich in der Makula lutea. Sie wird auch als „gelber Fleck“ bezeichnet und liegt in der Mitte der Netzhaut. Im Zentrum der Makula lutea wiederum stellt die gefäßlose Fovea centralis retinae (Netzhautgrube) eine circa 1,5mm im Durchmesser große Einsenkung dar. Hier werden die Zapfen einzeln innerviert und liefern daher eine hohe Sehschärfe. Aus diesem Grund wird die Fovea centralis retinae auch als Ort des schärfsten Sehens bezeichnet [52]. Außerdem unterscheidet man Blau-, Grün- und Rotzapfen, die für das Farbensehen essentiell sind. Zusammenfassend sind die Zapfen also für das Tages- und Farbensehen (photopisches Sehen) verantwortlich [7]. Als weitere wichtige Struktur der Netzhaut kann die Papilla nervi optici angesehen werden. Sie befindet sich nasal der Makula lutea und umschreibt den Austrittspunkt des Nervus opticus. Der Nervus opticus ist der zweite Hirnnerv und verbindet die Netzhaut über den Tractus opticus mit dem visuellen Cortex. An der Papille treten außerdem die Arteria centralis retinae in das Auge ein und die Vena centralis retinae aus dem Auge aus [34]. Die A. centralis retinae entspringt der A. ophthalmica und versorgt die inneren Schichten der Retina, die äußeren Schichten werden durch Diffusion aus Gefäßen der Aderhaut versorgt. Im Bereich der Papille befinden sich keinerlei Photorezeptoren, weshalb sie auch als „blinder Fleck“ bezeichnet wird. Dieser absolute Sehausfall wird beim binokulären Sehen durch das kontralaterale Auge ausgeglichen und führt daher nicht zu Gesichtsfeldausfällen [52]. 5 1.2 Retinitis pigmentosa Die Retinitis pigmentosa (RP), auch Retinopathia pigmentosa genannt, ist die häufigste hereditäre Netzhautdystrophie. Sie ist genetisch und klinisch sehr heterogen. Die Prävalenz liegt bei 1:4000. In Deutschland sind ungefähr 35.000, weltweit ca. 2 Millionen Menschen betroffen [14,84]. 1.2.1 Symptomatik, Diagnostik und Therapie Die Symptomausprägung der RP unterliegt einer erheblichen Variabilität, sogar innerhalb einer Familie [27]. Erste Krankheitserscheinungen können, je nach Vererbungsmodus, bereits im Kindesalter oder auch erst im Erwachsenenalter auftreten. Beide Augen sind bei RP meist gleichermaßen betroffen. Bei der häufigsten Form, der Stäbchen-Zapfen-Dystrophie, kommt es zu einer Degeneration der lichtempfindlichen Photorezeptoren in der Retina, der Stäbchen und der Zapfen. Es degenerieren zuerst die Stäbchen, einhergehend mit einer erhöhten Blendempfindlichkeit und Nachtblindheit [38]. Es kommt zu fortschreitenden Ausfällen des Gesichtsfeldes, die mit dem Goldmann-Perimeter diagnostiziert werden können. Bei der maximalen Ausprägung, dem so genannten Tunnelblick oder auch Flintenrohrgesichtsfeld, ist die Sehschärfe nur noch im zentralen Bereich der Retina erhalten, weil die Zapfen erst im weiteren Verlauf betroffen sind. Es kommt zu einem Verlust der Orientierungsfähigkeit mit erschwertem Zurechtfinden im Raum, zu Störungen des Farbsinns und des Kontrastempfindens, sowie zur Myopie (Kurzsichtigkeit) [34,52]. Die RP kann auch im Rahmen von komplexen Syndromen beobachtet werden. Das häufigste ist das Usher-Syndrom, bei dem sie kombiniert mit einer Innenohrschwerhörigkeit auftritt [45]. Ebenso wird die Augenerkrankung bei Stoffwechselstörungen beobachtet, beispielsweise bei Mukopolysaccharidosen [52]. Mit dem Elektroretinogramm (ERG) kann die Diagnose bereits in frühen, meist noch symptomarmen Krankheitsstadien gesichert werden. Typisch ist eine fehlende Antwort der Stäbchen in der Peripherie mit erhaltenem Signal der Zapfen im Zentrum der Retina. Im weiteren Verlauf ist auch die Zapfenantwort weniger bis gar nicht mehr nachweisbar [7]. In der Ophthalmoskopie können die charakteristischen 6 Knochenkörperchen oder Knochenbälkchen beobachtet werden. Es handelt sich hierbei um Pigmentverklumpungen, die durch den Untergang der Photorezeptoren und der Zellen des retinalen Pigmentepithels entstehen [34]. Außerdem zeigen sich typischerweise eine Optikusatrophie, enggestellte Arterien und ein reflexarmer Fundus. Zudem kann ein Makulaödem oder eine Linsentrübung (Katarakt) vorliegen (siehe Abbildung 1) [36]. Abbildung 1: Augenhintergrund bei RP (mit freundlicher Genehmigung der Universitäts-Augenklinik des Knappschaftskrankenhauses Bochum) Differentialdiagnostisch kommen posttraumatische oder postinfektiöse retinale Veränderungen in Betracht. Außerdem können Tumore der Retina und auch Nebenwirkungen bestimmter Medikamente zu ähnlichen Befunden führen. Als Beispiel sei hier auf die Fundusveränderungen durch das Medikament Chloroquin hingewiesen, welches zur Malaria-Prophylaxe oder zur Behandlung rheumatischer Erkrankungen eingesetzt wird [52,68]. Die RP zeigt einen chronisch-progressiven Verlauf und schreitet schließlich bis zur kompletten Erblindung fort [36]. Die schlechte Langzeitprognose geht mit einer deutlich eingeschränkten Lebensqualität einher. Eine kausale Therapie ist zum heutigen Zeitpunkt nicht möglich [52]. Dem Betroffenen sollte eine humangenetische Beratung angeboten werden. Zudem stehen in Deutschland verschiedene Selbsthilfegruppen der Retinitis-Pigmentosa-Gesellschaft zur Verfügung. Kantenfilterbrillen können bei vermehrter Blendempfindlichkeit das Restsehvermögen verbessern, bei Katarakt kommt, je nach Symptomausprägung, 7 eine Linsenoperation in Frage [34]. Liegt eine Myopie vor, sollten entsprechende Sehhilfen angepasst werden, ein Makulaödem kann meist gut mit der systemischen Gabe von Acetazolamid behandelt werden [7]. Wissenschaftliche Studien befassen sich mit der Transplantation von fetaler Retina [71] oder mit Retina-Chips, die durch elektrische Signale die noch intakten Ganglienzellen stimulieren sollen [16,81]. Zudem steht die Genersatztherapie im Mittelpunkt aktueller Studien. In einem Mausmodell konnte diese bereits erfolgreich bei vorliegender Mutation im RHO-Gen (Rhodopsin) mit einem viralen Vektor durchgeführt werden: neun Monate nach dem Transfer zeigten sich bereits Verbesserungen im ERG, zudem gingen in Folge der Therapie weniger Photorezeptoren zugrunde [54]. 1.2.2 Genetik Bisher konnten über 200 Kandidatengene identifiziert werden, deren Mutation zu einer Ausprägung der RP oder einer anderen Form der hereditären Netzhautdystrophie führt. Eine Auflistung dieser Gene liefert die Internetseite RetNet [65]. Über 60 dieser Gene sind für ungefähr 60% der Erkrankungen an RP verantwortlich, die restlichen 40% sind noch unbekannt [5]. Bisher wurden die Kandidatengene zum Beispiel mit Kopplungsanalysen und Homozygotie-Kartierung ermittelt [61]. Es kommen sämtliche Formen der Mendel’schen Vererbung vor: autosomal rezessiv (arRP, 50%), autosomal dominant (adRP, 30%) und Xchromosomal (10%). Die verschiedenen Formen der RP werden vorzugsweise durch Veränderungen in bestimmten Genen hervorgerufen. So zeigen sich bei arRP zu 20% Mutationen im USH2A-Gen (Usher syndrome 2A, Chromosom 1), die adRP wird zu 25% durch Sequenzveränderungen im RHO-Gen (Chromosom 3) hervorgerufen. Ungefähr 70% der X-chromosomal vererbten pathogenen Genveränderungen befinden sich im RPGR-Gen (RP GTPase Regulator) [38]. Weibliche Träger einer Xchromosomalen Mutation können ein auffälliges ERG, typische Veränderungen des Augenhintergrundes und entsprechende Symptome zeigen [77]. Die prozentuale Verteilung auf die betroffenen Gene ist jedoch von der ethnischen Zugehörigkeit der Patienten abhängig. Die oben genannten Anteile beziehen sich auf europäische und nordamerikanische Familienanalysen [22]. Zum heutigen Zeitpunkt sind in 36 Genen Mutationen für die arRP beschrieben worden, in 23 Genen für die adRP und in 3 8 Genen für die X-chromosomal vererbte RP [65]. Die seltene mitochondriale (maternale) Vererbung und eine digenische Vererbung durch gleichzeitige Mutationen in den Genen ROM1 (retinal outer segment membrane protein 1) auf Chromosom 11 und PRPH2 (pre-mRNA processing factor 3) auf Chromosom 6 wurden ebenfalls beobachtet [22]. Die X-chromosomal vererbte RP und die arRP verlaufen meist schwerer als die adRP und zeigen auch ein früheres Manifestationsalter [36,83]. Sogar bei gleicher zugrundeliegender Mutation treten innerhalb einer Familie oftmals unterschiedlich stark ausgeprägte Symptome auf [22]. Dies wird als variable Expression des Phänotyps umschrieben und ist ein häufig beobachtetes Phänomen in RP Familien. Hier spielen vor allem modifizierende Gene eine Rolle [26]. Wenn unterschiedliche Arten von Mutationen, zum Beispiel Punktmutationen und Deletionen mit unterschiedlichen chromosomalen Lokalisationen, in einem Gen krankheitsverursachend wirken, liegt allelische Heterogenie vor [21]. Das Mutationsspektrum des Kandidatengens RHO umfasst beispielsweise mehr als 100 verschiedene Basenaustausche, Deletionen und Insertionen [39]. Zudem wird im Zusammenhang mit der Augenerkrankung inkomplette Penetranz beschrieben, wenn sich trotz des vorhandenen Genotyps die Merkmale nicht manifestieren [43]. So kann bei der adRP eine Generation übersprungen werden, etwa bei einem gesunden Mutationsträger mit erkranktem Elternteil und erkrankten Nachkommen. Ursachen können auch hier modifizierende Gene oder noch nicht identifizierte Umweltfaktoren sein [35]. Neben den familiär gehäuften Formen ist ebenfalls das sporadische Auftreten der Augenerkrankung möglich. Als Folge der Mutationen sind verschiedene biochemische Signalwege betroffen, einerseits retinale Signalwege, wie die Photorezeptor-Kaskade und der Vitamin AMetabolismus. Mutationen befinden sich dann in den Genen RPE65 (retinal pigment epithelium-specific protein 65 kDa) oder ABCA4 (ATP-binding cassette, sub-family A, member 4). Andererseits werden Mutationen in Genen beschrieben, die für ubiquitär exprimierte Proteine wie Spleiß-Faktoren kodieren, beispielsweise bei dem Gen PRPF3 (pre-mRNA processing factor 3) [38]. Die Identifizierung der krankheitsverursachenden Mutation in Familien mit RP wird durch die hier beschriebenen Phänomene erschwert, sie kann jedoch Informationen über betroffene Signalwege liefern und ist so wiederum für die Entwicklung neuer Therapieansätze essentiell. 9 1.3 DNA-Sequenzanalyse Durch die Sequenzanalyse wird die Reihenfolge der DNA-Basen bestimmt [40]. Seit Fred Sanger und seine Mitarbeiter im Jahre 1977 die Kettenabbruchmethode veröffentlicht haben, hat sich diese Vorgehensweise in den folgenden Jahrzehnten zum „Goldstandard“ etabliert. Sie entwickelte sich zu einem unverzichtbaren Verfahren in Forschung und Diagnostik. Diese Vorgehensweise wird zum heutigen Zeitpunkt als die Methode der ersten Generation bezeichnet [69]. Zu Beginn des neuen Jahrtausends wurde eine Methode vorgestellt, die in Bezug auf diese Beschreibung als Next Generation Sequencing (NGS) umschrieben wird. Das NGS unterscheidet sich in einigen Punkten von der Sanger-Sequenzanalyse. So besteht keine Begrenzung auf bestimmte Sequenzabschnitte, sondern es wird das gesamte Exom oder sogar das gesamte Genom eines Individuums analysiert. Das Exom, also die Gesamtheit aller Exons, umfasst den kodierenden Bereich der DNA und entspricht ca. einem Prozent des gesamten menschlichen Genoms. Der Großteil der monogen vererbten Erkrankungen wird durch Veränderungen im Exom hervorgerufen [15]. Aufgrund des hohen Probendurchsatzes dauert die Exomanalyse eines Menschen nur wenige Tage. Im Vergleich zur Sanger-Sequenzanalyse ist das NGS schneller und kostengünstiger, denn ein gesamtes Exom kann heutzutage für ca. 1000 Euro sequenziert werden [69]. Im Jahre 2009 stellten Choi et al. zum ersten Mal eine genetische Diagnose mit Hilfe des NGS [15]. Seitdem werden mehr und mehr wissenschaftliche Studien veröffentlicht, die vor allem seltene, meist genetisch heterogene, monogen vererbte Krankheitsbilder mit Hilfe des NGS analysieren. Von Vorteil ist, dass eine große Anzahl von Kandidatengenen untersucht werden kann und zudem das gesamte restliche Exom für die Mutationsanalyse zur Verfügung steht, falls die krankheitsverursachende Mutation nicht in den Kandidatengenen gefunden wird. Eine große Herausforderung stellt nach wie vor die Auswertung der Daten dar, denn pro Exom werden ungefähr 30.000 so genannter Unclassified Variants (UVs) gefunden. Die Identifizierung von Polymorphismen ist hierbei besonders wichtig, weil dadurch viele in Frage kommende Varianten direkt als krankheitsverursachend ausgeschlossen werden können. Unter Polymorphismus versteht man eine Genvariante, die bei über einem Prozent der Bevölkerung auftritt [12]. 10 Computer-basierte und meist Internet-gestützte Datenbanken helfen dabei, das krankheitsverursachende Potenzial einer Mutation einzuschätzen. Wenn durch eine Deletion oder Insertion die Abfolge der Basen verändert wird, kann es zu einer Verschiebung des Leserasters (frame shift) kommen. Schließlich führt das Ablesen eines Stopp-Codons zum vorzeitigen Abbruch der Proteinbiosynthese. Eine Mutation kann auch durch den Austausch einer Base auftreten: ist nur die dritte Base eines Codons verändert, bleibt die zu kodierende Aminosäure meist gleich (stille Mutation). Wird eine andere Aminosäure kodiert, spricht man von einer missenseMutation. Wenn es sich dabei um ein Stopp-Kodon handelt, bezeichnet man dies als nonsense-Mutation [43]. Schätzungen in der Literatur zu Folge, tragen ungefähr 40% der RP-Patienten eine Mutation in bisher nicht mit RP assoziierten Genen [38]. Die meisten Studien beziehen sich allerdings auf nordamerikanische oder europäische Familien, sodass bei anderen Ethnien noch mit einer höheren Rate zu rechnen ist [23]. In den vergangenen Jahren sind viele Studien veröffentlicht worden, die die Exomanalyse zur Mutationssuche erfolgreich bei erblichen Augenerkrankungen angewendet haben. Bowne et al. untersuchten 21 Familien mit adRP und konnten in 5 Familien die krankheitsverursachende Mutation identifizieren [10]. Dies entspricht einer Rate von 24%. In einer anderen wissenschaftlichen Studie wurden 20 Personen aus 17 Familien mit verschiedenen Formen der hereditären Netzhautdystrophie, unter anderem RP, mit Hilfe des NGS untersucht [6]. Die Studie umfasste insgesamt 254 Kandidatengene und die Rate an identifizierten Mutationen lag schließlich bei 57%. Neveling et al. [60] veröffentlichten eine Studie mit 100 Patienten mit RP, die mit Hilfe des NGS analysiert werden sollten. Da der Vererbungsmodus bei diesen Familien unbekannt war, wurden alle bekannten RP-Gene in die Analyse miteinbezogen. Eine molekulargenetische Diagnose konnte hier für 36 Patienten gestellt werden, 3 Patienten zeigten eine Neumutation. Zusammenfassend bezeichneten diese Studien die Mutationssuche mit Hilfe des NGS als effektive Methode. Im Vergleich mit bisherigen Vorgehensweisen wurde ein geringerer Aufwand an Zeit und Kosten beschrieben. 11 2 Zielsetzung Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung der krankheitsverursachenden Mutation in einer türkischen Familie mit RP. Die hereditäre Netzhautdystrophie kann aufgrund der verschiedenen Vererbungsmodi und einer großen Anzahl von assoziierten Genen als sehr heterogen beschrieben werden. Im Mittelpunkt der Studie standen drei Mitglieder einer türkischen Großfamilie, die die typischen Symptome und Befunde der hereditären Netzhautdystrophie zeigten. Von diesen RP Patienten wurden die jeweiligen Exome sequenziert und mit Hilfe der gewonnenen Datensätze eine vergleichende Mutationsanalyse durchgeführt. Zu Beginn der Forschungsarbeit basierte die Auswertung auf der Information, dass alle drei Probanden einem großen Familienstammbaum angehörten, also die gleiche Mutation zeigen müssten. Die Studie wurde durch die Ethikkommission am Education and Research Hospital in Samsun (Türkei) genehmigt (Referenznummer 01, 08/19/2010). Die Identifizierung der krankheitsverursachenden Mutation in einer an RP erkrankten Familie liefert wichtige Informationen über biochemische Signalwege und Mechanismen der Krankheitsentstehung. Dieses Wissen kann wiederum für die Entwicklung neuer Therapieansätze genutzt werden. 12 3 3.1 Methoden Patienten Im Zentrum der Arbeit stand die Mutationsanalyse bei einer türkischen Großfamilie, deren Mitglieder die typischen Symptome der RP zeigten. Alle Probanden der Studie wurden am Education and Research Hospital in der türkischen Stadt Samsun rekrutiert. Die DNA von insgesamt 22 Familienangehörigen, davon 10 erkrankt und 12 gesund, wurde basierend auf der Aussalzmethode nach Miller aus venösem Blut isoliert [57]. Mit Hilfe des NGS erfolgte die Exom-Sequenzierung von drei erkrankten weiblichen Familienmitgliedern. 3.2 Next Generation Sequencing und Integrative Genomics Viewer Nach der DNA-Isolierung wurden die Exome der drei Patienten bei der Firma ATLAS Biolabs GmbH (Berlin) mit der NGS-Station Illumina HiSeq 2000 sequenziert. Bei dieser Methode wird die DNA zu Beginn in 80bp (Basenpaar) große Fragmente geteilt, in Einzelstränge aufgetrennt und auf eine Flusszelle gegeben [73]. Hier findet die Brückenamplifikation statt, indem beide Enden an die Flusszelle gebunden werden. Es folgt die Denaturierung des neu entstandenen Doppelstrangs und die Amplifikation beginnt erneut. Dieser Vorgang wiederholt sich, bis so genannte Cluster mit immer gleichen Kopien der Ursprungs-DNA entstehen. Die hinzugegebenen reversiblen Terminator-Nukleotide, die mit jeweils einem von vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, binden nacheinander an die DNA und werden mit einem Laser ausgelesen [56]. Da auf der Flusszelle viele dieser Cluster nebeneinander stehen und alle Vorgänge parallel ablaufen, bezeichnet man das NGS auch als Hochdurchsatzsequenzierung oder als Massively Parallel Sequencing [73]. Die mit dem Laser ausgelesene Sequenz wird mit dem menschlichen Referenzgenom verglichen und die 80bp-Fragmente diesem zugeordnet (Alignment). Je mehr DNA-Kopien einer Sequenz zugeordnet werden können, desto höher ist die Abdeckung (Coverage) [20]. 13 Das Ergebnis der Sequenzierung umfasste drei Dateien im .bam-Format (binary version of sequence alignment map), die in den Integrative Genomics Viewer (IGV) [80] eingelesen und mit dem aktuellen menschlichen Genom (hg19) verglichen wurden. Der IGV ermöglicht es, NGS-Datensätze zu betrachten und zu vergleichen. Abweichungen vom Referenzgenom werden hier farblich dargestellt. In Abbildung 2 sind im unteren Bereich die Referenzsequenz und die Aminosäureabfolge erkennbar. Bei dem ersten Patienten (obere Bildhälfte) liegen Guanin (G) und Thymin (T) zu jeweils 50% vor, sodass ein Basenaustausch im heterozygoten Zustand beobachtet werden kann. Bei dem anderen Patienten ist zu 100% Guanin (G) statt Thymin (T) zu sehen, es handelt sich also um einen Basenaustausch im homozygoten Zustand. Abbildung 2: IGV mit einem Basenaustausch im heterozygoten (oben: zweifarbiger Balken) und homozygoten Zustand (unten: einfarbiger Balken) Die Kandidatengene wurden der Online-Datenbank für retinale Erkrankungen RetNet und der aktuellen Literatur entnommen [6,65]. Aufgrund der bekannten genetischen Heterogenität und wegen sich überschneidenden Symptomen mit anderen retinalen Dystrophien, gingen auch die Kandidatengene für diese Erkrankungen in die Analyse mit ein. Eine Auflistung der insgesamt 299 Gene befindet sich im Anhang. Diese Gene wurden über die Suchfunktion aufgerufen und daraufhin manuell auf verdächtige Basenaustausche hin untersucht. Die Analyse beruhte auf der Annahme, dass alle drei Indexpatienten die gleiche Mutation zeigen 14 müssten. Der Fokus lag hierbei auf heterozygoten, homozygoten und compoundheterozygoten Varianten, sowie auf Insertionen und Deletionen. Wird ein Betroffener als compound-heterozygoter Anlageträger bezeichnet, so hat er zwei Mutationen in demselben Gen im heterozygotem Zustand von den Eltern geerbt, jeweils eine von der Mutter und eine von dem Vater, die aber bei gleichzeitigem Vorkommen krankheitsverursachend wirken [35]. Zudem wurde untersucht, welche Exons eine sehr niedrige Abdeckung (Coverage) zeigten. Sollten diese Bereiche eine Mutation enthalten, würde sie nicht oder nur bedingt gefunden werden können. 3.3 Online-Datenbänke und Vorhersageprogramme Die bei der manuellen Überprüfung festgestellten Sequenzvarianten wurden mit Hilfe von Online-Datenbänken und Vorhersageprogrammen auf ihre spezifische Pathogenität hin untersucht. Die Datenbanken lieferten Informationen über die entsprechenden Gene, über bereits beschriebene SNPs (single nucleotide polymorphism) und über Verteilungen von Varianten in bestimmten Populationen. Bei der weiteren Recherche stellten sich folgende Internetseiten als besonders informativ heraus: NCBI dbSNP [75], UCSC Genome Browser [46], GenAtlas [29], Ensembl [28], OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) [4] und HGMD (Human Gene Mutation Database) [78]. Als Vorhersageprogramme dienten der MutationTaster [70] und Polyphen-2 [1]. Mit ihnen war es möglich, das krankheitsverursachende Potenzial einer Mutation einzuschätzen, sodass bereits im Vorfeld viele Varianten als SNPs identifiziert und somit ausgeschlossen werden konnten. 3.4 NextGENe®-Software Um die Analyse auf das gesamte Exom zu erweitern, wurde ein spezielles Computerprogramm hinzugezogen. Die kostenpflichtige, MS Windows®-basierte Software NextGENe® (Softgenetics) ist ein eigens für die Auswertung von NGSDatensätzen entwickeltes Programm. Es wurde in der nahen Vergangenheit in vielen Studien zur Identifizierung der krankheitsverursachenden Mutation erfolgreich eingesetzt [55]. Für das Alignment und für die Auswertung der Dateien ist ein 15 Computer mit hoher Rechenleistung erforderlich. Das enthaltene Programm für den Vergleich mehrerer Datensätze, das Variant Comparison Tool, wurde im Rahmen dieser Arbeit angewendet. Der Report, eine Ergebnistabelle im MS Excel®-Format, enthielt alle Varianten, die im Vergleich mit dem humanen Referenzgenom identifiziert werden konnten. Neben Basenaustauschen wurden auch Deletionen und Insertionen aufgezeigt. Zudem fand eine automatische Abfrage der rs-Nummer (reference SNP) statt, die in der dbSNP-Datenbank [75] aufgerufen werden konnte. Die Einschätzung der Pathogenität der Varianten (in silico-Analyse) erfolgte automatisch über den Einsatz verschiedener Online-Vorhersageprogramme: Polyphen2, SIFT [51], MutationTaster, LRT [17] und Phylop [63]. Von diesen Datenbanken als krankheitsverursachend eingestufte Varianten wurden manuell überprüft und interpretiert. Mit Hilfe der Software erfolgte zuerst die Überprüfung der Kandidatengene. Dies diente auch der Verifizierung der Ergebnisse, die zuvor bei der manuellen Durchsicht gewonnen worden waren. In einem nächsten Schritt fand die Filterung des gesamten Reports, also die komplette Exomanalyse, nach verschiedenen Gesichtspunkten statt, denn alle Veränderungen der DNA, die zu einem fehlerhaften Ablesevorgang führen, können mögliche Ursachen einer Erkrankung sein. So erhielten die Varianten, die zu einem Stopp-Codon führten, also nonsense-Mutationen, besondere Aufmerksamkeit, ebenso Deletionen und Insertionen sowie die Basenaustausche zu Beginn und am Ende eines Introns. Dort befinden sich die konservierten Spleiß-Stellen, die für diesen Vorgang notwendig sind. Hierbei werden die Introns aus der prä-mRNA herausgeschnitten [43], denn erst die mRNA ohne Introns kann weiter zum Protein translatiert werden. Sollte der Spleiß-Vorgang gestört sein, kann es zum Fehlen von einzelnen Abschnitten oder des gesamten Proteins kommen. Auch die Varianten, die durch das Abfragen der Vorhersageprogramme als krankheitsverursachend (disease causing) ausgezeichnet wurden, gingen in die Analyse mit ein. Schließlich sollten auch alle Sequenzveränderungen, denen vom NextGENe®-Programm keine rsNummer zugeordnet werden konnte, ausgeschlossen werden. Die Überprüfung erfolgte wieder mit dem IGV, indem die Chromosomenpositionen aus dem Report in die Suchfunktion eingegeben wurden. Auffällige Varianten wurden auf mögliche Pathogenität hin überprüft. 16 3.5 Überprüfung der Pathogenität einer Variante Zu Beginn wurde die DNA mit Hilfe der PCR (polymerase chain reaction) amplifiziert, also vervielfältigt. Sie folgt einem vorher festgelegten Programm und beginnt mit der Denaturierung (bei 95°C), sodass die DNA einzelsträngig vorliegt. Nach einer Temperatursenkung (auf 66°C) folgt die Primer-Anlagerung. Es müssen immer ein Forward- und ein Reverse-Primer vorliegen, damit beide Einzelstränge der DNA abgelesen werden können. Als nächstes erfolgt die Synthese (bei 72°C), die in vielen Zyklen zur Vermehrung der im Fokus stehenden Fragmente führt. Hierfür müssen die thermostabile DNA-Polymerase und die vier Desoxynukleotide (dNTPs) vorhanden sein. Die für die PCR benötigten spezifischen Primer wurden von der Firma Metabion synthetisch hergestellt und sind im Anhang aufgeführt. Potenzielle Mutationen konnten dann mit Restriktionsenzymen erkannt werden, die sequenzspezifisch die doppelsträngige DNA spalten. Es entstehen unterschiedlich lange Fragmente, die mit Hilfe der Gelelektrophorese ihrer Länge nach im elektrischen Feld geordnet werden können. Kleine DNA-Fragmente wandern schneller in Richtung der Kathode als große DNA-Fragmente [12]. Schließlich werden die DNA-Fragmente durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Auf diese Weise kann nachgewiesen werden, ob eine veränderte Sequenzabfolge vorliegt. Zur Verifizierung der Ergebnisse können bestimmte DNA-Abschnitte durch die Methode nach Sanger sequenziert werden. Die Sanger-Sequenzanalyse ist eine heutzutage automatisierte Methode, mit der die Abfolge der DNA-Basen bestimmt werden kann [67]. Zuerst erfolgt die Amplifikation des zu untersuchenden DNA-Abschnittes mit der PCR. Der PCR werden Didesoxyribonukleotide (ddNTPs) zugemischt. Werden diese in den neu entstandenen DNA-Strang eingebaut, kommt es zum Strangabbruch, daher wird die Sanger-Sequenzanalyse auch Kettenabbruch-Methode genannt. Statistisch gesehen kommt es an allen Positionen der DNA zum Strangabbruch, sodass viele unterschiedlich lange Fragmente entstehen. Die Didesoxyribonukleotide sind zusätzlich auch mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die Fragmente werden nun mittels Kapillarelektrophorese der Länge nach aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers erfolgt das Auslesen der Farb- und somit der Basenabfolge [40]. 17 3.6 Familienanalyse Im Rahmen der Familienanalyse wird die DNA aller zur Verfügung stehender Familienmitglieder auf eine bestimmte Variation hin untersucht. Hierbei kommen je nach Art der Mutation verschieden Nachweismethoden zum Einsatz. Die Fragmentlängenanalyse ist die Methode der Wahl, um mehrere Proben gleichzeitig auf spezielle Deletionen oder Insertionen ab 3 bp zu untersuchen [42]. Sie wurde mit dem Beckman Coulter System durchgeführt. Ihr geht eine PCR mit einem Fluoreszenz-markierten Primer voraus, anschließend wird das Produkt mit einem ebenfalls Fluoreszenz-markierten Längenstandard vermischt. Darauf folgt die Auftrennung der Fragmente in einer Kapillare und deren Detektion mit einem Laser. Durch Vergleich mit dem Standard kann dann die Länge der Fragmente bestimmt und so eine Aussage über das Vorliegen der Mutation getroffen werden. Für den Nachweis noch kleinerer Deletionen oder Isertionen (unter 3 bp) kam die DHPLC-Methode (denaturing high performance liquid chromatography) zur Anwendung [76]. Bei dieser Methode wird die DNA zuerst mit der PCR amplifiziert und dann auf eine Säule injiziert. In der nächsten Phase findet die Elution des DNAFragments von der Säule statt. Liegt eine heterozygote Mutation vor, entstehen so genannte Heteroduplices. Diese eluieren eher von der Säule als die Homoduplices, die entstehen, wenn die Sequenz dem Wildtyp entspricht [40]. Zuerst wurden die Schmelzkurven von einem erkrankten und von einem gesunden Individuum als Referenzkurven bestimmt. Dann erfolgte die Analyse der restlichen Familienmitglieder und der Kontrollproben. Durch Vergleich dieser Kurven mit der Referenz konnte so eine Aussage über die mögliche vorliegende Mutation getroffen werden. Nicht eindeutige Ergebnisse wurden mit der Sanger-Sequenzanalyse verifiziert. 18 4 Ergebnisse 4.1 Stammbaumanalyse Zu Beginn der Arbeit beruhte die Analyse auf der Annahme, dass die beiden zur Verfügung stehenden Stammbäume zu einer Familie gehörten und sie der Übersicht halber auf zwei Stammbäume aufgeteilt worden waren (siehe Abbildung 3). Die Pfeile kennzeichnen die drei Indexpatientinnen. Sie waren zum Zeitpunkt der Dokumentation (im Jahre 2012) 50 Jahre (III.3), 32 Jahre (IV.3, beide Stammbaum A) und 32 Jahre alt (IV.1, Stammbaum B). Abbildung 3: Stammbaum A und B der untersuchten Familie mit Indexpatienten (Pfeile); Kreise = weibliche Individuen, Rechtecke = männliche Individuen, ausgefüllt = erkrankt, durchgestrichen = verstorben, horizontaler Doppelstrich = konsanguine Beziehung 19 Die beiden Patientinnen aus Stammbaum A litten neben den typischen Symptomen der RP auch an einer starken Myopie (Kurzsichtigkeit). Stammbaum B zeigt eine Weitergabe der krankheitsverursachenden Mutation von Mann zu Mann (III.1 und IV.2). Diese Beobachtung schließt die mitochondriale Vererbung nahezu aus, weil die Mitochondrien und damit auch die Mutationen in deren DNA, ausschließlich über die mütterliche Linie weitergegeben werden. Zudem vererbt eine betroffene Frau eine mitochondriale Mutationen an alle Kinder, was in dieser Familie nicht der Fall ist [43]. Frauen und Männer sind in der Familie gleichermaßen betroffen. Dies schließt jedoch den X-chromosomalen Erbgang nicht mit vollständiger Sicherheit aus, denn auch bei weiblichen Anlageträgern wurden Veränderungen des Augenhintergrundes und Symptome der RP beschrieben [77]. In nahezu jeder Generation der Familie befindet sich mindestens ein betroffenes Familienmitglied. Eine Ausnahme stellt das Familienmitglied II.3 in Stammbaum A dar, denn hier wird eine Generation übersprungen. Die Mutter und der Sohn der Frau sind betroffen, sie selbst aber nicht. Dies könnte für eine unvollständige Penetranz beim autosomal-dominanten Erbgang sprechen. Einige Partnerschaften sind konsanguin (horizontale Doppelstriche in Stammbaum B), also Ehen zwischen Blutsverwandten. Nachkommen dieser Partnerschaften zeigen ein erhöhtes Risiko für das Auftreten einer autosomal-rezessiv vererbten Erkrankung, weil die Eltern teilweise übereinstimmende Erbinformationen tragen. Bei den Eltern liegt die Mutation dann im heterozygoten Zustand vor, sie sind phänotypisch gesund. Die Nachkommen zeigen ein Risiko von 25% homozygot zu erkranken [35]. Zusammenfassend konnte die Vererbung in der Familie zu Beginn der Forschungsarbeit nicht eindeutig einem bestimmten Modus zugeordnet werden. Aus diesem Grund enthielt die Mutationsanalyse alle in Frage kommenden Kandidatengene, ausgenommen die der sehr unwahrscheinlichen mitochondrialen Vererbung (Auflistung der Kandidatengene siehe Anhang). 20 4.2 Vergleichende Analyse der Exomdatensätze Die vergleichende Analyse umfasste auf der einen Seite die manuelle Überprüfung der Kandidatengene mit dem IGV und auf der anderen Seite die automatisierte Analyse mit der NextGENe®-Software. Auf diesem Wege konnten zunächst fünf Mutationen erkannt werden, die als krankheitsverursachend in Frage kamen (siehe Tabelle 1). Tabelle 1: potenzielle RP-Mutationen (Chr = Chromosom, NG = NextGENe®) Gen Position Exon USH2A Chr1: 215960153 52 FLJ43860 Chr8: 142459779 20 PLXNA2 Chr1: 208272313 5 CROCC Chr1: 17281832 24 ACVR2A Chr2: 148676144 7 Mutation Restriktionsenzym c.10246T>G, p.Cys3416Gly, heterozygot c.2549_2550insT, p.Ala851Glyfs*110, heterozygot c.1609T>G, p.Cys537Gly, heterozygot, Exon-IntronGrenze c.3491G>A, p.Arg1164His, heterozygot, NG: disease causing c.945A>C, p.Lys315Asn, heterozygot, NG: disease causing Hph1 Eco147I BveI HpyCH4V BveI Das USH2A-Gen ist ein bekanntes Kandidatengen für das autosomal-rezessiv vererbte Usher-Syndrom und für die arRP [45]. Die restlichen Gene zählen bisher nicht zu den RP-Kandidatengenen. Da viele assoziierte Gene aber als noch nicht beschrieben gelten, gingen auch diese Mutationen in die weitere Analyse mit ein. 4.2.1 Pathogenes Potenzial der Mutationen Nach Amplifikation der DNA mit Hilfe der PCR und Einsetzen von Restriktionsenzymen sowie der Gelelektrophorese, kam zur Verifizierung unklarer Ergebnisse die Sanger-Sequenzanalyse zum Einsatz. Hierdurch konnten die Varianten in den Genen USH2A, FLJ43860 (full length long Japan 43860), PLXNA2 (plexin 2A) und ACVR2A (activin A receptor, type IIA) als falsch-positive 21 Ergebnisse der Exom-Sequenzierung identifiziert werden. Es zeigte sich ein Zusammenhang zwischen einer blassen Darstellung der Base im IGV (Abbildung 4) und einem falsch-positivem Sequenzergebnis. Die Substitution im Gen CROCC (ciliary rootlet coiled-coil) war bei einer gesunden Referenzprobe nachweisbar, so dass auch diese Mutation nicht als krankheitsverursachend in Frage kam. Abbildung 4: blasse Darstellung der Base Cytosin (C) im IGV (siehe Pfeile) 4.2.2 Coverage Die Analyse der Coverage ergab, dass besonders das Exon 1 einiger Kandidatengene nicht vollständig erfasst worden war. Dies betraf die Gene FLT3 (fms-related tyrosine kinase 3) und PITPNM3 (phosphatidylinositol transfer membrane associated family member 3). GC-reiche Regionen, die meist im ersten Exon zu finden und für die Genregulation wichtig sind, können hierfür ursächlich sein [2]. Auch das sehr GC-reiche Kandidatengen RGS9BP (regulator of G protein signaling 9 binding protein) zeigte daher eine vergleichsweise sehr niedrige Sequenzabdeckung. Um die krankheitsverursachende Mutation in diesen Genen nicht zu übersehen, wurden sie mit Hilfe der Sanger-Methode sequenziert (Primer siehe Anhang). Das Gen RGS9BP wurde aufgrund der Größe von 983bp für die Sequenzierung in drei ungefähr gleich große Abschnitte aufgeteilt, weil die zu sequenzierende DNA-Strecke pro Primerpaar auf 400-600bp begrenzt ist. Die Auswertung der Sequenzierungen ergab, dass sowohl die ersten Exons von FLT3 und PITPNM3, als auch das Gen RGS9BP keine Mutationen beherbergten. Im Gen RGS9BP wurden die SNPs rs259290 (c.286G>T, p.Ala96Ser) und rs259291 (c.*2G>A) bei Patientin IV.3 (Stammbaum A) im heterozygoten sowie bei Patientin III.3 (Stammbaum A) und Patientin IV.1 (Stammbaum B) im homozygoten Zustand nachgewiesen. 22 4.3 Unabhängige Analyse der einzelnen Exomdatensätze Die vergleichende Analyse, in der davon ausgegangen wurde, dass alle drei Exome die gleiche Mutation zeigen müssten, führte nicht zur Identifizierung einer RPverursachenden Sequenzveränderung. Daher erfolgte daraufhin die unabhängige Betrachtung der einzelnen Exome in Bezug auf kausale Mutationen in den RPKandidatengenen. Diese Untersuchung zeigte eine aus vier Basenpaaren bestehende Deletion, die allerdings nur bei den beiden Patientinnen aus Stammbaum A zu finden war. Die Deletion wurde im Exon 14 des RPGR-Gens (RP GTPase Regulator) auf dem X-Chromosom identifiziert. Das Protein befindet sich in Zilien, die die Photorezeptoren verbinden und so deren Überleben sichern [41]. Es spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit Transportproteinen [66]. Die Deletion führt zu einer Leserasterverschiebung (frame shift) und zu einem Strangabbruch nach 14 Aminosäuren (siehe Abbildung 5). Abbildung 5: 4bp-Deletion in Exon 14 des RPGR-Gens, c.1662_1665delAGAA, p.Glu555Glyfs*14 (WT=Wildtyp, MUT=mutiert) Daraufhin wurde die DNA aller zur Verfügung stehender Familienmitglieder mit der Fragmentlängenanalyse auf diese Deletion hin untersucht. Eine Auswahl der Ergebnisse zeigt Abbildung 6: A stellt das Ergebnis eines gesunden Familienmitgliedes dar (V.4 aus Stammbaum A, Fragmentlänge 177nt), B entspricht der Analyse bei einer Frau, die die Mutation im heterozygoten Zustand trägt (III.3 aus Stammbaum A, zwei X-Chromosomen, davon eines mit Mutation) und C zeigt 23 das Fragment eines erkrankten Mannes im hemizygoten Zustand (IV.2 aus Stammbaum A, Fragmentlänge 173nt). A 177 B 173 177 C 173 Abbildung 6: Ergebnis der Fragmentlängenanalyse (Erläuterungen siehe Text) Die Deletion konnte bei allen an RP erkrankten Familienmitgliedern aus Stammbaum A nachgewiesen werden, sowohl bei den männlichen als auch bei den weiblichen Probanden. Ebenso trug eine gesunde Frau die Mutation auf dem XChromosom im heterozygoten Zustand (IV.5 aus Stammbaum A). Bei den restlichen gesunden Familienmitgliedern aus Stammbaum A konnte die Mutation nicht nachgewiesen werden. Auch 160 deutsche und 60 türkische Kontrollproben zeigten den Wildtyp, also keine Deletion. Den Vererbungsregeln eines X-chromosomalen Erbgangs folgend, sind Söhne eines betroffenen Mannes nie Mutationsträger, Töchter jedoch immer. Söhne einer betroffenen Frau sind zu 50% Mutationsträger, je nachdem welches X-Chromosom weitergegeben wird. Töchter tragen ebenfalls mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% das betroffene X-Chromosom. 4.4 Weiterführende Analyse bezüglich Stammbaum B Nach Auswertung der Fragmentlängenanalyse konnte die Deletion bei den drei erkrankten Individuen aus Stammbaum B nicht nachgewiesen werden. Außerdem zeigte sich, dass eine X-chromosomale Vererbung in diesem Stammbaum nicht möglich sein konnte, weil dort eine Weitergabe der Mutation von Mann zu Mann dokumentiert wurde (siehe Abbildung 3). Zusätzliche Recherchen im Heimatland der Patienten ergaben, dass die anfangs angenommene Zugehörigkeit des Stammbaums B zum Stammbaum A nicht korrekt war. Somit blieb die krankheitsverursachende Mutation in Stammbaum B weiterhin unbekannt. Deshalb wurde das Exom von 24 Patientin IV.1 aus Stammbaum B nun unabhängig von den beiden anderen Exomen auf Mutationen in den RP-Kandidatengenen hin untersucht. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigt Tabelle 2. Tabelle 2: Ergebnisse der Kandidatengen-Analyse bei Patientin IV.1 aus Stammbaum B (MT = MutationTaster) Gen Position Exon CEP290 Chr12: 88465084 42 CEP290 Chr12: 88530518 5 IMPG2 Chr3: 100951679 15 NPHP3 Chr3: 132403464 24 VCAN Chr5: 82833426 8 VCAN Chr5: 82833940 8 Mutation c.5998A>G, p.Ile2000Val, heterozygot, MT: disease causing, keine rs-Nummer c.343A>G, p.Asn115Asp, heterozygot, MT: Polymorphismus, aber keine rsNummer c.3179T>G, p.Phe1060Cys, heterozygot, MT: disease causing, keine rs-Nummer c.3504A>G, p.Ala1168Ala, heterozygot, MT: disease causing, keine rs-Nummer c.4604A>G, p.Glu1535Gly, heterozygot, MT: Polymorphismus (rs61749614), noch nicht homozygot beschrieben, evtl. interessant wenn compound-heterozygot c.5118_5118delA, p.Ser1707Valfs*44, heterozygot, frame shift, MT: disease causing, keine rs-Nummer Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden die entsprechenden DNA-Abschnitte der drei erkrankten Probanden aus Stammbaum B (III.1, IV.1, IV.2) mit der SangerMethode sequenziert (Primer siehe Anhang). Eine Mutation kam nur als krankheitsverursachend in Frage, wenn sie bei allen drei erkrankten Familienmitgliedern nachweisbar war. Sowohl die missense-Mutationen im Gen CEP290 (centrosomal protein 290kDa) als auch die Sequenzveränderungen in den Genen IMPG2 (interphotoreceptor matrix proteoglycan 2) und NPHP3 (nephronophthisis 3), konnten nur bei einem oder bei zwei der erkrankten Probanden identifiziert werden. Auch die Substitution im VCAN-Gen (Versican) zeigte sich nicht bei allen drei RP-Patienten. Die Mutation mit dem größten krankheitsverursachenden Potenzial war somit eine 1bp-Deletion im Exon 8 des VCAN-Gens auf Chromosom 5. Diese Deletion führt zu einer Leserasterverschiebung mit einem Stopp-Codon nach 44 Aminosäuren (c.5118_5118delA, p.Ser1707Valfs*44, Abbildung 7). Sie konnte bei allen drei 25 erkrankten Familienmitgliedern aus Stammbaum B im heterozygoten Zustand mit der Sanger-Sequenzanalyse nachgewiesen werden. Die Deletion wird somit dem autosomal-dominantem Vererbungsmodus folgend vererbt. Das Wiederholungsrisiko bei Nachkommen eines Betroffenen liegt basierend auf den Mendel’schen Vererbungsregeln demnach bei 50%. Abbildung 7: 1bp-Deletion in Exon 8 des VCAN-Gens, c.5118_5118delA, p.Ser1707Valfs*44 (WT=Wildtyp, MUT=mutiert) VCAN ist ein Kandidatengen für retinale Dystrophien, es besteht aus 15 Exons mit verschiedenen Spleiß-Varianten und es kodiert für das Proteoglykan Versican. Es ist im Glaskörper des Auges zu finden und hält dessen Struktur aufrecht [79]. Die 1bpDeletion konnte bei den drei Erkrankten aus Stammbaum B mittels SchmelzkurvenAnalyse (DHPLC) bestätigt werden (siehe Abbildung 8). Die Mutation hat zur Folge, dass die Translation des größten Teils von Exon 8 und die komplette Translation der Exons 9 bis 15 nicht stattfindet. Als Kontrollen dienten 60 türkische sowie 160 deutsche DNA-Proben. Bei einer deutschen Kontrolle zeigte sich ein bereits beschriebener SNP (rs200941140), die Deletion konnte bei den Kontrollen nicht festgestellt werden. Abbildung 8: DHPLC-Analyse mit Schmelzkurven einer gesunden Kontrolle (A) und eines erkrankten Familienmitglieds aus Stammbaum B (B) 26 5 Diskussion Die vergleichende Mutationsanalyse im Rahmen dieser Arbeit folgte dem Ziel, die krankheitsverursachende Mutation in einer Familie mit RP zu bestimmen. Das Vorgehen beruhte auf der Exomanalyse von drei betroffenen Familienmitgliedern mit Hilfe von NGS. NGS nimmt in der heutigen Zeit einen immer größer werdenden Standpunkt ein. Die Technik wird stets weiter entwickelt, noch bestehende Schwachpunkte sind die Grundlage zukünftiger Untersuchungen. Einige Ergebnisse im Rahmen dieser Arbeit stellten sich nach näherer Untersuchung als falsch-positiv heraus. Falsche Zuordnungen beim Vorgang des Alignments sind meist auf GC-reiche oder repetitive Regionen, Pseudogene und duplizierte Genombereiche zurückzuführen [56,61]. GC-reiche Regionen sind für die Genregulation wichtig und da sie sich oft im ersten Exon befinden, ist das Alignment beim NGS in diesen Regionen erschwert. Das Phänomen konnte auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit beobachtet werden. Es wird daher empfohlen, die mit NGS festgestellten Mutationen stets mit Hilfe der Sanger-Sequenzanalyse zu verifizieren, um falsch-positive Ergebnisse herauszufiltern [32]. Auch sollten GC-reiche Regionen nachsequenziert werden, wenn das Alignment hier nicht möglich war. Nur so können mögliche Mutationen in diesen Bereichen ausgeschlossen werden. NGS kann also dazu genutzt werden, potenzielle Mutationen festzustellen. Diese können dann mit Hilfe von Online-Programmen weiter untersucht werden. Bei diesen Programmen sollte jedoch darauf geachtet werden, mit welcher Häufigkeit eine Variation auftritt und in welcher Population. In einer Studie lag die Treffsicherheit, also die Wahrscheinlichkeit, dass beispielswiese eine von dem Programm als Polymorphismus bezeichnete Variation auch wirklich ein Polymorphismus ist, bei dem MutationTaster bei ca. 86% [70]. Die endgültige Bestätigung einer potenziellen Mutation sollte daher derzeit noch auf die klassische Art und Weise, also durch die Sequenzanalyse nach Sanger, erfolgen. Der mit der Mutationsanalyse verbundene hohe Zeit- und Arbeitsaufwand steht ebenfalls im Zentrum für Weiterentwicklungen. Eine automatisierte Abfrage der Datenbanken und der Vorhersageprogramme ist zwar im Rahmen des NextGENe®Programmes im Ansatz vorhanden, könnte aber noch durch die Angabe der Verteilung in der Bevölkerung erweitert und insgesamt vollständiger und 27 übersichtlicher gestaltet werden. Es wäre zudem sinnvoll, wenn die Datenbanken die Details zu mehreren verdächtigen Variationen gleichzeitig anzeigen könnten, sodass nicht jede Variation einzeln abgefragt werden muss. Automatisierte Pipelines, die in Zukunft die Datenfilterung übernehmen könnten, würden die zeitaufwändige Auswertung deutlich beschleunigen [20]. Allerdings ist der finanzielle Aufwand der NGS-Technik nicht zu vernachlässigen. Die Anschaffung einer NGS-Station ist derzeit für die meisten humangenetischen Labore in Deutschland aus finanziellen Gründen nicht möglich. Zudem wird für die Auswertung der Datensätze ein Computer mit sehr hoher Rechenleistung benötigt. Personalkosten fallen vor allem durch die zeitlich aufwändige Datenauswertung an. Auch ethische Aspekte sind im Zusammenhang mit dem NGS zu bedenken. Eine umfassende Einverständniserklärung des Probanden ist unbedingte Voraussetzung. Ebenfalls muss über das Recht auf Nichtwissen aufgeklärt werden [31], insbesondere in Bezug auf Zufallsbefunde, die während der Exomanalyse gefunden werden könnten. Es sollte dokumentiert werden, ob und im welchem Rahmen der Patient über solche Befunde aufgeklärt werden möchte. Die Mutationsanalyse wurde in diesem Fall dadurch erschwert, dass zu Beginn die Zuordnung der Stammbäume zu einer gemeinsamen Familie nicht korrekt war. Nur durch erneute Recherche im Heimatland der Patienten konnte die Vermutung bestätigt werden, dass die beiden Stammbäume nicht zu einer Familie gehörten. Erst nach Betrachtung der Analyse unter diesen neuen Gesichtspunkten zeigten sich potenzielle Ergebnisse. So konnte bezüglich Stammbaum A eine aus vier Basenpaaren bestehende Deletion in dem Gen RPGR festgestellt werden. Mutationen in diesem Gen sind für 70% aller X-chromosomal vererbten RP-Fälle verantwortlich. Aufgrund des alternativen Spleißens gibt es 13 verschiedene Spleiß-Varianten mit unterschiedlich vielen Exons (zwischen 2 und 19) [25]. Insgesamt listet die HGMDDatenbank über 100 krankheitsverursachende Mutationen, die meisten sind missense-Mutationen, kleine Deletionen und Mutationen in Spleiß-Stellen [39]. Ein Mutationshotspot, also ein Bereich in dem sehr häufig Mutationen zu beobachten sind, ist das Exon ORF15. Betroffene mit Mutationen im ORF15 zeigen weniger stark ausgeprägte Symptome als Patienten mit Mutationen in Exon 1 bis 14 [72]. Einige RPGR-Mutationen führen häufiger zur Manifestation der RP bei Frauen, andere rufen Symptome nur bei Männern hervor. Es kann insgesamt eine hohe 28 intra- und interfamiliäre Variabilität des Phänotyps beobachtet werden [50]. Eine mögliche Erklärung ist der Einfluss von so genannten modifizierenden Genen [62]. Für das Gen RPGR sind bereits einige dieser Gene bekannt: NPHP4 (nephronophthisis 4), RPGRIP1 und RPGRIP1L (retinitis pigmentosa GTPase regulator interacting protein 1-like), NPM1 (nucleophosmin) RAB8A (member RAS oncogene family) und PDE6D (phosphodiesterase 6D) [30]. Mutationstragende Frauen können unterschiedliche Phänotypen zeigen. Mary Frances Lyon beschrieb erstmals im Jahre 1961 das Phänomen der teilweisen XInaktivierung bei der Maus und übertrug die nach ihr benannte Lyon-Hypothese kurze Zeit später auf Säugetiere im Allgemeinen und auch auf den Menschen [53]. In Bezug auf die RP bedeutet dies, dass wenn die X-Inaktivierung in den meisten Zellen das mutierte X-Chromosom betrifft, die Frau keine RP-Symptome entwickelt [44]. Trotzdem kann das mutierte Allel an ihre Nachkommen weitervererbt werden. Töchter von betroffenen Vätern können erkranken oder gesund sein, je nachdem welches X-Chromosom in der Mehrzahl ihrer Zellen inaktiviert wird. So kann ein Stammbaum mit einer RPGR-Mutation einem Stammbaum mit autosomal dominanter Vererbung ähnlich sein, weil hier typischerweise Frauen und Männer in mehreren Generationen betroffen sind. Diesen Ansatz beschrieben ebenfalls Churchill et al., in deren Studie bei 8,5% der aufgrund ihres Stammbaums als anfänglich autosomal dominant eingestuften Familien eine Mutation auf dem XChromosom nachweisbar war [18]. Es sollten daher bei Familien mit einem vermuteten autosomal dominanten Vererbungsmodus auch die X-chromosomalen Kandidatengene untersucht werden, falls die Kandidatengene für die adRP keine Mutation aufweisen. Ebenfalls spricht eine fehlende Mutationsübertragung von Mann zu Mann für eine Ursache auf dem X-Chromosom. Familien mit einer Mutation auf dem X-Chromosom und betroffenen Frauen sollten nicht als „Xchromosomal dominant“, sondern als „X-chromosomal mit kompletter Penetranz bei Männern und inkompletter Penetranz bei Frauen“ beschrieben werden [24]. Neben den typischen RP-Symptomen wurde bei den Patienten aus Stammbaum A auch eine starke Myopie diagnostiziert. Die weibliche Mutationsträgerin IV.5 zeigte ebenfalls eine Myopie, ansonsten aber keine RP-Symptome. Dieses Phänomen wurde ebenfalls in einer chinesischen RP-Familie beobachtet. Hier galt eine schwere Myopie als spezielles Merkmal weiblicher Mutationsträger [74]. 29 Die in dieser Studie beobachtete Deletion in Exon 14 des RPGR-Gens wurde bereits von einer Arbeitsgruppe aus Nordamerika bei einer aus 103 Familien mit einer RPGR-Mutation beschrieben [26]. Diese Familie stammte ursprünglich aus Jordanien [persönliche Mitteilung von Dr. Stephen P. Daiger, Human Genetics Center, School of Public Health, University of Texas at Houston, Texas, USA]. In Stammbaum B wurde nach erneuter Mutationsanalyse, die nun ausschließlich auf die Familienmitglieder dieses Stammbaumes abzielte, eine Deletion aus einem Basenpaar in dem Gen VCAN festgestellt. Mutationen in Spleiß-Stellen dieses Gens sind krankheitsverursachend für das Wagner-Syndrom (WS). Es handelt sich um eine erstmals im Jahre 1938 beschriebene, seltene Augenerkrankung mit autosomal dominantem Vererbungsmodus [47]. Einige Symptome der RP treten auch beim WS auf, zum Beispiel Nachtblindheit, schwindende Sehkraft, Myopie und Erblindung im Erwachsenenalter. Auch Pigmentablagerungen werden beim WS beschrieben, sodass sogar die Bezeichnung „pseudo-RP“ zu finden ist [11]. Außerdem sind ein optisch leerer Glaskörper, eine Netzhautablösung und chorioretinale Atrophie typische Befunde [47]. Bei den Mutationen, die bisher im Gen VCAN beobachtet wurden, handelte es sich um Mutationen in den Spleiß-Stellen von Intron 7 oder 8, sodass es zum Verlust der Exons 7 oder 8 kam [48]. Außerdem beschrieben Chen et al. eine missense-Mutation im Exon 8 des Gens als krankheitsverursachende Mutation bei einer Familie mit adRP [13]. Die Exons 7 und 8 sind wichtige Bestandteile des Gens, da sie für den Kern des Proteins kodieren und Bindungsstellen für Glykoaminoglykane (GAG) enthalten. Diese sind für die Funktion des Proteins im Glaskörper besonders wichtig, denn sie erhalten dessen Struktur [58]. Durch Verlust von Exon 8 existieren nur noch 5-8 der ursprünglich 17-23 GAG-Bindungsstellen [59]. Daher scheint die von Exon 8 kodierte Proteinsequenz für die normale Funktion des Proteins Versican besonders wichtig zu sein. Auch die in der türkischen Familie beschriebene 1bp-Deletion führt zu einer stark verkürzten Aminosäuresequenz mit Verlust eines großen Anteils von Exon 8. Nachdem die Mutation festgestellt wurde, erfolgte eine erneute klinische Untersuchung der Patienten. Hier lagen die typischen Befunde des WagnerSyndroms nicht vor. Beruhend auf den Ausführungen zu den bereits beschriebenen VCAN-Mutationen und den Ergebnissen dieser Arbeit könnte ein Zusammenhang 30 zwischen Phänotyp und Mutationstyp bestehen. Mutationen in Spleiß-Stellen führten zum WS, missense- und nonsense-Mutationen riefen, wie auch in dieser Studie, die adRP hervor. Diese Vermutung sollte die Grundlage zukünftiger InteraktionsAnalysen sein. Auch der durch die Mutation hervorgerufene Funktionsverlust des Gens könnte in entsprechenden Mausmodell-Versuchen näher untersucht werden. Mutationsanalysen können zeit- und kosteneffektiver gestaltet werden, wenn zu Beginn eine ausführliche Familienanamnese erhoben wird [64]. In diesem Fall wurde dies erschwert, weil beide Familien sich in der Türkei befanden und die direkte Kontaktaufnahme nicht möglich war. In Zukunft können jedoch, falls die Familienmitglieder dieses wünschen, Nachkommen auf die festgestellten Mutationen hin untersucht werden. So kann schon vor Auftreten erster Symptome die Diagnose gestellt werden. Auch kann nach Bestimmung des Vererbungsmodus das Risiko für Anlageträgerschaft bei den Nachkommen berechnet werden. Dies sollte jedoch erst nach einer ausführlichen genetischen Beratung und ausreichend Bedenkzeit geschehen [64]. Zwar gibt es für die RP heutzutage noch wenige experimentelle Therapiemöglichkeiten, jedoch kann die Diagnose für noch nicht erkrankte Betroffene beispielsweise hinsichtlich der Lebensplanung, der Berufswahl und des frühzeitigen Besuchs von Selbsthilfegruppen wichtig sein. Sollte zukünftig festgestellt werden, dass der Eintritt oder der Fortschritt der Erkrankung durch bestimmte Maßnahmen verzögert werden kann, wäre die Kenntnis über das Vorliegen der Mutation von großer Bedeutung. Auch für neue Therapieverfahren wie die Genersatztherapie ist dieses Wissen unverzichtbar. Die Genersatztherapie konnte beispielsweise bei den Genen RHO, CNGB1 (cyclic nucleotide gated channel beta 1), ABCA4 und RPE65 im Mausmodell erfolgreich angewendet werden [9,37,49,54]. Als Folge der Mutationen in diesen Genen kam es zu einem Untergang der Photorezeptoren in der Retina. Im Rahmen der Genersatztherapie wurde genetisches Material mit Hilfe von viralen Vektoren übertragen, die retroorbital in die Retina injiziert wurden [3]. Auch bezüglich des Gens RPGR ist die Genersatztherapie bei Hunden, die an einer der RP entsprechenden Augenerkrankung litten, mit Erfolg angewendet worden [8]. Insbesondere der Langzeiteffekt dieser Therapie ist bedeutsam, denn es zeigte sich, dass der Untergang der Photorezeptoren aufgehalten werden konnte [3,82], allerdings nur, wenn die Vektoren vor Ausbruch der Krankheit 31 injiziert worden waren. Dieser Effekt konnte für das Gen RPE65, dessen Mutation in diesem Fall zur Leberschen kongenitalen Amaurose führte, sogar in Studien an betroffenen Menschen gezeigt werden [19]. Das Ziel in der nahen Zukunft ist nun, die Ergebnisse aus den Tiermodellen auf den Menschen zu übertragen und sie in klinischen Studien zu verfestigen. In Bezug auf das Gen VCAN sind noch keine Versuche zur Genersatztherapie durchgeführt worden. Mutationen in diesem Gen sind selten und die Wirkungen und Funktionen des Proteins sind noch nicht ausreichend erforscht. Obwohl bezüglich der Anwendung des NGS auf retinale Dystrophien in der Vergangenheit bereits einige Erfolge verzeichnet werden konnten, ist davon auszugehen, dass viele Gene im Zusammenhang mit RP noch nicht beschrieben worden sind. In diesen Fällen könnte es hilfreich sein, die Analyse auf das gesamte Genom auszudehnen, um so mögliche Mutationen in noch nicht mit RP assoziierten Genen und in Introns sowie in den Zwischen-Gen-Bereichen zu finden. Auch die Exomsequenzierung eines gesunden Familienmitgliedes im Vergleich mit einem erkrankten Verwandten würde die Identifizierung familiärer Varianten erleichtern. Bei der so genannten panel-Diagnostik ist die Exomsequenzierung auf bekannte Kandidatengene begrenzt, weil hier die Wahrscheinlichkeit hoch ist eine Mutation zu erkennen. Zu Beginn einer Mutationsanalyse stellt diese Vorgehensweise eine kostengünstigere Vorgehensweise dar [33]. So könnte man die Mutationsanalyse mit einer panel-Diagnostik beginnen und sie erst im Anschluss auf das Exom oder sogar auf das gesamte Genom ausweiten, falls die erste Methode nicht zum Nachweis der gesuchten Mutation geführt hat. 32 6 Zusammenfassung Die RP ist die weltweit am häufigsten auftretende hereditäre Netzhautdystrophie. Die genetische Diagnose ist allerdings durch die klinische und genetische Heterogenie der Erkrankung in vielen Fällen erschwert. Das Ziel der Arbeit war es, die krankheitsverursachende Mutation in einer türkischen Familie mit RP zu identifizieren. Hierzu wurden die Exome von drei Familienmitgliedern mit Hilfe des NGS untersucht und im Anschluss eine vergleichende Mutationsanalyse durchgeführt. Potenzielle Mutationen wurden mit der Sequenzanalyse nach Sanger verifiziert. Es konnte festgestellt werden, dass die Stammbäume nicht zu einer gemeinsamen sondern zu zwei unabhängigen Familien gehörten. Dies wurde durch erneute Recherche im Heimatland bestätigt. Daraufhin wurde bei der Familie mit Stammbaum A eine aus vier Basenpaaren bestehende Deletion im RPGR-Gen auf dem X-Chromosom als krankheitsverursachend festgestellt. In der Familie mit Stammbaum B zeigte sich eine 1bp-Deletion im VCAN-Gen auf Chromosom 5. In Familienanalysen der beiden Stammbäume konnten die Mutationen mit Hilfe der Fragmentlängenanalyse und der DHPLC-Methode bei den betroffenen Familienmitgliedern bestätigt und bei den gesunden Probanden sowie bei 160 deutschen und 60 türkischen Normalpersonen ausgeschlossen werden. Die Exomsequenzierung in Kombination mit dem Screening der Kandidatengene hat sich somit als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung der krankheitsverursachenden Mutation innerhalb beider Familien erwiesen. Es konnte daraufhin der Vererbungsmodus und somit das Wiederholungsrisiko für weitere Nachkommen bestimmt werden. Familienmitglieder Die selbst, gewonnenen für deren Informationen Nachkommen könnten und für für die zukünftige Therapiestrategien von grundlegender Bedeutung sein. 33 7 Literaturverzeichnis 1. Adzhubei, I. A., Schmidt, S., Peshkin, L., Ramensky, V. E., Gerasimova, A., Bork, P., Kondrashov, A. S., Sunyaev, S. R. (2010). A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat. Methods 7(4), 248-249 2. Aerts, S., Thijs, G., Dabrowski, M., Moreau, Y., De Moor, B. (2004). Comprehensive analysis of the base composition around the transcription start site in Metazoa. BMC Genomics 5(1), 34 3. Al-Saikhan, F. I. (2013). The gene therapy revolution in ophthalmology. Saudi J. Ophthalmol. 27(2), 107-111 4. Amberger, J., Bocchini, C., Hamosh, A. (2011). A new face and new challenges for Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM®). Hum. Mutat. 32(5), 564-567 5. 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X A4: Weitere Kandidatengene für retinale Erkrankungen (RetNet) Gen ABCC6 ABHD12 ADAM9 AHI1 AIED AIPL1 ALMS1 ARL6 ARMS2 ATXN7 BBS1 BBS10 BBS12 BBS2 BBS4 BBS5 Chr. 16 2 8 6 11 17 2 3 10 3 11 12 4 16 15 2 Gen CNGB3 CNNM4 COL11A1 COL2A1 COL9A1 CYP4V2 DFNB31 DMD DPP3 EFEMP1 ELOVL4 ERCC6 FBLN5 FLVCR1 FZD4 GNAT1 Chr. 8 2 1 12 6 4 9 X 11 2 6 10 14 1 11 3 Gen MFN2 MFRP MKKS MKS1 MT-AP6 MTND1 MTND2 MTND4 MTND5 MTND6 MTTP MYO7A NDP NMNAT1 NPHP1 NPHP3 Chr. 1 11 20 17 M M M M M M 4 11 X 1 2 3 Gen PLA2G5 RAX2 RB1 RBP4 RCD2 RD3 RDH5 RGS9 RGS9BP RIMS1 RP1L1 RPGRIP1 RPGRIP1L RS1 SDCCAG8 SLC24A1 Chr. 1 19 13 10 17 1 12 17 19 6 8 14 16 X 1 15 42 BBS7 BBS9 BCMAD C1QTNF5 C2 C3 CABP4 CACNA1F CACNA2D4 CAPN5 CC2D2A CDH23 CDH3 CDHR1 CEP164 CEP290 CFB CFH CHM CIB2 CLN3 CNGA3 4 7 6 11 6 19 11 X 12 11 4 10 16 10 11 12 6 1 X 15 16 2 GNAT2 GNPTG GPR179 GPR98 GRK1 GRM6 GUCA1A GUCY2D HARS HMCN1 HTRA1 INPP5E INVS IQCB1 JAG1 KCNJ13 KCNV2 KIF11 LCA5 LRIT3 LRP5 LZTFL1 1 16 17 5 13 5 6 17 5 1 10 9 9 3 20 2 9 10 6 4 11 3 NPHP4 NYX OAT OPA1 OPA3 OPN1LW OPN1MW OPN1Sw OTX2 PANK2 PAX2 PCDH15 PCDH21 PDE6C PDE6H PDZD7 PEX1 PEX2 PEX7 PGK1 PHYH PITPNM3 1 X 10 3 19 X X 7 14 20 10 10 5 10 12 10 7 8 6 X 10 17 TEAD1 TIMM8A TIMP3 TLR3 TLR4 TMEM126A TMEM237 TREX1 TRIM32 TRPM1 TSPAN12 TTPA UNC119 USH1C USH1G VCAN WDPCP WDR19 WFS1 ZNF423 11 X 22 4 9 11 2 3 9 15 7 8 17 11 17 5 2 4 4 16 A5: Zusätzliche Kandidatengene aus aktueller Literatur (Audo et al. 2012) Gen Chr. Gen Chr. Gen Chr. Gen ADCY1 7 FLT3 13 MYOC 1 SLC16A8 ANKRD33 12 GJA9 1 NDUFA12 12 SLC17A7 ANXA2 15 GNAZ 22 NEUROD1 2 STAM2 ARL13B 3 GNGT1 7 NOS2 17 STK35 BMP7 20 GPR152 11 NXNL1 19 STX3 BSG 19 HCN1 5 NXNL2 9 SV2B C1orf142 1 HEATR5A 14 OPN1MW2 X TBC1D24 CAMK2D 4 HIST1H1C 6 OPTN 10 THRB CCDC28B 1 IMPG1 6 PFKFB2 1 TMEM216 CKB 14 INSL5 1 PIAS3 1 TMEM67 CLCN7 16 KCNB1 20 PKD2L1 10 TRPC1 CLN8 8 KCTD7 7 PLEKHA1 10 TTC26 COL4A3 2 KIAA0090 5 PPEF2 4 TUBB2C COL4A4 2 LASS4 19 RAB8A 19 UHMK1 COL4A5 X LRIT2 10 RABGEF1 7 VSX1 CORO1C 12 LRP2 2 RCVRN 17 VSX2 CUBN 10 MAB21L1 13 RGS20 8 WDR17 CYP1B1 2 MAP2 2 RNF144B 6 WDR31 DOHH 19 MAS1 6 RORB 9 WISP1 DSCAML1 11 MAST2 1 RTBDN 19 XIAP ESRRB 14 MGC42105 5 RXRG 1 ZDHHC2 FIZ1 19 MPP4 2 SGIP1 1 Chr. 22 19 2 20 11 15 16 3 11 8 3 7 9 1 20 14 4 9 8 X 8 43 A6: Untersuchte Gene und Primersequenzen (Ri = Richtung, F = forward/vorwärts, R = reverse/rückwärts) Gene Ri Primersequenzen 5'-3' USH2A F 5'-GTC ACA AAA GCC TAC CCT ATG TAT GTC-3' USH2A R 5'-TCT GCA TTT TCA GCA GCT TCT-3' FLJ43860 F FLJ43860 R PLXNA2 F PLXNA2 R CROCC F CROCC R ACVR2A F ACVR2A R FLT3 F FLT3 R PITPNM3 F PITPNM3 R RGS9BP (1) F RGS9BP (1) R RGS9BP (2) F RGS9BP (2) R RGS9BP (3) F RGS9BP (3) R RPGR F RPGR R 5'-ACC TGG CCT GTG TCA TTA CCT AC-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTC CCA GCC AGG CCT CG-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACG CAC AGA GTG AGT GCC CGA-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTG GGA CAA TGG AGC CAA ACA G-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACA GCG TGA ATG GAG CAC ACC-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTC AGG GAT CTG GGG TAC AAG A-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACG AAC GTT GGG GGT GAA GTT A-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTA AGA AAA GTC TCC TTA TAC ATA TGG CCT T-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACG TCT TGT AAA GCA TGA TTG CAT AAC A-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTC CAC TTT GCA CCA GTC CGA-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC GGG TCC ACA CTG CGG-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTT CGG CGC CTT TAA GGG AG-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC TAG ACG CGC GAG TCC CTC-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTT GGG CGA GAT GAT CGA CAA-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACA GGC AGA TGT GCA CTG GAA AC-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTC GAG TCA CGG ACC ATG AAG A-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACG TCC AGG CAG CCC GAG A-3' 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTG CTG TGC TGC GCG ACC-3' 5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACT GAC CGT GGA CAG GAG CTC-3' 5'-CAT CGC TGA TTC GCA CAT CTT ACT GAA AAC GAT GAT AGT GAT GAA TAT G-3' 44 IMPG2 F IMPG2 R CEP290Ex5 F CEP290Ex5 R CEP290Ex42 F CEP290Ex42 R NPHP3 F NPHP3 R VCANEx8-1 F VCANEx8-1 R VCANEx8-2 F VCANEx8-2 R 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GTT GAA GGG CTT TGT ATA CCC CA-3’ 5‘-CAG GAA ACA GCT ATG ACG ATG GCT CCC ATC TAT TGC CTA-3‘ 5‘-GTA AAA CGA CGG CCA GTA TAT CTG CAC TGA AGT ATA ATG CAA ATT TAA-3‘ 5‘-CAG GAA ACA GCT ATG ACA CCA ATA ATA ATA AAA AGC CAG GTA ACT TG-3‘ 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GTG GGT GTT ACA ATT ATT GTA ATT TGG TTT G-3’ 5’-AGG AAA CAG CTA TGA CTT ATT TCA ATT TCT AGG GGT CAA CCA-3’ 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GTC AGG ATT CCA AAC TCT AGA AAA TAG A-3’ 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA AGC TCA TAT AAA CTA ACC TGT CCC-3’ 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GTG GAA TTT GAA AGT GGA ACA GCC-3’ 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA CCC AGC TTT CTT TGG TAG ACA AC-3’ 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GTT TCG ATT CCA ATT ACA GAA GGC TC-3’ 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACG TGT AGA TGA ATA TAC CTC AAA TGT AGA AGC-3’ 45 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen für die Überlassung des Themas, seine Unterstützung und Motivation im Rahmen meiner Forschungsarbeit. Zudem danke ich Frau Dr. rer. nat. Gabriele Dekomien für die vorbildliche Betreuung, für das Beantworten all meiner Fragen, für ihre Geduld und ihre Ausdauer. Danken möchte ich ebenfalls Frau Dr. med. Sezgin Günes für die stets freundliche Kooperation und für die Bereitstellung der DNA-Proben. Bei Frau Yvonne Klenk und Frau Manuela Meyer bedanke ich mich für die Unterstützung im Labor. Sie haben mir bei Fragen stets weitergeholfen. Auch allen anderen Mitarbeitern der Abteilung danke ich für die gute Zusammenarbeit. Danken möchte ich außerdem der Heinrich und Alma Vogelsang-Stiftung für die finanzielle Förderung während der Promotion. Nicht zuletzt bedanke ich mich bei Tobias und bei meinen Eltern. Ohne ihre Unterstützung wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Lebenslauf Persönliche Daten Name Ina-Janine Thiemann Geburtsdatum 24.04.1985 Geburtsort Recklinghausen Schulische Ausbildung 1991-1995 Johannesschule, Marl 1995-2004 Gymnasium im Loekamp, Marl Abschluss: Abitur Studium, Promotion, Weiterbildung 2004 - 2008 Studium der Anglistik und der Romanistik (Spanisch) an der Ruhr-Universität Bochum, Bachelor of Arts (B.A.) 2006 - 2012 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung (2008) Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung (2012) Approbation als Ärztin (2012) Bis 09/2013 Forschungsarbeiten zur Promotion in der Abteilung für Humangenetik der Ruhr-Universität Bochum, Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen 03/2014 Posterpräsentation auf der 25. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik Seit 09/2013 Weiterbildung zur Fachärztin für Gynäkologie und Geburtshilfe
